一种芸香柚皮苷的制备方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种芸香柚皮苷的制备方法。

背景技术：

芸香柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物，主要存在于芸香科柑橘植物中柚、芸香科植物酸橙及其栽培变种的果实中。研究表明，芸香柚皮苷是一种天然的抗氧化剂，具有清除自由基、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏等作用，对心血管疾病，糖尿病也具有一定疗效。

目前，对于芸香柚皮苷的获取主要是通过植物提取和化学合成两种方法。从植物中提取，难以获得纯度较高的芸香柚皮苷且提取率低；化学法合成芸香柚皮苷费时费力。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提出一种芸香柚皮苷的制备方法，该方法操作简单、成本低、可获得较高纯度的芸香柚皮苷，并且其合成芸香柚皮苷的效率高。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案如下：

一种芸香柚皮苷的制备方法，其包括：

向柚皮苷溶液中加入α-l-鼠李糖苷酶，于温度50-70℃、ph为5.0-7.0的条件下反应，反应10min后加入l-鼠李糖，于400rpm条件下反应24h，获得芸香柚皮苷。

根据本发明实施例的一种芸香柚皮苷的制备方法，其通过α-l-鼠李糖苷酶水解柚皮苷生成普鲁宁，然后以l-鼠李糖为糖基供体，普鲁宁为糖苷受体，利用其糖基转移活性合成芸香柚皮苷；由此可在避免使用昂贵的化合物的情况下，低成本的获得较高纯度的芸香柚皮苷，并且其合成芸香柚皮苷的效率高。

另外，根据本发明上述实施例提出的一种芸香柚皮苷的制备方法，还可以具有如下附加的技术特征：

可选地，所述α-l-鼠李糖苷酶的cdna序列(2062bp，ncbi登录号为kc750908.1)，氨基酸序列(655aa)。

可选地，所述柚皮苷溶液的浓度为0.005mol/l-0.07mol/l，α-l-鼠李糖苷酶的浓度为50μg/ml，l-鼠李糖的浓度为0.05mol/l-1.5mol/l。

可选地，所述柚皮苷溶液的浓度为0.03mol/l，l-鼠李糖的浓度为1.0mol/l。

可选地，所述柚皮苷溶液、所述α-l-鼠李糖苷酶和所述l-鼠李糖的加入比例为6:1:6。

可选地，所述温度为60℃，所述ph为6.0。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为根据本发明实施例的产物与柚皮苷及芸香柚皮苷标准品的液相色谱图，(注：a：柚皮苷标准品；b：芸香柚皮苷标准品；c：实施例3的糖基转移反应样品；d：实施例3的样品中添加相同浓度的芸香柚皮苷)；

图2为根据本发明实施例1的产物的液相色谱图；

图3为根据本发明实施例2的产物的液相色谱图；

图4为根据本发明实施例3的产物的液相色谱图；

图5为根据本发明实施例的芸香柚皮苷的产率。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，α-l-鼠李糖苷酶rrha1cdna序列(2062bp，ncbi登录号为kc750908.1)，氨基酸序列(655aa)。

下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。

实施例1

取0.29mg柚皮苷溶解于1ml0.02mol/lph为3.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，获得0.005mol/l柚皮苷溶液。

取9.1mgl-鼠李糖溶解于1ml0.02mol/lph为3.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，获得0.05mol/ll-鼠李糖溶液。

取300μl上述的柚皮苷溶液置于50℃下温育10min后，加入50μl的50μg/mlα-l-鼠李糖苷酶rha1反应，反应10min后加入300μl的上述l-鼠李糖溶液，于400rpm条件下反应，反应24h后在100℃沸水中煮沸10min以终止反应。

实施例2

取40.6mg柚皮苷溶解于1ml0.02mol/lph为7.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，获得0.07mol/l的柚皮苷溶液。

取273.2mgl-鼠李糖溶解于1ml0.02mol/lph为7.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，获得1.5mol/ll-鼠李糖溶液。

取300μl上述的柚皮苷溶液置于70℃下温育10min后，加入50μl的50μg/mlα-l-鼠李糖苷酶rha1反应，反应10min后加入300μl的上述l-鼠李糖溶液，于400rpm条件下反应，反应24h后在100℃沸水中煮沸10min以终止反应。

实施例3

取17.4mg柚皮苷溶解于1ml0.02mol/lph为6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，获得0.03mol/l的柚皮苷溶液。

取182mgl-鼠李糖溶解于1ml0.02mol/lph为6.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，获得1.0mol/ll-鼠李糖溶液。

取300μl上述的柚皮苷溶液置于60℃下温育10min后，加入50μl的50μg/mlα-l-鼠李糖苷酶rha1反应，反应10min后加入300μl的上述l-鼠李糖溶液，于400rpm条件下反应，反应24h后在100℃沸水中煮沸10min以终止反应。

试验例

hplc检测实施例1-3获得的产物以及柚皮苷标准品、芸香柚皮苷标准品、实施例3的样品添加0.03mol/l的芸香柚皮苷。

样品分别通过0.22μm水相滤膜注入1.5ml的液相瓶中通过安捷伦1260液相色谱仪检测。注温：35℃，进样体积：20μl。流动相a泵为水、b泵为甲醇、c泵为乙腈，流速为1ml/min，波长选择280nm。洗脱程序如表1所示：

表1液相洗脱条件

每个值为实验三次所测的平均值。

实施例1、2、3芸香柚皮苷产率计算公式：芸香柚皮苷产率＝芸香柚皮苷摩尔量/柚皮苷摩尔量×100％

实施例1、2、3所制备的芸香柚皮苷分别收集10ml，旋蒸浓缩至1ml，使用制备液相进行纯化，纯化后进行hplc分析，检验纯度，芸香柚皮苷峰面积与总峰面积比值即为芸香柚皮苷的纯度。

结果如图2-图4所示，表明在ph为6.0、温度为60℃、l-鼠李糖的浓度为1.0mol/l、柚皮苷浓度为0.03mol/l时，芸香柚皮苷的纯度最高，为98％，产率达到最大为28.3％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。