一种便携式微生物诱导碳酸钙沉淀试剂盒及其在修复路面基层早期裂缝中的应用

本发明涉及生化及建筑技术领域，具体涉及一种便携式微生物诱导碳酸钙沉淀试剂盒及其在修复路面基层早期裂缝中的应用。

背景技术：

水泥稳定碎石是典型的路面基层材料，其主要由粒料和灰浆体积组成。粒料为级配碎石，灰浆体积包括水和胶凝材料，胶凝材料由水泥和混合材料组成。水泥稳定碎石具有良好的板体性、水稳性和抗冻性，但常因水分变化引起干缩裂缝。另外，由于外部环境因素(例如温度和外部荷载)的影响，水稳材料会产生不同程度的微小裂缝和损坏。早期如果不能及时采取有效措施进行修补，后期不仅会影响外观，还会降低基层的承载能力和耐久性。扩大的裂缝甚至会影响路面结构的安全性，从而产生隐患或事故。

现有的绝大多数修复材料(例如水泥砂浆，环氧树脂或改性聚合物材料等)普遍存在以下问题：(1)修复材料的化学成分中含有毒物质，会造成材料污染并可能给环境带来危害；(2)修补材料大多易老化，导致再次产生微小裂纹与损伤，需要重复修补；(3)修复材料与水泥材料的相容性差、流动性不好，颗粒过大难以完全渗透早期的微小裂缝，导致深层封闭裂缝难以修补；(4)修复材料大多直接添加到水泥砂浆或水泥基体中，在裂缝处不够集中，修复效果有待进一步提升。

近年来，随着微生物技术的发展，微生物诱导碳酸钙沉淀(microbialinducedcalciteprecipitation,micp)逐渐被用于现代土木工程修复中。微生物诱导碳酸钙沉淀是一种广泛存在于自然界中的生物矿化过程，其原理是自然界中的微生物能够产脲酶，从而在碱性环境中将尿素水解产生co3^2-，co3^2-与ca²⁺结合便可以析出caco3结晶。该结晶又被称为方解石，其具有胶结性，能够很好的和混凝土结合在一起，可用于修补水泥稳定碎石路面基层早期裂缝，同时还可以提升路面的硬度、抗酸碱能力和抗渗性。相较于传统修复技术，micp技术成本低、无污染，更适用于修补水泥基材料的早期损伤。

在以往的应用方式中，通常直接将微生物修复剂拌入水泥材料中(如cn104529217a、cn107445564a)，待裂缝产生后环境中的空气和水分得以进入，激活处于休眠期的细菌进行micp过程，生成具有胶结作用的碳酸钙结晶，从而达到修复早期裂缝的目的。然而，水泥材料内部相对密实且呈高碱性，直接掺入的修复剂中微生物的存活率及活性会显著降低，并且微生物较为分散利用率偏低，导致修复效果大打折扣。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种便携式微生物诱导碳酸钙沉淀试剂盒。该试剂盒包括至少三个相互独立的组分，其中第一组份为产脲酶菌菌液，第二组分为尿素，第三组分为钙源。

进一步的，所述产脲酶菌菌液由产脲酶菌、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、蒸馏水混合而成。

更进一步的，所述产脲酶菌菌液中蛋白胨的含量为8-10g/l，酵母提取物的含量为3-5g/l，氯化钠的含量为8-10g/l，紫外分光光度计测得的菌液od600＝1.3-1.8。

进一步的，所述产脲酶菌具体为巨大芽孢杆菌。

更进一步的，所述产脲酶菌的分离、富集、筛选过程具体如下：

a)采集离地表10-30cm深的水泥混凝土道路路侧土壤样品，加水制成土壤混悬液，灭菌(80℃水浴加热10min)完成芽孢富集；

b)将步骤a)得到的土壤混悬液涂布至lb固体培养基上，28-30℃下恒温培养22-24h；

c)从步骤b)所得平板中挑选出形态不同的单菌落进行划线，于28-30℃下恒温培养20-24h；重复挑选单菌落-划线培养多次(2-3次)，直至获得较纯的菌株；

d)将步骤c)得到的纯菌株接种至尿素琼脂培养基上，于28-30℃培养40-48h，选择使培养基变成粉红色的菌株确定为目标产脲酶菌；

e)将步骤d)筛选出的产脲酶菌接种至装有lb培养液的摇瓶中，控制摇瓶中菌液od600＝1.2-1.5，于28-30℃、165-180rpm/min转速下培养得到菌液；配制总浓度为0.5-2.0m的尿素-氯化钙水溶液并调节其ph至7.2-7.4，按照1:4-6的体积比将菌液与尿素-氯化钙水溶液混合均匀，于28-30℃静置48-72h后取样测量碳酸钙沉淀量；选择碳酸钙沉淀量最高的产脲酶菌确定为最终目标菌株。

