组成型活性嵌合细胞因子受体的制作方法

组成型活性嵌合细胞因子受体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年3月1日提交的美国临时申请第62/812,911号和于2020年2月24日提交的美国临时申请第62/980,823号的优先权，所述申请中的两个申请的内容均通过引用整体并入本文。
3.序列表
4.本技术含有序列表，所述序列表已经以ascii格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。创建于2020年2月21日的所述ascii副本被命名为at
‑
023_03wo_sl.txt并且大小为251,652字节。


背景技术：

5.经基因修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞(例如t细胞)的过继转移显示出作为治疗癌症的新方法的前景。例如，可以对t细胞进行基因修饰以表达嵌合抗原受体(car)，所述嵌合抗原受体是由抗原识别部分和t细胞激活结构域组成的融合蛋白。
6.t细胞增殖、细胞毒性效力和持久性由信号转导通路驱动。常规的car设计提供两种信号
–
cd3ζ激活(信号1)和共刺激(信号2，例如通过4
‑
1bb、ox40和/或cd28的表达)。在一些情况下，可能需要第三种信号(信号3)，即细胞因子诱导的细胞因子受体信号传导(例如细胞因子支持免疫增强)。然而，提供信号3的方法遇到了很大的限制。
7.提供细胞因子支持的一种方法包含将car
‑
t细胞疗法与重组细胞因子/细胞因子模拟物的全身输注相结合，以及对car
‑
t细胞进行工程改造以在细胞外分泌/表达细胞因子。由于细胞因子具有多效性，并且也可以影响其它细胞类型的功能，car
‑
t细胞的全身施用或产生免疫增强细胞因子具有至少有两个主要缺点：(i)这些方法可能导致人体全身毒性，以及(ii)在同种异体car
‑
t细胞疗法的背景下，这些方法可能会导致旁观者宿主免疫激活，所述旁观者宿主免疫激活加速同种异体car
‑
t细胞的排斥反应，从而影响治疗效果。提供细胞因子支持的另一种方法基于引入组成性地激活的二聚化细胞因子受体il
‑
7ra
–
这限制了信号传导输出的性质(仅il
‑
7信号传导)和幅度。提供细胞因子支持的又一种方法涉及将信号3直接掺入car分子中(《自然医学(nat med.)》2018年3月；24(3):352
‑
359)。这种方法的一个限制是信号3的强度取决于car激活的强度。在没有靶标(和car激活)的情况下，信号3不会被转导。
8.需要通过以可调的方式将细胞因子信号特异性靶向car
‑
t细胞来规避这些缺点的解决方案，从而允许提高的安全性和治疗效果。本文提供了解决该需要的组合物和方法。


