具有增加的乙醇生产的杂交酵母的制作方法

具有增加的乙醇生产的杂交酵母
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年1月8日提交的美国临时申请号62/789873的优先权，将其通过引用以其全文特此并入。
技术领域
3.本发明的组合物和方法涉及杂交酵母，所述杂交酵母与其亲本酵母相比从含淀粉底物产生增加量的乙醇。这种酵母非常适合用于燃料醇生产以增加产量。


背景技术：

4.第一代基于酵母的乙醇生产将糖转化为燃料乙醇。全世界酵母的年度燃料乙醇生产为约900亿升(gombert,a.k.和van maris.a.j.(2015)curr.opin.biotechnol.[生物技术现状]33:81
‑
86)。据估计，乙醇生产成本的约70％是原料。因为生产量如此大，所以甚至小的产量提升对该产业也具有巨大的经济影响。
[0005]
比它们的野生型亲本产生更多乙醇的工程化酵母，甚至人工进化的酵母，都是可商购的。然而，所有形式的工程化均涉及折衷，即使酵母的代谢工程亦不例外。工程化酵母典型地具有不希望的性质，例如生长速率缓慢、稳健性降低、不能在高溶解固体(ds)的存在下生长、以及不希望的副产物的生产增加。
[0006]
存在对于产生更多醇、在高ds的存在下快速生长并且在提高的温度生长的酵母的需要。


技术实现要素：

[0007]
描述了涉及杂交酵母细胞的组合物和方法，所述杂交酵母细胞与它们的亲本酵母相比从含淀粉底物产生增加量的乙醇。经修饰的酵母细胞和方法的方面和实施例描述于以下独立编号的段落中。
[0008]
1.在一方面，提供了酵母菌株，其为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)菌株dgy1(以登录号v18/015412保藏于澳大利亚维多利亚州国家计量研究所)、saccharomyces cerevisiae strain dgy1(deposited under accession no.v18/015412at national measurement institute,victoria,australia)；或其衍生物，所述衍生物具有酵母菌株酿酒酵母(s.cerevisiae)菌株dgy1的定义特征。
[0009]
2.在一些实施例中，如段落1所述的酵母菌株进一步包含导致所述菌株的细胞产生减少量的功能性dls1多肽的遗传改变。
[0010]
3.在如段落1或2所述的酵母菌株的一些实施例中，所述菌株的细胞包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
[0011]
4.在如段落3所述的酵母菌株的一些实施例中，所述编码碳水化合物加工酶的外源基因编码葡糖淀粉酶。
[0012]
5.在如段落1
‑
4中任一项所述的酵母菌株的一些实施例中，所述菌株的细胞包含
甘油途径和/或乙酰辅酶a途径中的改变。
[0013]
6.在如段落1
‑
5中任一项所述的酵母菌株的一些实施例中，所述菌株的细胞包含用于制备乙醇的备选途径。
[0014]
7.在另一方面，提供了用于从含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括：(a)糖化所述含淀粉材料以获得葡萄糖；以及(b)使用发酵生物体将所述葡萄糖发酵以生产乙醇；其中所述发酵生物体是酿酒酵母菌株dgy1(以登录号v18/015412保藏于澳大利亚维多利亚州国家计量研究所)、或其衍生物，所述衍生物具有酿酒酵母菌株dgy1的定义特征。
[0015]
8.在如段落7所述的方法的一些实施例中，在等同发酵条件下与亲本菌株相比所述酵母菌株产生增加量的醇。
[0016]
9.在如段落7或8所述的方法的一些实施例中，所述酵母菌株的细胞进一步包含导致所述菌株的细胞产生减少量的功能性dls1多肽的遗传改变。
[0017]
10.在如段落7
‑
9中任一项所述的方法的一些实施例中，所述酵母菌株的细胞进一步包含编码碳水化合物加工酶的外源基因。
[0018]
11.在如段落10所述的方法的一些实施例中，所述编码碳水化合物加工酶的外源基因编码葡糖淀粉酶。
[0019]
12.在如段落7
‑
11中任一项所述的方法的一些实施例中，所述菌株的细胞包含甘油途径和/或乙酰辅酶a途径中的改变。
[0020]
13.在如段落7
‑
12中任一项所述的方法的一些实施例中，所述菌株的细胞包含用于制备乙醇的备选途径。
[0021]
根据说明书，本发明的组合物和方法的这些和其他方面和实施例将是显而易见的。
具体实施方式
[0022]
i.概述
[0023]
本发明的组合物和方法涉及杂交酵母细胞，所述杂交酵母细胞在相同的发酵条件下与它们的亲本细胞相比从含淀粉底物产生增加量的乙醇。下文详细描述了所述组合物和方法的方面和实施例。
[0024]
ii.定义
[0025]
在详细地描述经修饰的酵母细胞和使用方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
[0026]
如本文所使用的，“醇”是指其中羟基官能团(
‑
oh)与饱和碳原子键合的有机化合物。
[0027]
如本文所使用的，术语“酵母细胞”、“酵母菌株”、或简称“酵母”是指来自子囊菌门(ascomycota)和担子菌门(basidiomycota)的生物体。示例性酵母是来自酵母目(saccharomycetales)的芽殖酵母。酵母的具体实例是酵母属物种，包括但不限于酿酒酵母。酵母包括用于生产燃料醇的生物体以及用于生产可饮用醇的生物体，包括用于制备独特味道的啤酒、葡萄酒和其他发酵饮料的特种和专有酵母菌株。
[0028]
如本文所使用的，短语“变体酵母细胞”、“经修饰的酵母细胞”或类似短语(参见上文)是指包括本文所述的遗传修饰和特征的酵母。变体/经修饰的酵母不包括天然存在的酵
