MUC1-Tn嵌合抗原受体修饰的Vγ9Vδ2T细胞及其应用的制作方法

muc1-tn嵌合抗原受体修饰的v
γ
9v
δ
2t细胞及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种muc1-tn嵌合抗原受体修饰的vγ9vδ2 t细胞及其应用。


背景技术：

2.近年来，car-αβ t细胞过继性免疫治疗在血液肿瘤治疗领域取得了巨大的成就，其中以cd19 car-αβ t细胞疗法最具代表性。在2017年，美国fda先后批准了两款分别针对于青少年复发难治性慢性b淋巴细胞白血病(kymriah)和成人复发难治性大b细胞淋巴瘤(yescarta)的cd19 car-t产品。此外，欧洲药品管理局(ema)也于2018年批准了这两种药物在欧洲上市。迄今为止，过继免疫治疗中应用最广泛的效应细胞是αβ t细胞亚群。然而，car-αβ t细胞疗法的广泛应用受到许多不利因素的阻碍，包括细胞因子释放综合征(crs)和神经毒性等等。此外，作为个体化的免疫治疗，患者自身来源的αβ t细胞是制备car-αβ t细胞必不可少的材料，但是由于大多数癌症患者的免疫系统可能已被严重的预处理、化疗或疾病本身所损害，因而缺乏足够的t细胞或者t细胞功能受损可能会增加car t细胞制备失败的风险或是降低临床疗效。因此，若要解决这些问题，开发一种现货型的同种异体car-t细胞产品将会是一个十分理想的选择。
3.γδ t细胞是t细胞的一个小亚群，在外周血中占循环t细胞的1％-5％，但其是上皮组织的主要淋巴细胞。γδ t细胞同时具有固有免疫细胞和适应性免疫细胞的特性，在抵抗细菌、病毒和肿瘤发生发展方面具有重要作用，是桥接固有免疫反应和适应性免疫反应的重要桥梁。与αβ t细胞抗原识别机制不同，γδ t对于异体抗原的识别不具有mhc依赖性，γδ t细胞能够以mhc分子非依赖性的方式识别相关抗原分子，这使得γδ t细胞成为异体细胞免疫治疗的一个极具吸引力的的候选细胞。组成γδ t细胞的vγ链和vδ链具有多种亚型，例如vγ(2-5，8，9)和vδ(1-8)链，其中vγ9链通常与vδ2链配对形成异二聚体。vγ9vδ2 t细胞是外周血中主要的γδ t细胞，其可通过唑来膦酸(zol)和白细胞介素-2(il-2)选择性的在体外扩增，目前的体外扩增方法可以制备出临床级别的vγ9vδ2 t细胞。研究表明，vγ9vδ2 t细胞对多种肿瘤具有内源性细胞毒性，在抵抗肿瘤的发生和发展方面具有重要作用。另外，vγ9vδ2 t细胞活化后可作为专门的抗原提呈细胞(apcs)，进而进一步的激活免疫系统，增强免疫反应。综上所述，vγ9vδ2 t细胞是一种十分具有应用前景的同种异体肿瘤免疫治疗细胞。
4.目前，现有技术中还不存在成熟的基于vγ9vδ2 t的car-t疗法，本领域还需要开发新的car-vγ9vδ2 t细胞以及相关的治疗方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种muc1-tn嵌合抗原受体修饰的vγ9vδ2 t细胞及其应用。
6.在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体的抗原
结合结构域(即，scfv)包括seq id no:1所示的抗体重链可变区，和seq id no:2所示的抗体轻链可变区。
7.在另一优选例中，所述抗体重链可变区和抗体轻链可变区通过连接肽相连。
8.在另一优选例中，所述的抗原结合结构域的结构如下式i或ii所示：
[0009]vl-vhꢀꢀ
(i)；v
h-v
l
ꢀꢀ
(ii)
[0010]
其中，vh为抗体重链可变区；v
l
为抗体轻链可变区；
“‑”
为连接肽或肽键。
[0011]
在另一优选例中，所述的抗原结合结构域的结构如式ii(v
h-v
l
)所示。
[0012]
在另一优选例中，所述vh的氨基酸序列如seq id no:1所示，v
l
的氨基酸序列如seq id no:2所示。
[0013]
在另一优选例中，所述连接肽为1-4个连续的seq id no:4(ggggs)所示的序列，较佳地2-4个，更佳地为3个。
[0014]
在另一优选例中，所述抗原结合结构域结合于muc1-tn，较佳地为人muc1-tn。
[0015]
在另一优选例中，所述抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区来源于人源化抗体。
[0016]
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的结构如下式iii所示：
[0017]
l-scfv-h-tm-c-cd3ζ
ꢀꢀ
(iii)
[0018]
其中，
[0019]
l为无或信号肽序列；
[0020]
scfv为靶向muc1-tn的scfv；
[0021]
h为绞链区；
[0022]
tm为跨膜结构域；
[0023]
c为共刺激信号分子；
[0024]
cd3ζ为源于cd3ζ的胞浆信号传导序列。
[0025]
在另一优选例中，所述的靶向muc1-tn的scfv包括seq id no:1所示的抗体重链可变区，和seq id no:2所示的抗体轻链可变区。
[0026]
在另一优选例中，所述的l为选自下组的蛋白的信号肽：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137、或其组合。
[0027]
在另一优选例中，所述的l为巨噬细胞集落刺激因子来源的信号肽。
[0028]
在另一优选例中，l的氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0029]
在另一优选例中，所述的h为选自下组的蛋白的铰链区：cd8、cd28、cd137、或其组合。
[0030]
在另一优选例中，所述的h为fc片段，较佳地为人fc片段，更佳地为ch2-ch3。
[0031]
在另一优选例中，h的氨基酸序列如seq id no:6所示。
[0032]
在另一优选例中，所述的tm为选自下组的蛋白的跨膜区：icos、cd28、cd3 epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、muc1-tn、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、或其组合。
[0033]
在另一优选例中，所述的tm为cd28来源的跨膜区。
[0034]
在另一优选例中，tm的序列如seq id no:7所示。
[0035]
