子宫内膜的miRNA容受性分析的制作方法

子宫内膜的mirna容受性分析
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2019年7月2日提交的美国临时专利申请第62/869,574号的权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
3.本公开是有关于一种测定女性的子宫内膜容受性的方法，所述方法使用(a)包括多个mirna，例如167个mirna的表达水平的微小核糖核酸(mirna)表达谱；和(b)计算机算法，所述计算机算法基于mirna表达谱对女性的子宫内膜状态进行分类。本公开的另一方面是有关于适合执行所述方法的试剂盒，以及使用试剂盒于诊断和治疗目的。在一些实施例中，所述方法和/或试剂盒用于分类女性对体外受精(in vitro fertilization；ivf)疗程的反应性。


背景技术：

4.辅助生殖技术(包含ivf)为具解决无法成功生殖的潜力方法。ivf能否成功的主要因素之一为子宫内膜的容受期状态。子宫内膜接受胚胎着床的时期仅开放相对短的时间，所述时期称为着床窗口期(window of implantation；woi)。着床窗口期通常出现在大约月经周期的第19天到第21天。长期以来，着床窗口期大部分依赖日历方法计算可能的受孕时间，但此方法往往不可靠，因此需要直接透过检查子宫内膜本身以监测子宫内膜当下的状态，以更可靠的方式预测胚胎植入的机会点。
5.人类子宫内膜为通过蛋白质和mirna两者周期性地调节的组织。人类基因组包括超过2500个mirna，其中一些已被证实在生殖周期中具有调控作用。举例来说，最近的文献指出某些mirna可以调控与着床窗口期发展过程有关的基因。
6.传统上，组织学和影像方法可用于评估子宫内膜的状态。然而，上述方法极为耗时，且通常无法清楚地区分子宫内膜的容受期状态与非容受期状态。市场上也陆续研发出利用特定基因表达水平检测的方法，早期研究多集中于特定的生物标记基因。艾捷隆(igenomix)开发出“子宫内膜容受性分析”(endometrial receptivity analysis；era)检测，其利用微阵列芯片分析与子宫内膜容受性有关的特定238个基因表达量。然而，基于微阵列芯片技术平台的era检测具有某些缺点。举例来说，众所周知以微阵列芯片分析基因表达量需要较多的组织样本。另外，相较于实时定量聚合酶连锁反应(quantitative polymerase chain reaction；qpcr)技术，微阵列芯片技术平台通常具有较低的特异性。近期，era检测也推出以次世代定序(next
‑
generation sequencing；ngs)技术平台进行子宫内膜容受性分析，然而该技术平台也同样需要较大量的检体组织及以及完整性佳的rna样品质量进行分析。
7.综上所述，目前市面上仍需要一种更可靠的子宫内膜容受性检测方法，其可适用于较少量的检体组织或是低质量、低样品量样品，以判定子宫内膜处于容受期状态或非容受期状态。
到1指容受期。
20.实施例11.根据实施例1至实施例10中的任一项所述的测定子宫内膜状态的方法，其中若子宫内膜状态被测定为处于容受期前或容受期后，则所述方法进一步包括：重复步骤(a)和(b)至少一次或直到子宫内膜状态被测定为处于容受期。
21.实施例12.根据实施例1至实施例11中的任一项所述的测定子宫内膜状态的方法，其中女性遭受或曾遭受胚胎植入失败。
22.实施例13.根据实施例1至实施例12中的任一项所述的测定子宫内膜状态的方法，其中女性进行ivf疗程。
23.实施例14.根据实施例13所述的测定子宫内膜状态的方法，其中容受性预测评分进一步分类女性对ivf疗程的反应性。
24.实施例15.一种检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其包括：(a)对来自女性的子宫内膜样本执行分析以测定子宫内膜样本的mirna表达谱，其中mirna表达谱包括多个mirna的表达水平；和(b)分析所述mirna表达谱以获得容受性预测评分，其中容受性预测评分用以判定女性子宫内膜是否具有适合胚胎植入的容受性状态，且其中多个mirna包括至少50个、75个、100个、125个、150个或200个mirna，且优先选择分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的至少167个mirna。
25.实施例16.根据实施例15所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中子宫内膜样本获自女性的子宫腔。
26.实施例17.根据实施例15或实施例16所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中子宫内膜样本包括子宫内膜检体、子宫内膜灌洗液或其组合。