母。
[0029]
如本文所使用的，短语“基本上无活性”或相似短语意指指定活性在混合物中不可检测或以不会干扰混合物的预期目的的量存在。
[0030]
如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”(以及它们各自的复数形式)可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规一字母或三字母代码，并且所有序列均从n
‑
末端到c
‑
末端方向进行呈现。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。这些术语还包括天然地修饰的或通过干预而修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。所述定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
[0031]
如本文所使用的，功能上和/或结构上相似的蛋白质被认为是“相关的蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或物种的生物体，或甚至不同纲的生物体(例如，细菌和真菌)。相关的蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的、或者通过免疫交叉反应性确定的同源物。
[0032]
如本文所使用的，术语“同源蛋白”或“同源物”是指与参考蛋白具有相似活性和/或结构的蛋白。这并不旨在意味着同源物必定与进化相关。因此，所述术语旨在涵盖从不同生物体获得的相同、相似、或相应(即，在结构和功能方面)的一种或多种酶。在一些实施例中，希望鉴定与参考蛋白具有类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白作为参考蛋白诱导相似的一种或多种免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白经过工程化以产生具有一种或多种所希望的活性的酶。
[0033]
序列之间的同源性程度可以使用本领域已知的任何适合方法确定(参见，例如，smith和waterman(1981)adv.appl.math.[应用数学进展]2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.[分子生物学杂志],48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444；威斯康星遗传学软件包(wisconsin genetics software package)(遗传学计算机组公司(genetics computer group)，麦迪逊，威斯康星州)中的程序，如gap、bestfit、fasta和tfasta；和devereux等人，(1984)nuc.acids res[核酸研究].12:387
‑
95)。
[0034]
例如，pileup是确定序列同源性水平的有用程序。pileup使用渐进的、两两比对创建了来自一组相关序列的多重序列比对。它还可以绘制显示用于创建所述比对的聚类关系的一个树。pileup使用feng和doolittle的渐进比对方法的简化(feng和doolittle(1987)j.mol.evol.[分子进化杂志]35:351
‑
60)。所述方法类似于higgins和sharp描述的方法((1989)cabios[计算机在生物学中的应用]5:151
‑
53)。有用的pileup参数包括为3.00的默认空位权重，为0.10的默认空位长度权重，以及加权的末端空位。有用算法的另一个实例是blast算法，由以下描述：altschul等人((1990)j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403
‑
10)和karlin等人((1993)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]90:5873
‑
87)。一个特别有用的blast程序是wu
‑
blast
‑
2程序(参见，例如，altschul等人(1996)meth.enzymol.[酶学方法]266:460
‑
80)。参数“w”、“t”、以及“x”确定了所述比对的灵敏度与速度。所述blast程序使用字长(w)为11、blosum62得分矩阵(参见，例如，henikoff和henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89:10915)比对(b)为50、
期望值(e)为10、m
′
5、n
′‑
4、以及两条链的比较作为默认值。
[0035]
如本文所使用的，在至少两个核酸或多肽的上下文中，短语“基本上相似”和“基本上相同”典型地意指多核苷酸或多肽包含与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约91％同一性、至少约92％同一性、至少约93％同一性、至少约94％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性、或甚至至少约99％同一性、或更高同一性的序列。使用具有默认参数的clustal w算法计算序列同一性百分比。参见thompson等人(1994)nucleic acids res.[核酸研究]22:4673
‑
4680。clustal w算法的默认参数是：
[0036][0037]
