类器官的培养换液方法

本发明涉及细胞培养
技术领域：
，特别是涉及一种类器官的培养换液方法。
背景技术：
：类器官是近年突破发展的一种体外3d组织培养技术，可以在体外高成功率、快速地培养人的组织细胞，形成保留原器官组织结构和生物信息的“微组织”，在个性化治疗和再生医学领域有广泛的应用前景。目前，类器官培养技术主要分为依赖外源支架的三维培养技术和不依赖外源支架的三维培养技术。其中不依赖外源支架的三维培养技术因无需特殊培养皿，类器官形成效率高、操作简单，检测方便及成本更低等优势近年逐渐受到重视，该技术主要是通过物理方法使悬浮于培养基中的细胞聚集到一定密度形成紧密的细胞-细胞连接，诱导分化使其自组装成为三维类器官结构。类器官培养中常遇到需要更换培养基以及转移类器官的情况，实验室通常采用的办法是直接在超净台上用肉眼侧面观察并使用移液枪进行换液或在显微镜下进行类器官转移。但由于类器官培养要求无菌操作，使得显微镜必须置于超净台内，这让显微镜的使用变得格外不方便。而由于超净台操作面的金属材质反光情况不佳，且类器官体积微小(直径可小至100μm)，肉眼观察困难从而导致类器官的损伤率和损失率较高。技术实现要素：基于此，有必要提供一种类器官的损伤率和损失率较低的类器官的培养换液方法。一种类器官的培养换液方法，包括以下步骤：将待换液的细胞培养皿置于换液台面上；使用柔光灯对所述细胞培养皿的侧面进行照射；使所述细胞培养皿中的类器官集中于所述细胞培养皿的中部；从所述细胞培养皿的边缘吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。在其中一个实施例中，所述柔光灯的照射方向与所述细胞培养皿的底壁平行。在其中一个实施例中，所述柔光灯的散射波长为450nm～470nm。在其中一个实施例中，所述柔光灯的光通量为1300lm～1800lm。在其中一个实施例中，所述柔光灯的显色指数为75ra～85ra。在其中一个实施例中，所述柔光灯与所述细胞培养皿的距离为1cm～20cm。在其中一个实施例中，在培养换液的过程中仅使用所述柔光灯作为唯一光源。在其中一个实施例中，通过旋转所述细胞培养皿的方式，使所述细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中部。在其中一个实施例中，旋转所述细胞培养皿的速度为30rpm/min～60rpm/min。在其中一个实施例中，在所述吸除原培养液的步骤之后以及所述加入新鲜培养液的步骤之前，震荡所述细胞培养皿以使所述类器官在所述细胞培养皿中分散。本发明通过使用柔光灯从细胞培养皿的侧面进行照射，通过散射作用能辅助肉眼观察细胞培养皿内的微小类器官(直径可小至100μm)，在使类器官集中至细胞培养皿的中部后，再用移液枪从细胞培养皿的边缘进行吸液体或加液体操作，使得类器官能避免因被吸取、转移而产生机械损伤。本发明通过侧射柔光观察类器官的原理如图1所示，侧面射入的柔光透过细胞培养皿的侧壁，遇到不透光的类器官后向上发生折射，部分折射光线可进入人的眼球，与此同时，换液台面如金属超净台的金属面也向上折射了部分扩散的光线，进一步使肉眼对类器官的观察更加地清晰。综上所述，一般的培养换液方法不仅操作繁琐困难且易导致类器官的损失损伤，而本发明的培养换液方法通过侧射柔光灯辅助类器官换液不仅可以简化操作流程，不依赖体视显微镜，而且能够使肉眼对类器官的观察更加地清晰，从而降低类器官的损失率及损伤率，提高培养换液效率。附图说明图1为本发明一实施例的类器官的培养换液方法的原理示意图；图2为本发明一实施例的类器官的培养换液方法的另一原理示意图；图3为本发明实施例1换液时的照片；图4为本发明对比例2换液时的照片；图5为本发明对比例3换液时的照片；图6为本发明实施例1换液后的类器官的显微照片；图7为本发明对比例1换液后的类器官的显微照片。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“上”、“下”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。术语解释类器官：类器官属于三维(3d)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。二次流(secondaryflow)：假如沿一边界的流动因受到横向压力的作用，产生了平行于边界的偏移，则靠近边界的流体层由于速度较小，就比离边界较远的流体层偏移得厉害，这就导致了叠加于主流之上的二次流。如图1所示，本发明一实施方式的类器官的培养换液方法，包括以下步骤s1～s4：s1、将待换液的细胞培养皿10置于换液台面20上。s2、使用柔光灯30对细胞培养皿10的侧面进行照射。s3、使细胞培养皿10中的类器官集中于细胞培养皿10的中部。s4、从细胞培养皿10的边缘吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。目前常用的类器官的培养换液方法有三种：第一种方法是在超净台上顶部白光灯的照射下，通过自然沉降，待类器官沉降至细胞培养皿的底部，然后吸走部分培养液，再加入部分新的培养液。但是，在超净台的顶部白光灯照射下，类器官通过肉眼不易观察，因此经常会将类器官与培养液一起吸入枪头中，从而导致类器官的损坏和丢失。