SNRPN基因甲基化检测试剂盒的制作方法

本发明涉及表观遗传学和核酸检测领域，具体地说，涉及一种snrpn基因甲基化检测试剂盒。
背景技术：
：prader-willi综合征(pws)又称张力减退-智力减退-性腺功能减退与肥胖综合征，多数为散发，少数为家族性。pws的主要遗传类型有15q11-q13区域约6mb的父源染色体缺失(70％)、母源同源二倍体(upd)(20％-25％)、印记中心(ic)微缺失及突变(1％-5％)，以及少量的染色体平衡易位(<1％)。天使综合征(angelmansyndrome，as)又称愉快木偶综合征，是由母系单基因遗传缺陷所致，具体为母源15号染色体q11-q13缺失所致。snrpn(smallnuclearribonucleoproteinpolypeptiden)基因与prader-willi综合征有着重要联系。snrpn位于15q11.2，分析snrpn等位基因的甲基化差异可以判断15号染色体的遗传方式是母系遗传还是父系遗传，或者染色体缺失。目前常见的甲基化检测方法包括：高分辨染色体分析、荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization，fish)、甲基化特异性多重连接探针扩增(methylationmethylation-specificmultiplexligation-dependentprobeamplification，ms-mlpa)等。其中，染色体核型分析仅适用于染色体大片段的缺失检测，不能检出基因缺失改变，检出率约为60％，fish操作复杂、费用昂贵，可将检出率提高到70％-75％，但无法检出母源同源二倍体(upd)和印迹突变，ms-mlpa能够区分pws两种主要发病机制，能检出约95％的病例但不能鉴别印迹中心突变或缺失以及染色体平衡易位。甲基化特异性pcr(methylation-specificpcr，ms-pcr)是一种特异位点甲基化检测技术。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组dna，未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。设计不同的引物进行pcr，即可检测出这种差异，从而确定基因有无cpg岛甲基化。技术实现要素：本发明的目的是提供一种snrpn基因甲基化检测试剂盒。本发明的另一目的是提供一种基于ms-pcr技术的snrpn基因甲基化检测方法。为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种snrpn基因甲基化检测引物，包括引物对p和引物对m，引物对p的核苷酸序列如seqidno:1-2所示(扩增产物大小为100bp)，引物对m的核苷酸序列如seqidno:3-4所示(扩增产物大小为174bp)。上述两对引物是采用methprimer软件分析snrpn基因(ncbi中编号为nc_000015.10)的cpg岛之后，分别针对m:hg38:g.24954892-24955065，p:hg38:g.24954921-24955020区段设计得到的。第二方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。第三方面，本发明提供一种snrpn基因甲基化检测试剂盒，包含引物对p和引物对m，所述试剂盒还包括dna甲基化修饰试剂、阳性标准模板等。优选地，所述dna甲基化修饰试剂是基于亚硫酸盐转化法的dna甲基化修饰试剂。例如，dna甲基化修饰试剂可来自ezdnamethylation-goldkit试剂盒。第四方面，本发明提供用于snrpn基因甲基化检测的pcr反应体系(分两管反应)，所述反应体系包括：zymotaqpremix5ul，引物对m或引物对p2ul，待测dna1-2ul，用ddh2o补齐至10ul。其中，正向引物、反向引物的浓度均为5um。第五方面，本发明提供用于snrpn基因甲基化检测的pcr反应体系(单管反应)，所述反应体系包括：zymotaqpremix5ul，引物对m和引物对p各1ul，待测dna1-2ul，用ddh2o补齐至10ul。其中，seqidno:1-2所示的正向引物和反向引物的浓度为5um，seqidno:3-4所示的正向引物和反向引物的浓度为5um。