两种多肽基本上相同的另一个指示是第一多肽与第二多肽具有免疫交叉反应性。典型地，差别在于保守氨基酸取代的多肽具有免疫交叉反应性。因此，多肽与第二多肽基本上相同，例如，其中两个肽仅相差保守取代。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子在严格条件下(例如，在中等至高严格的范围内)彼此杂交。
[0038]
如本文所使用的，术语“基因”与术语“等位基因”同义，是指编码和指导蛋白质或rna表达的核酸。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因此指定基因的单拷贝(即单个等位基因)足以赋予特定表型。
[0039]
如本文所使用的，“表达多肽”和类似术语是指使用细胞的翻译机制(例如，核糖体)产生多肽的细胞过程。
[0040]
如本文所使用的，“过表达多肽”、“提高多肽的表达”和类似术语是指与不包括指定的遗传修饰的亲本或“野生型细胞”所观察到的相比，以比正常较高的水平表达多肽。
[0041]
如本文所使用的，“表达盒”是指包含氨基酸编码序列、启动子、终止子以及允许在细胞中产生所编码的多肽所需的其他核酸序列的核酸。表达盒可以是外源的(即，引入细胞
中)或内源的(即，存在于细胞中)。
[0042]
如本文所使用的，术语“野生型”和“天然的”可互换使用，并是指天然发现的基因、蛋白质或菌株。
[0043]
如本文所使用的，术语“目的蛋白”是指希望在经修饰的酵母中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白、选择性标记等，并且能以高水平表达。目的蛋白由相对于亲本菌株的经修饰的内源基因或异源基因(即，目的基因)编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌的蛋白表达。
[0044]
如本文所使用的，“基因的缺失”是指所述基因从宿主细胞的基因组中去除。当基因包括与基因编码序列不紧邻的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列、以及任选地相邻增强子元件(例如，包括但不限于启动子和/或终止子序列)的缺失，但未要求非相邻控制元件的缺失。
[0045]
如本文所使用的，“基因的破坏”泛指任何实质上阻止细胞在宿主细胞中产生功能性基因产物(例如，蛋白质)的遗传的或化学的操作(即，突变)。示例性破坏方法包括基因的任何部分的完全或部分(包括多肽编码序列、启动子、增强子或另外的调节元件)缺失、或其诱变，其中诱变涵盖取代、插入、缺失、倒位、及其组合和变化，任何这些突变基本上阻止功能基因产物的产生。也可以使用rnai、反义、或任何其他消除基因表达的方法破坏基因。可以通过非相邻控制元件的缺失或遗传操作来破坏基因。
[0046]
如本文所使用的，术语“遗传操作”和“遗传改变”可互换地使用，并且是指核酸序列的改变/变化。改变可包括但不限于核酸序列中至少一种核酸的取代、缺失、插入或化学修饰。
[0047]
如本文所使用的，“功能性多肽/蛋白质”是具有活性(如酶活性、结合活性、表面活性性质等)的蛋白质，并且其未被诱变、截短或以其他方式修饰以废除或减少所述活性。如所指出的，功能性多肽可以是热稳定的或不耐热的。
[0048]
如本文所使用的，“功能性基因”是能够被细胞组分用于产生活性基因产物(典型地是蛋白质)的基因。功能性基因是破坏的基因的对立体，破坏的基因被修饰使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
[0049]
如本文所使用的，如果已对酵母细胞进行遗传或化学改变以阻止产生呈现出野生型蛋白质的活性特征的功能性蛋白质/多肽，则对所述酵母细胞已经进行了“修饰以阻止产生特定蛋白质”。此类修饰包括但不限于编码蛋白质(如本文所述)的基因的缺失或破坏、使得编码的多肽缺乏前述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰、及其组合。
[0050]
如本文所使用的，术语“旁系同源物”是指作为重复事件的结果的同源基因。
[0051]
如本文所使用的，“途径的减弱”或“通过途径的通量的减弱”(即，生物化学途径)泛指通过代谢途径减少或完全阻止生物化学底物或中间体的通量的任何遗传的或化学的操作。可以通过各种众所周知的方法实现途径的减弱。此类方法包括，但不限于：完全或部分缺失一个或多个基因、用编码具有减少的催化活性或增加的km值的酶的突变体形式替代这些基因的野生型等位基因、修饰启动子或控制一种或多个基因表达的其他调控元件、针对减少的稳定性工程化所述酶或编码这些酶的mrna、将酶错误指导进不太可能与底物和中间体相互作用的细胞区室、使用干扰rna等。
[0052]
如本文所使用的，“需氧发酵”是指在氧存在下的生长。
[0053]
如本文所使用的，“厌氧发酵”是指在不存在氧的情况下的生长。
[0054]
如本文所用，除非上下文另外明确指明，否则单数冠词“一个/种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
[0055]
℃
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摄氏度
[0056]
aa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
α
‑
淀粉酶
[0057]
bp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
碱基对
[0058]
dna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
脱氧核糖核酸
[0059]
dp
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合度
