一种检测Citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒的制作方法

本发明涉及基因检测
技术领域：
，更具体地，涉及一种检测citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒。
背景技术：
：希特林缺乏症(citrindeficiency,cd)是由人体等位基因slc25a13突变，导致肝细胞中一种被称为希特林(citrin)的载体蛋白功能障碍而形成的一种常染色体隐形遗传疾病。该基因位于染色体7q21.3上，由18个外显子和17个内含子组成，编码一种被称为希特林(citrin)的载体蛋白。citrin是主要表达于肝细胞线粒体内膜的一种钙调节蛋白，含有4个ef手模体和6个跨膜结构域，其功能主要是作为线粒体中天冬氨酸/谷氨酸载体，将线粒体内合成的天冬氨酸转运到胞质，同时把胞质中的谷氨酸和质子转运进线粒体内。这一过程与苹果酸穿梭、柠檬酸穿梭、尿素循环、蛋白质合成、糖酵解、糖异生等生化反应相偶联，对于肝细胞正常生理功能的发挥至关重要。cd有3种年龄相关的临床表型，分别为citrin缺陷导致的新生儿肝内胆汁淤积症(neonatalintrahepaticcholestasiscausedbycitrindediciency,niccd)、成人发病瓜氨酸血症ii型(adult-onsetcitrullinemiatypeii,ctln2)以及citrin缺陷导致的生长发育落后和血脂异常(failuretothriveanddyslipidemiacausedbycitrindeficiency,fttdcd)。婴儿肝内胆汁淤积发病率约为1/2500-1/5000，是儿童最常见的肝病类型之一，我国一些地区进行的遗传代谢选择性筛查研究结果表明，niccd阳性率仅次于甲基丙二酸尿症，在中国遗传代谢病高危患者中居第2位。据报道，中国人群中slc24a13基因突变的携带率达到1/63，而南方人群的携带率高达1/48。以长江为界，南方人群的突变携带率明显高于北方人群，其中南方人群中以海南、广东、香港为高发人群。患有citrin缺陷症的新生儿无法代谢母乳中的很多成分，必须停止母乳喂养，否则可能会引起黄疸、肝硬化等重症。而患有成人发病瓜氨酸血症ii型的病人如果不进行及时的治疗将会导致死亡。因此，对citrin缺陷症患者进行早期诊断具有重要的临床意义，通过对niccd患者进行早期的诊断，指导饮食的调整，可有效的防止病情恶化，降低治疗风险和死亡率。另外，有citrin缺陷症的婴儿，会有大量胆汁淤积在肝内，导致婴儿患黄疸并长时间都不能治愈。更为严重的是，大约2％的患儿会因为肝功能不明原因的恶化，需要进行肝脏移植。因此，在citrin遗传缺陷病高发的地区开展新生儿疾病的筛查工作，普及citrin缺陷病知识，对于疾病控制以及优生优育具有重要作用，也是精准医疗发展的要求。niccd的症状具有暂时性和复杂性的特点，因而难以建立明确的临床诊断指标，因此，基因检测是最适合用于citrin缺陷症的诊断方法。对于黄疸、肝大和肝功能异常的患儿，检查slc24a13基因即可明确诊断是否患希特林缺陷症。目前，通过对slc24a13基因进行检测对citrin缺陷症进行诊断的方法有pcr法、限制性片段长度多态性分析法(rflp)和测序法，但这些方法仅适用于实验室研究，且成本较高，难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测，因而，不适用于大规模筛查。因此，有必要建立一种高通量、高效率的基因突变检测方法，以实现临床快速检测或大规模人群筛查。传统基因诊断技术主要采用southern印迹杂交方法，灵敏度高、准确率高，但操作时间长、要求dna量多、需要同位素等原因使其只用于研究，不能进行大规模筛查。而普通pcr电泳技术，其方法与传统的southern分子杂交相比操作简易、快速、准确、经济且易推广，为citrin缺陷症基因诊断提供了较为有效的方法，但特异性较低，易出现假阴性或假阳性。专利cn109182492a和cn103421909a公开了citrin缺陷症基因检测引物及试剂盒、诊断试剂，但只能检测citrin缺陷症基因的部分突变位点，且操作步骤较为复杂，难以大范围应用推广。杂交分析检测技术由于其特异性高而被广为推崇，dna杂交是高密度基因芯片之核心分析方法，能在同一芯片上同时分析千万个不同的基因片段，大大加速了研究的速度。杂交技术和pcr扩增技术结合，具有技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低的特点。杂交法能提升dna分析的特异性，但是大多数杂交方法耗时耗力，无法达到临床快速检测的要求。将灵敏性高的pcr检测技术配合特异性极高的反斑点杂交技术以一种简单、快速且省钱的方式结合起来，利用了导流杂交技术，该技术可大大提高杂交的效率，且操作方便，从而避免了传统杂交方法冗长的操作过程。