27.实施例18.根据实施例15至实施例17中的任一项所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中子宫内膜样本(i)在女性内源性促黄体激素遽增之后七天或(ii)在女性孕酮投药之后五天获得。
28.实施例19.根据实施例15至实施例18中的任一项所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中mirna表达谱通过qpcr、定序、微阵列芯片或rna
‑
dna杂交捕获技术来测定。
29.实施例20.根据实施例19所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中mirna表达谱通过对由子宫内膜样本中的mirna合成的cdna进行qpcr来测定。
30.实施例21.根据实施例20所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中cdna合成使用具有由以下通式表示的核苷酸序列的通用逆转录引物执行：5'
‑
r
‑
(dt)nvn
‑
3'，其中r包括seq id no:168，(dt)n为n个连续胸腺嘧啶残基，n为19，v为腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，且n为腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。
31.实施例22.根据实施例15至实施例21中的任一项所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中容受性预测评分为通过计算机算法产生且使用算式mira score＝f(x∈eq(c))＝xβ+ε所计算的数值，β为系数向量，且ε为误差。
32.实施例23.根据实施例22所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中计算机算法通过执行以下一或多个步骤中来建立：数据正规化、数据缩放、数据转换、预测建模以及交叉验证。
33.实施例24.根据实施例22或实施例23所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性
的方法，其中容受性预测评分介于
‑
1到1指女性子宫内膜具有适合胚胎植入的容受性状态。
34.实施例25.根据实施例15至实施例24中的任一项所述的检测女性胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其中女性遭受或曾遭受胚胎植入失败。
35.实施例26.一种试剂盒，其包括：(a)一或多个针对多个mirna的mirna表达谱分析芯片，和(b)关于(i)任选地使用一或多个mirna表达谱分析芯片测定来自女性的子宫内膜样本的mirna表达谱和(ii)基于mirna表达谱使用计算机算法获得容受性预测评分的使用说明，其中多个mirna包括至少50个、75个、100个、125个、150个或200个mirna，且优先选择分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的至少167个mirna。
36.实施例27.根据实施例26所述的试剂盒，其中一或多个mirna表达谱分析芯片包括用于检测多个mirna的表达水平的引物。
37.实施例28.根据实施例27所述的试剂盒，其中mirna表达谱分析芯片适合于进行实时定量pcr(qpcr)、定序、微阵列芯片或rna
‑
dna杂交捕获分析，优先选择qpcr，以检测多个mirna的表达水平。
38.实施例29.一种根据实施例27或实施例28所述的试剂盒的用途，其用于测定女性的子宫内膜状态。
39.实施例30.根据实施例29所述的试剂盒的用途，其中女性遭受或曾遭受胚胎植入失败和/或进行体外受精(ivf)疗程。
附图说明
40.图1描绘在自然周期或激素替代治疗周期中女性的子宫内膜状态。lh+5：在女性内源性促黄体激素(lh)遽增之后五天；lh+7：在女性内源性lh遽增之后七天；且lh+9：在女性内源性lh遽增之后九天。p+3：在女性孕酮投药之后三天；p+5：在女性孕酮投药之后五天；且p+7：在女性孕酮投药之后七天。
41.图2描绘根据本公开使用特定167个mirna的mira panelchip的子宫内膜容受性检测的工作流程。
42.图3描绘计算机算法(mira模型)如何建构且mira模型如何产生检测结果的过程。
43.图4a示出子宫内膜容受性的示范性分析，其将子宫内膜状态分类为以下三种状态中的一种：容受期前状态、容受期状态或容受期后状态。
44.图4b示出分类为三种容受期状态的示范性女性胚胎植入结果。
45.图5示出使用183个子宫内膜样本所得的具167个mirna表达水平的mirna表达谱的10折(10
‑