[0060]
ds或ds
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
干固体
[0061]
etoh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙醇
[0062]
g或gm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
克
[0063]
g/l
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
克/升
[0064]
ga
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
葡糖淀粉酶
[0065]
gau/g ds
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
葡糖淀粉酶单元/克干固体
[0066]
h2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
水
[0067]
hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
高效液相色谱
[0068]
hr或h
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
小时
[0069]
kg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
千克
[0070]
m
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摩尔
[0071]
mg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫克
[0072]
ml或ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫升
[0073]
ml/min
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫升/分钟
[0074]
mm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫摩尔
[0075]
n
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
正常
[0076]
nm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
纳米
[0077]
pcr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
聚合酶链式反应
[0078]
ppm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
份/百万份
[0079]
rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核糖核酸
[0080]
δ
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
与缺失有关
[0081]
μg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微克
[0082]
μl和μl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微升
[0083]
μm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微摩尔
[0084]
iii.从淀粉底物产生增加的乙醇的杂交酵母
[0085]
描述了从含淀粉底物产生增加量的乙醇的杂交酵母。许多经遗传修饰的酵母已经被描述为与它们的亲本酵母相比产生增加量的乙醇。增加的乙醇生产通常通过引入将碳引导至乙醇生产的异源代谢途径来实现。不幸的是，这样的酵母通常产生增加量的有毒副产物，例如乙酸盐、甲酸盐、杂醇油(fusel alcohols)等。当与其他胁迫因素(例如提高的温度
和低ph的发酵条件)组合时，此类副产物可能尤其有毒。
[0086]
尽管代谢途径工程化能够产生具有大量有利性质的酵母细胞，但对于代谢通量和氧化还原再平衡的整体修饰是复杂的。因此，申请人已使用先进的高通量形式的酵母配对(yeast mating)和表型选择，以生成展示出增加的乙醇生产同时具有最少不希望特征的酵母。
[0087]
将两种可商购的亲本酵母菌株用于配对。用于生成产生增加量的乙醇的杂交酵母细胞的配对和选择，生成了被命名为酿酒酵母菌株dgy1的酵母菌株，dgy1以登录号v18/015412保藏于澳大利亚维多利亚州国家计量研究所，并具有巴西sisgen注册号a9d1003。尽管正在进行分析以确定杂交菌株的基因型，但酿酒酵母菌株dgy1已经代表用于改善乙醇生产(特别是在提高的发酵温度和较低ph条件)的稳健的酵母菌株。
[0088]
在一些实施例中，由杂交酵母细胞产生的乙醇的量的增加与由在相同条件下生长的任一亲本酵母细胞产生的乙醇的量相比，增加至少2.0％、至少2.5％、至少3.0％、至少3.5％、至少4.0％、至少4.5％、至少5.0％、至少5.5％、或甚至至少6.0％或更高。
[0089]
iv.具有减少的dls1表达的杂交酵母细胞
[0090]
由基因yjl065c编码的dls1是isw2酵母染色质可及性复合物(ychrac)的167个氨基酸多肽亚基，所述isw2酵母染色质可及性复合物含有isw2、itc1、dpb3样亚基(dls1)、和dpb4(参见例如，peterson,c.l.(1996)curr.opin.genet.dev.[遗传学与发育新观点]6:171
