一种用于检测Fe2+的樟脑基增强型荧光探针及其制备方法和应用

本发明属精细有机合成技术领域，涉及一种用于检测fe²⁺的高选择性高灵敏度快速响应增强型樟脑基荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

铁是人体内最丰富的微量元素，在许多生命活动过程中发挥着重要的作用，如机体氧结合和运输、线粒体呼吸、酶的合成、电子传递和氧化还原等。铁稳态的失调不仅会影响诸如缺铁性贫血、动脉粥样硬化、神经退行性疾病等的发生和发展，而且还会造成细胞铁死亡。虽然细胞内的铁有不同的结合形式和不同的配体，但目前认为能够反映细胞内铁稳态的是胞浆中那部分具有较弱结合力和较高氧化还原活性的不稳定铁池。大量研究表明，尽管细胞中的铁有fe²⁺和fe³⁺两种形式，但不稳定铁池的还原性微环境使其主要以fe²⁺存在。因此，开发一种可靠有效的手段来追踪细胞内不稳定铁池中fe²⁺的水平，对铁依赖性疾病的诊断和早期治疗具有重要的价值和意义。

荧光探针法具有操作简单、灵敏度高和能实时成像等优点，是监测生物体内金属离子浓度和分布的有力工具。但与常见的金属离子如cu²⁺、al³⁺、zn²⁺相比，用于检测fe²⁺的荧光探针数量非常有限。这主要是由于铁易变的氧化还原性质，使得大多数荧光探针对fe²⁺缺乏选择性，尤其是受fe³⁺的干扰。此外，由于fe²⁺的强顺磁性，已报道的大部分荧光探针包括商用检测fe²⁺的试剂大多都是基于猝灭型的荧光响应模式。因此，设计开发一种具有高灵敏度、高选择性、快速响应性、增强型响应模式检测fe²⁺的荧光探针具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测fe²⁺的樟脑基增强型荧光探针，满足使用需求。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种上述樟脑基增强型荧光探针的制备方法。本发明还要解决以技术问题是提供樟脑基增强型荧光探针的应用。

为实现解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

樟脑基增强型荧光探针，为n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺，其结构式为：

所述的用于检测fe²⁺的樟脑基增强型荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

1)樟脑与4-二甲氨基肉桂醛进行羟醛缩合反应，得到3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮。

2)3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮与间氯过氧苯甲酸进行氧化反应，得到n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺。

步骤1)中，樟脑与4-二甲氨基肉桂醛进行羟醛缩合反应，得到3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮，具体的制备方法包括：

(1)将10mmol(1.52g)樟脑、12～20mmol(2.10～3.50g)4-二甲氨基肉桂醛、30ml叔丁醇和20～30mmol(2.24～3.37g)叔丁醇钾依次加入干燥的三口烧瓶中，搅拌回流12h；

(2)反应液经减压蒸馏除去溶剂叔丁醇后，加入30ml乙酸乙酯，再用饱和食盐水洗涤至中性，有机相再经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得到3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮粗产物；

(3)3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮粗产物经无水甲醇重结晶，3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮纯品。

步骤2)中，3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮与间氯过氧苯甲酸进行氧化反应，得到n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺，具体的制备方法包括：

(1)将2mmol(0.62g)3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮和30ml二氯甲烷加入干燥的三口烧瓶中，在0℃下逐滴加入含有3～4mmol(0.52～0.69g)间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷，室温下反应4h；

(2)反应液经减压蒸馏除去二氯甲烷后，得到的n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺粗产物经硅胶柱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺。

所述的n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺在检测fe²⁺中的应用。

所述的n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺在制备荧光探针中的应用。

所述的n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺作为荧光探针在检测fe²⁺中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明利用樟脑为原料，与4-二甲氨基肉桂醛进行取代反应，得到3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮；3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮再与间氯过氧苯甲酸进行氧化反应，得到n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺。该化合物能够特异性地识别fe²⁺，在365nm紫外光下，溶液荧光从无色变为红色，作为检测fe²⁺的增强型荧光探针具有合成简便、原料来源广、灵敏度高、选择性好、响应速度快等优点，具有很好的应用价值。

附图说明

图1是n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺与不同浓度fe²⁺作用的荧光光谱图；

图2是n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺对fe²⁺和其他物质(k⁺、na⁺、mg²⁺、ca²⁺、cu²⁺、zn²⁺、al³⁺、ni⁺、cs²⁺、sn²⁺、cr³⁺、cd²⁺、mn²⁺、la³⁺、co²⁺、hg²⁺、ag⁺、pb²⁺、ce⁴⁺、fe³⁺、so4^2-、no3^-、clo^-、h2o2、cys、gsh、atp、adp)的荧光光谱图；

图3是n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺与fe²⁺作用前后随时间变化的荧光光谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺的合成，反应式如下：

