环氧乙烷类化合物、其制备方法及其在制备RET激酶抑制剂上的用途与流程

本发明属于医药领域，涉及一种环氧乙烷类化合物、其制备方法及其在制备ret激酶抑制剂上的用途

背景技术：

ret(rearrangedduringtransfection)作为一种原癌基因，近两年因特异性小分子抑制剂的成功研发，而备受国内外关注。ret基因位于染色体10q11.2上，编码由1100个氨基酸组成的酪氨酸激酶受体，即ret蛋白。酪氨酸激酶家族是涉及几乎所有癌症类型的信号分子家族，同时也是癌症靶向治疗药物研发的基础。酪氨酸激酶家族成员的基因突变是许多不同种类癌症发生发展的主要驱动因素。当ret基因发生突变并被激活时，可能会编码出异常的蛋白质，而异常的ret基因会传递异常信号，并造成在细胞生长、生存、侵袭、转移等多方面的影响。持续的异常信号传递可能造成细胞的过度增殖，因此导致肿瘤的发生和发展。

近年研究发现ret基因在多种恶性肿瘤中存在高表达和/或基因重排现象，且ret的表达与这些恶性肿瘤的发生、发展关系密切。在非小细胞肺癌(nsclc)、甲状腺乳头状癌和骨髓单核细胞白血病中，均被发现有ret基因重排的现象。在临床治疗中，患者耐药越来越容易发生，而且某些药物具有很明显的非靶向毒性，研发ret激酶抑制剂作为一种新的治疗方案，自2012年研究者在非小细胞肺癌中发现ret融合以来，人们对其进行了广泛的研究并尝试研发靶向ret的小分子抑制剂。ret变异肿瘤相关的多靶点抑制剂，包括vandetanib、cabozantinib和lenvatinib等，均在甲状腺癌及肺癌中展现了一定的抗肿瘤作用。但这些多靶点抑制剂应答率普遍小于50％，对ret的选择性也通常不高，常会因同时抑制vegfr造成严重的高血压等副作用，限制了患者的使用。

本发明创新性的合成了一种环氧乙烷类化合物，对ret激酶活性有良好的抑制作用，同时可以抑制ret异常肿瘤细胞生长，抗肿瘤活性显著，以期得到可以用于制备ret激酶抑制剂的全新化合物，现有技术并未见到相关结构的报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的是提供一种环氧乙烷类化合物的制备方法和应用，此类化合物对ret激酶活性有良好的抑制作用，可用于制备ret激酶抑制剂。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种环氧乙烷类化合物，其结构通式i如下：

本发明另一目的为提供环氧乙烷类化合物式i的合成路线为：

进一步地，上述合成路线中各步骤的合成方法如下：

1)化合物ⅱ和通式ⅲ化合物在高温下、适宜的溶剂中反应5小时左右制得目标化合物ⅰ。

部分化合物的¹h-nmr(400mhz)和¹³c-nmr(125mhz)如下：

化合物3：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:3.15(s,4h),3.73(s,3h),3.85(d,2h),5.80(d,1h),6.72(m,1h),6.82(d,1h),7.28(m,3h),7.87(dd,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:30.49,35.49,51.36,120.93,121.66,122.98,123.18,126.48,128.86,133.92,134.85,135.46,140.07,140.54,143.58,166.96。

化合物4：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:3.21(s,4h),3.58(d,2h),3.71(t,1h),5.61-5.73(m,2h),6.82(d,1h),7.24-7.31(m,3h),7.92(d,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:31.12,36.06,63.32,122.17,123.26,123.5,126.48,128.13,128.85,132.09,134.33,134.49,135.4,139.57,139.91。

化合物5：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:3.18(s,4h),3.56(d,2h),3.88(d,2h),5.68(m,1h),5.94(m,1h),6.82(d,1h),7.26(m,2h),7.32(t,1h),7.94(d,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:30.29,30.32,33.34,35.76,122.14,123.52,123.69,126.78,128.85,131.36,133.54,134.22,134.43,135.65,140.16,140.66。

化合物6：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:3.01-3.11(m,2h),3.16(d,4h),3.52(d,2h),3.95-4.08(m,2h),4.23(d,1h),4.41(d,1h),6.81(d,1h),7.14(d,1h),7.26-7.31(m,2h),7.89(dd,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:30.20,36.32,37.72,71.00,72.96,122.22,123.86,124.58,126.71,128.00,132.14,133.42,136.50,140.16,140.66。