在另一优选例中，所述的c为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：icos、ox40、cd2、
cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、或其组合。
[0036]
在另一优选例中，所述的c为cd28来源的共刺激信号分子。
[0037]
在另一优选例中，所述c的氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0038]
在另一优选例中，cd3ζ的氨基酸序列如seq id no:9所示。
[0039]
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no:3所示。
[0040]
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(car)。
[0041]
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
[0042]
在另一优选例中，所述核酸分子如seq id no:10所示。
[0043]
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。
[0044]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(aav)、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
[0045]
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。
[0046]
在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。
[0047]
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
[0048]
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的car。
[0049]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
[0050]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌。
[0051]
在本发明的第五方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞表达有本发明第一方面所述的car。
[0052]
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
[0053]
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
[0054]
在另一优选例中，所述细胞包括t细胞、nk细胞。
[0055]
在另一优选例中，所述t细胞为vγ9vδ2 t细胞。
[0056]
在另一优选例中，所述细胞为car-vγ9vδ2 t细胞。
[0057]
在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。
[0058]
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
[0059]
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
[0060]
在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，较佳地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0061]
在另一优选例中，所述的制剂还包含抗肿瘤的第二活性成分，较佳地包括第二抗体、或化疗剂。
[0062]
在另一优选例中，所述的化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
[0063]
在另一优选例中，所述的制剂还包含il-2。
[0064]
在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
[0065]
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
[0066]
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(aml)、多发性骨髓瘤(mm)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、急性淋巴白血病(all)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或其组合。
[0067]
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
[0068]
在另一优选例中，所述的肿瘤为muc1-tn阳性肿瘤，较佳地为muc1-tn高表达的肿瘤。
[0069]
在另一优选例中，所述的muc1-tn阳性肿瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等实体肿瘤。
[0070]
在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述的宿主细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。
[0071]
在本发明的第九方面，提供了一种制备工程化的免疫细胞的方法，所述的免疫细胞表达本发明第一方面所述的car，所述方法包括以下步骤：
[0072]
(a)提供待改造的免疫细胞；和
[0073]
(b)将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
[0074]
在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞为car-t细胞或car-nk细胞。
[0075]
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
[0076]
