作为非抗生素选择标记的β‑半乳糖苷酶α肽及其用途
技术领域：
：1.本发明涉及包含非抗生素选择标记的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。具体地，该分离的β‑半乳糖苷酶表达盒包含可操作地连接至启动子的β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段。还提供了包含该β‑半乳糖苷酶表达盒的分离的载体、产生该分离的载体的方法以及包含该分离的载体的试剂盒。2.以电子方式提交的参考序列表3.本技术包含序列表，该序列表作为ascii格式的序列表经由efs‑web以电子方式递交，文件名为″jbi6031uspsp1seqlist1″并且创建日期为2019年1月17日，并且大小为48kb。经由efs‑web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术：
：：4.质粒载体通常含有在大肠杆菌(e.coli)中表达的基因，并且当通过转化或电穿孔将质粒引入到细胞中时，提供了从那些不含有质粒的细胞中鉴定或选择含有质粒的细胞的方法。最常用的选择性标记是赋予抗生素抗性的基因。然而，在几种情况下抗生素抗性基因是不期望的。当质粒用于形成生物制剂(诸如抗体)的制造细胞系时，通常移除或破坏抗生素抗性基因。对于基因疗法，抗生素抗性基因也是不期望的。虽然卡那霉素/新霉素抗性基因通常被fda容许，但eu监管机构要严格得多。欧洲药典指出″除非另有证据和授权，否则用作选择性遗传标记的抗生素抗性基因(尤其对于临床上有用的抗生素)不包括在载体构建体中。其他用于重组质粒的选择技术是优选的(″genetransfermedicalproductsforhumanuse″，europeanpharmacopei7.0，2011年)。虽然当细胞系开发需要少量质粒时，对抗生素选择标记的破坏是可能的，但这些技术对于其中需要制造更多质粒的基因疗法应用是不切实际的。5.为了开发基于质粒的基因疗法以避免体内基因沉默，需要其中复制起点和选择标记的组合大小＜1kb的质粒载体。当与具有3kb或更大的质粒主链的传统质粒相比，质粒主链为1kb或更小时，治疗转基因在小鼠中表达更长久并以更高水平表达(lu等人，mol.ther.，第20卷第11期，第2111‑2119页，2012年)。已提出，未在体内表达的大段dna诱导沉默。因此，具有较小质粒主链的质粒可能更有效。6.对于其中使用瞬时转染来制造治疗剂的应用，也需要较小的质粒。一个示例是腺病毒相关病毒载体的产生，其中使用质粒的大规模转染来生成临床材料。较小的质粒减少必须被转染的dna的量，从而降低成本。7.因此，需要生成可用于基因疗法应用的包含选择性标记的较小质粒。技术实现要素：8.在一个总的方面，提供了使用核酸构建体作为选择性标记的方法。该方法包括(a)使在乳糖操纵子中包含缺失的宿主细胞与核酸构建体接触，其中核酸构建体包含分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，该分离的β‑半乳糖苷酶表达盒包含编码可操作地连接至启动子的β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段的核酸序列；以及(b)使宿主细胞在其中核酸构建体在该宿主细胞中得以维持的条件下生长。9.在另一个总的方面，提供了分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。该分离的表达盒包含编码可操作地连接至启动子的β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段的核酸序列。10.在某些实施方案中，β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段包含与seqidno：1具有至少75％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段包含seqidno：1的氨基酸序列。11.在某些实施方案中，核酸序列还包含复制起点。复制起点可例如为高拷贝复制起点。在某些实施方案中，高拷贝复制起点为puc57复制起点。在某些实施方案中，puc57复制起点包含seqidno：19的核酸序列。12.在某些实施方案中，分离的β‑半乳糖苷酶表达盒还包含二聚体解离元件。二聚体解离元件可例如包含具有位点特异性重组酶识别位点的核酸序列。二聚体解离元件还可包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。在某些实施方案中，宿主细胞包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。二聚体解离元件可例如为cole1二聚体解离元件。在某些实施方案中，cole1二聚体解离元件包含seqidno：20的核酸序列。13.还提供了包含本发明的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒的分离的载体。在某些实施方案中，分离的载体的大小小于约1.5千碱基。在某些实施方案中，分离的载体包含选自seqidno：9‑13、17和18的核酸序列。14.还提供了生成本发明的分离的载体的方法。该方法包括(a)使宿主细胞与分离的载体接触；(b)使宿主细胞在产生该载体的条件下生长；以及(c)从宿主细胞分离载体。15.在某些实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。基本培养基可包含乳糖作为唯一碳源。在某些实施方案中，基本培养基包含约1％至约4％重量/体积(w/v)乳糖。在某些实施方案中，基本培养基包含约2％w/v乳糖。16.还提供了试剂盒，该试剂盒包含(a)本发明的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒；以及(b)在乳糖操纵子中包含缺失的宿主细胞。在某些实施方案中，试剂盒还包含基本培养基，该基本培养基包含乳糖作为唯一碳源。在某些实施方案中，载体包含分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。在某些实施方案中，宿主细胞包含laczδm15缺失。在某些实施方案中，宿主细胞选自大肠杆菌宿主细胞和酵母宿主细胞。附图说明17.结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述
