一种结合LED阵列的活细胞长时间孵育系统的制作方法

本实用新型涉及光遗传学、电路电子、显微成像、光学等技术领域，特别是涉及一种结合led阵列的活细胞长时间孵育系统。

背景技术：

光遗传学作为一门新兴学科，整合了光学、生物学等相关知识与基因工程、软件工程等相关技术，可通过调控光照的方式来操纵生物体的各项生命活动，具有无损伤、非侵入、操作简便、调控精准、分辨率高、可重复性高等一系列优点。

显微成像技术在生物科学领域的应用由来已久，研究者通过荧光蛋白或染料标记细胞内参与生命活动的结构(如线粒体、囊泡等)，再通过显微成像技术拍摄并观察被标记的结构在细胞内的位置，以此来研究细胞的生命过程。通过对活细胞连续拍摄多张显微图片，合成视频并追踪被标记结构的运动轨迹，可以更加清晰的了解细胞生命活动的进行方式。然而细胞的许多生命过程往往需要几个小时，甚至几天的时间才能够完整的展现出来。为了长时间连续观察活细胞的生命活动，为细胞提供稳定的培养环境是必要的。

活细胞工作站能够实现活细胞在体外模拟体内环境的条件下进行显微成像，通过活细胞长时间孵育系统保持细胞培养状态的稳定。但是活细胞成像面临的一个主要挑战是如何在实验过程中保持细胞的活性，并使细胞的机能尽可能接近于自然状态。

此外，传统的活细胞工作站中的活细胞长时间孵育系统缺少刺激光源，无法开展光遗传学细胞成像的研究，且外加光源常常会干扰成像光路，影响成像效果。而光遗传学技术是可被用来操控细胞的生命活动的重要技术，为了更加精确的研究细胞生命活动的各个细节，亟需一种能够实现光遗传学细胞研究的活细胞长时间孵育系统，且还需保证不影响活细胞工作站的成像光路，这是在光遗传学成像领域面临的极大挑战。

技术实现要素：

为了解决上述问题，弥补长时间光遗传学成像实验装置的不足，本实用新型提出了一种结合led阵列的活细胞长时间孵育系统。本实用新型提出的活细胞长时间孵育系统由气体供应系统、温度控制系统、封闭培养舱室、led阵列、镜面投射系统以及led阵列控制器构成。此led阵列由发射波长为488nm(蓝光)、561nm(绿光)、640nm(红光)的led灯珠交替排布构成，可根据需要实时更改led阵列的发光波长。led阵列的发光模式由控制器进行更改，控制器上实时显示当前led阵列的工作状态。由led阵列发出的光经凹面镜反射后水平照射到位于密闭培养舱室中央的培养皿中，不会影响活细胞工作站的成像光路。完全适用于活细胞工作站中，为长时间的光遗传学活细胞成像提供便携、稳定的培养环境。

为了实现上述目的，本实用新型采用的技术方案如下：

一种结合led阵列的活细胞长时间孵育系统，包括气体供应系统、温度控制系统、密闭培养舱室、led阵列、镜面投射系统以及光照控制器；

所述密闭培养舱室的外壁上设有用于透光成像的透明窗口，密闭培养舱室的内部中心位置设有载物台；气体供应系统和温度控制系统分别控制密闭培养舱室内的气体环境和温度；

所述led阵列由多种不同波长的led灯珠循环交替排列构成，以圆周形式均匀环绕在密闭培养舱室的内壁上，位于载物台的外围；

所述镜面投射系统环绕在led阵列中远离载物台的一侧，从led阵列发射的光经过镜面投射系统反射后，分别以水平方向的平行光投射至密闭培养舱室中的载物台上；

所述光照控制器包括显示面板、调节面板和无线通讯模块，所述无线通讯模块与led阵列无线连接；通过调节面板设置led参数，由无线通讯模块将参数传递至led阵列，由显示面板实时显示led阵列的工作状态。

作为本实用新型的优选，所述温度控制系统由温度传感器、温度控制器和水浴系统组成，所述温度传感器实时测量密闭舱室内的温度，当测量温度低于预设温度下限时，启动水浴系统进行加热；当测量温度高于预设温度上限时，启动水浴系统进行散热。

作为本实用新型的优选，所述的水浴系统安装在密闭培养舱室的外壁上，采用循环水冷方式进行降温，采用循环水热方式进行升温。

作为本实用新型的优选，所述的led阵列由三种不同波长的led灯珠循环交替排列构成，分别为波长488nm的蓝色led灯珠、波长561nm的绿色led灯珠、波长640nm的红色led灯珠。