‑
75以及winston,f和carlson,m.(1992)trends genet.[遗传学趋势]8:387
‑
91)。目前的研究人员和他们的同事先前已经确定，在没有其他遗传修饰的情况下，具有使细胞中功能性dls1的量减少的遗传改变的酵母在发酵过程中展现出增加的稳健性，从而允许更高的温度和可能更短的发酵(数据未显示)。
[0091]
减少细胞中产生的功能性dls1的量可以通过破坏yjl065c基因来完成。yjl065c基因的破坏可以使用基本上阻止功能性yjl065c基因产物(即，dls1)表达的任何适合方法进行。如本领域技术人员已知的示例性破坏方法包括但不限于：完全或部分缺失yjl065c基因，包括完全或部分缺失例如dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或其他调节元件；以及完全或部分缺失包含yjl065c基因任何部分的染色体的一部分。破坏yjl065c基因的具体方法包括在yjl065c基因的任何部分(例如，dls1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调节元件)中进行核苷酸取代或插入。优选地，缺失、插入和/或取代(统称为突变)通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作来进行，与通过化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。尽管如此，化学诱变理论上仍可用于破坏yjl065c基因。
[0092]
yjl065c基因突变可降低yjl065c启动子的效率、降低yjl065c增强子的效率、干扰yjl065c mrna的剪接或编辑、干扰yjl065c mrna的翻译、将终止密码子引入yjl065c编码序列以阻止全长tyjl065c蛋白的翻译、改变dls1蛋白的编码序列以产生活性更低或无活性的蛋白或减少dls1与其他核蛋白组分或dna的相互作用、改变dls1蛋白的编码序列以产生更不稳定的蛋白质或靶向蛋白质进行破坏、导致dls1蛋白错误折叠或被错误修饰(例如，通过糖基化)、或干扰dls1蛋白的细胞运输。在一些实施例中，这些和其他遗传操作用于减少或阻止功能性dls1蛋白的表达，或减少或阻止dls1的正常生物活性。
[0093]
在一些实施例中，本发明的杂交酵母细胞包括减少或阻止功能性dls1蛋白表达的遗传操作，或者减少或阻止dls1的正常生物活性的遗传操作；以及减少或阻止功能性isw2、
itc1或dpb4蛋白表达的额外的突变，或者减少或阻止isw2、itc1或dpb4蛋白的正常生物活性的额外的突变。在一些实施例中，本发明的杂交酵母细胞包括减少或阻止功能性dls1蛋白表达的遗传操作，或者减少或阻止dls1的正常生物活性的遗传操作；而不具有减少或阻止功能性isw2、itc1或dpb4蛋白表达的额外的突变，或者减少或阻止isw2、itc1或dpb4蛋白的正常生物活性的额外的突变。
[0094]
示例性酿酒酵母dls1多肽的氨基酸序列如以下seq id no:1所示：
[0095][0096]
基于此类blast和clustal w数据，显而易见的是示例性酿酒酵母dls1多肽(seq id no:1)与其他已知的酿酒酵母dls1多肽以及来自其他酵母属物种的dls1多肽共享非常高程度的序列同一性。因此，完全预期本发明的组合物和方法适用于含有此类结构上相似的多肽、以及其他相关的蛋白质、同源物和功能上相似的多肽的酵母细胞。
[0097]
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，被破坏的dls1蛋白的氨基酸序列与seq id no:1的氨基酸序列具有整体氨基酸序列同一性，为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。
[0098]
优选地，通过使用序列特异性分子生物学技术的遗传操作进行yjl065c基因的破坏，所述遗传操作与化学诱变相反，化学诱变通常不靶向特定核酸序列。然而，不排除化学诱变作为制备经修饰的酵母细胞的方法。
[0099]
在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性dls1多肽的量的减少是与在相同条件下生长的亲本杂交细胞中的功能性dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。在一些实施例中，经修饰的细胞中功能性dls1蛋白的表达的减少是与在相同条件下生长的亲本杂交细胞中的功能性dls1多肽的量相比，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多的减少。
[0100]
在一些实施例中，与亲本杂交细胞相比经修饰的细胞中醇的额外增加，与在相同条件下生长的亲本杂交细胞中的功能性dls1多肽的量相比增加至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％或更多。
[0101]
v.包括影响醇生产、甘油生产和/或乙酸盐生产的额外突变的杂交酵母细胞
[0102]
在一些实施例中，除了具有减少的功能性dls1多肽的表达之外，本发明的杂交酵母细胞任选地进一步包括影响醇、甘油和/或乙酸盐生产的额外的修饰。
[0103]
在特定的实施例中，杂交酵母细胞包括由引入异源磷酸转酮酶基因和异源磷酸转乙酰酶基因产生的人工途径或备选途径。示例性磷酸转酮酶可以从阴道加德纳菌(gardnerella vaginalis)(uniprot/trembl登录号：wp_016786789)获得。示例性磷酸转乙酰酶可以从植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)(uniprot/trembl登录号：wp_
