一种硝化细菌的常温保藏方法与流程

1.本发明涉及硝化细菌的保藏，具体涉及一种硝化细菌的常温保藏方法。


背景技术：

2.氮素是造成水体污染的重要因素之一，目前多采用生物法去除。生物脱氮是通过硝化反应先将氨氮氧化为硝氮或/和亚硝氮，再通过反硝化反应将硝氮或亚硝氮还原成气态氮从水中除去，主要依靠硝化菌和反硝化菌实现。菌种是重要的生物资源之一，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期在生产中应用。
3.微生物菌种保藏的基本原理主要是根据微生物生理生化特点，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。菌种保藏方法很多，一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。为了有效地保藏微生物菌种，就需要针对菌种的特性和保藏需求开发适宜的保藏方法。
4.目前国内外常用的菌种保藏方法有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、超低温冰箱冷冻法、超低温液氮冷冻法等。其中冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐，且需要使用保护剂，保藏成本较高。
5.cn103103143a公开了一种硝化菌保藏方法，包括（1）将硝化菌体培养至生长稳定期，并收集硝化菌；（2）配制硝化菌保藏营养液；（3）步骤（1）收集的硝化菌与步骤（2）配制的硝化菌保藏营养液混合，含水率为40%～80%，含水率指菌体湿重和培养液体积比；（4）添加保藏剂；（5）冷冻保藏。该法具有方法简单和存活率高等优点，但需添加保藏剂且采用冷冻保藏，保藏成本相对较高。
6.cn106554921a公开了一种硝化细菌的保藏方法，包括（1）在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，所述生长促进剂包括金属盐和多胺类物质，其中金属盐为40-100重量份，多胺类物质为5-30重量份；所述金属盐由钙盐、铜盐、镁盐和/或亚铁盐组成；培养至进入生长稳定期后，收集菌体；（2）配制硝化细菌保藏营养液；（3）将步骤（1）收集的硝化细菌与步骤（2）配制的保藏营养液混合，控制含水率为40%-80%；（4）添加保藏剂；（5）低温冷冻保藏。该法通过在硝化细菌培养过程中投加生长促进剂，可以提高菌体活性和耐低温能力，经低温冷冻藏后能够快速恢复活性。但是也需添加保藏剂且采用冷冻保藏，保藏成本相对较高。
7.cn108117992a公开了一种反硝化菌的常温保藏方法，包括（1）将反硝化菌培养至对数生长期，并收集菌体；（2）配制保藏营养液，主要包括碳源、氮源和微量物质等；（3）步骤（1）反硝化菌与步骤（2）保藏营养液于保藏容器中混合，加入适量保藏助剂，所述保藏助剂包括糖脂、糖醇和有机酸盐；（4）将步骤（3）混合液密封培养4-12h，常温保藏。该方法具有常温保存效果好、存活率高、活性恢复快等优点。但是，该方法也需要添加特定组成的保藏营养液。