作为本实用新型的优选，所述led阵列中每一种波长的led灯珠可单独控制。

作为本实用新型的优选，所述的密闭培养舱室为双层设计，其中内层和外层之间为水浴层，水浴层上设有进水口和出水口。

作为本实用新型的优选，所述的镜面投射系统由一系列凹面镜构成，凹面镜的数量与led阵列中的led灯珠数量相同，且每一个led灯珠位于与其相对应的凹面镜的焦点位置。

作为本实用新型的优选，每一个led灯珠面向密闭培养舱室中心的半圆面设有遮光层。

作为本实用新型的优选，所述的led参数包括点亮状态、点亮时长、照射强度和照射频率。

与现有技术相比，本实用新型的优势在于：

1)为了使传统的活细胞工作站能够满足光遗传学活细胞长时间成像功能，本实用新型提供了一种结合led阵列的活细胞长时间孵育系统，包括为细胞提供稳定培养条件的气体供应系统、温度控制系统、密闭培养舱室，以及用于辅助光遗传学实验的led阵列。led阵列的发光模式能够由控制器进行更改，系统稳定，满足长时间成像实验的需求；

2)采用led阵列作为光源，led阵列采用多种不同波长的led灯珠循环交替排列构成，以圆周形式均匀环绕在密闭培养舱室的内壁上，可根据需要实时更改led阵列的发光波长；由于led灯珠为点光源，直接使用led灯珠发出的光照射样品会影响成像系统的光路，而在成像时关闭光源的操作控制系统复杂且会影响活细胞的生命活动，本实用新型采用了一系列凹面镜环绕在led阵列的外围，保证每一个led灯珠位于对应凹面镜的焦点上，实现原本发散的点光源转变为平行光照向舱室中心的样品上，同时将led阵列上的所有led灯珠面向舱室中心的一侧进行了遮光处理，完全消除了该侧光线对成像的影响。

3)本实用新型采用光遗传学技术来操控细胞的生命活动，利用结合led阵列的活细胞长时间孵育系统的活细胞工作站追踪细胞的生命活动过程，二者结合能够更加精确的研究生命活动的各个细节，满足不同实验条件的需求，并且实现了完全自动化获取光遗传学活细胞的生命活动轨迹，操作简便。

附图说明

图1是本实施例中的活细胞长时间孵育系统横截面示意图；

图2是本实施例中的led阵列、镜面投射系统以及载物台之间的安装位置关系示意图；

附图标记：气体供应系统1；温度传感器201、温度控制器202和水浴系统203；密闭培养舱室3、透明窗口301、载物台302；led阵列4、led灯珠401、遮光层402；镜面投射系统5、凹面镜501；光照控制器6、无线通讯模块601。

具体实施方式

下面结合附图对本实用新型进行进一步的说明。

本实用新型提供了一种结合led阵列的活细胞长时间孵育系统，如图1所示，包括：气体供应系统1、温度控制系统、密闭培养舱室3、led阵列4、镜面投射系统5以及光照控制器6。所述密闭培养舱室1的外壁上设有用于透光成像的透明窗口301；气体供应系统1和温度控制系统分别控制密闭培养舱室3内的气体环境和温度；

所述led阵列4由多种不同波长的led灯珠401循环交替排列构成，以圆周形式均匀环绕在密闭培养舱室的内壁上，位于载物台302的外围；

所述镜面投射系统5环绕在led阵列4中远离载物台的一侧，从led阵列发射的光经过镜面投射系统反射后，分别以水平方向的平行光投射至密闭培养舱室中的载物台上；

所述光照控制器6包括显示面板、调节面板和无线通讯模块601，所述无线通讯模块601与led阵列4无线连接；通过调节面板设置led参数，由无线通讯模块601将参数传递至led阵列4，由显示面板实时显示led阵列的工作状态。

在本实用新型的一项具体实施中，气体供应系统为密闭舱室提供二氧化碳，使密闭舱室内的二氧化碳浓度维持在最适合细胞生长的浓度(通常为5％且可调)。气体浓度调节过程为：将传感器测得的舱室内气体浓度与设定浓度比较，通过输入特定气体的方式将舱室内气体浓度保持在设定值附近，保证细胞处于最佳生长状态。

所述温度控制系统由温度传感器201、温度控制器202和水浴系统203组成。由于本孵育系统中存在用于进行光遗传学实验的led阵列以及led控制系统，虽然led属于冷光源，但是电路工作时的损耗会不可避免的转化成热量。这就导致了长时间工作时，即使不加热，舱室内温度仍有可能超过设定值从而导致细胞的培养环境偏离最佳状态，导致舱室内温度过高影响细胞活性。因此在温度控制系统中采取降温措施是必要的。具体的，所述温度传感器实时测量密闭舱室内的温度，当测量温度低于预设温度下限时(通常为37℃)，启动水浴系统进行加热；当测量温度高于预设温度上限时，启动水浴系统进行散热。

在本实用新型的一项具体实施中，本实用新型采取水冷降温方式，当温度传感器检测到舱室内温度高于设定值超过阈值时，水冷系统开始工作，处于室温的降温水被输送到舱室外层的水浴层中，当水浴层中的水温升高后，新的处于室温的降温水又被输送到水浴层中，如此循环实现降低舱室内温度的目的。而当舱室内温度过低时，通过加热水浴层的降温水就变成了加热水，通过水浴的方式提高舱室内的温度。