在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞为car-vγ9vδ2 t细胞。
[0077]
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行培养的步骤，并且所述的培养是在il-2存在的情况下进行的培养。
[0078]
在另一优选例中，培养体系中，il-2的浓度为200u/ml。
[0079]
在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第三方面所述的载体、本发明第五方面所述的免疫细胞、或本发明第六方面所述的制剂。
[0080]
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
[0081]
在另一优选例中，在所述免疫细胞的体外培养过程中，添加il-2。
[0082]
在本发明的第十一方面，提供了一种il2的用途，用于制备一制剂，所述制剂用于增强car vγ9vδ2 t细胞的持久性和/或增强car vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性。
[0083]
在另一优选例中，所述制剂用于基于car vγ9vδ2 t细胞的过继免疫治疗。
[0084]
在另一优选例中，所述的增强car vγ9vδ2 t细胞的持久性是指增强car vγ9vδ2 t细胞对肿瘤细胞的持续杀伤能力。
[0085]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0086]
图1显示了细胞流式检测的3个健康供体pbmc扩增的vγ9vδ2 t细胞的表型。
[0087]
图2显示了carαβ t和car vγ9vδ2 t细胞的构建。图2a显示了car载体结构，包含信号肽，抗muc1-tn单链抗体，fc连接肽，cd28跨膜区，cd28胞内区，cd3ζ区域。图2b显示了细胞流式检测的αβ t细胞和vγ9vδ2 t细胞表面muc1-tn car的表达。
[0088]
图3显示了car vγ9vδ2 t细胞以抗原特异性依赖的方式裂解肿瘤细胞。图3a显示了muc1-tn抗原在jurkat t细胞和cosmc-jurkat t细胞表面的表达。muc1-tn在cosmc-jurkat t细胞上不表达。图3b显示了car vγ9vδ2 t细胞对jurkat t细胞和cosmc-jurkat t细胞的细胞毒性。图3c显示了细胞毒性实验上清液中tnf-α,granzyme b和ifn-γ的含量。
[0089]
图4显示car vγ9vδ2 t比carαβ t对乳腺癌细胞展现了更强的细胞毒性。图4a显示了muc1-tn在t47d细胞、mda-mb-231细胞和mda-mb-468细胞表面的表达情况。图4b显示了car vγ9vδ2 t细胞和car t细胞对t47d、mda-mb-231和mda-mb-468细胞的细胞毒性。图4c显示了细胞毒性实验上清液中tnf-α,granzyme b和ifn-γ的含量。
[0090]
图5显示了car vγ9vδ2 t细胞对胃癌细胞的细胞毒性。图5a显示了muc1-tn抗原在胃癌细胞株hgc-27,sun-1和kato iii表面的表达情况。图5b显示了car vγ9vδ2 t对hgc-27,sun-1和kato iii的细胞毒性。图5c显示了细胞毒性实验上清液中tnf-α,granzyme b和ifn-γ的含量。
[0091]
图6显示了car vγ9vδ2 t细胞在持久性方面的不足。图6a和图6b显示与carαβ t细胞相比，car vγ9vδ2 t细胞对肿瘤细胞的持续杀伤能力弱一些。
[0092]
图7显示il-2对增强car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性和改善其功能持久性具有重要作用。图7a和图7b显示在il-2添加组中，vγ9vδ2 t和car-vγ9vδ2 t细胞均表现出明显增强的细胞毒性和持久的细胞毒性，与未添加il-2组中的对照相比，它们能更有效地消除的gfp-jurkat t细胞。
[0093]
图8显示car vγ9vδ2 t细胞展现了有效的体内抗肿瘤作用。图8a显示了体内实验设计流程图。图8b显示了测量的不同组小鼠肿瘤大小变化。图8c显示了小鼠处死后，不同组小鼠肿瘤大小。图8d显示了不同组小鼠的体重变化。
具体实施方式
[0094]
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种满足临床应用需要的临床级别的car-vγ9vδ2 t细胞的制备方法。通过用慢病毒转染的方法分别制备muc1-tn特异性car修饰的vγ9vδ2 t细胞和αβ t细胞，分别命名为car-vγ9vδ2 t细胞和car-αβ t细胞。据研究表明，异常的o-糖基化抗原muc1-tn广泛高度表达在包括乳腺癌和胃癌在内的多种肿瘤细胞表面，因此这种muc1分子异常糖基化所形成的新型肿瘤抗原可能成为肿瘤治疗的理
想靶点12。本研究结果表明，car-vγ9vδ2 t细胞在体外对多种肿瘤细胞均具有较强特异性细胞毒性作用，而且其细胞毒性作用要强于car-αβ t细胞。但是，car-vγ9vδ2 t细胞存在一个极为严重的缺陷，就是其细胞毒性的持久性要弱于car-αβ t细胞。在进一步的研究中，我们发现加入il-2能够增强car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性，同时还能改善其细胞毒性功能的持久性。体内细胞毒性研究结果表明，相比于vγ9vδ2 t细胞，car-vγ9vδ2 t细胞能够更有效的抑制肿瘤生长，而且实验动物并为造成明显的毒副作用。综上所述，本研究证明了car修饰能够显著增强vγ9vδ2 t细胞的抗原特异性细胞毒性，为实体肿瘤提供了一种极具应用前景的异体细胞免疫治疗策略。
[0095]
vγ9vδ2 t细胞具有内源性抗肿瘤活性，对抗原分子的识别不受mhc分子限制，因此其同种异体移植反应可以忽略不计，是肿瘤异体免疫治疗的理想效应细胞。本研究的结果表明car修饰vγ9vδ2 t细胞能够赋予vγ9vδ2 t细胞抗原特异性的细胞毒性，且car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性要强于传统的car-αβ t细胞。因此，car修饰的vγ9vδ2 t细胞有望成为了一种新型的、极具潜力的、现货型的、同种异体的肿瘤免疫治疗产品。car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性持久性要弱于car-αβ t细胞，il-2能够改善car-vγ9vδ2 t这一缺陷。