发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。18.图1示出了p215质粒的示意图。19.图2示出了p216质粒的示意图。20.图3示出了p217质粒的示意图。21.图4示出了p218质粒的示意图。22.图5示出了p219质粒的示意图。23.图6示出了p469‑2质粒的示意图。具体实施方式24.背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。25.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。26.应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式″一个/一种″和″所述/该″包括复数引用物。27.除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语″约″修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/ml的浓度包括0.9mg/ml至1.1mg/ml。同样，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。28.除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语″至少″应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。29.如本文所用，术语″包含″、″包括″、″具有″或″含有″或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则″或″是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件a或b由以下任一项满足：a为真(或存在)而b为假(或不存在)，a为假(或不存在)而b为真(或存在)，以及a和b均为真(或存在)。30.如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语″和/或″被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由″和/或″连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语″和/或″的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语″和/或″的要求。31.如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语″由......组成″表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。32.如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语″基本上由......组成″表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见m.p.e.p.§2111.03。33.还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的″约″、″大约″、″大致″、″基本上″和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他系统误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。34.在两个或更多个核酸或多肽序列(例如氨基末端β‑半乳糖苷酶肽和编码它们的多核苷酸；本文所述的分离的载体的核酸)的上下文中术语″相同″或″同一性″百分比是指当进行比较和比对以获得最大对应性时，相同的或具有相同的氨基酸残基或核苷酸的指定百分比的两条或更多条序列或子序列，如使用以下序列比较算法中的一种序列比较算法或通过目视检查所测量的。35.对于序列比对，通常将一个序列作为参考序列，将测试序列与其进行对比。当使用序列比对算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数来计算对于测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。36.用于比较的序列的最佳比对可例如通过smith&waterman的局部同源性算法进行(adv.appl.math.第2卷：第482页(1981年))，通过使用needleman&wunsch的同源比对算法进行(j.mol.biol.第48卷：第443页(1970年))，通过搜索pearson&lipman的相似性方法进行(proc.nat′l.acad.sci.usa第85卷：第2444页(1988年))，通过这些算法(gap，bestfit，fasta和tfasta，在威斯康星州遗传学软件包，遗传学计算小组，威斯康辛州，麦迪逊，科学街区575号(575sciencedr.，madison，wi)计算机化实施，或通过目测(大体参见currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubel等人编辑，《实验室指南》，格林尼出版协会和约翰威利父子公司的合资企业(1995年增补版)(ausubel))。37.适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的示例是blast和blast2.0算法，其分别描述于altschul等人1990年的j.mol.biol.第215卷，第403至第410页和altschul等人1997年的nucleicacidsres.第25卷：第3389‑3402页。用于执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为w的短字词来识别高评分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同长度的字词比对时，该短字词匹配或满足一些正值阈值分数t。t被称为邻近字词分数阈值(altschul等人，出处同上)。这些初始邻近字词命中充当用于发起搜索以找到包含它们的较长hsp的种子。然后将字词命中沿每个序列在两个方向上延伸，只要可增加累积的比对分数。