第六方面，本发明提供一种基于ms-pcr技术的snrpn基因甲基化检测方法，所述方法包括：提取血样dna，进行dna甲基化修饰，然后甲基化修饰的dna经纯化、质控后作为模板，利用引物对p、引物对m进行pcr反应，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判断是否为pws、as或正常。前述的方法，可采用试剂盒ezdnamethylation-goldkit(型号d5005或d5006，购自zymoresearch公司，美国)对提取的dna进行甲基化修饰。前述的方法，对甲基化修饰的dna进行纯化处理的具体方法为：使用前向每管ctconversionreagent中加入900ul水，300ulm-dilutionbuffer和50ulm-dissolvingbuffer。室温涡旋10min。使用前向m-washbuffer中加入24ml无水乙醇(d5005),或向其中加入96ml无水乙醇(d5006)，在pcr管中向20uldna中加入130ulctconversionreagent，如果dna不足20ul用ddh2o补足，dna浓度超过100ng/ul时，需将dna用ddh2o稀释至100ng/ul以下再使用，弹打管底或吹打混匀，瞬时离心。运行以下程序：98℃10min；64℃2.5h；4℃保存至少20h。将zymo-spiniccolumn放入准备好的collectiontube，并向其中加入600ulm-bindingbuffer。将上述制备好的样品加入准备好的zymo-spiniccolumn，关闭管盖，颠倒混匀数次。离心(>10000g)30s。弃滤过液。向柱子中加入100ulm-washbuffer，离心(>10000g)30s。向柱子中加入200ulm-desulphonationbuffer，室温(20-30℃)静置15-20min，室温孵育完成后离心(>10000g)30s。向柱子中加入200ulm-washbuffer，离心(>10000g)30s。向柱子中加入200ulm-washbuffer，离心(>10000g)30s。空转30s。将柱子置于一个干净的1.5ml离心管中，向其中加入10ulm-elutionbuffer，离心(>10000g)30s。质控方法如下：使用nanodropone测量纯化后dna的浓度，纯化回收效率应大于80％，如所测纯化后甲基化dna浓度计算得率低于80％，应重新进行甲基化纯化回收步骤。前述方法采用的pcr反应程序：95℃10min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃∞。电泳检测使用浓度为3％的琼脂糖凝胶，电泳条件：120v电泳30min。前述的方法，电泳检测结果判断如下：snrpn基因正常(无缺失、upd、印记突变)：出现两条带，即引物对m和引物对p各自对应的特征条带；提示pws：仅出现引物对m对应的一条特征条带(m带)；提示as：仅出现引物对p对应的一条特征条带(p带)；以该患者未经甲基化的dna作为系统对照，未出现任何条带。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：(一)ms-pcr法可以检出除染色体平衡易位外几乎所有的pws患者，诊断pws覆盖率高达99％，as诊断覆盖率为80％以上。(二)本方法只需少量dna即可完成检测，设备要求简单，检测过程耗时短，成本低，可快速对新生儿期伴有肌张力低下、喂养困难等症状的新生儿进行临床筛查，以及对于具有肥胖和矮小等不典型症状的患者进行早期快速排查。(三)本发明通过对引物序列进行优化，并协同改良了pcr反应体系和反应程序，可以有效降低非特异性扩增引起的假阳性和假阴性，使用低电压高琼脂糖浓度能够更好地区分m带和p带，从而更准确地判断受检者的情况。附图说明图1为本发明较佳实施例中snrpn基因甲基化检测结果(分两管进行反应)。m：dnamarker为dna-dl1000。图2为本发明较佳实施例中snrpn基因甲基化检测结果(单管反应)。图3为本发明较佳实施例中检测引物和检测方法的灵敏度考察结果。图4为本发明较佳实施例中snrpn基因甲基化检测引物的优化结果。