[0096]
术语
[0097]
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本技术中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
[0098]
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
[0099]
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
[0100]
术语“抗体”(ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(h)链和两条轻(l)链，或其抗原结合部分。每条h链包含重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域cl。vh和vl区可以进一步细分为称为互补决定区(cdr)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(fr)的区域。每个vh和vl包含三个cdr和四个fr，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0101]
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：ala(a)、arg(r)、asn(n)、asp(d)、cys(c)、gln(q)、glu(e)、gly(g)、his(h)、i1e(i)、leu(l)、lys(k)、met(m)、phe(f)、pro(p)、ser(s)、thr(t)、trp(w)、tyr(y)、val(v)。
[0102]
γδ t细胞
[0103]
γδ t细胞根据其δ链的使用偏好可分为两个主要亚群，其中vδ2+细胞更倾向于与vγ9链共表达，而vδ2-细胞可与一系列vγ链配对。vγ9vδ2 t亚型细胞是外周血循环中主要的γδ t细胞。vγ9vδ2 t细胞具有天然的抗肿瘤活性和较强的实体瘤微环境浸润能力。
先前的研究表明，γδ t细胞在癌症治疗中发挥着重要作用，γδ t细胞在肿瘤内是各种癌症中最有利的预后指标。vγ9vδ2 t细胞在活化后也可以作为专门的apcs，在增强免疫应答方面发挥重要作用。
[0104]
muc1-tn
[0105]
muc1-tn是一种由于cosmc基因功能缺失所形成的异常o型-糖基化抗原，高度异常表达于乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞表面，但在正常组织中不表达或者低表达，因此,muc1-tn抗原是众多实体肿瘤免疫治疗的理想靶点。有研究表明，以muc1-tn抗原为靶点的5e5 car-αβ t细胞在体外和动物模型体内对t细胞白血病和胰腺癌均具有十分有效的抗肿瘤效果，说明了靶向muc1-tn抗原免疫疗法对于肿瘤疾病的治疗极具可行性。
[0106]
嵌合抗原受体(car)
[0107]
cars的设计经历了以下过程：第一代car只有一个胞内信号组份cd3ζ或者fcγri分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的t细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的t细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代cars在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如cd28、4-1bb、ox40、icos，与一代cars相比功能有很大提高，进一步加强car-t细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代cars基础上串联一些新的免疫共刺激分子如cd27、cd134，发展成为三代和四代cars。
[0108]
本发明的嵌合抗原受体(car)为二代car，包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。在优选的实施方式中，本发明的car包含来源cd28的共刺激信号分子。
[0109]
在car的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在car的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
[0110]
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的car的胞外结构域包括靶向muc1-tn的抗原结合结构域。本发明的car当在t细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。
[0111]
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的fab片段，fab’片段，f(ab’)2片段，或单一fv片段。fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，fv抗体还包含vh和vl结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scfv(single-chain variable fragment)。scfv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scfv包含特异性识别muc1-tn的抗体，较佳地为人源化的单链抗体。
[0112]
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，car可被设计以包括融合至car的胞外结构域
的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与car中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
[0113]
载体
[0114]
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
[0115]