第二种方法是将细胞培养皿中的类器官和原培养液均移至尖底离心管，待类器官沉至离心管的尖底部时，通过肉眼观察，吸走上清培养液，然后加入新鲜培养液。但是，先将细胞培养皿中的类器官和原培养液收集到尖底离心管，待类器官沉淀后再换液，不仅操作麻烦，吸取过程中也容易损伤类器官。第三种方法则是在体视显微镜的观察下进行换液。在体视显微镜观察下进行换液，虽能清晰看见类器官，但观察视野较小，操作不方便，也容易造成细菌污染。本发明通过使用柔光灯从细胞培养皿的侧面进行照射，通过散射作用能辅助肉眼观察细胞培养皿内的微小类器官(直径可小至100μm)，在使类器官集中至细胞培养皿的中部后，再用移液枪从细胞培养皿的边缘进行吸液体或加液体操作，使得类器官能避免因被吸取、转移而产生机械损伤。本发明通过侧射柔光观察类器官的原理如图1所示，侧面射入的柔光透过细胞培养皿的侧壁，遇到不透光的类器官后向上发生折射，部分折射光线可进入人的眼球，与此同时，换液台面如金属超净台的金属面也向上折射了部分扩散的光线，进一步使肉眼对类器官的观察更加地清晰。综上所述，一般的培养换液方法不仅操作繁琐困难且易导致类器官的损失损伤，而本发明的培养换液方法通过侧射柔光灯辅助类器官换液不仅可以简化操作流程，不依赖体视显微镜，而且能够使肉眼对类器官的观察更加地清晰，从而降低类器官的损失率及损伤率，提高培养换液效率。在一个具体示例中，柔光灯30包括壳体和灯泡，灯泡安装于壳体内的一端，壳体的侧面不透光以防止光线散射，远离灯泡的一端为透明的出光口，使得灯泡的灯光只能沿着壳体的扁平长轴传递，最终从壳体扁平长轴的另外一端射出变成柔光。例如可将led灯安装在透明亚克力壳体一侧，亚克力壳体的侧面均贴白色不透光膜以防止光线散射，使得侧面射入的led灯光只能沿着亚克力壳体的扁平长轴传递，最终从亚克力壳体扁平长轴的另一侧射出变成柔光。方向性很强的直射光一般就叫硬光，而经过阻挡或反射后照在被摄对象上的光就叫柔光，柔光灯的原理就是把僵硬的闪光灯直射光线通过半透明塑料转化为柔和的漫射光，可以理解，柔光灯30的结构不限于此，可根据需要选择。在一个具体示例中，柔光灯30的照射方向与细胞培养皿10的底壁的夹角为0°～30°。在一个具体示例中，柔光灯30的照射方向与细胞培养皿10的底壁平行，即夹角为0°，从而能够更有效地令光线折射进入人的眼球，从而使肉眼对类器官的观察更加清晰。在一个具体示例中，柔光灯30的散射波长为450nm～470nm，在该范围波长的光线下能够使肉眼对类器官的观察更加清晰。在一个具体示例中，柔光灯30的光通量为1300lm～1800lm，由于人眼对不同波长光的相对视见率不同，所以不同波长光的辐射功率相等时，其光通量并不相等，在该范围的光通量时能够使肉眼对类器官的观察更加清晰。在一个具体示例中，柔光灯30的显色指数为75ra～85ra，物体在太阳光和白炽灯的照射下，显示出它真实的颜色，但当物体在非连续光谱的气体放电灯的照射下，颜色就会有不同程度的失真，光源对物体真实颜色的呈现程度即称为光源的显色性，显色指数在该范围时能够使肉眼更好地区分类器官，从而降低类器官的损失率及损伤率，提高培养换液效率。在一个具体示例中，柔光灯30与细胞培养皿10的距离为1cm～20cm，优选为2～10cm，从而能够使肉眼更好地区分类器官，降低类器官的损失率及损伤率，提高培养换液效率。在一个具体示例中，在培养换液的过程中仅使用柔光灯30作为唯一光源。如此，可以避免其他光源影响柔光灯30的照射效果，能够使肉眼对类器官的观察更加地清晰，从而降低类器官的损失率及损伤率，提高培养换液效率。在一个具体示例中，通过旋转细胞培养皿10的方式，使细胞培养皿10中的类器官集中于细胞培养皿10的中部，从而防止类器官过于分散而增加换液难度。旋转细胞培养皿10使类器官集中于细胞培养皿10的中部的原理如图2所示，在旋转细胞培养皿10时，由于培养液和细胞培养皿10之间的摩擦，细胞培养皿10中会产生二次流，也就是和旋转面垂直的一圈圈水流。类器官被卷入这个二次流中，最终被扫到细胞培养皿10的中部。由于在二次流中，靠近细胞培养皿10的底部的液体速度更小，那里的类器官速度不足无法上升，最终被扫成了一团，集中沉淀在中心皿底。在一个具体示例中，旋转细胞培养皿10的速度为30rpm/min～60rpm/min，如此能够更有效地使细胞培养皿10中的类器官集中于细胞培养皿10的中部。在一个具体示例中，在吸除原培养液的步骤之后以及加入新鲜培养液的步骤之前，震荡细胞培养皿10以使类器官在细胞培养皿10中分散。优选地，采用“井”字震荡法使类器官在细胞培养皿10中分散，即将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡。以下为具体实施例实施例1(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将柔光灯置于换液台面上，并对细胞培养皿的侧面进行照射，且不使用其它光源。柔光灯的照射方向与细胞培养皿的底壁平行，柔光灯的散射波长为460nm，柔光灯的光通量为1500lm，柔光灯的显色指数为80ra，柔光灯与细胞培养皿的距离为5cm。效果如图3所示，类器官清晰可见。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。实施例2(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将柔光灯置于换液台面上，并对细胞培养皿的侧面进行照射，且不使用其它光源。