003641060)获得。
[0104]
杂交酵母细胞可以进一步包括导致天然甘油生物合成途径减弱的突变，已知这些突变可增加醇产量。用于减弱酵母中甘油生物合成途径的方法是已知的，并包括例如通过破坏基因gpd1、gpd2、gpp1和/或gpp2中的一个或多个来降低或消除内源性nad依赖性甘油3
‑
磷酸脱氢酶(gpd)或磷酸甘油磷酸酶(gpp)活性。参见例如美国专利号9,175,270(elke等人)、8,795,998(pronk等人)和8,956,851(argyros等人)。
[0105]
杂交酵母的特征可以进一步在于增加的乙酰辅酶a合酶(也称为乙酰辅酶a连接酶)活性(ec 6.2.1.1)，以清除(即捕获)通过化学或酶水解乙酰磷酸产生(或出于任何其他原因存在于酵母的培养基中)的乙酸盐并将其转化为乙酰辅酶a。这避免了乙酸盐对酵母细胞生长的不良影响，并且可以进一步有助于醇产量的提高。增加乙酰辅酶a合酶活性可以通过将异源乙酰辅酶a合酶基因引入细胞、增加内源乙酰辅酶a合酶基因的表达等来实现。用于引入细胞中的特别有用的乙酰辅酶a合酶可以从康斯力鬃毛甲烷菌(methanosaeta concilii)(uniprot/trembl登录号：wp_013718460)获得。该酶的同源物，包括与上述来自康斯力鬃毛甲烷菌的乙酰辅酶a合酶具有至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、以及甚至至少99％氨基酸序列同一性的酶，也可用于本发明的组合物和方法中。
[0106]
在一些实施例中，杂交酵母细胞可进一步包括编码具有nad
+
依赖性乙酰化乙醛脱氢酶活性的蛋白质的异源基因和/或编码丙酮酸甲酸裂解酶的异源基因。例如，在美国专利号8,795,998(pronk等人)中描述了与甘油途径减弱进行组合的此类基因的引入。然而，在本发明组合物和方法的大多数实施例中，不需要引入乙酰化乙醛脱氢酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶，因为通过减弱导致氧化还原辅因子失衡的用于制备乙酰辅酶a的天然生物合成途径消除了对这些活性的需要。因此，本发明的组合物和方法的实施例特意缺失编码乙酰化乙醛脱氢酶、丙酮酸甲酸裂解酶或两者的一个或多个异源基因。
[0107]
在一些实施例中，本发明的杂交酵母细胞进一步包含丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述丁醇生物合成途径是异丁醇生物合成途径。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽催化选自由以下组成的组的底物至产物的转化：(a)丙酮酸至乙酰乳酸；(b)乙酰乳酸至2,3
‑
二羟基异戊酸盐；(c)2,3
‑
二羟基异戊酸盐至2
‑
酮异戊酸盐；(d)2
‑
酮异戊酸盐至异丁醛；和(e)异丁醛至异丁醇。在一些实施例中，所述异丁醇生物合成途径包含编码具有乙酰乳酸合酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、酮异戊酸脱羧酶、和醇脱氢酶活性的多肽的多核苷酸。
[0108]
在一些实施例中，本发明的杂交酵母细胞可以进一步过表达糖转运蛋白样(stl1)多肽以增加甘油的摄取(参见，例如，ferreira等人(2005)mol.biol.cell[细胞分子生物学]16:2068
‑
76；等人.(2015)mol.microbiol.[分子微生物学]97:541
‑
59和wo 2015023989 a1)。
[0109]
在一些实施例中，包含丁醇生物合成途径的杂交酵母细胞进一步包含编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的多核苷酸中的修饰。在一些实施例中，酵母细胞在编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的内源多核苷酸中包含缺失、突变和/或取代。在一些实施例中，具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽选自由以下组成的组：pdc1、pdc5、pdc6、及其组合。在一些实施例中，酵母细胞在一个或多个内源多核苷酸中进一步包含缺失、突变、过表达和/或取代，所述
内源多核苷酸编码fra2、ald6、adh1、gpd2、bdh1、dpb3、cpr1、mal23c、mnn4、pab1、tmn2、hac1、ptc1、ptc2、osm1、gis1、crz1、hug1、gds1、cyb2p、sfc1、mvb12、ldb10、c5sd、gic1、gic2、tda9和/或ymr226c。
[0110]
vi.杂交酵母细胞与其他有益突变的组合
[0111]
在一些实施例中，任选地与有益于醇、甘油或乙酸盐生产的其他遗传修饰组合的杂交酵母细胞进一步包含任何数目的编码目的蛋白的额外目的基因。目的蛋白包括选择性标记、碳水化合物加工酶以及其他商业上相关的多肽，包括但不限于选自下组的酶，该组由以下组成：脱氢酶、转酮醇酶、磷酸转酮酶、转醛醇酶、差向异构酶、植酸酶、木聚糖酶、β
‑
葡聚糖酶、磷酸酶、蛋白酶、α
‑
淀粉酶、β
‑
淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、海藻糖酶、脂肪酶、果胶酶、聚酯酶、角质酶、氧化酶、转移酶、还原酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、酯酶、异构酶、果胶酶、乳糖酶、过氧化物酶和漆酶。目的蛋白可以被分泌、糖基化和以其他方式修饰。