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
[0116]
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
[0117]
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
[0118]
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
[0119]
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0120]
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
[0121]
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
[0122]
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序
列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(ef-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复(ltr)启动子、momulv启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(epstein-barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
[0123]
为了评估car多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段dna上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
[0124]
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在dna已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，ui-tei等，2000febs letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
[0125]
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
[0126]
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如sambrook等(2001,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
[0127]
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
[0128]
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
[0129]
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，
以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
[0130]
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
[0131]
制剂
[0132]
本发明提供了一种含有本发明的car-t细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1
×
10
3-1
×
108个细胞/ml，更优地1
×
10
4-1
×
107个细胞/ml。
[0133]
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
[0134]
治疗性应用
[0135]
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(lv)转导的细胞(例如，t细胞)进行的治疗性应用。转导的t细胞可靶向肿瘤细胞的标志物muc1-tn，协同激活t细胞，引起t细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
[0136]
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的t细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的car-t细胞。
[0137]
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体t细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生car-t细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被t细胞以无mhc限制方式识别。此外，一种car-t就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，car-t细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
[0138]
在一个实施方式中，本发明的car-t细胞可经历稳固的体内t细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，car介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中car-修饰t细胞诱导对car中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗muc1-tn的car-t细胞引起抗muc1-tn阳性的细胞的特异性免疫应答。
[0139]
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗-muc1-tn scfv、fc铰链和icos跨膜区和胞内区、4-1bb胞内区和cd3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
[0140]