柔光灯的照射方向与细胞培养皿的底壁平行，柔光灯的散射波长为450nm，柔光灯的光通量为1300lm，柔光灯的显色指数为75ra，柔光灯与细胞培养皿的距离为1cm。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为30rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。实施例3(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将柔光灯置于换液台面上，并对细胞培养皿的侧面进行照射，且不使用其它光源。柔光灯的照射方向与细胞培养皿的底壁平行，柔光灯的散射波长为470nm，柔光灯的光通量为1800lm，柔光灯的显色指数为85ra，柔光灯与细胞培养皿的距离为20cm。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为60rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。实施例4(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将柔光灯置于换液台面上，并对细胞培养皿的侧面进行照射，同时使用超净台顶部的普通白光灯。柔光灯的照射方向与细胞培养皿的底壁平行，柔光灯的散射波长为460nm，柔光灯的光通量为1500lm，柔光灯的显色指数为80ra，柔光灯与细胞培养皿的距离为5cm。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。实施例5(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将柔光灯置于换液台面上，并对细胞培养皿的侧面进行照射，且不使用其它光源。柔光灯的照射方向与细胞培养皿的底壁之间的夹角为30°，柔光灯的散射波长为460nm，柔光灯的光通量为1500lm，柔光灯的显色指数为80ra，柔光灯与细胞培养皿的距离为5cm。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。对比例1(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将柔光灯从细胞培养皿的顶部进行照射，且不使用其它光源。柔光灯的照射方向与所述细胞培养皿的底壁平行，柔光灯的散射波长为460nm，柔光灯的光通量为1500lm，柔光灯的显色指数为80ra，柔光灯与细胞培养皿的距离为5cm。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。对比例2(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)开启超净台顶部的普通白光灯，且不使用其它光源，效果如图4所示，类器官肉眼几乎不可见。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。对比例3(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)开启超净台顶部的普通白光灯，且不使用其它光源，并在细胞培养皿的底部放置白板，效果如图5所示，细胞培养皿底部放置白板时类器官也几乎肉眼不可见。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。对比例4(1)将待换液的细胞培养皿置于换液台面上。(2)将普通灯(硬光灯)置于换液台面上，并对细胞培养皿的侧面进行照射，且不使用其它光源。非柔光灯光线太强，比较刺眼，细胞培养皿底部放置白板时类器官也不易观察。非柔光灯的照射方向与细胞培养皿的底壁平行，非柔光灯的散射波长为460nm，非柔光灯的光通量为1500lm，非柔光灯的显色指数为80ra，非柔光灯与细胞培养皿的距离为5cm。(3)通过旋转细胞培养皿使细胞培养皿中的类器官集中于细胞培养皿的中心的底部。旋转细胞培养皿的速度为45rpm/min。(4)用移液枪从远离类器官的细胞培养皿的边缘处吸除原培养液，然后加入新鲜培养液。(5)将细胞培养皿轮流沿相互垂直的两个方向来回震荡，以使类器官在细胞培养皿中分散。经同一操作人员按照各实施例和对比例的方法进行类器官的培养换液操作，统计类器官的平均损失率，结果如下表所示。可见，采用本发明的类器官的培养换液方法能够使肉眼对类器官的观察更加地清晰，从而降低类器官的损失率及损伤率，提高培养换液效率。如图6所示为实施例1经过培养换液操作之后的类器官的显微照片，图7为对比例1经过培养换液操作之后的类器官的显微照片，可见对比例的类器官损伤较多。分组换液前类器官数(个)换液后类器官数目(个)损失率(％)实施例130028896实施例230028494.7实施例330028695.3实施例430027993实施例530027591.7对比例130020869.3对比例230021973对比例330016755.7对比例430024180.3以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12