目前，市场上还未有获证的希特林缺陷症基因检测产品，因此，开展该项目的检测用于人群大规模筛查具有很大的市场潜力。技术实现要素：本发明的目的在于克服上述现有技术中的不足，通过结合杂交分析技术和pcr扩增技术，提供一种可同时检测citrin缺乏症基因slc25a13的8种点突变型(2t>c、550c>t、ivs6+5g>a、955c>t、1048g>a、1078c>t、ivs11+1g>a、1399c>t)，2种缺失型(851_854del4、1092_1095delt)，2种插入型(ivs4ins6kb、ivs16ins3kb)和1种重复型(1638_1660dup)的引物、探针和试剂盒。本发明的第一个目的在于提供一种检测citrin缺乏症slc25a13基因突变的多重pcr引物。本发明的第二个目的在于提供一种检测citrin缺乏症slc25a13基因突变的探针。本发明的第三个目的在于提供一种检测citrin缺乏症slc25a13基因型的基因芯片。本发明的第四个目的在于提供所述引物和/或所述探针在制备检测citrin缺乏症slc25a13基因型的试剂盒中的应用。本发明的第五个目的在于提供所述基因芯片在制备检测citrin缺乏症slc25a13基因型的试剂盒中的应用。本发明的第六个目的在于提供一种检测citrin缺乏症slc25a13基因型的试剂盒。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：本发明提供一种检测citrin缺乏症slc25a13基因突变的多重pcr引物，其核苷酸序列如seqidno.1～16所示。优选地，所述引物的5’端标记有生物素。其中，所述引物对应检测的基因型如下表1所示：表1一种检测citrin缺乏症slc25a13基因突变的探针，其核苷酸序列如seqidno.18～39所示。优选地，所述探针的5’端进行氨基化处理。其中，所述探针对应检测的基因型如下表2所示：表2优选地，所述citrin缺乏症slc25a13基因突变为slc25a13基因点突变型、缺失型、插入型和重复型中的一种或多种。更优选地，所述slc25a13基因点突变型为2t>c、550c>t、ivs6+5g>a、955c>t、1048g>a、1078c>t、ivs11+1g>a、1399c>t，缺失型为851_854del4、1092_1095delt，插入型为ivs4ins6kb、ivs16ins3kb，重复型为1638_1660dup。本发明要求保护以上所述引物和/或所述探针在制备citrin缺乏症slc25a13基因型的检测试剂盒中的应用。本发明还要求保护一种检测citrin缺乏症slc25a13基因型的基因芯片，含有以上所述探针。优选地，所述基因芯片的探针固定在尼龙膜上。以上所述基因芯片在制备检测citrin缺乏症slc25a13基因型的试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围之内。同时，本发明还要求保护一种检测citrin缺乏症slc25a13基因型的试剂盒，含有以上所述引物、所述探针和/或所述基因芯片。优选地，所述试剂盒还含有检测内标基因的探针，其核苷酸序列如seqidno.17所示。更优选地，所述检测内标基因的探针的5’端采用生物素修饰。更优选地，检测内标基因的探针用于监控杂交过程，可以与杂交显色液结合显色。优选地，所述试剂盒还含有多重pcr的反应液。更优选地，所述多重pcr的反应液包括pcrbuffer、q-solution、mgcl2、dntps、taq酶、ddh2o。更优选地，所述多重pcr的反应液各成分的浓度及反应量如下表3所示：表3试剂μl/1人份试剂名称μl/1人份10×pcrbuffer5100μm引物seqidno.80.25×q-solution10100μm引物seqidno.90.1525mmmgcl23100μm引物seqidno.100.1525mmdntps0.8100μm引物seqidno.110.2100μm引物seqidno.10.1100μm引物seqidno.120.2100μm引物seqidno.20.1100μm引物seqidno.130.1100μm引物seqidno.30.15100μm引物seqidno.140.1100μm引物seqidno.40.15100μm引物seqidno.150.1100μm引物seqidno.50.1100μm引物seqidno.160.1100μm引物seqidno.60.1ddh2o23.5100μm引物seqidno.70.2taq酶0.5优选地，所述试剂盒的pcr扩增程序为：95℃热启动15min，95℃变性30s；60℃退火55s；72℃延伸120s，共35个循环；最后一步72℃延伸5min。