fold)交叉验证和妊娠率。sen：灵敏性＝真阳性/(真阳性+假阴性)；spe：特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)；ppv：精确性或阳性预测值＝真阳性/(真阳性+假阳性)；且npv：阴性预测值＝真阴性/(真阴性+假阴性)。p+6：在女性孕酮投药之后六天胚胎植入，所述女性的子宫内膜先前被测定为处于容受期前状态；p+5：在女性孕酮投药之后五天胚胎植入，所述女性的子宫内膜先前被测定为处于容受期状态；且p+4.5：在女性孕酮投药之后4.5天(即108个小时)胚胎植入，所述女性的子宫内膜先前被测定为处于容受期后状态。
46.图6示出mira评分系统，其根据容受性预测评分的值而将子宫内膜样本分类为以下三种状态中的一种：容受期前状态、容受期状态或容受期后状态。
具体实施方式
47.本文所阐述的公开内容和实施例将被理解为仅为示范性的且并不限制本发明的范围。虽然本文采用特定术语，除非另外指出，否则所述术语仅在通用意义和描述性意义上使用且不用于限制目的。
48.定义
49.除非上下文另外清楚地指示，否则如本文所用，单数形式“一(a/an)”和“所述(the)”意图同样包含复数形式。
50.术语“cdna”是指通过使用逆转录酶对rna进行逆转录而产生的互补dna。在一些实施例中，rna含有自子宫内膜组织样本提取的mirna。参看实例1。
51.术语“包括”、“具有”以及“包含”是开放的连系动词。这些动词中的一或多个的任何形式或时态，例如“包括(comprises/comprising)”、“具有(has/having)”以及“包含(includes/including)”也是开放的。举例来说，“包括”、“具有”或“包含”一或多个步骤的任何方法不限于仅具有那些一或多个步骤，且也可涵盖其它未列出的步骤。类似地，“包括”、“具有”或“包含”一个或多个特征的任何组合物或试剂盒不限于仅具有那些一个或多个特征，且可涵盖其它未列出的特征。除非另外要求，否则关于本文的某些实施例提供的任何和所有实例或示范性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地阐明本公开，且不对本公开的范围构成限制。
52.术语“表达”是指生物样本，例如女性的子宫内膜组织样本中的rna分子的转录和/或积累。在此上下文中，术语“mirna表达”是指生物样本中的一或多个mirna的数量，且可通过使用所属领域中已知的合适方法来检测mirna表达。参看，例如，实例1。
53.术语“微小核糖核酸”(“microrna”或“mirna”)是指从内源基因衍生的一类长度为大约18个到25个核苷酸的非编码rna。mirna通过与其目标mrna的3'非转译区(utr)进行碱基配对来作为基因表达的转录后调控因子，以用于mrna降解或转译抑制。
54.术语“核酸”、“核苷酸”以及“多核苷酸”可互换地使用且是指呈单链或双链形式的dna或rna的聚合物。除非另外指出，否则这些术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的多核苷酸，所述多核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。
55.术语“引物”是指寡核苷酸，当在诱导引物延伸产物的合成的条件下，例如在核苷酸和聚合诱导剂(如dna或核糖核酸聚合酶)的存在下且在合适温度、ph、金属离子浓度以及盐浓度下放置所述寡核苷酸时，所述寡核苷酸用以引发互补核酸链的合成。
56.术语“探针”是指包括多核苷酸的结构，其含有与存在于目标核酸分析物(例如，核酸扩增产物)中的核酸序列互补的核酸序列。探针的多核苷酸区可由dna和/或rna和/或合成核苷酸类似物构成。探针的长度通常与其用于专一性检测目标核酸的所有或部分目标序列兼容。
57.术语“实时定量pcr”(“qpcr”)是指使用聚合酶链反应以同时扩增且定量目标dna和/或rna的实验方法。定量使用多种化学物质(包含例如green的荧光染料或塔克曼(taqman)探针的荧光报导子寡核苷酸探针)执行，且实时定量通过测量在一或多个扩增周期之后反应中的扩增dna和/或rna来执行。
58.术语“标靶”(targeting)是指选择与所关注核酸序列杂交的合适核苷酸序列。在
一些实施例中，所关注核酸序列包含具有seq id no:1到seq id no:167中的任一个的序列的mirna。参看实例1。
59.用于测定子宫内膜状态的方法的概述
60.子宫内膜容受性是指女性的子宫内膜准备用于胚胎植入的状态。此发生在称为着床窗口期(woi)的时间段内的所有月经周期中。如图1所示，在自然周期内，排卵在lh遽增之后发生，且woi为lh遽增之后大约七天(lh+7)。在激素替代治疗周期中，woi在孕酮投药之后大约五天(p+5)。这些估计给出了关于子宫内膜容受性的可能信息。然而，子宫内膜状态的最终答案只可通过检查子宫内膜本身来提供。
61.为此，子宫内膜样本可在激素替代治疗周期中孕酮投药之后五天(p+5)或在自然周期中内源性lh遽增之后七天(lh+7)从女性的子宫腔采集。随后样本以分子诊断工具分析子宫内膜容受性状态。在根据本公开的测定子宫内膜状态的方法中，分子诊断工具分析子宫内膜样本的mirna表达谱。