式ⅰ：¹h-nmr(400mhz,cdcl3)δ:3.08(d,2h),3.20(d,4h),3.44(m,2h),3.74(m,1h),3.95(d,1h),4.00-4.06(m,1h),6.81(d,1h),7.19(d,1h),7.25-7.29(m,2h),7.83(dd,1h).¹³c-nmr(125mhz,cdcl3)δ:31.12,38.49,45.52,56.14,72.11,121.66,122.74,123.21,126.44,128.04,131.48,133.79,135.86,140.07,140.54。

本发明所述的一种环氧乙烷类化合物对ret激酶活性有良好的抑制作用，同时可以抑制ret异常肿瘤细胞生长，抗肿瘤活性显著。说明本发明所述的环氧乙烷类化合物在作为ret激酶抑制剂中具有积极意义，可以进行更加深入的研究。

所述的用于制备ret激酶抑制剂的药物或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备ret激酶抑制剂中的应用，特别是提供了一种环氧乙烷类化合物在制备ret激酶抑制剂的应用。

与现有技术比，本发明的有益效果如下：

本发明的化合物在抑制ret激酶活性方面具有很好的效果。进一步地，从本发明提供的研究结果可以看出：本发明的化合物具有良好的抑制激酶活性、抗肿瘤活性以及低毒副作用。

综上所述，将本发明所述的一种环氧乙烷类化合物用于制备ret激酶抑制剂方面具有很好的开发前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其他多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1：本发明所得环氧乙烷类化合物对ret激酶抑制活性的测定。

图2：本发明所得环氧乙烷类化合物对ret异常肿瘤细胞(tt细胞)增殖抑制活性的测定。

图3：本发明所得环氧乙烷类化合物对ret信号通路的影响。

具体实施方式

下列合成实例、生物测试结果可用来进一步说明本发明，但不意味着限制本发明。

合成实例

实施例1、式ⅰ的制备

(1)(e)-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)-2-丁烯酸甲酯(化合物3)的合成

将(1,2-二氢苊烯-5-基)硼酸(化合物2)(100mmol)溶解在1,4-二恶烷(12ml)中，向其中加入kf(120mmol)，搅拌30分钟。然后，加入pd(oac)2(10mmol)和溶解在1,4-二恶烷(100ml)中的(e)-4-溴代-2-丁烯酸甲酯(化合物1)(100mmol)溶液，将反应混合物在室温下搅拌10小时，然后将其通过硅胶过滤，用et2o(100ml)洗涤。通过减压浓缩除去溶剂，得到无色油状物，用乙醚(100ml)溶解后搅拌析晶，可得黄色固体(e)-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)-2-丁烯酸甲酯(化合物3)，21.60g，产率为85.6％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:253.12[m+h]。

(2)(e)-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)丁基-2-烯-1-醇(化合物4)的合成

在0℃，氮气环境下，向(e)-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)-2-丁烯酸甲酯(化合物3)(100mmol)的无水dcm(150ml)溶液中逐滴加入二异丁基氢化铝(200mmol)。将反应在室温下搅拌3小时，然后在0℃下通过加入10％的h2so4溶液(200ml)将其淬灭。静置，分层，有机层用饱和nahco3水溶液(80ml)和水(80ml)洗涤。用无水na2so4干燥，过滤并浓缩，残余物用石油醚打浆两小时，过滤，干燥得到棕色固体(e)-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)丁基-2-烯-1-醇(化合物4)，19.65g，产率为87.6％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:225.12[m+h]。

(3)(e)-5-(4-溴丁-2-烯-1-基)-1,2-二氢苊烯(化合物5)的合成

在0℃和氮气环境下，向(e)-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)丁基-2-烯-1-醇(化合物4)(100mmol)的无水dcm(150ml)溶液中加入pph3(120mmol)和nbs(120mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后用水(100ml)淬灭。静置，分层，有机相用无水na2so4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(洗脱剂为石油醚)纯化得淡黄色固体(e)-5-(4-溴丁-2-烯-1-基)-1,2-二氢苊烯(化合物5)，26.88g，产率为93.6％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:287.04[m+h]。

(4)1-溴-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)丁烷-2,3-二醇(化合物6)的合成

在室温下，将k2oso4·2h2o(30mmol)，(dhqd)2aqn(75mmol)，k3fecn6(22.5mmol)，k2co3(22.5mmol)，nahco3(22.5mmol)，meso2nh2(8mmol)加入t-buoh/水(＝1/1，75ml)中。将混合物冷却至0℃并加入(e)-5-(4-溴丁-2-烯-1-基)-1,2-二氢苊烯(化合物5)(8mmol)。保持温度将反应物搅拌24小时，然后加入na2so4(10g)，并将混合物升至室温。加入乙酸乙酯(80ml)萃取，分液，并将水层进一步用乙酸乙酯(2×80ml)萃取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩，得到1-溴-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)丁烷-2,3-二醇(化合物6)，无需进一步纯化，直接用于下一步。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:321.04[m+h]。