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明设计了一种能够同时扩增检测citrin缺乏症slc25a13基因的点突变型、缺失型、插入型和重复型的引物和探针，利用设计的引物和探针制备的基因芯片和基因检测试剂盒仅通过一次试验就能同时检测13种citrin缺乏症slc25a13基因类型，包括8种点突变型(2t>c、550c>t、ivs6+5g>a、955c>t、1048g>a、1078c>t、ivs11+1g>a、1399c>t)、2种缺失型(851_854del4、1092_1095delt)、2种插入型(ivs4ins6kb、ivs16ins3kb)和1种重复型(1638_1660dup)。本发明的检测试剂盒采用生物素标记的引物分别对citrin缺乏症基因slc25a13点突变型、缺失型、插入型和重复型突变区域进行特异性扩增，将扩增产物与标记不同突变类型的citrin缺乏症探针的尼龙膜在导流杂交仪上进行导流杂交(flow-throughhybridization)，然后通过化学显色对结果进行判读来进行citrin缺乏症的基因型诊断。本发明的试剂盒在同一个条件下扩增citrin缺乏症基因，能够减少pcr仪的需求量，减少操作步骤，降低了成本。该试剂盒不仅特异性好、灵敏度高，而且检测时间短、成本低、操作方便，对开展citrin缺乏症人群的临床筛查、遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。附图说明图1为slc25a13基因不同突变型的检测结果图；其中：编号1为ivs6+5g>a突变型的检测结果；编号2为955c>t突变型的检测结果；编号3为1048g>a突变型的检测结果；编号4为ivs11+1g>a突变型的检测结果；编号5为1399c>t突变型的检测结果；编号6为851_854del4突变型的检测结果；编号7为ivs4ins6kb突变型的检测结果；编号8为ivs16ins3kb突变型的检测结果；编号9为1638_1660dup突变型的检测结果；编号10为2t>c突变型的检测结果；编号11为550c>t突变型的检测结果；编号12为1078c>t突变型的检测结果；编号13为1092_1095delt突变型的检测结果。图2为slc25a13基因检测试剂盒的准确率和特异性的检测结果图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1citrin缺乏症slc25a13基因的检测试剂盒一、引物和探针的设计1、多重pcr引物的设计和pcr反应体系以及扩增程序的确定(1)引物的设计设计用于扩增待检样品中dna的特异性引物，根据citrin缺乏症slc25a13基因的的8种点突变型(2t>c、550c>t、ivs6+5g>a、955c>t、1048g>a、1078c>t、ivs11+1g>a、1399c>t)、2种缺失型(851_854del4、1092_1095delt)、2种插入型(ivs4ins6kb、ivs16ins3kb)和1种重复型(1638_1660dup)设计16条用于pcr扩增的多重pcr引物；引物的序列为seqidno.1～16，引物的5′端标记有生物素，引物序列具体如表4所示：表4引物序列及对应检测基因型(2)多重pcr反应体系的确定通过大量的实验对比，控制mg2+浓度、引物浓度和pcrbuffer浓度可以做到citrin缺乏症基因基因高效率扩增，特异性好。最终确定最优的pcr反应体系为pcr反应液45μl，dna加样量5μl，总反应体积为50μl，具体如表5所示：表5多重pcr反应体系(3)多重pcr扩增程序的确定经过大量实验对比优化，控制退火温度和退火时间可以做到特异性好，扩增效率高，最终确定的最佳扩增程序为：95℃热启动15min，95℃变性30s；60℃退火55s；72℃延伸120s，共35个循环；最后一步72℃延伸5min。在同一个条件下扩增citrin缺乏症基因，能够减少pcr仪的需求量，减少操作步骤，降低了成本，能够同时检测citrin缺乏症基因的点突变型、缺失型、插入型和重复型。2、探针的设计citrin缺乏症常见于8种点突变型(2t>c、550c>t、ivs6+5g>a、955c>t、1048g>a、1078c>t、ivs11+1g>a、1399c>t)、2种缺失型(851_854del4、1092_1095delt)、2种插入型(ivs4ins6kb、ivs16ins3kb)和1种重复型(1638_1660dup)，共设计检测上述基因突变类型的22条探针，序列如seqidno.18～39所示，其中探针的5’端进行氨基化处理将探针5端，将其固定在芯片基材上，制备基因芯片；并设计1条检测内标基因的探针，序列如seqidno.17所示，探针的5’端采用生物素修饰。探针序列具体如表6所示：表6探针序列及对应检测基因型这些探针有着合理的碱基成分、tm值相近，有利于在同一杂交温度下的同步性，不会因为温度的问题而影响杂交的结果，使检查的准确性大大增加。