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的
肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的car治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
[0141]
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
[0142]
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
[0143]
在优选的实施方式中，可治疗的癌症为muc1-tn阳性肿瘤，如乳腺癌、胃癌、肺癌、胰腺癌、白血病等。
[0144]
本发明的car-修饰t细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
[0145]
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码car的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
[0146]
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的car的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。car-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和car-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
[0147]
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
[0148]
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的car-修饰的t细胞。
[0149]
本发明的car-修饰的t细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如il-2、il-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
[0150]
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
[0151]
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，
待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的t细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。t细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如rosenberg等，neweng.j.of med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
[0152]
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的t细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的t细胞组合物优选通过i.v.注射施用。t细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
[0153]
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将t细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ara-c)或对ms患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对pml患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的t细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和fk506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(xrt)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
[0154]
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1
×
106个至1
×
10
10
个本发明经修饰的t细胞(如，car-t细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
[0155]
本发明的主要优点包括：
[0156]
(a)本发明的car-vγ9vδ2 t细胞在体外对多种肿瘤细胞均具有较强特异性细胞毒性作用，而且其细胞毒性作用要强于car-αβ t细胞。
[0157]
(b)本发明发现，il-2能够增强car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性，改善细胞的持久性。
[0158]
(c)在实验动物中，本发明的car-vγ9vδ2 t细胞无明显的毒副作用。
[0159]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0160]
实施例1 vγ9vδ2 t细胞的体外制备
[0161]
vγ9vδ2 t细胞是外周血中主要的γδ t细胞，占循环t细胞的1％～5％。zol和il-2扩增方法可在体外选择性扩增制备临床级别vγ9vδ2 t细胞。
[0162]
本实施例中，在vγ9vδ2 t细胞活化扩增的第8天，使用鼠抗人cd3抗体和小鼠抗人δ2抗体对活化和扩增后的vγ9vδ2 t细胞进行染色后进行流式细胞仪分析。结果表明，三批不同来源的健康供体的pbmcs制备的vγ9vδ2 t细胞纯度均大于90％(图1)。
[0163]
实施例2 car-αβ t细胞和car-vγ9vδ2 t细胞的制备
[0164]
