小麦抗白粉病基因Pm13的诊断型分子标记及其应用

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记及其应用。

背景技术：

普通小麦(triticumaestivuml.,2n＝6x＝42,aabbdd)是世界上最重要的粮食作物之一，在全世界各大农作物产区均有大面积种植，种植面积约占谷类作物种植总面积的1/3。在我国，小麦是最重要的口粮作物，小麦的高产和稳产，对国家粮食安全和社会稳定起着十分重要的作用。小麦白粉病是由专性寄生真菌blumeriagraminisf.sp.tritici引起，在世界各个小麦产区普遍发生，严重影响小麦的产量，可导致小麦减产13-50％。将抗病基因导入到小麦中是减少白粉病损失最经济有效的途径。

迄今为止，国内外已经在小麦及其近缘物种的63个位点鉴定出了100多个白粉病抗性基因。但是，一部分抗性基因，因与不良农艺性状紧密连锁，而不能在生产上利用。大部分抗性基因随着白粉病生理小种的不断变异以及新生理小种的出现，已经逐步失去抗性，如：来自黑麦的抗白粉病基因pm8，其抗性已在我国大部分地区丧失；来自簇毛麦的广谱抗白粉病基因pm21，由于广泛应用而导致新型致病菌株的出现，在我国四川省部分地区也逐步丧失抗性。因此，不断挖掘白粉病抗性新基因及其紧密连锁分子标记，对小麦白粉病抗性育种具有十分重要的意义。

高大山羊草(aegilopslongissima,2n＝14,s^ls^l)是小麦野生近缘物种，蕴藏着丰富的抗旱、优质和抗白粉病等优异基因，是小麦遗传改良的重要基因源。ceoloni等(1988)从高大山羊草3s^l短臂上鉴定出一个广谱抗小麦白粉病基因pm13(见参考文献:ceoloni等(1988)transferofmildewresistancefromtriticumlongissimumintowheatbyinducedhomoeologousrecombination.inproc.7thint.wheatgenet.symp.cambridge,uk.editedbyt.e.millerandr.m.d.koebner.instituteofplantscienceresearch,trumpington.pp.221-226.)。ceoloni等(1992)和donini等(1995)利用中国春ph1b基因诱导部分同源染色体高频重组技术，创制了携带pm13基因的小麦-高大山羊草易位系r1a、r1b、r4a、r5a、r6a、r2a、r2b和r1d(见参考文献：ceoloni等(1992)locatingthealienchromatinsegmentincommonwheat-aegilopslongissimamildewresistanttransfers.hereditas,116,239-245.donini等(1995)cytogeneticandmolecularmappingofthewheat–aegilopslongissimachromatinbreakpointsinpowderymildewresistantintro-gressionlines.theoreticalandappliedgenetics,91,738-743.)。cenci等(1999)开发了能检测pm13的分子标记utv14(见参考文献：cenci等(1999)identificationofmolecularmarkerslinkedtopm13,anaegilopslongissimageneconferringresistancetopowderymildewinwheat.theoreticalandappliedgenetics,98,448-454.)，但是分子标记utv14没有在普通小麦背景下检测。

近年来，随着高通量测序技术的快速发展，转录组测序可以快速有效获取大量具有基因转录和表达信息的转录组数据，为开发外源染色体特异分子标记提供了有效的方法。本研究根据接种白粉菌前后的小麦-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575转录组测序结果，成功研制出两个能够在普通小麦背景下检测含小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记cl897-2和cl114525-1及其配套的pcr检测技术。分子标记cl897-2和cl114525-1的成功研制为鉴定与辅助选育携带抗白粉病基因pm13的小麦新品系/品种奠定基础。

技术实现要素：

本发明涉及植物分子遗传学和小麦育种，具体涉及一种小麦白粉病抗病基因pm13的分子标记及其应用。本发明人经过大量的研究，获得了抗白粉病基因pm13诊断型分子标记cl897-2和cl114525-1，这两个分子标记可以在普通小麦背景下准确快速鉴定pm13基因存在与否并预测白粉病抗性，从而加快对抗白粉病基因pm13的利用，提高育种效率，加快育种进程。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明的第一个目的是提供一种小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记，所述的诊断型分子标记为cl897-2和cl114525-1。

本发明的第二个目的是提供一种小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记cl897-2和cl114525-1的获得方法，具体方法是，以具有pm13基因的小麦基因组dna为模板，采用如seqidno:1和2所示的序列的引物对进行pcr扩增，其所获得的扩增序列为seqidno:5；采用如seqidno:3和4所示的序列的引物对进行pcr扩增，其所获得的扩增序列为seqidno:6。

本发明的第三个目的是提供一种检测小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记的引物对，检测分子标记cl897-2引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物seqidno:1：5’-tgtggacgagattaagtgtt-3’，

下游引物seqidno:2：5’-aaataggccgtaggaaagt-3’；

检测分子标记cl114525-1引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物seqidno:3：5’-tgacatggtctctctggtc-3’，

下游引物seqidno:4：5’-ttttctgtgtgcctttagc-3’。

本发明的第四个目的是提供一种检测小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记的引物对在小麦抗白粉病基因pm13的分子标记辅助育种中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记的检测方法，包括以下步骤：