38.对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；始终＞0)和n(错配残基的处罚分数；始终＜0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，评分矩阵用于计算累积分数。字词命中在每个方向上的延伸在以下情况下停止：累积比对分数从其最大实现值下降数量x；累积分数由于一个或多个负分数残基比对的累积而变为零或更低；或到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x确定比对的灵敏度和速度。blastn程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(w)11、期望值(e)10、m＝5、n＝‑4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用字长(w)3、期望值(e)10以及blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff的proc.natl.acad.sci.usa第89卷：第10915页(1989年)).39.除了计算序列同一性百分比之外，blast算法还对两条序列之间的相似性进行统计分析(参见例如karlin和altschul的proc.nat’l.acad.sci.usa第90卷：第5873页至5787页(1993年))。blast算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(p(n))，其提供了两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸类似于参考序列。40.两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是通过第一核酸编码的多肽与通过第二核酸编码的多肽免疫地交叉反应，如下所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅通过保守置换而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是，两个分子在严格条件下彼此杂交。41.如本文所用，术语″分离的″意指生物组分(诸如核酸、肽、蛋白质或细胞)已经与组分天然存在的生物体的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的dna和rna、蛋白质、细胞和组织)基本上分离、分开得到或从其中纯化出来。因此，已被″分离″的核酸、肽、蛋白质和细胞包括通过标准纯化方法和本文所述的纯化方法纯化的核酸、肽、蛋白质和细胞。″分离的″核酸、肽、蛋白质和细胞可为组合物的一部分，并且如果该组合物不是核酸、肽、蛋白质或细胞自身环境的一部分，则仍然是分离的。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸、肽和蛋白质以及化学合成的核酸。42.如本文所用，同义地称为″核酸分子″、″核苷酸″或″核酸″的术语″多核苷酸″是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的rna或dna或者修饰的rna或dna。″多核苷酸″包括但不限于单链和双链的dna、为单链区和双链区的混合物的dna、单链和双链的rna以及为单链区和双链区的混合物的rna、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的dna和rna的杂合分子。此外，″多核苷酸″是指包含rna或dna或rna和dna两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的dna或rna，以及具有出于稳定性或其它原因而被修饰的主链的dna或rna。″修饰的″碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对dna和rna进行多种修饰；因此，″多核苷酸″包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的dna和rna的化学形式。″多核苷酸″也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。43.如本文所用，术语″载体″是复制子，其中可以可操作地插入另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。44.如本文所用，术语″表达″是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到rna的转录。该术语还涵盖rna到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的car可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。45.如本文所用，术语″可操作地连接″是指当核酸(例如，启动子和编码多肽的核酸)被置于结构或功能关系时核酸之间的连接。例如，如果核酸序列的一个片段和核酸序列的另一个片段相对于彼此定位在同一邻接核酸序列上并且具有结构或功能关系(诸如启动子或增强子相对于编码序列定位以便有利于编码序列的转录；核糖体结合位点相对于编码序列定位以便有利于翻译；或前序列或分泌前导序列相对于编码序列定位以便有利于前蛋白(例如，参与所编码的多肽的分泌的前蛋白)的表达)，则核酸序列的一个片段可以可操作地连接至核酸序列的另一个片段。在其他示例中，可操作地连接的核酸序列不是邻接的，而是以使得它们作为核酸或作为由核酸表达的蛋白质而彼此具有功能关系的方式定位。例如，增强子不必是邻接的。连接可通过在方便的限制位点处连接或通过使用合成的寡核苷酸衔idno：1具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段可包含seqidno：1。55.在某些实施方案中，核酸序列还包含复制起点。复制起点可例如为高拷贝复制起点。在某些实施方案中，高拷贝复制起点为puc57复制起点。在某些实施方案中，puc57复制起点包含与seqidno：19具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在某些实施方案中，puc57复制起点包含seqidno：19的核酸序列。