62.如图2中所示，本公开提供测定子宫内膜状态的方法，其包括：(a)对子宫内膜样本执行分析以测定子宫内膜样本的mirna表达谱，其中mirna表达谱包括多个mirna，例如分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的167个mirna的表达水平；和(b)用计算机算法分析mirna表达谱以获得容受性预测评分，其中容受性预测评分将子宫内膜状态分类为容受期前状态、容受期状态或容受期后状态。
63.容受期前状态系指子宫内膜尚未准备好接受胚胎且此时胚胎植入可能过早。容受期状态(woi)系指子宫内膜处于胚胎植入的最佳时间。容受期后状态系指子宫内膜已经过了胚胎植入的最佳阶段。
64.分析mirna表达谱以测定子宫内膜容受性
65.本公开测定子宫内膜样本的mirna表达谱。在一些实施例中，mirna表达谱包括多个mirna，例如至少10个、25个、50个、75个、100个、125个、150个或200个mirna的表达水平，其全部可能涉及子宫内膜容受性的调控作用。在优先选择的实施例中，本公开提供167个mirna的选择，其表达水平涉及子宫内膜容受性的调控。参看实例1。通过首先从human disease ontology数据库中识别与生殖疾病有关的基因，且随后使用mirtarbase、targetscan以及mirdb选择潜在的调控因子mirna来选出这167个mirna。
66.为测定子宫内膜状态，根据本公开的方法包括执行分析以测定子宫内膜样本的mirna表达谱，其中mirna表达谱包括表1中所示的167个mirna的表达水平。
67.表1. 167个mirna的名称和序列。
68.69.70.[0071][0072]
可用所属领域中已知的定量方法来分析mirna的表达水平。在一些实施例中，为促进分析，一或多个以167个mirna为标靶的mirna表达谱分析芯片可作为使用。举例来说，在实例1中，两个mirna表达谱分析芯片被设计开发以用于分析167个mirna的表达水平。在一些实施例中，一或多个芯片另外以可作为mirna表达分析的内源性对照的某些rna序列为标靶，例如18s rrna。参看实例1。
[0073]
本公开提供测定子宫内膜样本的mirna表达谱的方法。所述方法通常包括(i)获得或已获得来自女性子宫腔的子宫内膜样本，(ii)进行分析以测定子宫内膜样本的mirna表达谱，其中mirna表达谱包括多个mirna，例如分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的167个mirna的表达水平。
[0074]
在一些实施例中，子宫内膜样本可通过侵入性方法，例如通过获取来自子宫内膜的小量检体来获得。参看实例1。在一些实施例中，子宫内膜样本可通过较不具侵入性的方法，例如通过收集存在于子宫灌洗液中的脱落细胞来获得。不希望因此受任何理论束缚，相信相较于基于微阵列芯片的mrna表达谱分析方法，所主张的基于qpcr的mirna表达谱方法提供更高的特异性和灵敏性，使得在根据本公开的方法中可能仅需要显著较少量的子宫内膜样本。参看王(wang)等人,“large scale real
‑
time pcr validation on gene expression measurements from two commercial long
‑
oligonucleotide microarrays”,bmc genomics,2006,7:59
‑
75。
[0075]
在一些实施例中，子宫内膜样本在女性的内源性lh遽增之后七天(lh+7)获得。在一些实施例中，子宫内膜样本在女性孕酮投药五天之后(p+5)获得。
[0076]
使用所属领域中已知的方法可提取且富集子宫内膜样本中的mirna。举例来说，可遵循制造商的说明书使用mirneasy micro kit(凯杰(qiagen))从子宫内膜组织提取mirna。参看实例1。富集的mirna可在
‑
80℃下储存。可使用所属领域中已知的方法来分析mirna的数量和质量。举例来说，可使用商购的安捷伦生物分析仪(agilent bioanalyzer)来分析mirna。
[0077]
可通过所属领域中已知的方法，包含qpcr、定序、微阵列芯片或rna
‑
dna杂交捕获技术来定量各mirna的表达水平。在一些实施例中，根据本公开的方法使用qpcr反应，其通常具有比北方印迹杂交和/或微阵列基因芯片分析更高的灵敏性和特异性。为此，cdna可由逆转录反应中所提取和富集的mirna合成，且可执行qpcr反应以定量mirna的表达水平。因此，在一些实施例中，通过qpcr，任选地使用本文中所公开的一或多个mirna表达谱分析芯片来测定mirna表达谱。参看实例1。
[0078]
目前，qpcr分析可分成两种类型。第一种类型使用茎
‑