泳道1～5分别对应同一个正常人甲基化后的dna使用引物对1～5的扩增结果，其中泳道1无任何扩增条带，泳道2、3和4可以看到清晰的m带和模糊的p带，引物对5仅扩增出m带。图5为本发明较佳实施例中pcr反应条件的优化结果。图示为选择7个不同的正常人，2个pws患者使用优化后引物，将pcr体系退火温度由69℃降低到59℃，其中7个正常人结果如泳道1、2、3、4、6、8和9所示，pws患者1(upd)结果如泳道5所示，pws患者2(缺失)结果如泳道7所示。图6为本发明较佳实施例中pcr反应体系的优化结果。图示为选择1个正常人，两个pws患者，分别下调m对，p对引物对使用量(m引物对，p引物对配制好的工作浓度均为5um)，将使用量从2ul下调至1ul，pcr结果显示，正常人结果如泳道1所示，pws患者1(upd)结果如泳道2所示，pws患者2(缺失)结果如泳道3所示。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1snrpn基因甲基化检测引物的设计与合成采用methprimer软件分析snrpn基因的cpg岛，然后针对snrpn基因启动子上的序列(5’-gggagctgggacccctgcactgcggcaaacaagcacgcctgcgcggccgcagaggcaggctggcgcgcatgctcaggcggggatgtgtgcgaagcctgccgctgctgcagcgagtctggcgcagagtggagcggccgccggagatgcctgacgcatctgtctgaggagcggtcagtgacgcgatggagcgggcaaggtcagctgtgccggtggcttctctcaagagacagcctggggagc-3’)设计并优化得到如下两对引物：引物对p：f5’-gtaggttggtgtgtatgttaag-3’，r5’-acatcaaacatctccaacaac-3’(seqidno:1-2)引物对m：f5’-taaataagtacgtttgcgcgg-3’，r5’-aaccttacccgctccatcg-3’(seqidno:3-4)实施例2基于ms-pcr技术的snrpn基因甲基化检测方法的建立基于ms-pcr技术建立snrpn基因甲基化检测方法，所述方法包括：提取血样dna，进行dna甲基化修饰，然后甲基化修饰的dna经纯化、质控后作为模板，利用引物对p、引物对m进行pcr反应，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判断是否为pws、as或正常。可采用试剂盒ezdnamethylation-goldkit对提取的全血dna进行甲基化修饰，得到甲基化修饰的dna。然后，对甲基化修饰的dna进行纯化处理，具体方法为：使用前向每管ctconversionreagent中加入900ul水，300ulm-dilutionbuffer和50ulm-dissolvingbuffer。室温涡旋10min。使用前向m-washbuffer中加入24ml无水乙醇(d5005),或向其中加入96ml无水乙醇(d5006)，在pcr管中向20uldna中加入130ulctconversionreagent，如果dna不足20ul用ddh2o补足，dna浓度超过100ng/ul时，需将dna用ddh2o稀释至100ng/ul以下再使用，弹打管底或吹打混匀，瞬时离心。运行以下程序：98℃10min；64℃2.5h；4℃保存至少20h。将zymo-spiniccolumn放入准备好的collectiontube，并向其中加入600ulm-bindingbuffer。将上述制备好的样品加入准备好的zymo-spiniccolumn，关闭管盖，颠倒混匀数次。离心(>10000g)30s。弃滤过液。向柱子中加入100ulm-washbuffer，离心(>10000g)30s。向柱子中加入200ulm-desulphonationbuffer，室温(20-30℃)静置15-20min，室温孵育完成后离心(>10000g)30s。向柱子中加入200ulm-washbuffer，离心(>10000g)30s。向柱子中加入200ulm-washbuffer，离心(>10000g)30s。空转30s。