56.在某些实施方案中，分离的β‑半乳糖苷酶表达盒还可包含二聚体解离元件。二聚体解离元件可例如包含具有位点特异性重组酶识别位点的核酸序列。位点特异性重组酶识别位点可例如选自loxp位点、rfs位点、frt位点、rp4res位点、rk2res位点和res位点。二聚体解离元件还可包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。在某些实施方案中，宿主细胞包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。位点特异性重组酶可例如选自cre重组酶、resd重组酶、flp重组酶、para重组酶、sin重组酶、β重组酶、γδ重组酶、tnpr重组酶和psk41解离酶。57.二聚体解离元件可例如为cole1二聚体解离元件。cole1二聚体解离元件可包含与seqidno：20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在某些实施方案中，cole1二聚体解离元件包含seqidno：20的核酸序列。58.在某些实施方案中，分离的载体包含本发明的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。可使用根据本公开的本领域技术人员已知的任何载体，诸如质粒、粘粒、人工染色体(例如，细菌人工染色体(bac)、酵母人工染色体(yac)和/或衍生自p1的人工染色体(pac)、转座子、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施方案中，载体是重组表达载体，诸如质粒。载体可包括建立表达载体的常规功能的任何元件，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起点。启动子可为组成型、诱导型或阻抑型启动子。能够向细胞递送核酸的多种表达载体在本领域中是已知的，并且在本文可用于产生β‑半乳糖苷酶肽的氨基末端片段。常规克隆技术或人工基因合成可用于根据本发明的实施方案生成重组表达载体。59.在某些方面，分离的载体的大小小于约1.5千碱基。分离的载体的长度可例如为约700个碱基对、约800个碱基对、约900个碱基对、约1000个碱基对(约1千碱基)、约1100个碱基对(约1.1千碱基)、约1200个碱基对(约1.2千碱基)、约1300个碱基对(约1.3千碱基)、约1400个碱基对(约1.4千碱基)或约1500个碱基对(约1.5千碱基)。在某些实施方案中，分离的载体的大小小于约1千碱基。在某些实施方案中，分离的载体的大小小于约900个碱基对。在某些实施方案中，分离的载体的大小小于约800个碱基对。60.在某些实施方案中，分离的载体包含与选自seqidno：9‑13、17和18的核酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。在某些实施方案中，分离的载体包含选自seqidno：9‑13、17和18的核酸序列。61.还提供了生成本发明的分离的载体的方法。该方法包括(a)使宿主细胞与分离的载体接触；(b)使宿主细胞在产生该载体的条件下生长；以及(c)从宿主细胞分离载体。62.在某些实施方案中，宿主细胞在基本培养基中生长。基本培养基可包含乳糖作为唯一碳源。在某些实施方案中，基本培养基包含约1％至约4％重量/体积(w/v)乳糖。在某些实施方案中，基本培养基包含约1％至约4％w/v、约1％至约3％w/v、约1％至约2％w/v、约1.5％至约4％w/v、约1.5％至约3％w/v、约1.5％至约2％w/v、约2％至约4％w/v、约2％至约3％w/v、约2.5％至约4％w/v、约2.5％至约35％w/v或约3％至约4％w/v乳糖。在某些实施方案中，基本培养基包含约2％w/v乳糖。63.在某些实施方案中，本发明涉及包含本发明的分离的载体的宿主细胞。鉴于本公开，本领域的技术人员已知的任何宿主细胞可用于比较本发明的分离的载体。合适的宿主细胞包括具有laczδm15缺失但乳糖生物合成途径的其余部分完整的细胞。在噬菌体φ80整合的上下文中含有该突变(即φ801aczδm15标记)的菌株在完整乳糖操纵子的上下文中含有该突变，并因此是合适的宿主。当用lacz‑α互补质粒转化时产生显著水平的β‑半乳糖苷酶的lacz基因的在氨基末端(n‑末端)区域中具有不同缺失的其他宿主也可为合适的宿主。本发明的合适的宿主细胞可包括大肠杆菌宿主细胞或酵母宿主细胞。64.还提供了试剂盒，该试剂盒包含(a)本发明的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒；以及(b)在乳糖操纵子中包含缺失的宿主细胞。在某些实施方案中，载体包含分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。在某些实施方案中，宿主细胞包含laczδm15缺失。在某些实施方案中，宿主细胞可选自大肠杆菌宿主细胞或酵母宿主细胞。65.在某些实施方案中，试剂盒还包含基本培养基，该基本培养基包含乳糖作为唯一碳源。在某些实施方案中，基本培养基包含约1％至约4％重量/体积(w/v)乳糖。在某些实施方案中，基本培养基包含约1％至约4％w/v、约1％至约3％w/v、约1％至约2％w/v、约1.5％至约4％w/v、约1.5％至约3％w/v、约1.5％至约2％w/v、约2％至约4％w/v、约2％至约3％w/v、约2.5％至约4％w/v、约2.5％至约35％w/v或约3％至约4％w/v乳糖。在某些实施方案中，基本培养基包含约2％w/v乳糖。66.实施方案67.本发明提供了以下非限制性实施方案。68.实施方案1是一种使用核酸构建体作为选择性标记的方法，该方法包括：69.a.使在乳糖操纵子中包含缺失的宿主细胞与核酸构建体接触，其中核酸构建体包含分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，该分离的β‑半乳糖苷酶表达盒包含编码可操作地连接至启动子的β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段的核酸序列；以及70.b.使宿主细胞在其中仅含有核酸构建体的宿主细胞在该宿主细胞中得以维持的条件下生长。71.实施方案2是根据实施方案1所述的方法，其中β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段包含与seqidno：1具有至少75％同一性的氨基酸序列。