[0112]
vii.杂交酵母用于增加醇生产的用途
[0113]
本发明的组合物和方法包括在发酵反应中用于增加醇生产和/或减少甘油生产的方法。此类方法不限于特定的发酵过程。预期本发明的工程化酵母是任何醇发酵设施中常规酵母的“滴入式(drop
‑
in)”替代品，无论使用粗淀粉水解、同时糖化和发酵，或其他常规乙醇生产的标准变化。虽然主要用于燃料醇生产，但本发明的酵母还可用于生产可饮用醇，包括葡萄酒和啤酒。
[0114]
viii.适用于杂交和进一步修饰的酵母细胞
[0115]
酵母是被归类为真菌界成员的单细胞真核微生物，并且包括来自子囊菌门和担子菌门的生物。可以用于醇生产的酵母包括但不限于酵母属物种，包括酿酒酵母、以及克鲁维酵母属(kluyveromyces)、lachancea属和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)物种。许多酵母菌株是可商购的，其中许多已被选择或基因工程化以获得所需特征，例如高醇生产、快速生长速率等。一些酵母已经被基因工程化以产生异源酶，例如葡糖淀粉酶或α
‑
淀粉酶。
[0116]
ix.底物和产物
[0117]
从许多碳水化合物底物(包括但不限于玉米淀粉、甘蔗、木薯和糖蜜)中生产醇是众所周知的，正如酶条件和化学条件以及机械方法的无数变化和改善也是众所周知的。据信本发明的组合物和方法与此类底物和条件完全相容。
[0118]
醇发酵产物包括具有与碳原子键合的羟基官能团(
‑
oh)的有机化合物。示例性醇包括但不限于甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、2
‑
戊醇、异戊醇、和高级醇。最常制备的燃料醇是乙醇和丁醇。
[0119]
鉴于本说明书，本发明的酵母菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员是清楚的。以下实例旨在进一步说明但不限制所述组合物和方法。
[0120]
实例
[0121]
实例1.菌株dgy1的构建
[0122]
酿酒酵母菌株dgy1(简称dgy1)是杂交酵母菌株，所述杂交酵母菌株由来源于两种可商购工业谷物乙醇生产菌株的单倍体菌株(本文命名为菌株a和菌株b)配对构建。使菌株a和菌株b形成孢子，并将单倍体分离子分离。将来自每个菌株的一个分离子配对以生成杂交菌株dgy1，其以登录号v18/015412保藏于澳大利亚维多利亚州国家计量研究所，并具有
巴西sisgen注册号a9d1003。
[0123]
实例2.菌株dgy1在不同温度的乙醇生产
[0124]
在不同温度在液化物中对新酵母菌株dgy1进行了测试，以将其生产乙醇的能力与众所周知的用于醇生产的商业菌株基准酵母fermax
tm
gold(玛翠公司(martrex,inc.)，美国明尼苏达州查斯卡市；以下简称fg)进行比较。通过添加600ppm尿素、0.124sapu/g ds fermgen
tm
2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33gau/g ds变体木霉属(trichoderma)葡糖淀粉酶(trga)、2.28sscu/g ds曲霉属(aspergillus)α
‑
淀粉酶(acaa)、0.078thu/g ds海藻糖酶和0.113ftu/gds植酸酶，调节ph为4.8，来制备液化物(具有35％干固体含量的磨细的玉米浆料)。将100g液化物称重到250ml容器中，并用新鲜的dgy1或fg过夜培养物接种，并在32℃、34℃、37℃或表1中所示的温度斜坡条件孵育66h。基于随着时间的推移产生co2带来的累积压力，使用气体监测系统(安卡姆科技公司(ankom technology))来记录发酵速率。
[0125]
通过离心收集样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并使用phenomenex rezex
‑
rfq fast fruit柱(其在0.01nh2so4洗脱液中的等度流速为1ml/min)通过hplc(安捷伦科技公司1200系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油的含量。用于定量的校准标准品包括已知量的乙醇、葡萄糖、甘油和乙酸盐。分析结果显示在表2中。报道了相对于fg的乙醇增加。
[0126]
表1.温度斜坡条件
[0127]
时间(hr)温度(℃)0
‑
1032.010
‑
1233.012
‑
1534.015
‑
1735.017
‑
2235.522
‑
2734.527
‑
3134.031
‑
3633.536
‑
4133.041
‑
5532.555
‑
结束32.0
[0128]
表2.在不同温度的fg和dgy1的性能
[0129]
[0130][0131]
与fg相比，新菌株dgy1产生显著更多的乙醇(即约2％至5％以上)，特别是在提高的温度。与fg相比，dgy1也产生更少的甘油。实例3.具有yjl065c缺失的dgy1的构建
[0132]
通过yjl065c基因(其编码dls1)的缺失进一步修饰dgy1，产生菌株dgy1
‑
δ。dls1的氨基酸序列在以下作为seq id no:1提供：
[0133][0134]
使用标准酵母分子生物学技术，通过缺失dls1的基本上完整的编码序列，即通过缺失在酿酒酵母的起始密码子之前的4个碱基对到两个等位基因的终止密码子之前的10个碱基对的核酸序列来破坏yjl065c基因。所有程序均基于可公开获得的yjl065c的核酸序列，其在下文作为seq id no:2提供：