首先构建了靶向muc1-tn抗原的二代car分子，并通过亚克隆的方法将其插入慢病毒载体中，其结构简图如图2a所示。通过慢病毒转染的方法，成功制备了car-αβ t细胞和car-vγ9vδ2 t细胞。随后，通过鼠抗人fc抗体染色法应用流式细胞仪对car分子在αβ t细胞和vγ9vδ2 t细胞的表达效率进行检测。结果表明，car-αβ t细胞和car-vγ9vδ2 t细胞的阳性率分别为39.43％和42.60％(图2b)。
[0165]
此外，vγ9vδ2 t细胞和car-vγ9vδ2 t细胞体外扩增倍数统计结果表明，二者在体外扩增倍数相似，说明了慢病毒转染对vγ9vδ2 t细胞的增殖能力并无影响。以上结果证明，本实施例成功地建立了car-vγ9vδ2 t细胞的制备方法。
[0166]
实施例3 car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性具有抗原特异性
[0167]
研究表明，cosmc基因突变或表观遗传沉默是muc1-tn抗原形成的主要原因。jurkat t细胞的cosmc基因有一个碱基核苷酸缺失，导致t合成酶伴侣蛋白的框移突变和早期截断，从而导致tn抗原的表达。
[0168]
本实施例中，首先使用muci抗体证实了muc1-tn抗原在jurkat t细胞上的高表达(图3a)。接着，通过能够编码cosmc基因的慢病毒恢复jurkat t细胞cosmc基因功能，流式检测结果表明cosmc基因功能恢复后的jurkat t细胞表面muc1-tn抗原表达缺失(图3a)，将此细胞系命名为cosmc-jurkat t细胞。
[0169]
进一步实验中，在体外研究了vγ9vδ2 t和car-vγ9vδ2 t细胞对jurkat t细胞和cosmc jurkat t细胞的细胞毒性作用。结果表明，car-vγ9vδ2 t细胞对jurkat t细胞具有特异性细胞毒性，而cosmc jurkat细胞则没有特异性细胞毒性(图3b)。
[0170]
细胞毒性实验上清液中细胞因子含量检测结果同时表明，与jurkat t细胞共孵育24小时后，car-vγ9vδ2 t细胞分泌的细胞因子明显高于vγ9vδ2 t细胞。但是，与cosmc-jurkat细胞共孵育后，car-vγ9vδ2 t细胞分泌的细胞因子虽高于vγ9vδ2 t细胞，但差异并不明显，这可能是由于慢病毒转染激活vγ9vδ2 t细胞所致(图3c)。
[0171]
以上实验结果表明，car修饰能够赋予vγ9vδ2 t细胞抗原特异性的细胞毒性作用。
[0172]
实施例4 car-vγ9vδ2 t细胞肿瘤细胞具有比car-αβ t细胞更强的细胞毒性作用
[0173]
为了进一步研究car修饰是否能增强vγ9vδ2 t细胞抗原特异性细胞毒性，选用了muc1-tn抗原阳性率不同的三株乳腺癌细胞进行实验(图4a)。
[0174]
实验结果表明，car-vγ9vδ2 t细胞和car-αβ t细胞对三株乳腺癌细胞的细胞毒性作用均强于相应的vγ9vδ2 t细胞和αβ t。此外，相比于car-αβ t细胞，car-vγ9vδ2 t细胞表现出更强的细胞毒性作用(图4b)。
[0175]
cba法检测细胞毒性实验上清液中细胞因子的结果表明，car-vγ9vδ2 t细胞比v
γ9vδ2 t细胞具有更强的ifn-γ、颗粒酶b、tnf-α(图4c)。这些结果进一步证明car修饰能够显著增强vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性。
[0176]
实施例5 car-vγ9vδ2 t细胞对胃癌细胞具有特异性细胞毒性作用
[0177]
胃癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤，是第三位最常见的肿瘤死亡原因；因此，本实施例进一步研究了了car-vγ9vδ2 t细胞对胃癌细胞的细胞毒性作用。
[0178]
本实验中采用了三种胃癌细胞株：hgc-27，kato iii和sun-1，来研究car-vγ9vδ2 t细胞对胃癌细胞的细胞毒性作用，在这些细胞上muc1-tn抗原的表达如图5a所示。
[0179]
实验结果表明，与vγ9vδ2 t细胞相比，car-vγ9vδ2 t细胞对这三种胃癌细胞具有更强的细胞毒性作用(图5b)。
[0180]
同时，cba法检测细胞毒性试验上清液细胞因子含量的结果显示，与肿瘤细胞共孵育后，car-vγ9vδ2 t细胞的细胞因子分泌能力明显强于vγ9vδ2 t细胞。而且car-vγ9vδ2 t细胞因子分泌和muc1-tn抗原密度之间存在正相关关系(图5c)。
[0181]
实施例6 car-vγ9vδ2 t细胞细胞毒性持久性方面存在缺陷
[0182]
前期研究表明，vγ9vδ2 t细胞与αβ t细胞相比，其持久性较差，因此可能减弱其抗肿瘤作用，进而限制其应用。因此，本实施例中进一步研究了car-vγ9vδ2 t细胞对肿瘤细胞的连续清楚能力，并以car-αβ t细胞为对照。
[0183]
首先，通过慢病毒转染建立了gfp稳定表达的jurkat t细胞，并通过流式细胞术证实了gfp的表达。依据实验设计，效应细胞与gfp-jurkat细胞以1:1的效靶比共孵育，每48h加入一次肿瘤细胞。
[0184]
结果表明，在第4次刺激时，car-vγ9vδ2 t细胞不能清除肿瘤细胞，残留肿瘤细胞约为90％，而car-αβ t细胞仍能有效清除肿瘤细胞(图6a，6b)。
[0185]
结果表明，虽然car-vγ9vδ2 t细胞比car-αβ t细胞具有更强的细胞毒性，但其持久性弱于car-αβ t细胞，car-vγ9vδ2 t细胞功能持久性需进一步改善。
[0186]
实施例6 il-2对增强car-vγ9vδ2 t细胞细胞毒性和改善其功能持久性具有重要作用
[0187]
为了进一步改善car-vγ9vδ2 t细胞的功能持久性，研究了在vγ9vδ2 t细胞体外细胞培养中使用最广泛的il-2对其功能的影响。
[0188]
在上述重复刺激实验的基础上，进一步研究加入il-2后对vγ9vδ2 t细胞和car-vγ9vδ2 t细胞细胞毒性和功能持久性的影响。
[0189]
结果显示，在il-2添加组中，vγ9vδ2 t和car-vγ9vδ2 t细胞均表现出明显增强的细胞毒性和持久的细胞毒性，与未添加il-2组中的对手相比，它们能更有效地消除的gfp-jurkat t细胞(图7a，7b)。
[0190]
上述结果表明，il-2在维持car-vγ9vδ2 t细胞功能和提高其持久性方面具有重要作用，为后续的动物体内细胞毒性实验设计提供了重要的参照依据。
[0191]
实施例7 car-vγ9vδ2 t细胞在nsg小鼠体内能够有效抑制肿瘤生长
[0192]
6～7周龄雌性nsg小鼠皮下注射1
×