72.实施方案3是根据实施方案1或2所述的方法，其中β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段包含seqidno：1的氨基酸序列。73.实施方案4是根据实施方案1‑3中任一项所述的组合物，其中核酸序列还包含复制起点。74.实施方案5是根据实施方案4所述的方法，其中复制起点为高拷贝复制起点。75.实施方案6是根据实施方案5所述的方法，其中高拷贝复制起点为puc57复制起点。76.实施方案7是根据实施方案6所述的方法，其中puc57复制起点包含seqidno：19的核酸序列。77.实施方案8是根据实施方案1‑7中任一项所述的方法，其中分离的β‑半乳糖苷酶表达盒还包含二聚体解离元件。78.实施方案9是根据实施方案8所述的方法，其中二聚体解离元件包含具有位点特异性重组酶识别位点的核酸序列。79.实施方案10为根据实施方案8或9所述的方法，其中二聚体解离元件还包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。80.实施方案11为根据实施方案8或9所述的方法，其中宿主细胞包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。81.实施方案12是根据实施方案8‑11中任一项所述的方法，其中二聚体解离元件为cole1二聚体解离元件。82.实施方案13是根据实施方案12所述的方法，其中cole1二聚体解离元件包含seqidno：20的核酸序列。83.实施方案14是根据实施方案1‑13中任一项所述的方法，其中宿主细胞包含laczδm15缺失。84.实施方案15是根据实施方案1‑14中任一项所述的方法，其中分离的载体包含分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。85.实施方案16是根据实施方案15所述的方法，其中分离的载体的大小小于约1.5千碱基。86.实施方案17是根据实施方案15或16所述的方法，其中分离的载体包含选自seqidno：9‑13、17和18的核酸序列。87.实施方案18是一种生成根据实施方案15‑17中任一项所述的分离的载体的方法，其中该方法包括：88.a.使宿主细胞与分离的载体接触；89.b.使宿主细胞在产生该载体的条件下生长；90.c.从宿主细胞分离载体。91.实施方案19是根据实施方案18所述的方法，其中宿主细胞在基本培养基中生长。92.实施方案20是根据实施方案19所述的方法，其中基本培养基包含乳糖作为唯一碳源。93.实施方案21是根据实施方案20所述的方法，其中基本培养基包含约1％至约4％重量/体积(w/v)乳糖。94.实施方案22是根据实施方案21所述的方法，其中基本培养基包含约2％w/v乳糖。95.实施方案23是一种分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，该分离的β‑半乳糖苷酶表达盒包含编码可操作地连接至启动子的β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段的核酸序列。96.实施方案24是根据实施方案23所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段包含与seqidno：1具有至少75％同一性的氨基酸序列。97.实施方案25是根据实施方案23或24所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中β‑半乳糖苷酶的氨基末端片段包含seqidno：1的氨基酸序列。98.实施方案26是根据实施方案23‑25中任一项所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中核酸序列还包含复制起点。99.实施方案27是根据实施方案26所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中复制起点为高拷贝复制起点。100.实施方案28是根据实施方案27所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中高拷贝复制起点为puc57复制起点。101.实施方案29是根据实施方案28所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中puc57复制起点包含seqidno：19的核酸序列。102.实施方案30是根据实施方案23‑29中任一项所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中分离的β‑半乳糖苷酶表达盒还包含二聚体解离元件。103.实施方案31是根据实施方案30所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中二聚体解离元件包含具有位点特异性重组酶识别位点的核酸序列。104.实施方案32为根据实施方案30或31所述的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中二聚体解离元件还包含编码位点特异性重组酶的核酸序列。105.实施方案33是根据实施方案30‑32中任一项所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中二聚体解离元件为cole1二聚体解离元件。106.实施方案34是根据实施方案33所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒，其中cole1二聚体解离元件包含seqidno：20的核酸序列。107.实施方案35是一种分离的载体，该分离的载体包含根据实施方案23‑34中任一项所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。108.实施方案36是根据实施方案35所述的分离的载体，其中分离的载体的大小小于约1.5千碱基。109.实施方案37是根据实施方案35或36所述的分离的载体，其中分离的载体包含选自seqidno：9‑13、17和18的核酸序列。110.实施方案38是一种试剂盒，该试剂盒包含：111.a.根据实施方案23‑37中任一项所述的分离的β‑半乳糖苷酶表达盒；以及112.b.在乳糖操纵子中包含缺失的宿主细胞。113.