环(stem
‑
loop)逆转录引物进行cdna合成，且使用mirna特异性探针或通用探针来定量mirna。第二种方法使用线性通用逆转录引物进行cdna合成，且使用mirna特异性正向引物、具逆转录引物特异性的反向引物和双股dna嵌入染料来定量mirna。
[0079]
在一些实施例中，使用如美国专利第10,590,478号中所公开的通用逆转录引物来进行cdna合成，其以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，使用具有由以下通式表示的核苷酸序列的通用逆转录引物进行cdna合成：5'
‑
r
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(dt)nvn
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3'，其中r包括caactcaggtcgtaggcaattcgt的序列(seq id no:168)，(dt)n为n个连续胸腺嘧啶残基，其中n为19，v为腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基或胞嘧啶残基，且n为腺嘌呤残基、鸟嘌呤残基、胞嘧啶残基或胸腺嘧啶残基。
[0080]
为降低成本且易于使用，在一些实施例中，可使用根据本公开的以所有167个mirna为标靶的一或多个mirna表达谱分析芯片来进行qpcr反应。参看实例1。在一些实施例中，每一个mirna表达谱分析芯片预载有合适的引物和/或探针，所述引物和/或探针能够同时分析至少20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、95个、96个、97个、98个、99个、
100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个或200个mirna的表达。在一些实施例中，mirna表达谱分析芯片含有如美国专利第9,724,692号、专利第10,415,084号、申请第16/191,451号以及申请第16/233,121号中所公开的多工试片(multiplex slide plate)，其以引用的方式并入本文中。
[0081]
可使用所属领域中已知的方法执行qpcr反应。在一些实施例中，可使用如美国专利第9,168,533号和申请第16/559,642号中所公开的热循环仪装置来进行qpcr反应，其以引用的方式并入本文中。同样参看实例1。
[0082]
mirna分析算法和其用于测定子宫内膜容受性的用途
[0083]
根据本公开的方法，mirna表达谱可用于运用计算机mirna分析算法产生容受性预测评分。容受性预测评分将子宫内膜状态分类为以下三种状态中的一种：容受期前状态、容受期状态或容受期后状态。
[0084]
计算机mirna分析算法为数学预测分类器，其使用mirna表达数据且根据不同容受性状态学习区分类别。
[0085]
为建构算法，将关于mirna表达水平的原始数据分成训练组和验证组。训练组用于训练预测分类器且验证组用于评估并改善预测分类器的性能。如图3中所示，执行以下一或多个步骤来建构且验证算法：数据正规化、数据缩放、数据转换、预测建模以及交叉验证。
[0086]
为使在统计特性中分布相同，数据可通过百分位正规化(quantile normalization)来正规化，如博尔斯塔(bolstad)等人,于“a comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias”,(bioinformatics,2003,19(2):185
‑
193中所描述。此外，为确保目标函数恰当地起作用，可标准化数据的数值范围以使数据具有零均值(zero
‑
mean)和单位变异数(unit
‑
variance)。
[0087]
出于数据简化(data reduction)和特征撷取(feature extraction)的原因，主成分分析(principal component analysis；pca)可用于压缩来自大量原始变量的信息且通过线性地组合原始变量来产生一小组新特征。
[0088]
pca转换的数据可用于进一步建构具有弹性网正则化(elastic net regularization)的广义线性模型，其为线性地结合lasso和ridge方法的l1和l2惩罚的正则化回归法，如邹(zou)等人,“regularization and variable selection via the elastic net”j.r.statist.soc.b,2005,67,part 2,301
‑
320中所描述。关于glmnet的额外信息为已知且可在glmnet.stanford.edu获得。
[0089]
k折交叉验证方法(例如，10折交叉验证)可用于评估计算机mirna分析算法在最终完成之前的预测值。参看图5。在k折交叉验证中，将原始样本随机地分割成k等分的子样本。在k个子样本中，其中一个子样本保留作为测试模型的验证数据，且将其余k