进一步的，所述lb固体培养基按照重量份数计的配方为：蛋白胨8-10份、酵母提取物3-5份、nacl8-10份、琼脂粉15-20份，蒸馏水1000份，ph＝7.2-7.4；所述尿素琼脂培养基按照重量份数计的配方为：尿素10-20份、nacl5-7份、kh2po42-4份、蛋白胨0.5-1.5份、酚红0.01-0.02份、琼脂15-20份、蒸馏水1000份，ph＝6.8-7.0；所述lb培养液的组成为：蛋白胨8-10g/l，酵母提取物3-5g/l，氯化钠8-10g/l，溶剂为蒸馏水。

进一步的，第二组分中的尿素具体为固体尿素；第三组分中的钙源选自固体氯化钙、固体硝酸钙中的至少一种，优选为固体氯化钙、固体硝酸钙的混合物。

进一步的，所述试剂盒还包括第四组分，所述第四组份包括独立包装的蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，三者的质量比为1-3:0.5-2:1-3。

进一步的，所述试剂盒中第一组分、第二组分、第三组分、第四组分的比例为200ml:240-720g:548-1644g:2.5-8g。

本发明的另一目的在于提供一种上述便携式微生物诱导碳酸钙沉淀试剂盒在修复水泥稳定碎石路面基层早期裂缝中的应用。

本发明提供的微生物诱导碳酸钙沉淀试剂盒可制成小巧、方便携带和运输的独立包装产品，使用时通过喷淋或浇灌的方式在裂缝部位集中补充可诱导碳酸钙产生的微生物以及胶结液，进而高效、低成本修复水泥稳定碎石基层的早期裂缝或损伤，效果十分显著。本发明避免了直接将微生物加入到水泥砂浆或水泥基体中可能导致菌种死亡或活性降低等问题，同时最大限度的保证了筛选出的菌种沉淀碳酸钙的能力及利用率。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)该试剂盒独立包装，便于外出携带，能够适应野外作业环境；(2)利用该试剂盒可反复多次、局部集中补充micp技术所需新的微生物及胶结液，彻底避免了提前拌入的产脲酶微生物因为环境因素失活或死亡而导致的修补失败；(3)选用的菌株是从土壤中分离筛选得到的，不仅不会对环境造成二次污染而且成本较低，相较传统修复材料更为环保；(4)菌液能够深入渗透至化学修补材料无法到达的早期较为微小且深层的裂缝，不仅利用率高而且修复效果好。

附图说明

图1为本发明试剂盒的结构示意图；

图2为饼状普通水泥试件示意图。

其中1-产脲酶菌菌液，2-固体尿素，3-固体氯化钙，4-固体硝酸钙，5-蛋白胨，6-酵母提取物，7-氯化钠。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例及附图进行进一步说明。

本发明所涉及到的产脲酶菌菌液及各种培养基配方如下：

所述产脲酶菌菌液由产脲酶菌、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、无菌水混合而成，其中蛋白胨的含量为8-10g/l，酵母提取物的含量为3-5g/l，氯化钠的含量为8-10g/l，紫外分光光度计测得的菌液od600＝1.3-1.8。

lb固体培养基(按照重量份数计)：蛋白胨8-10份、酵母提取物3-5份、氯化钠8-10份、琼脂粉15-20份，蒸馏水1000份，ph＝7.2-7.4。

尿素琼脂培养基(按照重量份数计)：尿素10-20份、nacl5-7份、kh2po42-4份、蛋白胨0.5-1.5份、酚红0.01-0.02份、琼脂15-25份，蒸馏水1000份，ph＝6.8-7.0。

lb培养液的组成为：蛋白胨8-10g/l，酵母提取物3-5g/l，氯化钠8-10g/l，溶剂为蒸馏水。

本发明所选用的产脲酶菌是从土壤中分离、富集、筛选得到的，具体过程如下：

1)收集土壤样品：采集离地表10-30cm深的水泥混凝土道路路侧土壤，装入塑料袋中密封。

2)芽孢富集：取10g采集到的土壤样品，将其加入到250ml烧杯中，再加入90ml无菌水，振荡20min得到土壤混悬液。将烧杯置于80℃水浴锅中加热10min杀灭菌体，完成芽孢的富集。