实施方案39是根据实施方案38所述的试剂盒，该试剂盒还包含基本培养基，该基本培养基包含乳糖作为唯一碳源。114.实施方案40是根据实施方案38或39所述的试剂盒，其中载体包含分离的β‑半乳糖苷酶表达盒。115.实施方案41是根据实施方案38‑40中任一项所述的试剂盒，其中宿主细胞包含laczδm15缺失。116.实施方案42是根据实施方案41所述的试剂盒，其中宿主细胞选自大肠杆菌宿主细胞和酵母宿主细胞。117.实施例118.实施例1：经由β‑半乳糖苷酶的α‑互补的质粒选择而不是top10细胞中的抗生素选择119.材料120.细胞：oneshottop10感受态细胞(thermo‑fisher公司(waltham，ma)；目录号c404003)。neb5‑α(newenglandbiolabs公司(ipswich，ma)；目录号c2987)。gt115(invivogen公司(sandiego，ca)；目录号gt115‑21)。nebstable(newenglandbiolabs公司；目录号c3040h)。stellar(takarabiousa公司(mountainview，ca)；目录号636766)。dh10b(thermo‑fisher公司；目录号18297010)。stbl3(thermo‑fisher公司；目录号c737303)。xli‑blue(agilent公司(santaclara，ca)；目录号200236)。121.质粒：puc19(thermo‑fisherscientific公司；目录号sd0061)。pbluescriptii.ks(‑)(agilent公司(santaclara，ca)；目录号212208)。克隆p215(seqidno：9)和p216(seqidno：10)。gwiz‑luciferase(genlantiscorporation公司(sandiego，ca)；p030200)。p219(seqidno：13；图5)。p469‑2(seqidno：17；图6)。122.培养基：m9+乳糖培养基(teknova公司(hollisterca)；目录号m1348‑04(平板))：0.3％kh2po4、0.6％na2hpo4、0.5％(85mm)nacl、0.1％nh4cl、2mmmgso4、50mg/ll‑亮氨酸、50mg/l异亮氨酸、1mm硫胺素、2％乳糖和1.5％琼脂。123.m9+葡萄糖培养基(teknova公司(hollisterca)；目录号m1346‑04(平板))：0.3％kh2po4、0.6％na2hpo4、0.5％(85mm)nacl、0.1％nh4cl、2mmmgso4、50mg/ll‑亮氨酸、50mg/l异亮氨酸、1mm硫胺素、1％葡萄糖和1.5％琼脂。lb‑羧苄青霉素(100)平板(teknova公司(hollisterca)；目录号l1010)。lb平板(teknova公司(hollisterca)；l1100)。lb+60μg/mlx‑gal，0.1mmiptg(teknova公司(hollisterca)；l1920)。soc培养基(thermo‑fisher公司；15544034)。lb肉汤(thermo‑fisher公司；10855021)；d‑pbs，ph7.1，不合mg2+且不含ca2+(thermofisher公司，14200‑075)。124.结果125.不含抗生素选择标记的质粒对于基因疗法应用和治疗剂产品的细胞系开发是期望的。据报道，1kb或更小的质粒主链在体内递送给动物时可用于避免基因沉默。这些实验的目的是探索一种用于开发用于在大肠杆菌中选择含质粒细胞的小代谢选择标记的新策略。126.假设表达β‑半乳糖苷酶的α肽的质粒可与top10细胞中的laczδ15等位基因互补，从而完成乳糖操纵子并允许细胞在以乳糖作为唯一碳源的基本培养基上生长。127.质粒puc19和pbluescriptii两者均表达β‑半乳糖苷酶α肽融合蛋白。测试这些质粒是否能够与top10宿主菌株中的lac突变互补并允许其在基本培养基上生长。128.为了测试puc19和/或pbluescriptii是否能够与top10细胞中的laczδ15突变互补，使用以下程序将这些质粒转化到细胞中。129.如下在无菌微量离心管中制备两种转化体混合物：1)1μl(100pg)pbluescriptii质粒+50μloneshottop10细胞；2)1μl(10pg)puc19质粒+50μloneshottop10细胞。将转化体混合物在冰上温育30分钟，然后在42℃下热休克30秒。热休克后，将转化体混合物在冰上温育1分钟。向转化体混合物中加入450μlsoc培养基，并将细胞在37℃并振荡下温育1小时。将含有细胞的转化体混合物离心，并将细胞重悬于500μl无菌d‑pbs缓冲液中。将细胞离心并重悬两次以上。对于每个样品，在d‑pbs中制备细胞的两个1∶10系列稀释液。将200μl的每种稀释液涂覆到m9+乳糖平板上。另外将200μl的前两种稀释液涂覆到lb‑羧苄青霉素(100)平板上。将平板在37℃下温育过夜。130.过夜温育后，有许多来自两种转化体的菌落接种到lb‑羧苄青霉素(100)平板上；将这些平板保存在4℃下。未见来自任一种转化体的菌落接种到m9+乳糖平板上；将这些平板在37℃下再温育24小时。在m9‑乳糖平板上未见菌落。将细胞在30℃下再培养48小时。在这些平板上未见菌落，甚至在长时间温育后也未见菌落。131.表达lacz‑α融合肽的克隆载体都不能与top10宿主菌株中的lac突变互补，以允许在含有乳糖作为唯一碳源的基本培养基中生长。132.puc19和pbluescriptii克隆载体对lacz‑α肽融合蛋白的表达可能不足以与所测试的宿主菌株中的lac突变充分地互补。两种载体均产生通过多克隆区域转录的融合蛋白，并且此类融合蛋白对于与laczδ15突变互补来说可能是次优的。133.实施例2：在大肠杆菌中用作代谢选择标记的表达lacz的质粒134.设计了两个具有中等启动子和强启动子的lacz‑α表达盒(分别为laczya和ompf)。ompf启动子序列基于stavropoulos等人所使用的ompf启动子(stavropoulos和strathdee，genomics，第72卷第1期，第99‑104页，2001年)。laczya启动子来源于pbluescript中的序列以及由lac阻遏蛋白结合的乳糖操纵子序列。135.对于laczα肽的开放阅读框(orf)，reddy(reddy，biotechniques，第37卷第6期，第948‑952页，2004年)报道称质粒puc19产生的β‑半乳糖苷酶活性比pbluescript高约10倍。