‑
1个子样本用作训练数据。随后重复进行交叉验证过程k次(折)，其中k个子样本中的每一个都刚好使用一次作为验证数据。来自等分数的k个结果随后可被平均化(或以其它方式结合)以产生单一估算值。
[0090]
妊娠率可用于评估计算机mirna分析算法的预测值。参看实例2。
[0091]
在验证及优化之后，产出计算机mirna分析算法。运行算法产生容受性预测评分，所述评分将女性的子宫内膜状态分类成如下三种状态中的一个：若评分大于1，则女性的子
宫内膜处于容受期前状态；若评分小于
‑
1，则女性的子宫内膜处于容受期后状态；若评分介于
‑
1到1，则女性的子宫内膜处于容受期状态。参见图6。
[0092]
根据本公开的方法的应用
[0093]
本公开提供一种使用样本，例如子宫内膜检体以测定子宫内膜状态的方法，所述方法包括：(a)对女性的子宫内膜样本进行分析以测定子宫内膜样本的mirna表达谱，其中mirna表达谱包括多个mirna，例如分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的167个mirna的表达水平；和(b)使用例如计算机算法来分析mirna表达谱以获得容受性预测评分。
[0094]
本公开的方法可用于各种诊断和治疗目的，包含(但不限于)ivf疗程。举例来说，在一些实施例中，基于子宫内膜的结果，可进一步包含在女性体内植入胚胎或向遭受或曾遭受胚胎植入失败的女性投予一或多种疗程的方法。在一些实施例中，本公开提供检测胚胎植入的子宫内膜容受性的方法，其包括：(a)对女性的子宫内膜样本进行分析以测定子宫内膜样本的mirna表达谱，其中mirna表达谱包括多个mirna例如分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的167个mirna的表达水平，(b)分析mirna表达谱以获得容受性预测评分，其中容受性预测评分判定女性是否具有子宫内膜容受性，以及(c)将胚胎转移至被测定具有子宫内膜容受性的女性的子宫内膜。
[0095]
在一些实施例中，测定子宫内膜状态的方法可用于判定女性胚胎植入的时机。在一些实施例中，若子宫内膜状态处于容受期状态，则认为女性适合胚胎植入。若子宫内膜状态处于容受期前或容受期后状态，则认为女性不适合胚胎植入。在一些实施例中，当子宫内膜状态被判定为处于容受期前状态或容受期后状态时，本公开提供基于子宫内膜状态的信息的胚胎植入的方法。举例来说，若子宫内膜状态被判定为处于容受期前状态，则在下一周期期间，可在孕酮投药之后的5.5天到7.5天之间，例如5.5天、6天、6.5天、7天或7.5天进行胚胎植入。或者，若子宫内膜状态被判定为处于容受期后状态，则在下一周期期间，可在孕酮投药之后的2.5天到4.5天之间，例如2.5天、3天、3.5天、4天或4.5天进行胚胎植入。
[0096]
在取样时子宫内膜显示非容受期状态的情况下，所获得信息为具指导性的，使得所述方法可通过在另一时间点获取子宫内膜样本来重复进行，以根据首次判定结果进行修改。借助于实例，若子宫内膜状态处于容受期前状态，则获取子宫内膜样本的下一个时间点可在内源性lh遽增之后超过七天或在孕酮投药之后超过五天。举例来说，获取子宫内膜样本的下一个时点可在内源性lh遽增之后7.5天到10.5天之间，例如7.5天、8天、8.5天、9天、9.5天、10天、或10.5天，或在孕酮投药之后5.5天到7.5天之间，例如5.5天、6天、6.5天、7天或7.5天。或者，若子宫内膜状态处于容受期后状态，则获取子宫内膜样本的下一个时间点可在内源性lh遽增之后少于七天或在孕酮投药之后少于五天。举例来说，获取子宫内膜样本的下一个时点可在内源性lh遽增之后3.5天到6.5天之间，例如3.5天、4天、4.5天、5天、5.5天、6天或6.5天，或在孕酮投药之后2.5天到4.5天之间，例如2.5天、3天、3.5天、4天或4.5天。通过遵循这些程序，可得出容受期状态，且可提高ivf疗程的成功率。对于这些用途中的任何一种，女性遭受或曾遭受胚胎植入失败。在一些实施例中，女性进行ivf疗程。
[0097]
在一些实施例中，若子宫内膜状态被判定为处于容受期前状态或容受期后状态，则可将测定子宫内膜状态的方法重复至少一次或直到子宫内膜状态被判定为处于容受期状态。
[0098]
在一些实施例中，根据本公开的测定子宫内膜状态的方法可用于判定女性的woi。
在一些实施例中，根据本公开的方法可用于分类女性对ivf治疗的反应性。对于这些用途中的任何一种，在一些实施例中，女性遭受或曾遭受胚胎植入失败。在一些实施例中，女性进行ivf疗程。
[0099]
在一些实施例中，根据本公开的测定子宫内膜状态的方法可作为探讨妊娠药物对女性子宫内膜影响的有用工具。在这些实施例中，女性遭受或曾遭受胚胎植入失败。在一些实施例中，使女性进行ivf疗程。
[0100]
试剂盒
[0101]