二、用于检测citrin缺乏症的基因芯片的制备1、基因芯片的尼龙膜处理首先对尼龙膜进行处理，将尼龙膜放入0.1mhcl溶液中浸泡30秒钟，然后把已除去残余溶液的膜放入20％的edac溶液中浸泡15分钟，最后放在洗膜盘中用200ml的纯化水冲洗10秒钟，此步骤重复3次，再放到吸水纸上除去多余的残液。转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时。将已烘干的尼龙膜用kimwipes纸隔开，转入封口薄膜袋中，放进点膜间的冰箱中，贮藏在4℃的温度下，备用。2、探针的点样、排列和固定在直接寡核苷酸dna探针的固定中，先将以上设计的dna探针用探针稀释液(ph8.4的0.5mna2co3和0.5mnahco3的溶液)混合，进行点样。启动dna点样装置，在芯片制作程序的控制下，进行dna探针的打印。通过dna打印针每次取一个dna探针，通过三维定点传递装置将dna探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针清洗、干燥，进行下一轮探针的点样，依次类推，直至所有dna探针传递点样完毕。通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在上述处理好的尼龙膜上，每滴0.4μl。点膜结束后，将膜放置于室温15分钟，进行反应。然后将膜转入0.1mnaoh溶液中浸泡10分钟，停止反应；将洗好的膜转入温度为20℃、湿度为45％的烘干箱内烘干12小时，即制得基因芯片。各探针在基因芯片上的具体分布位置如表7所示，本发明的基因芯片总共24个格子，其中右下角的1个格子为空白，没有探针，其他位点每个格子对应一条探针。表7检测各基因型的探针在基因芯片中的具体分布位置注：上表中ivs6+5g>am、955c>tm、1048g>am、ivs11+1g>am、1399c>tm、851_854del4m、ivs4ins6kbm、ivs16ins3kbm、1638_1660dupm分别以ivs6+5g>an、955c>tn、1048g>an、ivs11+1g>an、1399c>tn、851_854del4n、ivs4ins6kbn、ivs16ins3kbn、1638_1660dupn为正常对照；其中2t>cm、550c>tm、1078c>tm、1092_1095deltm4个基因型因纯合子的概率极低，未设置正常对照的；标记生物素的内标基因探针用于监控杂交过程，不需加入扩增产物，也可以与杂交显色液结合显色。三、citrin缺乏症slc25a13基因检测试剂盒1、组成试剂盒由上述设计合成的多重pcr引物、反应体系和基因芯片组成。2、试剂盒检测方法(1)citrin缺乏症dna样品的pcr扩增利用上述的多重pcr引物对13例临床样本dna进行pcr扩增，得到citrin缺乏症dna样品的扩增产物。(2)基因型杂交检测利用上述制备的基因芯片对步骤(1)获得的citrin缺乏症dna样品的扩增产物进行检测，dna样品的扩增产物通过和基因芯片中尼龙膜上的探针反应，最后根据显色情况进行判断，具体方法如下：将获得的citrin缺乏症dna样品的扩增产物在95℃下变性5～10分钟，迅速转移到冰水混合物中，放置2分钟；然后加入到预先温浴到42℃的0.8ml杂交液(2×ssc/0.1％sds)中，混合后加入到杂交仪的反应孔中，应用于上述制得的基因芯片，42℃杂交30分钟，然后用溶液wb1(0.5×ssc/0.1％sds，42℃温浴)清洗3～4遍。加入0.5ml封阻液(0.25％脱脂奶粉，0.05％硫柳汞)，25℃封闭5分钟。抽干反应孔的溶液后加入0.5ml的酶标液(tbs中溶解的带有链霉亲和素标记的ap酶)，酶标5分钟；用0.8ml溶液a(tbs，0.1％tween20及0.05％叠氮钠)清洗4遍，然后加入0.5ml的显色液(nbt/bcip)，避光显色5分钟。最后用溶液b冲洗3遍，晾干，分析显色情况，判读结果。(3)实验结果分析判读：基因芯片检测的slc25a13基因突变位点有13种，共有探针23条，检测结果可由肉眼判断。样品的slc25a13基因不同突变型的检测结果如图1所示，与表7基因芯片中的具体分布位置相对应；其中：编号1的检测结果为ivs6+5g>a突变型；编号2的检测结果为955c>t突变型；编号3的检测结果为1048g>a突变型；编号4的检测结果为ivs11+1g>a突变型；编号5的检测结果为1399c>t突变型；编号6的检测结果为851_854del4突变型；编号7的检测结果为ivs4ins6kb突变型；编号8的检测结果为ivs16ins3kb突变型；编号9的检测结果为1638_1660dup突变型；编号10的检测结果为2t>c突变型；编号11的检测结果为550c>t突变型；编号12的检测结果为1078c>t突变型；编号13的检测结果为1092_1095delt突变型。说明本发明的基因芯片能应用于检测slc25a13基因的13种突变型。实施例2检测试剂盒的准确性和特异性试验一、实验方法样本设置：以30份已知基因型的临床样本dna作为试剂盒检测准确性、特异性的参考品，dna浓度均在20～40ng/μl。