这些质粒具有驱动laczα肽的同一启动子元件。然而，pbluescript具有比puc19长得多的多接头，并且puc19编码非laczc末端残基。这些差异中哪一种差异导致更高的puc19β‑半乳糖苷酶活性是未知的。nishiyama等人发现60个氨基酸的n‑末端α肽在其测定中具有最大的β‑半乳糖苷酶活性(nishiyama等人，proteinsci.，第24卷第5期，第599‑603页，2015年)。使用来自菌株mg1655的在残基60处截短的以下野生型laczα区域：mtmitdslavvlqrrdwenpgvtqlnrlaahppfaswrnseeartdrpsqqlrslngewr(seqidno：1)。136.终止子序列来源于orosz等人所述的rmbt2终止子(orosz等人，eur.j.biochem.，第201卷第3期，第653‑659页，1991年)。137.通过基因合成在genewiz(southplainfield，nj)构建p215(seqidno：9)(图1)和p216(seqidno：10)(图2)质粒。质粒含有氨苄青霉素抗性盒和4.9kb转基因。138.结果139.不含抗生素选择标记的质粒对于基因疗法应用和治疗剂产品的细胞系开发是期望的。据报道，1kb或更小的质粒主链在体内递送给动物时可用于避免基因沉默。这些实验的目的是探索一种用于开发用于在大肠杆菌中选择含质粒细胞的小代谢选择标记的新策略。140.假设表达β‑半乳糖苷酶的α肽的质粒可与top10细胞中的laczδ15等位基因互补，从而完成乳糖操纵子并允许细胞在以乳糖作为唯一碳源的基本培养基上生长。141.在实施例1中，测试了表达laczα融合肽的puc19和pbluescript载体是否可与top10细胞互补并允许它们在含有乳糖的基本培养基上生长。这些实验不成功。142.基于以下假设：由这些载体编码的laczα融合蛋白在与laczδ15突变互补方面是次优的，并且不以足够高的水平表达以实现在含乳糖基本培养基上生长，合成具有新型laczα表达盒的载体。测试这些载体与laczδ15突变互补的能力。将十纳克(ng)的质粒p215和p216以及pbluescriptii转化到50μloneshottop10细胞中。将细胞与dna在冰上温育20分钟，在42℃下热休克30秒，并放回冰上温育1分钟。将450μlsoc加入细胞中，将细胞在37℃并振荡下温育1小时。取出250μl细胞并将剩余的细胞放回培养箱中。将所提取的细胞用500μl的d‑pbs洗涤两次，并在最后一次洗涤后重悬于200μl的d‑pbs中。将50μl细胞接种在lb‑羧苄青霉素(100)、m9+葡萄糖和m9+乳糖平板上，并将平板在37℃下温育。在热休克后4.5小时后，如上所述洗涤来自培养箱的剩余细胞，并将其接种到m9+葡萄糖和m9+乳糖平板上。将平板在37℃下温育过夜。143.接种在m9+葡萄糖上的转化体形成细胞菌苔，这表明top10宿主细胞可以在这些平板上生长。接种在lb‑羧苄青霉素(100)上的转化体也产生多个菌落。将lb‑羧苄青霉素平板保存在4℃下。m9+乳糖平板保持在37℃下以再温育24小时。144.当接种在m9+乳糖平板上时，允许恢复一小时的转化体或允许恢复四小时的转化体均产生大量的菌落。在pbluescriptii转化体上无菌落确认了来自实施例1的结果，表明pbluescriptii无法通过laczδ15突变的互补产生足够的β‑半乳糖苷酶以允许在乳糖基本培养基上生长。将平板保存在4℃下。145.在不存在抗生素选择的情况下，将天然质粒诸如cole1有效维持在大肠杆菌宿主中，而puc系列载体可在不存在选择的情况下以高速率从细胞中丢失(summers，molecularmicrobiology，第29卷，第1137‑1145页，1998年)。然而，考虑到p215和p216转化的细胞在基本培养基上相对于在富lb培养基上生长速率慢得多，如果质粒丢失的频率不太高，则质粒dna纯化在不存在选择的情况下使细胞培养物在lb中生长更快且成本更低。包含β‑半乳糖苷酶α‑互补质粒的细胞容易与在lb‑iptg‑xgal平板上生长的不含质粒的细胞区分开，因为β‑半乳糖苷酶水解xgal(5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚基‑β‑d‑吡喃半乳糖苷)指示剂，使细胞变成蓝色。当这些细胞在不存在抗生素的情况下在lb培养基中生长时，该测定用于研究质粒丢失的频率。146.通过在lb‑iptg‑xgal平板上划线分离细胞来获得纯的细胞群，并且包含质粒的菌落变成蓝色。如所预期的，在平板上划线分离的大部分菌落是蓝色的。147.在获得纯的细胞群后，使细胞的连续培养物生长。选取单个蓝色菌落并使其在15ml管中的2mllb培养基中生长。将培养物在37℃并振荡下温育过夜。148.将来自培养物的细胞划线分离到lb‑iptg‑xgal平板上，并将平板在37℃下温育过夜。再次划线的平板上的菌落是蓝色的。将单个菌落接种在250ml烧瓶中的50mllb中，并在37℃并振荡下温育过夜。149.将50μl的过夜培养物的10‑4稀释液接种到lb‑iptg‑xgal平板上。将平板在37℃下温育过夜。取50ml培养物中的1μl稀释成50mllb中的新培养物溶液(50,000倍稀释)。使培养物在37℃下生长过夜。150.温育过夜后，观察到平板上的所有菌落均为蓝色的。将前一天晚上50ml培养物的10‑4稀释液中的50μl接种在lb‑iptg‑xgal平板上。取前一天晚上50ml培养物中的1μl稀释成50mllb中的新培养物溶液(50,000倍稀释)。使培养物在37℃下生长过夜。151.温育过夜后，在含有50μl的10‑4稀释液的平板上观察到约1000个菌落。p215转化的所有菌落均为蓝色的，在p216转化平板上仅观察到3个白色菌落。152.结果表明，质粒p215和p216即使在不存在选择的情况下也是稳定的。对于p215和p216，这些质粒分别为7.2kb和7.3kb。从单个菌落到50ml，然后以1∶50,000稀释并生长汇合两次，表明细胞可在不存在选择的情况下生长至1.25×108升的体积，同时仍将质粒保留在大多数细胞中。当热休克后使细胞在soc培养基中恢复一小时时相对于当恢复四小时时，转化效率是相似的。153.所构建的α互补质粒与top10细胞中的laczδ15突变互补，从而实现在以乳糖作为唯一碳源的基本培养基上生长。还发现这些质粒在不存在选择性压力的情况下在lb液体培养物中是稳定的。154.