本公开的另一方面是有关于用于实施测定子宫内膜状态方法的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括适合于检测多个mirna，例如分别具有seq id no:1到seq id no:167的序列的167个mirna的表达水平的引物和/或探针。参看实例1。在一些实施例中，引物和/或探针适合于进行qpcr反应以检测167个mirna的表达水平。在一些实施例中，试剂盒包括一或多个以167个mirna为标靶的mirna表达谱分析芯片。在一些实施例中，一或多个芯片另外以可作为mirna表达分析的内源性对照的rna序列为标靶，例如18s rrna。
[0102]
试剂盒可另外含有关于(i)任选地使用一或多个mirna表达谱分析芯片测定来自女性子宫内膜样本的mirna表达谱，和/或(ii)基于mirna表达谱使用计算机算法获得容受性预测评分的使用说明。在一些实施例中，试剂盒含有关于如何解释且运用容受性预测评分的指示说明。
[0103]
在一些实施例中，试剂盒有助于诊断和治疗目的，包含但不限于ivf疗程。
[0104]
实例
[0105]
实例1：产出mirna表达谱的材料和方法。
[0106]
子宫内膜检体。在激素替代治疗周期中孕酮给药之后五天(p+5)或在自然周期中内源性促黄体激素遽增之后七天(lh+7)，使用pipelle子宫内膜吸引刮匙(库柏外科公司(cooper surgical,inc.))从女性子宫腔采集子宫内膜检体。紧接着将子宫内膜组织储存于rnalater中。
[0107]
rna提取和mirna富集。遵循制造商的说明书使用mirneasy micro kit(凯杰(qiagen))从子宫内膜组织分离总rna。简要来说，将五毫克子宫内膜组织用电动机和研杵破碎且在液氮中均质化。将700微升qiazol lysis reagent添加到均质化组织中，且将所得样本在室温下培育五分钟以促进核蛋白复合物的分解。每700微升qiazol lysis reagent添加140微升三氯甲烷到试管中，且手动剧烈摇晃试管15秒并在室温下培育2分钟到3分钟。将样本在4℃下以12,000克离心15分钟。在离心之后，将上部水相转移到新试管，将一体积的70％乙醇添加到试管中，且充分地涡动试管。将样本转移到rneasy minelute旋转柱且在室温下以8,000克离心15秒。将流过物移液到2毫升试管内，将0.65体积的100％乙醇添加到流过物中，且充分地涡动所得样本。随后将样本转移到rneasy minelute旋转柱内且在室温下以8,000克离心15秒。丢弃流过物，将700微升缓冲液rwt添加到rneasy minelute旋转柱中，且将柱以8000克离心15秒以洗涤柱。丢弃流过物，将500微升缓冲液rpe添加到rneasy minelute旋转柱内，且将柱以8,000克离心15秒以洗涤柱。丢弃流过物，将500微升的80％乙醇添加到rneasy minelute旋转柱内，且将柱以8,000克离心2分钟以干燥旋转柱膜片。将rneasy minelute旋转柱放置于新的2毫升收集试管内且以8,000克离心5分钟。将rneasy minelute旋转柱放置于1.5毫升收集试管内，将14微升到20微升的无核酸酶水添加到旋转
柱膜片上，且将柱以8,000克离心1分钟以洗脱富集mirna的级分。在
‑
80℃下储存富集mirna的级分。
[0108]
cdna合成。在20微升逆转录反应中，来自子宫内膜组织的≥2纳克富集mirna的级分用于合成cdna。遵循制造商的说明书使用quarkbio microrna universal rt kit(奎克生技光电股份有限公司(quark biosciences taiwan,inc.))进行逆转录。简要来说，使用poly
‑
a聚合酶将poly
‑
a尾部添加到mirna，之后进行cdna合成。随后使用以下程序执行cdna合成：42℃持续60分钟和95℃持续5分钟，且然后4℃直到程序完成。在
‑
20℃下储存合成的cdna。
[0109]
使用nextamp分析系统和mira panelchip组进行mirna表达谱分析。mira panelchip组含有总共167个mirna分析。167个mirna的序列列示于表1中。另外，rnu6b、rnu43以及18s rrna均作为内源性对照。三个外源性插入对照用于监测mirna提取、cdna合成以及qpcr效能(奎克生技光电股份有限公司)。使用mira panelchip组分析cdna。将cdna(等同于0.1纳克富集mirna的级分)添加到含有30微升2
×