步骤1)、选取抗白粉病材料中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和感白粉病受体亲本中国春，在一心一叶期接种白粉菌，在接种白粉菌前和接种后12小时、24小时、48小时分别取叶片进行rna-seq转录组测序；

步骤2)、从转录组测序结果中发现基因cl897contig3和基因cl114525contig1在感白粉病受体亲本中国春接种白粉菌前和接种白粉菌后表达量均为0，但在抗白粉病材料中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575中接种前后均有表达；基因cl897contig3的核苷酸序列如seqidno:7所示，基因cl114525contig1的核苷酸序列如seqidno:8所示；

步骤3)、基因cl897contig3与csrefseqv1.0(http://202.194.139.32/)进行序列比对，发现该基因序列与小麦染色体3bs上的一段序列具有73％的相似性，根据cl897contig3序列与3bs序列比对结果设计分子标记cl897-2；

步骤4)、基因cl114525contig1与csrefseqv1.0(http://202.194.139.32/)进行序列比对，发现该基因序列与小麦染色体3ds上的一段序列具有87％的相似性，根据cl114525contig1序列与3ds序列比对结果设计分子标记cl114525-1；

步骤5)、利用分子标记cl897-2，分别对不含pm13的中国春、含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及含pm13的中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的基因组dna进行pcr扩增，含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b均能扩增出特异条带，但在不含pm13的中国春中没有扩增出任何条带，表明cl897-2为鉴定抗白粉病基因pm13的分子标记；

步骤6)、利用分子标记cl114525-1，分别对不含pm13的中国春、含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及含pm13的中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的基因组dna进行pcr扩增，含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b均能扩增出特异条带，但在不含pm13的中国春中没有扩增出任何条带，表明cl114525-1为鉴定抗白粉病基因pm13的分子标记；

步骤7)、利用分子标记cl897-2和cl114525-1在18个国内小麦品种、中国春以及携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的基因组dna中进行pcr扩增，验证分子标记cl897-2和cl114525-1的适用性；结果表明，只有在携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b中能够扩增出特异条带，而其它一组小麦品种均无任何扩增条带，表明cl897-2和cl114525-1能够对含有pm13基因的材料进行检测，确定标记cl897-2和cl114525-1为pm13基因的诊断型分子标记。

分子标记cl897-2的引物对的pcr反应体系包括:2.0μldna(100ng/ul)，7.5μltaqmastermix，10μm的上下游引物各0.5μl，无菌双蒸馏水4.5μl；pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min，随后35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，16℃保存。

分子标记cl114525-1的引物对的pcr反应体系包括:2.0μldna(100ng/ul)，7.5μltaqmastermix，10μm的上下游引物各0.5μl，无菌双蒸馏水4.5μl；分子标记cl114525-1的引物对pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min，随后10个循环：94℃变性20s，63℃退火20s，每个循环降0.5℃，72℃延伸2min；随后35个循环：94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，16℃保存。

本发明的积极效果是：相比先前开发的分子标记utv14，本发明的pm13基因诊断型分子标记cl897-2和cl114525-1，只能在含有pm13的材料中扩增出特异条带，在19个国内小麦品种中均没有特异扩增，表明分子标记cl897-2和cl114525-1是抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记，可以在小麦背景中特异追踪pm13基因，为鉴定与辅助选育携带抗白粉病基因pm13的小麦新品系/品种奠定基础，从而提高育种效率，加速抗白粉病育种进程。

附图说明

图1是本发明的分子标记cl897-2(图1a)和cl114525-1(图1b)对不含pm13基因的中国春以及携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的扩增结果。图1中，m：100bpdnaladder，1:中国春，2：中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575，3：中国春，4:中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b；箭头所示为特异扩增条带。

图2是本发明的分子标记cl897-2(图2a)和cl114525-1(图2b)在18个国内小麦品种中的扩增结果。图2中，m：100bpdnaladder，1:中国春，2-3：中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575，4：中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b，5：中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r2b，6-23：分别是18个国内小麦品种平安0518、偃展4110、周麦23、西农979、平安602、百农207、天民198、天民363、矮抗58、宁麦3号、天民118、天民263、优选101、扬麦16、百农64、周麦16、济麦22，周麦22，箭头所示为特异扩增条带。

图3是基因cl897contig3与csrefseqv1.0的比对结果。

图4是基因cl114525contig1与csrefseqv1.0的比对结果。

具体实施方式

如图1到图4所示，小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记，所述的诊断型分子标记为cl897-2和cl114525-1，其中分子标记cl897-2在携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的扩增序列如seqidno:5所示，分子标记cl114525-1在携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的扩增序列如seqidno:6所示。

以具有pm13基因的小麦基因组dna为模板，采用如seqidno:1和2所示的序列的引物对进行pcr扩增，其所获得的扩增序列为seqidno:5；采用如seqidno:3和4所示的序列的引物对进行pcr扩增，其所获得的扩增序列为seqidno:6。