106hgc-27细胞，随机分为3组，每组4只。当各组肿瘤平均体积达到100mm3时，分别用瘤内注射pbs、1
×
107vγ9vδ2t和car-vγ9vδ2 t细胞。体内实验设计流程图如图8a所示。
[0193]
实验结果表明，vγ9vδ2 t细胞和car-vγ9vδ2 t细胞均能抑制肿瘤生长，而car-v
γ9vδ2 t具有更强的抗肿瘤作用(图8b和8c)。
[0194]
体重监测结果显示，实验期间各组小鼠的体重保持稳定说明car-vγ9vδ2t细胞治疗对小鼠没有明显毒性和副作用(图8d)。
[0195]
上述结果表明，vγ9vδ2 t细胞在体外活化扩增过程中并没有丧失其固有的抗肿瘤能力，而car修饰能够赋予vγ9vδ2 t细胞在抗原特异性的细胞毒性。
[0196]
讨论
[0197]
car-αβ t细胞免疫治疗作为一种过继性免疫疗法在肿瘤治疗领域独树一帜，取得了令人瞩目的成果，特别是在针对血液肿瘤的治疗方面。但在实体肿瘤治疗方面，其研究进展仍待突破。到目前为止αβ t细胞是car-t免疫治疗领域最主要的和应用最广泛的效应细胞，但是其广泛应用仍然受到众多不利因素的阻碍。由于car分子信号通路一体化的串联设计，使得car-αβ t细胞的激活和功能发挥不再受mhc分子限制。car-αβ t细胞在接受抗原刺激后极易被过度活化，因而容易产生多种毒副作用，例如细胞因子释放综合症(crs)和神经毒性，这些毒副作用严重时可危急患者生命。另外，car-αβ t细胞疗法作为一种个体化的免疫治疗手段，其制备必须使用患者自身来源的αβ t细胞。然而，多数癌症患者的免疫系统可能因反复化疗或疾病进展而严重受损，可导致t细胞数量缺乏或者功能受损，因而增加了制备car-αβ t细胞失败的风险或者导致car-αβ t细胞活性较低。
[0198]
为了解决如上问题，发明人关注到了另一个t细胞亚群，即γδ t细胞。发明人使用zol和il-2选择性地将vγ9vδ2 t细胞从健康供体外周血单个核细胞(pbmc)中扩增临床级别的数量。关于zol扩增的vγ9vδ2 t细胞用于过继性移植，在以往的临床试验中已有报道和应用，这些研究为vγ9vδ2 t细胞的临床应用提供了安全的依据。为了证实了vγ9vδ2 t细胞经car修饰后能够获得抗原特异性细胞毒性的假设，通过慢病毒转染的方法成功制备了靶向muc1-tn抗原的特异性二代car(muc1-tn-cd28-cd3ζ)修饰的vγ9vδ2 t细胞，并对其体外和体内抗肿瘤活性进行了详细研究。
[0199]
在使用抗体染色流式法证实car在vγ9vδ2 t细胞上成功表达后，首先在体外研究了car-vγ9vδ2 t抗原特异性的肿瘤细胞的杀伤作用。已有的研究表明，cosmc基因突变或表观遗传沉默是muc1-tn抗原形成的主要原因，jurkat t细胞就是因cosmc基因一碱基核苷酸缺失导致tn抗原表达。本发明通过能够编码cosmc基因的慢病毒转染jurkat t细胞成功的恢复了cosmc基因功能，并通过流式检测法确定了muc1-tn抗原的表达在cosmc基因恢复后完全消失，并将此细胞命名为cosmc-jurkat t细胞。接下来，以jurkat t细胞和cosmc-jurkat t细胞作为靶细胞，在体外对car-vγ9vδ2 t细胞的特异性细胞毒性进行了验证。实验结果表明，相比于vγ9vδ2 t细胞，car-vγ9vδ2 t细胞对muc1-tn抗原阳性的jurkat t细胞具有显著增强特意性细胞毒性，而对于cosmc基因恢复后的muc1-tn抗原阴性的jurkat t细胞并无特异性的细胞毒性作用。说明，muc1-tn car修饰能使vγ9vδ2 t细胞具有显著增强的抗原特异性细胞毒性。
[0200]
本发明进一步比较了car-vγ9vδ2 t细胞和car-αβ t细胞的细胞毒性和肿瘤细胞连续刺激下的肿瘤细胞杀伤能力。结果表明，相比于car-αβ t细胞，car-vγ9vδ2 t细胞对多种肿瘤细胞均具有较强的细胞毒性作用。然而，在肿瘤细胞的持续清除能力方面，结果显示car-αβ t细胞比car-vγ9vδ2 t胞表现出更强的肿瘤细胞持续清除能力。此外，在肿瘤细胞反复刺激的情况下，car-αβ t细胞连续分泌细胞因子的能力也高于car-vγ9vδ2 t细胞。
这些结果说明，car-vγ9vδ2 t细胞比car-αβ t细胞具有更强的细胞毒性作用，但其细胞毒性的持久性需要进一步的改善。
[0201]
在进一步的研究中，探究了加入il-2对于car-vγ9vδ2 t细胞功能的影响。结果表明，il-2的存在能显著增强car-vγ9vδ2 t细胞的细胞毒性和连续肿瘤细胞清除能力。这一结果为接下来的动物模型体内细胞毒性试验提供了重要的实验依据。在car-vγ9vδ2 t细胞体内抗肿瘤活性实验中，各组小鼠每2天接受20000u的il-2，以维持和增强car-vγ9vδ2 t细胞的功能。体内实验结果表明，与pbs组和vγ9vδ2 t细胞组相比，car-vγ9vδ2 t细胞能更有效抑制肿瘤生长，而vγ9vδ2 t细胞也具有一定的抗肿瘤活性。体内外的实验结果均说明，car修饰能够赋予vγ9vδ2 t细胞特异性的抗肿瘤活性。此外，vγ9vδ2 t细胞也表现出一定的抗肿瘤活性，表明vγ9vδ2 t细胞在体外刺激和扩增过程中其固有的抗肿瘤能力并没有丧失，证明car-vγ9vδ2 t细胞在获得抗原特异性细胞毒性时，仍能保持其固有的抗肿瘤特性。
[0202]
本研究成功地建立了临床分级car-vγ9vδ2 t细胞的制备方法，为临床应用提供了坚实的基础。在体外和体内抗肿瘤实验中，证明muc1-tn car修饰能够赋予vγ9vδ2 t细胞抗原特异性细胞毒性。研究还发现car-vγ9vδ2 t细胞在细胞毒性持久性方面有很大的缺陷，而il-2的存在可以显著改善这种缺陷。polito等人使用il-2、il-15和人工抗原提呈细胞apc能够选择性的扩增出多克隆的γδ t细胞，该多克隆细胞产物中含有一类长寿的γδ t细胞亚类，具有广泛的抗肿瘤活性。该研究结果提示，使用此方法扩增出来的多克隆γδ t细胞构建car-γδ t细胞有望克服单一vγ9vδ2 t细胞细胞毒性持久性弱的缺陷，有望成为一种更具潜力的免疫治疗产品。
[0203]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
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本技术序列表中涉及的各序列如下：
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