3)涂布平板：吸取100μl富集后的土壤混悬液，将其均匀涂布至若干个lb固体培养基表面，30℃下恒温培养24h。

4)复筛:从以上平板中挑选出形态不同的单菌落进行划线，接着在30℃下恒温培养20h。同样条件下重复划线培养2-3次，直至复筛获得较纯的菌株。

5)筛选产脲酶菌：将上述复筛后的不同形态较纯菌株接种至尿素琼脂培养基上，于28-30℃℃下培养48h，选择使培养基变成粉红色的菌株确定为目标产脲酶菌。

6)选择沉淀碳酸钙能力最强的产脲酶菌：将上一步筛选出的目标产脲酶菌接种于装有lb培养液的摇瓶中(确保菌液od600＝1.2-1.5)，于28-30℃、165-180rpm/min转速下培养，得到菌液。分别配制4组尿素-氯化钙水溶液，各组中尿素与氯化钙浓度相等并且两者浓度之和分别为0.5m、1.0m、1.5m、2.0m。配制好的尿素-氯化钙水溶液用0.1m的稀盐酸和0.1m的naoh水溶液调节ph至7.2-7.4之间。按照1:4的体积比将菌液与尿素-氯化钙水溶液混合均匀，所得混合液在30℃下保温静置48h，分别取样测量碳酸钙沉淀量。比较不同样品中碳酸钙沉淀量高低，最终选择沉淀量最高的菌种确定为最优产脲酶菌株。经鉴定，筛选出的最优产脲酶菌为巨大芽孢杆菌。

筛选出最优产脲酶菌株后，将其接种于含lb培养液的摇瓶中培养，摇床转速为165-180rpm/min，温度28-30℃，直至用紫外分光光度计测得菌液od600＝1.3-1.8，即为第一组份产脲酶菌菌液。独立包装的固体尿素作为试剂盒的第二组分，分开密封包装的固体氯化钙、固体硝酸钙作为试剂盒的第三组分，分开密封包装的蛋白胨、酵母提取物、氯化钠作为第四组分。整个试剂盒的结构及各个组份的位置布局如图1所示，每一份试剂盒成品中通常包括200ml产脲酶菌菌液，240-720g固体尿素，220-660g固体氯化钙，328-984g固体硝酸钙，1-3g蛋白胨，0.5-2g酵母提取物，1-3g氯化钠。利用该试剂盒修复水泥稳定碎石路面基层早期裂缝时，每一种组分并非正好全部用完(理想情况下正好用完)，实际中可根据裂缝的具体情况灵活调整。

为了进一步说明问题，以如图2所示的饼状普通水泥试件(尺寸150mm×40mm，裂缝宽度约为0.5-1mm)为模型进行了修复试验，具体过程如下：

第一步：首先将试剂盒中的第二组分尿素与蒸馏水混合，制成尿素浓度为0.5m的第二组分溶液。

第二步：将5mlod600＝1.4的第一组分产脲酶菌菌液与10ml第二组分溶液混合后静置1h，接着将所得混合液沿饼状普通水泥试件的裂缝进行喷淋。

第三步：将试剂盒中的第三组分、第四组份以及水混合配制成钙离子浓度为0.5m的营养液。待第二步喷淋的混合液自然下渗后，再沿裂缝加入10ml浓度为0.5m的营养液。至此完成碳酸钙第一次沉淀处理。

第四步：待水泥表面自然干燥后，重复上述步骤二、三对水泥试件裂缝进行喷淋。连续4天共对水泥试件进行了10次诱导碳酸钙沉淀处理。

对照组a

本对照组与上述实施例基本相同，不同之处在于：第一组分中不含筛选所得产脲酶菌。

对照组b

第一步：在制作水泥试件时，直接将50mlod600＝1.4的第一组分产脲酶菌菌液拌入水泥中。

第二步：将第二组分尿素溶液沿饼状普通水泥试件的裂缝进行喷淋。

第三步：将试剂盒中的第三组分、第四组份以及水混合配制成钙离子浓度为0.5m的营养液。待第二步喷淋的混合液自然下渗后，再沿裂缝加入10ml浓度为0.5m的营养液。至此完成碳酸钙第一次沉淀处理。

第四步：待水泥表面自然干燥后，重复第二、三步对水泥试件裂缝进行喷淋。连续4天共对水泥试件进行了10次诱导碳酸钙沉淀处理。

修复完成后，将实施例和对照组a-b的水泥试件均沿裂缝分开，收集水泥试件表面及裂缝内壁白色沉淀物，用去离子水冲洗过滤后放入烘箱内干燥，称重记为w1。将干燥后的固体放入0.1m盐酸中洗涤，直至无明显气泡产生，再用去离子水冲洗后重新放入烘箱干燥，称重记为w2。两次称重的差值即为caco3产量，钙离子沉淀量与钙离子初始量之比即为钙离子沉淀率。

结果表明，对照组a水泥试件裂缝中无明显白色沉淀物，裂缝处经盐酸洗涤后无明显变化。实施例及对照组b中钙离子沉淀量结果如表1所示。

表1caco3沉淀量(g)结果表

参照上述公式计算得到实施例及对照组b中碳酸钙的沉淀率分别为64.90％、3.20％。(实施例计算过程：6.493g/100与0.1mol之比，再乘以100％)。由此可知，对照组b中直接拌入水泥中的菌体存活率、利用率较低，导致caco3沉淀率大幅下降，修复效果较差。

综上所述，本申请提供的便携式微生物诱导碳酸钙沉淀试剂盒确实能够高效、低成本的修复水泥稳定碎石路面基层早期裂缝，并且效果显著。