实施例3：减小β‑半乳糖苷酶α互补质粒的大小155.在先前的实验中，已证明，来自p215和p216质粒的β‑半乳糖苷酶α肽的表达可用作质粒上的选择标记，从而替代抗生素抗性基因。接下来，为了限定最小可能的复制子，探索限定质粒的哪些区域对于质粒在大肠杆菌中的选择和复制是必需的。156.结果157.使用标准克隆技术，从质粒p215中移除mcherry和嘌呤霉素抗性基因，以形成质粒p217(seqidno：11)(图3)。158.使用标准克隆技术从质粒p217中移除氨苄青霉素抗性基因。将所连接的dna转化到50μl的top10细胞中，在冰上温育20分钟，热休克30秒，并在冰上再温育3分钟。温育后，将450μl的soc培养基加入细胞中，并将细胞在37℃并振荡下温育1小时。将细胞制粒并用1ml的d‑pbs洗涤3次。将细胞接种到m9‑乳糖平板上并在37℃下温育两天。选取来自转化体的菌落并划线分离到lb‑iptg‑xgal平板上。每个克隆的所得菌落均为蓝色的。选取单个克隆(克隆p218(seqidno：12；图4))，并且dna测序确认已经形成期望的缺失。159.为了进一步减小β‑半乳糖苷酶选择盒的大小，rmbt2转录终止子(seqidno：7)有缺失。除了该序列可能不需要维持转录物稳定性之外，据报道来自puc57/pmb1起点上游启动子的通读转录可通过增加通过该起点的复制引物区的转录来增加拷贝数(panayotatos，nucleicacidres.，第12卷第6期：第2641‑2648页，1984年；oka等人，molgengenet.，第172卷第2期，第151‑159页，1979年)。160.使用标准克隆技术，获得缺失构建体p219的克隆(seqidno：13；图5)。通过dna测序确认缺失。161.通过该工作阐明的最小β‑半乳糖苷酶表达盒/复制起点盒(seqidno：18)为938bp。其实现了小于1kb的目标，以便避免与较大质粒主链相关联的哺乳动物细胞中的dna沉默(lu等人，mol.ther.，第20卷第11期，第2111‑2119页，2012年)。162.实施例4：形成具有萤火虫荧光素酶表达盒的β‑半乳糖苷酶α互补载体163.在上文提供的实施例中，构建了使用β‑半乳糖苷酶突变的α互补作为选择标记而不是抗生素抗性基因的质粒。为了确定当质粒大小增加时dna复制是否仍然有效，采用标准克隆技术，使用上文定义的最小β‑半乳糖苷酶表达盒/复制起点序列(seqidno：18)替代现有质粒的抗生素选择标记和复制起点。164.使用标准克隆技术将来自gwiz‑荧光素酶质粒(seqidno：16)的cmv启动子‑荧光素酶‑polya表达盒克隆到p219中。转化到oneshottop10细胞中，接种到m9+乳糖平板上，并在37℃下温育2天，得到大菌落。将菌落再次划线分离到lb‑iptg‑xgal平板上并在37℃下温育过夜。165.使用引物cnfor(seqidno：14)和p455r2(seqidno：15)，针对插入序列筛选转化反应的蓝色菌落。选取两个pcr阳性菌落并用于接种在37℃下生长的6mllb培养物。从培养物中分离dna，并且通过用分光光度计测量其od260来估计dna收率(表1)。166.表1：选定克隆的dna收率[0167][0168]对于克隆p469‑2，将500ml烧瓶中的200mllb用单个蓝色菌落接种，并在37℃下在振荡培养箱中生长18小时。使用qiagenhispeedmaxiprep试剂盒从该培养物中纯化dna，并回收440μg的dna。[0169]在genewiz测序确认质粒p469‑2(seqidno：17)。[0170]在该实施例中，卡那霉素抗性基因和gwiz‑荧光素酶的复制起点被上文定义的最小β‑半乳糖苷酶/复制起点成功替代。当该克隆在lb培养基中在不存在选择性压力的情况下生长时，实现了可接受的质粒收率。[0171]实施例5：在多种大肠杆菌菌株中测试β‑半乳糖苷酶α互补载体功能[0172]为了鉴定其中β‑半乳糖苷酶α肽可用作选择性标记而不是抗生素抗性基因的另外的大肠杆菌菌株，通过dna转染到8种不同的菌株中来测试上文所构建的质粒中的一个质粒。[0173]表2：细菌菌株[0174][0175]结果[0176]将50μl表2中的大肠杆菌菌株与1ng的质粒p469‑2在无菌微量离心管中的冰上温育30分钟。将细胞在42℃下热休克30秒，并在冰上温育1分钟。将450μlsoc培养基加入除neb‑stable细胞之外的所有细胞中。将450μl的neb‑stable扩增培养基(由制造商提供)加入转化的neb‑stable细胞中。将细胞在37℃并振荡下温育1小时。将细胞制粒并用1ml的d‑pbs洗涤3次。将细胞接种到m9‑乳糖平板上并在37℃下温育三天。[0177]可以预知，在平板上未检测到来自stb13转化的细胞的菌落，该菌落被包括作为阴性对照。菌株中的五种菌株(top10、gt115、neb‑stable、stellar和dh10b)具有正常大小的菌落。两个菌株(neb‑a和xl1‑blue)具有小菌落。这是期望的，因为与neb‑α(dh5α)和xl1‑blue相似的菌株在purb基因中包含导致在基本培养基上生长缓慢的突变(jung等人，applenviron.micro.，第76卷，第6307‑6309页，2010年)。[0178]将xl1‑blue和neb‑α平板在37℃下再温育一天。[0179]通过将来自m9‑乳糖平板的菌落划线分离到lb‑iptg‑xgal平板上并在37℃下温育来获得纯菌落。将蓝色菌落(含有质粒的细胞)再次划线分离到lb‑iptg‑xgal平板上并在37℃下温育，这得到大部分蓝色细胞。[0180]包含φ80dlaczδm15标记的全部所测试菌株均可通过β‑半乳糖苷酶α肽表达质粒p469‑2来转化，并在以乳糖作为唯一碳源的m9基本培养基上进行选择。在f附加体上包含标记laciqzδm15的菌株xl1‑blue的质粒p469‑2转染子在m9‑乳糖平板上也具有选择性。因此，已证明七种可商购获得的大肠杆菌菌株与β‑半乳糖苷酶选择性标记相容。[0181]本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。[0182]序列表[0183][0184][0185][0186][0187][0188][0189][0190][0191][0192][0193][0194][0195][0196][0197][0198][0199][0200][0201][0202][0203][0204][0205][0206][0207]当前第1页12当前第1页12