将柱子置于一个干净的1.5ml离心管中，向其中加入10ulm-elutionbuffer，离心(>10000g)30s。纯化后的甲基化dna进行质控，具体方法如下：使用nanodropone测量纯化后dna的浓度，纯化回收效率应大于80％，如所测纯化后甲基化dna浓度计算得率低于80％，应重新进行甲基化纯化回收步骤。可采用如下两种pcr反应体系：①分两管进行反应的反应体系：zymotaqpremix5ul，引物对m或引物对p2ul，ddh2o1ul，待测dna2ul。正向引物、反向引物的浓度为5um。②单管反应体系：zymotaqpremix5ul，引物对m和引物对p各1ul，ddh2o1ul，待测dna2ul。seqidno:1-2所示的正向引物和反向引物的浓度为5um，seqidno:3-4所示的正向引物和反向引物的浓度为5um。pcr反应程序：95℃10min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min，4℃∞。电泳检测使用浓度为3％的琼脂糖凝胶，电泳条件：120v电泳30min。电泳检测结果(分两管进行反应)见图1，其中1,2,3,4泳道为质控条带，在质控条带通过的情况下，根据患者m带和p带情况判断是否为pws。snrpn-m带(m带)阳性且snrpn-p带(p带)阴性提示pws。snrpn-m带阴性且snrpn-p带阳性提示as。snrpn-m带阳性且snrpn-p带阳性表明snrpn基因正常(无缺失、upd、印记突变)，可排除99％的pws与80％的as。但不排除可能存在父源、母源基因平衡易位(<1％)或者母源基因突变(20％)导致的异常。阴性对照：m带(泳道1)有，p带(泳道2)有；阳性对照：m带(泳道3)有，p带(泳道4)无；样本系统对照(以该患者未经甲基化的dna作为系统对照)：m带(泳道11)无，p带(泳道12)无；snrpn基因正常(无缺失、upd、印记突变)：质控通过且m带(泳道5)有，p带(泳道6)有；提示as：质控通过且m带(泳道7)无，p带(泳道8)有；提示pws：质控通过且m带(泳道9)有，p带(泳道10)无。单管反应的实验结果(即单管中进行双重pcr扩增反应)，电泳检测结果见图2，其中1-2泳道为质控条带，在质控条带通过的情况下，根据患者m带和p带情况判断是否为pws。snrpn-m带(m带)阳性且snrpn-p带(p带)阴性提示pws。snrpn-m带阴性且snrpn-p带阳性提示as。snrpn-m带阳性且snrpn-p带阳性表明snrpn基因正常(无缺失、upd、印记突变)，可排除99％的pws与80％的as。但不排除可能存在父源、母源基因平衡易位(<1％)或者母源基因突变(20％)导致的异常。阴性对照(泳道1)：m带有，p带有；阳性对照(泳道2)：m带有，p带无；样本系统对照(泳道3、5、7、9、11)：m带无，p带无；snrpn基因正常(无缺失、upd、印记突变)(泳道6、12)：质控通过且m带有，p带有；提示as(泳道10)：质控通过且m带无，p带有；提示pws(泳道4、8)：质控通过且m带有，p带无。实施例3本发明检测引物和检测方法的准确度选取健康体检成人标本20例，pws患者6例(4例由二代测序或基因芯片cma结合临床评分系统确诊的缺失型pws患者，2例由二代测序或基因芯片cma结合临床评分系统确诊的母源性单亲二倍体pws患者)，as患者2例(1例由基因芯片cma技术结合临床评分系统确诊的父源性单亲二倍体as患者，1例由基因芯片cma技术结合临床评分系统确诊的缺失型as患者)。采用实施例2的方法对28例患者样本进行检测，检测结果如表1所示：表1样本编号临床结合二代测序/基因芯片本发明方法是否一致1as(upd)as是2pws(缺失)pws是3pws(upd)pws是4pws(缺失)pws是5pws(缺失)pws是6as(缺失)as是7pws(缺失)pws是8pws(upd)pws是9正常正常是10正常正常是11正常正常是12正常正常是13正常正常是14正常正常是15正常正常是16正常正常是17正常正常是18正常正常是19正常正常是20正常正常是21正常正常是22正常正常是23正常正常是24正常正常是25正常正常是26正常正常是27正常正常是28正常正常是由以上实验结果可知，本发明检测引物和检测系统的检测结果与二代测序及基因芯片法完全一致，所有结果均符合预期，准确度为100％。