一种感觉神经元细胞的无血清诱导方法与流程

文档序号:23232675发布日期:2020-12-08 15:22阅读:来源:国知局

技术特征:

1.ly2157299、repsox、sb5253334或tew7179在诱导多能干细胞分化为感觉神经前体细胞及感觉神经元细胞中的应用。

2.权利要求1所述的应用,其中ly2157299、repsox、sb5253334或tew7179的用量为55nm-25um,优选为100nm、300nm、500nm、700nm、900nm、1um、2.5um、5um、7.5um、10um、12.5um、15um、17.5um、20um或22um。

3.人-nt3或chir98014在培养感觉神经元中的应用。

4.权利要求3所述的应用,其中人-nt3的用量为0.1-49ng/ml,或者chir98014的用量为0.5nm-3um。

5.感觉神经元细胞诱导培养基,其特征在于:由50%(v/v)dmem培养基和50%(v/v)神经基础培养基形成基础培养基,然后添加0.5%-2%(v/v)n2添加剂(优选0.7%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%(v/v)),0.2%-3.1%(v/v)gs21添加剂或b27添加剂(优选0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%、2.6%、2.8%、3.0%(v/v)),0.1-15mmhepes缓冲液(优选1、5、10mm),5-22mm甘氨酸-谷氨酰胺一水合物(优选10、15、20mm),12-180nmldn-193189或ldn-1931892hcl(优选20、50、70、80、90、100、110、120、150、170nm),和55nm-25umly2157299、repsox、sb5253334或tew7179(优选100nm、300nm、500nm、700nm、900nm、1um、2.5um、5um、7.5um、10um、12.5um、15um、20um或22um)。

6.权利要求5所述的感觉神经元细胞诱导培养基,其特征在于:由50%(v/v)dmem培养基和50%(v/v)神经基础培养基形成基础培养基,然后添加1%(v/v)n2添加剂,2%(v/v)gs21添加剂或b27添加剂,0.5mmhepes缓冲液,20mm甘氨酸-谷氨酰胺一水合物,100nmldn-193189或ldn-1931892hcl,和选自5um、7.5um或12.5umly2157299、repsox、sb5253334或tew7179。

7.权利要求5或6所述的感觉神经元细胞诱导培养基,其中所述诱导培养基的组成如下:由50%(v/v)dmem培养基和50%(v/v)神经基础培养基形成基础培养基,然后添加1%(v/v)n2添加剂,2%(v/v)gs21添加剂或b27添加剂,0.5mmhepes缓冲液,20mm甘氨酸-谷氨酰胺一水合物,100nmldn-193189或ldn-1931892hcl,和选自5um、7.5um或12.5umly2157299,优选地,所述感觉神经元细胞诱导培养基还添加血清替代物(例如血清白蛋白,转铁蛋白,脂肪酸),更优选地,所述血清替代物为纯化形式。

8.感觉神经元细胞培养基,其特征在于:以权利要求5-7任一项所述的诱导培养基为基础,添加3-10umsu5402(优选5um、6um、7um、8um、9um),3-10umdapt(4um、5um、6um、7um、8um、9um),1-3umchir99021(优选1.3um、1.5um、1.7um、1.9um、2.0um、2.2um、2.5um、2.7um)或0.5nm-3um的chir98014(优选5nm、50nm、100nm、200nm、300mm、500mm、700mm、900mm、1um、1.4um、1.8um、2.0um、2.5um、2.7um),和0.1-49ng/mlhuman-nt3(优选1、5、10、15、20、25、30、35、40、45ng/m1),优选地,所述感觉神经元细胞培养基还添加血清替代物(例如血清白蛋白,转铁蛋白,脂肪酸),更优选地,所述血清替代物为纯化形式。