具体步骤如下：

1)3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮的制备：

将10mmol樟脑、12mmol4-二甲氨基肉桂醛、30ml叔丁醇和20mmol叔丁醇钾依次加入干燥的三口烧瓶中，搅拌回流12h。反应液经减压蒸馏除去溶剂叔丁醇后，加入乙酸乙酯，再用饱和食盐水洗涤至中性，有机相再经无水硫酸钠干燥、过滤、浓缩后得到3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮粗产物，经无水甲醇重结晶，得到橙红色粉末状的3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮纯品，得率为83％，纯度为98％；¹hnmr(600mhz，cdcl3)δ：7.37(d，j＝6hz，2h)，6.95(d，j＝12hz，1h)，6.82(d，j＝18hz，1h)，6.68-6.73(m，3h)，3.00(s，6h)，2.92(d，j＝6hz，1h)，2.04-2.09(m，1h)，1.68-1.72(m，1h)，1.39-1.46(m，2h)，0.99(s，3h)，0.99(s，3h)，0.83(s，3h)；¹³cnmr(150mhz，cdcl3)δ：207.99，147.05，140.81，140.54，131.49，130.84，128.39，128.32，119.95，112.31，57.94，48.21，46.68，40.41，30.63，30.60，26.66，20.65，9.36；hrms(esi⁺)：m/zcalculatedforc21h28no[m+h]⁺310.2171，found310.2172。

2)n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺的制备：

将2mmol3-(3-(4-(二甲氨基)苯基)烯丙叉基)-1，7，7-三甲基双环[2.1.1]庚-2-酮和30ml二氯甲烷加入干燥的三口烧瓶中，在0℃下逐滴加入含有3mmol间氯过氧苯甲酸的二氯甲烷，室温下反应4h。反应液经减压蒸馏除去二氯甲烷后，得n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺粗产物。经硅胶柱分离(二氯甲烷/甲醇＝10/1)，得到红棕色粘稠状的n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺纯品，得率88％，纯度为98％；¹hnmr(600mhz，cdcl3)δ：7.78(d，j＝6hz，2h)，7.50(d，j＝6hz，2h)，6.79-6.91(m，3h)，3.54(s，6h)，2.92(d，j＝6hz，1h)，2.01-2.07(m，1h)，1.64-1.70(m，1h)，1.31-1.41(m，2h)，0.95(s，3h)，0.95(s，3h)，0.77(s，3h)；¹³cnmr(150mhz，cdcl3)δ：207.83，153.69，144.48，139.41，137.54，137.39，133.07，130.40，127.51，126.19，120.35，62.98，57.93，50.01，48.25，46.49，30.33，26.56，20.65，18.36，9.22；hrms(esi⁺)：m/zcalculatedforc21h28no2[m+h]⁺326.2120，found326.2110。

实施例2

将n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺溶于pbs/etoh(v/v＝8/2)缓冲液中配制成1×10^-5m浓度的探针溶液，将fe²⁺溶于pbs/etoh(v/v＝8/2)缓冲液中配成浓度为0、1×10^-6、2×10^-6、3×10^-6、4×10^-6、5×10^-6、6×10^-6、7×10^-6、8×10^-6、9×10^-6、10×10^-6、11×10^-6、12×10^-6、13×10^-6、14×10^-6、15×10^-6、16×10^-6、17×10^-6、18×10^-6、19×10^-6、20×10^-6m的溶液。采用标准滴定法在荧光分光光度计下测得不同浓度的fe²⁺对n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺的荧光发射光谱，如图1所示。结果表明，在0-20μm浓度范围内，随着体系中fe²⁺浓度的不断增加，溶液从无色变为红色荧光，由此说明，该探针可以灵敏地、定量地检测fe²⁺。

实施例3

将n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺溶于pbs/etoh(v/v＝8/2)缓冲液中配制成1×10^-5m浓度的探针溶液，将不同金属离子、阴离子及生物相关性物质溶解于pbs/etoh(v/v＝8/2)缓冲液中配制成100×10^-6m浓度的溶液，fe²⁺配制成20×10^-6m浓度的溶液。采用标准滴定法在荧光分光光度计下测得不同金属离子和生物相关性物种对n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺的荧光发射光谱，如图2所示。结果表明，探针溶液中加入fe²⁺后红色荧光增强，而加入k⁺、na⁺、mg²⁺、ca²⁺、cu²⁺、zn²⁺、al³⁺、ni⁺、cs²⁺、sn²⁺、cr³⁺、cd²⁺、mn²⁺、la³⁺、co²⁺、hg²⁺、ag⁺、pb²⁺、ce⁴⁺、fe³⁺等金属离子，so4^2-、no3^-、clo^-等阴离子，以及h2o2、cys、gsh、atp、adp等物质时，溶液的荧光光谱没有发生明显的变化。由此说明，该探针可专一性地识别fe²⁺。

实施例4

将n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺溶于pbs/etoh(v/v＝8/2)缓冲液中配制成1×10^-5m浓度的探针溶液，然后加入浓度为20×10^-6m的fe²⁺。采用荧光光谱滴定法在荧光分光光度计上测得n，n-二甲基-4-(3-(4，7，7-三甲基-3-氧双环[2.2.1]庚-2-烯基)丙-1-烯-1-基)氧化苯胺与fe²⁺在0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400s作用的荧光发射光谱，如图3所示。结果表明，当fe²⁺加入探针溶液后，随着反应时间的增加，该探针的荧光强度在40s内迅速升高并达到稳定。由此说明，该探针可快速地对fe²⁺作出响应。