实施例4本发明检测引物和检测方法的灵敏度本实施例利用dna的输入量来评价检测系统和检测引物的灵敏度。稀释同一样本dna，使dna输入量分别为10ng、20ng和100ng，检测电泳结果如图3所示，其中泳道1和2为实验阴性质控品，泳道3和4为实验阳性质控品，泳道5和6为dna输入量100ng，泳道7和8为该样本系统对照，泳道9和10为dna输入量20ng，泳道11和12为dna输入量10ng，由检测结果可知，当dna输入量低至10ng时，此方法难以扩增出可供识别的m带、p带，因此，只要dna输入量不低于20ng，即可实现检测目的。实施例5本发明检测引物和检测方法的特异性本实施例中，特异性定义为阴性符合率。选取29例正常人样本(健康体检成人)利用实施例2的方法对pws相关snrpn基因甲基化状态进行检测。实验结果如表2所示：表2由以上实验结果可知，使用本发明方法对29例正常人样本的结果均提示正常，为正常人样本，检测引物的特异性为100％。实施例6snrpn基因甲基化检测引物的设计及优化使用正常人甲基化后dna作为模板，使用5对不同的引物对(表3)表3单孔扩增m带、p带，其中泳道1、5均未能获得正确结果，泳道2、3、4可见清晰的m带，p带模糊可见不易判断，采用生物学软件设计甲基化引物时，引物的3′端至少包含1个cpg位点，同时引物的最后3个碱基中，至少有1个是cpg的“c”。通过设定cpg的“c”距3′末端的最远距离，并对泳道3所对应的引物进行逐个碱基调整后得到seqidno:1-2和seqidno:3-4所示的两对引物。引物优化实验结果如图4所示。对于已知基因的cpg岛，由于其gc含量的特异性，利用生物学软件易于判定，例如，使用methprimer判断其cpg岛，“methprimer”设计程序默认的cpg岛跨度至少为200bp,gc含量>50％,cpg出现频率>0.6。因此，符合这些参数的区域都默认为cpg岛，原则上可以根据任意一个cpg岛设计引物进行扩增。在进行引物设计时，为了最大程度地区分甲基化与非甲基化，引物序列中应包含尽可能多的cpg位点。且甲基化引物和非甲基化引物序列3′端应处于相同的cpg位点。如果两对引物不在相同的cpg位点退火，pcr结果就不能准确反映出样本dna甲基化的情况。但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的长度，在起始位点和长度上也可以不同。这也就导致不会因为选择同样的cpg位点而轻易设计出完全一样的引物，同样地，软件设计出来的引物直接使用也会遇到上述优化实验时所遇到的问题，需要进行序列优化以及实验条件优化。实施例7pcr反应体系及反应条件的优化由于cpg岛引物对应的推荐退火温度为69℃，在对引物进行碱基调整后，将退火温度调整为59℃后可以增加p带的扩增效率使p带更易判断，但是此时m带在单管反应时易出现非特异性扩增的模糊带，无论是阴性样本还是阳性样本。pcr反应条件的优化结果见图5。图6为调整单管反应是引物对的用量后，按照优化后pcr反应条件和体系进行扩增，可以看到，单管反应中可以得到清晰明显的两条m带、p带，但是无论再在单管反应如何调整，均难以获得两条亮度相同的条带。因此在单管反应的基础上，进行分管扩增，同时优化反应体系，调整引物浓度，最终得到图1所示干净清晰可供判断的条带。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>武汉海希生物科技有限公司<120>snrpn基因甲基化检测试剂盒<130>khp201118294.8<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gtaggttggtgtgtatgttaag22<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2acatcaaacatctccaacaac21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taaataagtacgtttgcgcgg21<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4aaccttacccgctccatcg19当前第1页12