(5)2-(1,2-二氢苊烯-5-基)-1-(环氧乙烷-2-基)乙基-1-醇(式ⅰ)的制备

将上一步得到的粗品1-溴-4-(1,2-二氢苊烯-5-基)丁烷-2,3-二醇(化合物6)溶于meoh(70ml)中，然后加入k2co3(16mmol)。将反应在室温下搅拌1小时。加入水(30ml)和乙酸乙酯(70ml)，搅拌半小时，分液，并将水相用乙酸乙酯(2×80ml)萃取两次。合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。通过硅胶色谱法(洗脱剂为石油醚/et2o＝1/1)纯化，得到类白色固体2-(1,2-二氢苊烯-5-基)-1-(环氧乙烷-2-基)乙基-1-醇(式ⅰ)，1.45g，两步的产率为75.6％。lc-ms(esi,pos,ion)m/z:241.12[m+h]。

试验例1、本发明化合物对ret酶抑制活性的测定

384多孔板中加入2ul/孔5xret激酶(终浓度0.5nm)，设定空白组(酶反应缓冲液)作为阴性对照，blu-667作为阳性对照。加入4ul/孔2.5x化合物梯度(终浓度最高浓度为2500nm，3倍梯度稀释，10个稀释点，dmso终浓度为0.4％)，室温孵育30分钟。加入2ul/孔5x底物(终浓度500nm)和2ul/孔5xatp(终浓度10um)起始反应，室温反应30分钟。加入5ul/孔tkantibody-cryptate和5ul/孔4xsteptavidin-xl665(终浓度62.5um)，室温孵育60分钟。envision读取htrf信号。用graphpadprism5软件对化合物的剂量效果(ic50)进行分析。如图1所示，本发明化合物和阳性对照blu-667皆对ret酶活性具有明显的抑制作用。

试验例2、本发明化合物对ret异常肿瘤细胞(tt细胞)增殖抑制活性的测定

本发明所得化合物对ret异常肿瘤细胞(tt细胞)增殖抑制活性的测定使用mtt法测定。tt细胞为人甲状腺髓样癌细胞株，该细胞株含retc634w突变。该细胞使用ham'sf-12k(kaighn's)培养基附加10％胎牛血清(fbs)，1xglutamax,1xnon-essentialaminoacids，1xpen/strepantibiotics。在37℃，5％co2的条件下进行常规培养和传代。培养好的细胞用胰蛋白酶消化后，转移至96孔板上(5000细胞/孔)。继续培养过夜后，将本发明所得化合物以指定的工作浓度处理细胞。孵育48小时后，将20ulmtt(5mg/ml)滴入孔中。继续孵育4小时后，去除96孔板中的混合培养基，然后添加150ul二甲基亚砜(dmso)。接下来，将96孔板摇床约15分钟，保持室温以混合其内容物。然后在490nm波长下测量od值。用graphpadprism5软件对化合物的剂量效果(ic50)进行分析。如图2所示，本发明化合物和阳性对照blu-667皆对ret酶活性具有明显的抑制作用。结果见图2，结果表明本发明所得化合物对ret异常肿瘤细胞(tt细胞)增殖具有抑制作用。

试验例3、本发明化合物对ret信号通路的影响

收集对数期tt细胞，将细胞悬液加入6孔细胞培养板中(1x10⁶/孔)。培养过夜后，加入本发明所得化合物(0nm，1nm，10nm)，继续连续培养12h后，收集细胞。然后使用全细胞裂解液(wholecelllysates，wcl)裂解后离心，加入样品缓冲液煮沸，进行sds-page电泳，电泳结束后将蛋白转移到pvdf膜上，5％bsa封闭后，一抗ret和磷酸化的ret(pret(y1062))和内参蛋白(gapdh))孵育过夜，冲洗后hpr-标记的二抗室温孵育两个小时，冲洗后化学发光法检测enhancedchemiluminescence(ecl)detectionsystem。结果如图3所示，本发明所得化合物可以通过抑制ret信号通路，从而发挥其抗肿瘤作用。

以上说明本发明所制备的化合物可以抑制ret异常肿瘤细胞生长，抗肿瘤活性显著，可以用于制备ret激酶抑制剂，为ret异常肿瘤细胞药物研发提供了一条新的研究思路。