本实用新型的密闭舱室为细胞培养提供一个封闭的稳态环境，舱室内部的气体浓度与温度由所述的气体供应系统1和温度控制系统稳定在最适宜细胞生长的状态(可根据具体实验需求进行设定)。舱室由外向内分别为水浴层、镜面投射系统与led阵列。水浴层位于整个舱室最外侧，用于保持舱室内温度稳定在最适合细胞生长的温度。led阵列作为长时间光遗传学实验的光源，镜面投射系统将led阵列发出的光以平行光照向舱室中心。实验中待观察的样品放置于舱室中心，在适宜细胞培养的环境下进行长时间的活细胞成像。整个舱室体积较小，可直接置于活细胞工作站的显微镜载物台上，底部与顶部的中央部分为透明材料便于成像。顶部的盖子可以通过滑动打开以方便样品的处理。

所述led阵列位于舱室内侧，以圆周形式排成一排环绕在舱室的侧壁上。led阵列作为光遗传学实验的光源，为了尽量以一套装置应对尽可能多的实验情况，led阵列由三种不同波长的led灯珠构成，分别为488nm(蓝色)、561nm(绿色)、640nm(红色)，尽可能的满足各种不同光控元件对激发光波长的要求。三种波长的led灯珠在舱壁上以“…-蓝-绿-红-蓝-绿-红-…”的方式循环排列，单独看任意一种颜色的led灯珠都是以圆周形式排成一排均匀环绕在舱室的侧壁。

所述镜面投射系统5位于舱室内壁，led阵列的外围。其功能是通过凹面镜的反射原理，将led发出的点光源以水平方向的平行光照向位于舱室中央的样品。

所述镜面投射系统作为led阵列的辅助系统，其作用是将led灯珠发射的光经光路转换后水平照射到位于舱室中心的样品上。如图2所示，led灯珠可被看作为点光源，直接使用led灯珠发出的光照射样品可能会影响成像系统的光路，而在成像时关闭光源的操作控制系统较为复杂且会影响活细胞的生命活动，因此通过凹面镜的反射原理，将原本发散的点光源转变为平行光照向舱室中心。led阵列上的所有led灯珠401面向舱室中心的半圆面设置遮光层402，例如可以喷涂不透光的黑漆，消除这一侧的光对成像的影响。而在每个led灯珠后方的对应位置，放有一面凹面镜501，led灯珠恰好位于凹面镜的焦点上，这样一来这一侧的光线经凹面镜反射后将变为水平方向的平行光照射位于舱室中心的样品。

所述光照控制器6包括显示面板、调节面板和无线通讯模块601，所述无线通讯模块601与led阵列4无线连接；通过调节面板设置led参数，由无线通讯模块601将参数传递至led阵列4，由显示面板实时显示led阵列的工作状态。

具体的，显示面板实时显示当前的led光照参数(每种颜色的led是否点亮、点亮时长、照射强度、照射频率等)，调节面板提供调节选项可供操作者使用，调节led阵列上每种颜色灯珠的光照方式，以应对不同光遗传学实验条件下对光源的要求。无线通讯模块601将确定后的调节面板上的光照参数传递给led阵列并以此控制led阵列工作。

使用本系统进行光遗传学活细胞成像的典型实验流程如下：

通过转染使细胞表达特定的光敏蛋白，并将转染完成的细胞种在成像用的打孔培养皿中。待细胞贴壁且表达相应光敏蛋白后，通过活细胞染色等方法标记想要观察的胞内结构(也可以在转染步骤就使细胞表达相应的荧光蛋白)。设定长时间活细胞孵育系统的工作参数(通常为5％二氧化碳，37℃)后将打孔培养皿放入舱室内并将其放置在显微镜的载物台上。最后设定显微镜的成像参数后，活细胞工作站便可自动记录样品在实验过程中的生命活动轨迹供实验者研究。

在操作过程中，气体供应系统、温度控制系统、密闭培养舱室为活细胞提供稳定培养条件，led阵列为光遗传技术的实施提供光源，通过调节面板设置活细胞适宜生存的气体环境参数、温度参数和led参数；

气体供应系统根据气体环境参数，向密闭培养舱室内通入预设浓度的气体；

温度控制系统根据温度参数，控制密闭培养舱室内的温度处于预设区间；

无线通讯模块601通过led参数，调整需要点亮的led灯珠、点亮时长、照射强度和照射频率，并将led阵列的工作状态实时反馈至显示面板进行可视化显示。

在实时记录活细胞的生命活动轨迹过程中，每一个点亮的led灯珠中远离密闭培养舱室中心的半圆面射出的发散光线经镜面投射系统反射后形成平行光照向待观察细胞，保证了活细胞生命活动的正常进行。

综上，本实用新型采用光遗传学技术来操控细胞的生命活动，利用结合led阵列的活细胞长时间孵育系统的活细胞工作站追踪细胞的生命活动过程，将二者结合能够更加精确的研究生命活动的各个细节。

以上列举的仅是本实用新型的具体实施例。显然，本实用新型不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本实用新型公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本实用新型的保护范围。