技术实现要素：

8.针对现有技术的不足，本发明提供了一种硝化细菌的常温保藏方法。本发明采用藻菌共生方式实现菌体大批量常温保藏，具有常温保藏周期长、保藏活性好、恢复速度快等优点。
9.本发明提供的一种硝化细菌的常温保藏方法，包括如下步骤：（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，收集菌体；（2）将菌体和微藻投加至保藏液中，进行保藏；保藏条件为室温、光暗交替培养，日光照总时间高于8h；（3）保藏结束后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，得到活性稳定的硝化菌。
10.本发明中，步骤（1）硝化细菌培养采用本领域常规培养方法，如sbr法等。硝化细菌的曝气培养条件为：温度15～40℃，ph为7.0～8.5，溶解氧浓度为1-5mg/l。
11.本发明中，步骤（1）硝化菌培养至生长稳定期，通过沉降、过滤、离心等方法收集获得的菌体。
12.本发明中，步骤（1）曝气培养采用的培养液中主要含氨氮和无机盐，其中nh
4+-n浓度为 0.1-1.5g/l，fe
2+
浓度为0.01-0.03g/l，k
+
浓度为0.05-0.5g/l，ca
2+
浓度为0.01-0.05g/l，mg
2+
浓度为0.05-0.25g/l 。
13.本发明中，步骤（2）所述微藻为自养微藻，如可以是绿藻、硅藻、蓝藻等中任意一种，优选绿藻。微藻可以采用培养获得的微藻细胞，具体是将微藻培养至浓度为5-10g/l时，收集藻细胞获得。
14.本发明中，步骤（2）所述菌体按照菌体质量与培养液的质量比为5-20:100投加。
15.本发明中，步骤（2）所述微藻细胞的用量为硝化细菌菌体质量的1%-10%。
16.本发明中，步骤（2）所述保藏液中，每1000ml水中含有氨氮0.3-0.7g、锌盐0-0.04g、钾盐0.06-0.5g、碳酸钠0.6-1.4g、钠盐20-32g、镁盐0.2-0.8g、钙0.8-1.4g、碳酸氢钠0-0.6g、维生素液1-10ml，ph=8-9。该保藏液适合硝化细菌的保藏，并有助于藻类生长代谢。
17.本发明中，步骤（2）所述的室温为5-25℃。所述的光暗交替培养中，日光照总时间高于8h，光照培养可以一次完成，也可以分多次进行，每次光照时间不低于1h。
18.本发明中，步骤（3）保藏时间为0.5-6个月，优选为1-3个月。
19.本发明中，步骤（3）切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，所述培养液与步骤（1）培养液相同。
20.本发明中，步骤（3）曝气培养条件为：温度15～40℃，ph为7.0～8.5，溶解氧浓度为3-5mg/l。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明采用藻菌共生方式能够实现硝化细菌批量常温保藏，具有常温保藏周期长、保藏活性好等优点。
22.（2）本发明保藏结束后，通过切出上层藻液和将下部硝化细菌曝气培养的方式，特别是控制高的溶解氧浓度条件，淘汰微藻，不影响硝化菌的恢复性能。
23.（3）本发明保藏成本低，适合大批量硝化细菌的常温保藏。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明方法和效果进行详细说明，实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
25.以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
26.本发明实施例中，硝化细菌曝气培养采用的培养液中：nh
4+-n浓度为 100mg/l，fe
2+
浓度为0.01g/l，k
+
浓度为0.1g/l，ca
2+
浓度为0.01g/l，mg
2+
浓度为0.05g/l 。
27.本发明实施例保藏液中，每1000ml水中含有氨氮0.5g、锌盐0.02g、钾盐0.06g、碳酸钠0.8g、钠盐22g、镁盐0.3g、钙0.8g、碳酸氢钠0.5、维生素液1ml、ph=8-9。
28.实施例1本实施例采用的微藻为cn109576158a中公开的小球藻（chlorella sp.），保藏编号为cgmcc no.11005。将微藻培养至浓度为5g/l时，过滤收集藻细胞。
29.（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，培养条件为：温度25℃，ph为7.0～7.5，溶解氧浓度为2-3mg/l，培养至生长稳定期停止，过滤收集菌体。
30.（2）将菌体和微藻细胞投加至保藏液中，菌体按照菌体质量与培养液的质量比为5:100投加，微藻细胞的用量为硝化细菌菌体质量的5%，保藏条件为：20℃、光暗交替培养，日光照总时间为12h，光照培养一次完成。
31.（3）保藏3个月后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，所述培养液、培养条件与步骤（1）相同，得到活性稳定的硝化菌。
32.实施例2本实施例采用的微藻为cn106467896a公开的凯氏拟小球藻（parachlorella kessleri）fsh-y3，保藏编号cgmcc no.9238。将微藻培养至浓度为5g/l时，过滤收集藻细胞。
33.（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，培养条件为：温度25℃，ph为7.0～7.5，溶解氧浓度为2-3mg/l，培养至生长稳定期停止，过滤收集菌体。
34.（2）将菌体和微藻细胞投加至保藏液中，菌体按照菌体质量与培养液的质量比为10:100投加，微藻细胞的用量为硝化菌菌体质量的3%，保藏条件为：15℃、光暗交替培养，日光照总时间为8h，光照培养一次完成。
35.（3）保藏3个月后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，所述培养液、培养条件与步骤（1）相同，得到活性稳定的硝化菌。
36.实施例3本实施例采用微藻为cn105713836a公开的纤维藻（ankistrodesmus sp.）ss-b7，保藏编号为cgmcc no.7478。将微藻培养至浓度为6g/l时，过滤收集藻细胞。
37.（1）将硝化细菌曝气培养至生长稳定期，培养条件为：温度15℃，ph为7.0～7.5，溶解氧浓度为2-3mg/l，培养至生长稳定期停止，过滤收集菌体。
38.（2）将菌体和微藻细胞投加至保藏液中，菌体按照菌体质量与培养液的质量比为20:100投加，微藻细胞的用量为硝化菌菌体质量的10%，保藏条件为：25℃、光暗交替培养，日光照总时间为14h，光照培养一次完成。
39.（3）保藏3个月后，切出上层微藻层，剩余物料加入培养液进行曝气培养，所述培养液、培养条件与步骤（1）相同，得到活性稳定的硝化菌。
40.实施例4同实施例1，不同在于：培养过程中，所述光暗交替培养中，光照培养分6次进行，每次光照时间2h。最终得到培养后硝化细菌。
41.比较例1同实施例1，不同在于：保藏过程中，保藏条件始终为光照条件，最终得到培养后硝化细菌。
42.比较例2同实施例1，不同在于：保藏过程中，保藏条件始终为无光照的暗反应条件，最终得到培养后硝化细菌。
43.比较例3同实施例1，不同在于：保藏结束后，未切出上层微藻层。最终得到培养后硝化细菌。
44.测试例将实施例1-4和比较例1-3保藏后获得的硝化细菌用于含氨废水的处理，在100l生物曝气反应池中进行污水处理，氨氮浓度为400mg/l，温度32℃，ph为7.8，溶解氧do为1.0-2.5mg/l。24h后处理效果如表1所示。
45.表1