检测方法：使用实施例1的检测试剂盒和检测方法，在博日基因扩增仪上扩增样本dna，然后在凯普医用核酸分子杂交仪hb-2012a上进行杂交，对测试品进行检测，具体操作按照试剂盒使用说明书进行；其检测结果与金标准测序的结果进行对比，判断准确率和特异性。二、实验结果检测结果如图2(从左往右与表8中的样本编号对应)和表8所示，30份已知基因型的样品均与本发明检测试剂盒对样品检测得到的基因型一致，准确性为100％，特异性好。表8试剂盒准确性和特异性检测结果实施例3检测试剂盒的稳定性和灵敏度试验一、实验方法样本设置：以13份杂合子基因型样本dna作为灵敏度参考品，13份基因组(851_854del4杂合子、ivs16ins3kb杂合子、1638_1660dup杂合子、ivs6+5g>a杂合子、1399c>t杂合子、ivs4ins6kb杂合子、ivs11+1g>a杂合子、955c>t杂合子、1048g>a杂合子、2t>c、550c>t、1078c>t、1092_1095delt)dna浓度均设置为10±5ng/μl、80±5ng/μl。检测方法：使用3批实施例1的检测试剂盒(批号：201001、201002、201003)和检测方法在博日基因扩增仪上扩增样本dna，然后在凯普医用核酸分子杂交仪hb-2012a上进行杂交，对待检样品进行检测，每份待检样品测定20次；其检测结果与金标准测序的结果进行对比，判断稳定性和灵敏度。二、实验结果试剂盒稳定性和灵敏度的检测结果见表9，结果显示，13种基因组检测位点(851_854del4杂合子、ivs16ins3kb杂合子、1638_1660dup杂合子、ivs6+5g>a杂合子、1399c>t杂合子、ivs4ins6kb杂合子、ivs11+1g>a杂合子、955c>t杂合子、1048g>a杂合子、2t>c、550c>t、1078c>t、1092_1095delt)的样本浓度为10±5ng/μl和80±5ng/μl时，杂交结果清晰，因此本试剂盒对样本的最低检出量为10±5ng/μl，且3批试剂盒的检测结果均一致，稳定性好。表93批试剂盒稳定性和灵敏度检测结果注：以上“+”表示各阳性结果的深浅程度，“+++”表示深浅正常；“++”表示相对较浅。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。序列表<110>广州凯普医药科技有限公司郑州凯普医学检验所（有限合伙）广东凯普生物科技股份有限公司<120>一种检测citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒<160>39<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tctgcctattctggtggt18<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtggtctacccttgga16<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tggtctaccttggacc16<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ttggacctagaggttct17<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5gaggttgagtcctttggg18<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6gttcttttagtcctttggg19<210>7<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccaaagactcaaagaacct19<210>8<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aagaaagctcggtgc15<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9cctttaagtgatggcct17<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10acttcaggatgagtctat18<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11tattgctattaccttaaccc20<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gcagaatggtacctgga17<210>13<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13caggagctttgggagga17<210>14<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14tttggcaaacaattcacc18<210>15<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15attctgcctaataaaaaacat21<210>16<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16aagaagggctcacaggac18<210>17<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17accctaggatgtggct16<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgggcataaaagtcaggg18<210>19<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19cctgactttcatgccca17<210>20<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20ctgggcatagaagtcag17<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21gcaaatgtaagcaatagat19<210>22<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22attgcttccatttgcttc18<210>23<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23agacaccatggtgcatc17<210>24<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24gatgcaccctggtgtct17<210>25<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25ctcctgaggagaagtctg18<210>26<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26atctgactcgaggagaag18<210>27<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27tcttctccttaggagtcag19<210>28<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28tgactcctgtggagaagt18<210>29<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29actcctgggagaagtct17<210>30<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30tcagacctcctcagga16<210>31<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31ggcagaccttctcct15<210>32<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32ttcaccttgccccacag17<210>33<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33ccctgtagggcaaggtga18<210>34<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34gttcaccttccccacag17<210>35<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35gtggggctaggtgaac16<210>36<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36tggggcaaggtgaacg16<210>37<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37gtgagcgtggatgaa15<210>38<211>14<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38tggtgaggccctgg14<210>39<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39ttggtggtgaggccct16当前第1页12