sybr master mix的混合物中(奎克生技光电股份有限公司)，且将无核酸酶的水添加到混合物中以获得60微升的最终体积。将混合物手动充分地混合且短暂地快速离心以收集底部的液体。使用pipetman将60微升混合物沿芯片边缘分配且随后通过用玻璃载片进行刮擦动作将混合物施加在mira panelchip的整个表面上。随后将每个芯片浸没到含有channeling solution(奎克生技光电股份有限公司)的托盘内，其中使反应孔面向托盘的底部。然后将每个托盘放入到q station，其为mira panelchip应用的热循环仪(参看图2中的panelstation)且包含内建的样本管理数据库和分析平台，使得mira panelchip检测和数据分析可便利且快速地进行。其后根据以下程序执行mira panelchip分析：95℃持续36秒和60℃持续72秒，持续40个周期。
[0110]
实例2：计算机mirna分析算法和其用途。
[0111]
如图3中所示，计算机mirna分析算法(mira)通过执行以下一或多个步骤来建构：数据正规化、数据缩放、数据转换、预测建模以及交叉验证。
[0112]
数据正规化。为使在统计特性中分布相同，通过百分位正规化来正规化数据。参看图3中的算式(a)；也参看博尔斯塔(bolstad)等人,“a comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias”,bioinformatics,2003,19(2):185
‑
193。
[0113]
数据缩放。为确保目标函数恰当地作用，可标准化数据的数值范围以使数据具有零均值和单位变异数。参看图3中的算式(b)。
[0114]
数据转换。出于数据简化和特征撷取的原因，pca压缩来自大量原始变量的信息且通过线性地组合原始变量来产生一小组新特征。请参照图3中的算式(c)。
[0115]
建模。pca转换的数据用于进一步建构具有弹性网正则化的广义线性模型，其为线性地结合lasso和ridge方法的l1和l2惩罚的正则化回归法。参看图3中的算式(d)；也参看邹等人(zou),“regularization and variable selection via the elastic net”,j.r.statist.soc.b,2005,67,part 2,301
‑
320。
[0116]
在完成mira模型之前进行交叉验证以评估计算机mirna分析算法的预测值。如图4a所示，使用含有具有表1中所示的seq id no:1到seq id no:167的序列的167个mirna的
表达水平的mirna表达谱，mira模型能够成功地将临床样本分类成以下三种状态组中的一种：容受期前状态、容受期状态、容受期后状态。此外，如图4b所示，初步验证显示分类为容受期状态的女性(测试组)的妊娠率为100％。
[0117]
将来自183位女性的数据分成10个子集以达到模型评估的10折交叉验证。图5示出使用183个子宫内膜样本所得的具167个mirna表达水平的mirna表达谱之10折交叉验证和妊娠率。在这些测试中，于第一周期中，测定每位女性的子宫内膜状态。若女性的子宫内膜被判定为处于容受期前状态，则在下一周期孕酮投药之后六天进行胚胎植入(p+6组；35位女性)。若女性的子宫内膜被判定为处于容受期状态，则在下一周期孕酮投药之后五天进行胚胎植入(p+5组；142位女性)。若女性的子宫内膜被判定为处于容受期后状态，则在下一周期孕酮投药之后4.5天进行胚胎植入(p+4.5组；6位女性)。另外，图5示出灵敏性、特异性、ppv、npv和10折交叉验证结果的总体一致率。
[0118]
在三个组当中，检测到137件妊娠事件，其中22件事件来自p+6组，113件事件来自p+5组以及2件事件来自p+4.5组。参看图5，关于计算机mirna分析算法的预测评估，在所有137件妊娠事件当中，2分之1来自p+4.5组、113分之107来自p+5组以及22分之17来自p+6组，显示出可通过算法判定正确的胚胎植入时间调整且产生91.24％的妊娠率(125/137)。参看图5。
[0119]
mira模型。考虑描述于此实例中的所有参数(参看图3，eq(a
‑
d)且随后根据交叉验证微调其参数)，产出将所有样本分类成三种不同子宫内膜状态的预测模型。运行mira产生容受性预测评分(mira评分)，其使用以下算式计算：mira score＝f(x∈eq(c))＝xβ+ε，其中β为系数向量，且ε为误差，均通过交叉验证由glmnet产出(图3)。这个模型可适用于子宫内膜的任何qpcr图谱分析以预测子宫内膜状态。
[0120]
如图6所示，运行计算机mirna分析算法产出容受性预测评分，其将女性的子宫内膜状态分类成如下三种状态中的一种：若评分大于1，则女性的子宫内膜处于容受期前状态；若评分小于
‑
1，则女性的子宫内膜处于容受期后状态；若评分介于
‑
1到1，则女性的子宫内膜处于容受期状态(woi)。
[0121]
尽管本公开已参照具体实施方式进行特定呈现和描述，所属领域的技术人员应理解在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可对各种形式和细节做出改变。
[0122]
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