[0135][0136]
通过菌落pcr确认dgy1中的yjl065c基因缺失。使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的卡那霉素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。将产生的菌株(具有yjl065c基因缺失的dgy1)命名为dgy1
‑
δ。
[0137]
实例4.dgy1和dgy1
‑
δ的乙醇生产
[0138]
对新酵母菌株dgy1和dgy1
‑
δ以及亲本酵母菌株(称为菌株a和菌株b)在32℃或35℃的摇瓶发酵中产生乙醇的能力进行测试。通过添加600ppm尿素、0.124sapu/g ds fermgen
tm
2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.33gau/g ds变体里氏木霉(trichoderma reesei)葡糖淀粉酶和2.28sscu/g ds曲霉属α
‑
淀粉酶(acaa)，在ph 4.8制备液化物(即，具有干固体(ds)值为34％的玉米面粉浆料)。将50g液化物称重到125ml锥形瓶中，并用新鲜的过夜酵母培养物接种，最终od
600
为0.3。将瓶伴随振荡(200rpm)在32℃或35℃孵育65h。通过离心收集来自摇瓶发酵的样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在65℃使用bio
‑
rad aminex hpx
‑
87h柱(其在0.01nh2so4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过hplc(沃特世e2695系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油的含量。使用校准标准物用于定量乙酸盐、乙醇、甘油和葡萄糖。在35℃发酵的结果如表3所示。
[0139]
表3.在用菌株a和b、dgy1和dgy1
‑
δ在液化物中在35℃发酵后对发酵液进行分析
[0140][0141]
在35℃，dgy1与亲本酵母菌株相比产生显著更多的乙醇(即，比菌株a多4.8％的乙醇以及比菌株b多2.6％的乙醇)。dgy1
‑
δ产生比dgy1甚至更多的乙醇，即比菌株a多5.6％的乙醇以及比菌株b多3.4％的乙醇。这表明在dgy1杂交菌株背景下yjl065c缺失赋予了乙醇生产的改善。在32℃，dgy1和dgy1
‑
δ的乙醇生产与菌株a和菌株b产生的乙醇生产相似(数据未显示)。
[0142]
实例5.葡糖淀粉酶在dgy1和dgy1
‑
δ中的表达
[0143]
通过用含有密码子优化的ga基因(其与酿酒酵母fba1启动子和fba1终止子融合)的dna盒进行转化，dgy1和dgy1
‑
δ均被进一步修饰以表达两种不同的葡糖淀粉酶(本文命名为g1和g2)中的一种。通过将相同的ga表达盒转化到菌株a或具有yjl065c缺失的菌株a(即菌株a
‑
δ)来构建参考菌株。通过菌落pcr确认ga表达盒的整合。使经修饰的酵母在非选择性培养基中生长，以除去赋予用于选择转化体的抗生素抗性的质粒，产生了与亲本酵母相比不需要生长补充物的经修饰的酵母。鉴定ga表达盒被整合到其中的转化体，并如表4中所指示进行命名。
[0144]
表4.葡糖淀粉酶表达菌株的命名
[0145]
菌株表达的ga背景菌株a
‑
g1g1菌株adgy1
‑
g1g1dgy1菌株a
‑
δ
‑
g2g2菌株a
‑
δ(即，菌株aδyjl065c)dgy1
‑
δ
‑
g2g2dgy1
‑
δ(即，dgy1δyjl065c)
[0146]
实例6.在液化物中表达葡糖淀粉酶的杂交酵母的乙醇生产
[0147]
对表达葡糖淀粉酶的新杂交酵母菌株进行测试，以与含有相同修饰但在菌株a背景下的等效参考菌株比较在液化物中产生乙醇的能力(即，dgy1
‑
g1与参考菌株菌株a
‑
g1进行比较，并且dgy1
‑
δ
‑
g2与参考菌株菌株a
‑
δ
‑
g2进行比较)。通过添加600ppm尿素、0.124sapu/g ds fermgen
tm
2.5x(酸性真菌蛋白酶)、0.11gau/g ds变体里氏木霉葡糖淀粉酶和2.28sscu/g ds曲霉属α
‑
淀粉酶(acaa)，在ph 4.8制备液化物(即，具有干固体(ds)值为34％的玉米面粉浆料)。将50g液化物称重到125ml锥形瓶中，并用新鲜的过夜酵母培养物接种，最终od
600
为0.3。将瓶伴随振荡(200rpm)在32℃或35℃孵育65h。通过离心收集来自摇瓶发酵的样品，将其通过0.2μm过滤器过滤，并在65℃使用bio
‑
rad aminex hpx
‑
87h柱(其在0.01nh2so4洗脱液中的等度流速为0.6ml/min)通过hplc(沃特世e2695系列)分析乙醇、葡萄糖、乙酸盐和甘油的含量。使用校准标准物用于定量乙酸盐、乙醇、甘油和葡萄糖。在35℃发酵的结果如表5所示。报告了相对于表达相同ga的基于fg菌株的乙醇增加(即，dgy1
‑
g1与
菌株a
‑
g1进行比较，并且dgy1
‑
δ
‑
g2与菌株a
‑
δ
‑
g2进行比较)。
[0148]
表5.在用表达ga的菌株a和dgy1酵母在液化物中在35℃发酵后对发酵液进行分析
[0149][0150]
与等效菌株a
‑
g1相比，dgy1
‑
g1在35℃产生显著更多的乙醇(即，与菌株a
‑
g1相比乙醇多8.4％)。与等效菌株a
‑
δ
‑
g2相比，dgy1
‑
δ
‑
g2产生显著更多的乙醇(即，与菌株a
‑
δ
‑
g2相比乙醇多2.1％)。在32℃，dgy1
‑
g1的乙醇生产与菌株a
‑
g1的乙醇生产相似，并且dgy1
‑
δ
‑
g2的乙醇生产与菌株a
‑
δ
‑
g2的乙醇生产相似(数据未显示)。