检测分子标记cl897-2的引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物seqidno:1：5’-tgtggacgagattaagtgtt-3’，

下游引物seqidno:2：5’-aaataggccgtaggaaagt-3’；

检测分子标记cl114525-1的引物对的核苷酸序列如下所示：

上游引物seqidno:3：5’-tgacatggtctctctggtc-3’，

下游引物seqidno:4：5’-ttttctgtgtgcctttagc-3’。

检测小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记的引物对在小麦抗白粉病基因pm13的分子标记辅助育种中的应用。

小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记的检测方法，包括以下步骤：

步骤1)、选取抗白粉病材料中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和感白粉病受体亲本中国春，在一心一叶期接种白粉菌，在接种白粉菌前和接种后12小时、24小时、48小时分别取叶片进行rna-seq转录组测序；

步骤2)、从转录组测序结果中发现基因cl897contig3和基因cl114525contig1在感白粉病受体亲本中国春接种白粉菌前和接种白粉菌后表达量均为0，但在抗白粉病材料中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575中接种前后均有表达；基因cl897contig3的核苷酸序列如seqidno:7所示，基因cl114525contig1的核苷酸序列如seqidno:8所示；

步骤3)、基因cl897contig3与csrefseqv1.0(http://202.194.139.32/)进行序列比对，发现该基因序列与小麦染色体3bs上的一段序列具有73％的相似性，根据cl897contig3序列与3as序列比对结果设计分子标记cl897-2；

步骤4)、基因cl114525contig1与csrefseqv1.0(http://202.194.139.32/)进行序列比对，发现该基因序列与小麦染色体3ds上的一段序列具有87％的相似性，根据cl114525contig1序列与3ds序列比对结果设计分子标记cl114525-1；

步骤5)、利用分子标记cl897-2，分别对不含pm13的中国春、含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及含pm13的中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的基因组dna进行pcr扩增，含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b均能扩增出特异条带，但在不含pm13的中国春中没有扩增出任何条带，表明cl897-2为鉴定抗白粉病基因pm13的分子标记；

步骤6)、利用分子标记cl114525-1，分别对不含pm13的中国春、含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575以及含pm13的中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的基因组dna进行pcr扩增，含pm13的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b均能扩增出特异条带，但在不含pm13的中国春中没有扩增出任何条带，表明cl114525-1为鉴定抗白粉病基因pm13的分子标记；

步骤7)、利用分子标记cl897-2和cl114525-1在18个国内小麦品种、中国春以及携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b的基因组dna中进行pcr扩增，验证分子标记cl897-2和cl114525-1的适用性；结果表明，只有在携带pm13基因的中国春-高大山羊草3s^l/3b二体代换系ta3575和中国春-高大山羊草t3s^ls.3bs-3bl易位系r1b中能够扩增出特异条带，而其它一组小麦品种均无任何扩增条带，表明cl897-2和cl114525-1能够对含有pm13基因的材料进行检测，确定标记cl897-2和cl114525-1为pm13基因的诊断型分子标记。前述的一组国内小麦品种为：平安0518、偃展4110、周麦23、西农979、平安602、百农207、天民198、天民363、矮抗58、宁麦3号、天民118、天民263、优选101、扬麦16、百农64、周麦16、济麦22，周麦22。

分子标记cl897-2的引物对扩增特征在于15.0μl的pcr反应体系包括:2.0μldna(100ng/ul)，7.5μltaqmastermix，10μm的上下游引物各0.5μl，无菌双蒸馏水4.5μl。

分子标记cl897-2的引物对pcr扩增反应程序为：94℃预变性5min，随后35个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，16℃保存。

分子标记cl114525-1的引物对扩增特征在于15.0μl的pcr反应体系包括:2.0μldna(100ng/ul)，7.5μltaqmastermix，10μm的上下游引物各0.5μl，无菌双蒸馏水4.5μl。

分子标记cl114525-1的引物对pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min，随后10个循环：94℃变性20s，63℃退火20s，每个循环降0.5℃，72℃延伸2min；随后35个循环：94℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，16℃保存。

分子标记cl897-2的琼脂糖凝胶电泳检测方法如下：以cl897-2为分子标记，按上述pcr反应体系和扩增程序进行pcr扩增，用1×tae缓冲液和低电渗高纯度琼脂糖配置浓度为2.0％的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭(eb)至终浓度0.5μg/ml，在额定电压130v下电泳30分钟，后用紫外光透射仪记录观察电泳结果，所看到的扩增条带即为分子标记cl897-2的扩增结果。

分子标记cl114525-1的琼脂糖凝胶电泳检测流程如下：以cl114525-1为分子标记，按上述pcr反应体系和扩增程序进行pcr扩增，用1×tae缓冲液和低电渗高纯度琼脂糖配置浓度为2.0％的琼脂糖凝胶，加入溴化乙锭(eb)至终浓度0.5μg/ml，在额定电压130v下电泳30分钟，后用紫外光透射仪记录观察电泳结果，所看到的扩增条带即为分子标记cl114525-1的扩增结果。

sequencelisting

<110>河南农业大学

<120>小麦抗白粉病基因pm13的诊断型分子标记及其应用

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