9.诱导多能干细胞分化为感觉神经元细胞的方法,其特征在于,将多能干细胞在权利要求5-7任一项所述的诱导培养基中培养,获得感觉神经前体细胞,然后将感觉神经前体细胞在权利要求8所述的感觉神经元培养基中培养,获得感觉神经元细胞,优选地,所述培养是在有基底膜的情况下进行的,更优选地,所述基底膜为基底胶(matrigel)(stemcelltechnologies),层粘蛋白(laminin)和玻连蛋白的一种或多种的组合。

10.感觉神经前体细胞,其特征在于利用权利要求5-7任一项的诱导培养基培养多能干细胞制备。

11.感觉神经元细胞,其特征在于利用权利要求8的感觉神经元培养基培养权利要求10的感觉神经前体细胞制备。

12.诱导感觉神经元细胞的方法,其特征在于,使用权利要求5-7任一项所述的诱导培养基培养多能干细胞以获得感觉神经前体细胞,然后用权利要求8所述的感觉神经元培养基来培养感觉神经前体细胞。

13.权利要求9或12所述的方法,其中所述多能干细胞是通过使用重编程培养基培养成体细胞制备,优选地,其中所述重编程培养基由dmem-f12基础培养基和添加成分组成,所述添加成分包括60μg/ml-180μg/ml的l-抗坏血酸、5.3μmol/l-74μmol/l的氢化可的松、3ng/ml-89ng/ml的亚硒酸钠、8μmol/l-23μmol/l的optiferrin、0.5μmol/l-7.4μmol/l的视黄醇乙酸酯、40ng/ml-60ng/ml的植物源重组人碱性生长因子、8μg/ml-12μg/ml的igf、0.2μmol/l-0.6μg/ml的a-83、2μmol/l-6μmol/l的chir99021以及100μmol/l-450μmol/l的丁酸钠。

14.权利要求13所述的方法,其特征在于,所述添加成分包括70μg/ml-90μg/ml的l-抗坏血酸、40μmol/l-60μmol/l的氢化可的松、10ng/ml-30ng/ml的亚硒酸钠、8μmol/l-12μmol/l的optiferrin、3μmol/l-6μmol/l的视黄醇乙酸酯、45ng/ml-55ng/ml的植物源重组人碱性生长因子、8μg/ml-12μg/ml的igf、0.3μmol/l-0.5μg/ml的a-83、3μmol/l-5μmol/l的chir99021以及280μmol/l-410μmol/l的丁酸钠。

15.权利要求13所述的方法,其特征在于,所述添加成分包括80μg/ml的l-抗坏血酸、50μmol/l的氢化可的松、20ng/ml的亚硒酸钠、10μmol/l的optiferrin、4μmol/l的视黄醇乙酸酯、50ng/ml的植物源重组人碱性生长因子、10μg/ml的igf、0.4μg/ml的a-83、4μmol/l的chir99021以及400μmol/l的丁酸钠。

16.权利要求12-15任一项所述的方法,其中所述培养是在有基底膜的情况下进行的,优选地,所述基底膜为基底胶(matrigel)(stemcelltechnologies),层粘蛋白(laminin)和玻连蛋白的一种或多种的组合。

17.权利要求13-16任一项所述的方法,其中所述成体细胞为人间充质细胞,人cd34+细胞或人成纤维细胞(例如皮肤成纤维细胞,肺成纤维细胞,膀胱成纤维细胞,包皮成纤维细胞,子宫成纤维细胞)。

18.权利要求11所述的感觉神经元在筛选治疗或缓解疼痛的药物或制备用于筛选治疗或缓解疼痛的药物的模型中的应用。


技术总结
本发明提供一种新的人源型感觉神经元诱导培养体系,通过将小分子抑制剂LY2157299和生长因子的组合添加至无血清基础培养基中,与含有血清的诱导方法相比,不仅大大提高了多能干细胞转变为感觉神经元的效率,而且显著提高了多种离子通道蛋白的表达,从而实现了将多种不同来源的诱导多能干细胞成功诱导为感觉神经元。

技术研发人员:魏君;蔡萌
受保护的技术使用者:武汉睿健医药科技有限公司
技术研发日:2020.05.19
技术公布日:2020.12.08
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