技术实现要素：

9.本公开提供了组成型活性嵌合细胞因子受体(caccr)。当存在于携带嵌合抗原受体(car)的免疫细胞(car
‑
i细胞，例如car
‑
t细胞)上时，此类caccr允许增加免疫细胞激活、增殖、持久性和/或效力。还提供了制造和使用本文所述的caccr的方法。
10.因此，在一方面，本文提供了一种由两个单体组成的caccr，每个单体包括：(a)跨
膜结构域；(b)janus激酶(jak)结合结构域；以及(c)募集结构域，其中所述单体是组成型二聚化的。在一些实施例中，所述caccr不包括细胞外结构域配体结合结构域。
11.在一些实施例中，所述跨膜结构域和/或所述jak
‑
结合结构域衍生自tpor/mplr受体。在一些实施例中，所述跨膜结构域和/或所述jak结合结构域衍生自seq id no:6的天然存在的tpor/mplr受体的氨基酸478
‑
582。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括选自h499l、s505n、w515k和g509n的氨基酸取代中的一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括h499l、s505n和w515k取代，或s505n和w515k取代。在一些实施例中，所述募集结构域是stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域，例如，il7ra(316
‑
459)。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域，例如，il2rb(333
‑
551)、il2rb(393
‑
433、518
‑
551)、il2rb(339
‑
379、393
‑
433、518
‑
551)、il2rb(333
‑
551、y381s、y384s、y387s)、il2rb(333
‑
551、y364s、y381s、y384s、y387s)。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1的stat
‑
募集结构域，例如，il12rb1(622
‑
662)。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb2的stat
‑
募集结构域，例如，il12rb2(714
‑
862)或il12rb2(775
‑
825)。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域，例如，il21r(322
‑
538)。
12.在相关方面，本文提供了一种编码本公开的任何一种caccr的多核苷酸，以及包括此类多核苷酸的表达载体。在一些实施例中，所述多核苷酸进一步编码嵌合抗原受体(car)，其中所述car结合bcma、egfrviii、flt
‑
3、wt
‑
1、cd20、cd23、cd30、cd38、cd70、cd33、cd133、ley、nkg2d、cs1、cd44v6、ror1、cd19、claudin
‑
18.2(claudin
‑
18a2或claudin18同种型2)、dll3(delta样蛋白3、果蝇delta同源物3、delta3)、muc17(mucin17、muc3、muc3)、fapα(成纤维细胞激活蛋白α)、ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合位点蛋白g6d、c6orf23、g6d、megt1、ng25)和/或rnf43(e3泛素蛋白连接酶rnf43、ring指蛋白43)。
13.在另一方面，本文提供了一种工程化免疫细胞，其包括本公开的至少一种嵌合抗原受体(car)和至少一种caccr。在一些实施例中，所述免疫细胞是t细胞。在一些实施例中，所述免疫细胞是同种异体免疫细胞。在其它实施例中，所述免疫细胞是自体免疫细胞。所述免疫细胞可以选自由以下组成的组：t细胞、树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、nk细胞、巨噬细胞、单核细胞、b细胞和衍生自干细胞的免疫细胞。在相关方面，本文提供了一种包括本公开的任何工程化免疫细胞的药物组合物，以及包括此类药物组合物的试剂盒。
14.在另一方面，本文提供了一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的任何工程化免疫细胞。
附图说明
15.图1示出了本公开的工程化caccr的示意图。
16.图2示出了本公开的载体的示意图，所述载体可用于共表达本公开的caccr和car。一个或多个细胞尾(cytotail)可以串联连接以模拟来自一个或多个细胞因子的信号传导。还示出了表达对照bfp(蓝色荧光蛋白)car的载体的示意图。
17.图3a
‑
3b示出了组成性地激活细胞因子受体信号传导的tpor跨膜(tm)突变体的鉴定。
18.图4a
‑
4c示出了扩增共表达组成型活性嵌合细胞因子受体的car
‑
t细胞的结果。
19.图5示出了在不同il
‑
2条件下，car
‑
t细胞产品中的分化和记忆t细胞亚群分布。
20.图6a
‑
6b示出了由每个tpor tm变体介导的组成型细胞因子信号传导的程度。
21.图7a
‑
7d示出了tpor tm突变体的细胞毒活性，其表明组成型细胞因子受体信号传导增强了car
‑
t细胞效力。
22.图8a
‑
8b示出了tpor tm突变体的细胞毒活性和持久性。
23.图9示出了在生长因子非依赖性测定中car
‑
t细胞随时间推移的富集。
24.图10a
‑
10b示出了在生长因子非依赖性测定中car
‑
t细胞随时间推移的扩增倍数。
25.图11示出了在生长因子非依赖性测定中car+ t细胞之间随时间推移的记忆t细胞亚群分布。
26.图12示出了共表达指示的caccr的car
‑
t细胞对stat信号传导通路的激活。
27.图13a
‑
13b和图14a
‑
14b示出了在表达全长或截短的细胞尾的hek293 t细胞的报告基因测定中示出的caccr信号传导强度的优化。
28.图15示出了在共表达全长或截短的细胞尾的原代car
‑
t细胞中示出的caccr信号传导强度的优化。
29.图16a
‑
16c显示，携带截短的il2rb细胞尾的caccr car
‑
t细胞更接近地模拟il
‑
15而非il
‑
2信号传导。
30.图17a
‑
17d示出了串联融合的不同细胞尾的组合信号输出。
31.图18a
‑
18b描绘了caccr对car
‑
t细胞的记忆分化的影响。
32.图19a
‑
19d描绘了caccr在生长因子非依赖性条件下对car
‑
t细胞存活和记忆分化的影响。
33.图20a
‑
20b描绘了共表达多种caccr的car
‑
t细胞的细胞毒活性。
34.图21显示，caccr提高了针对液体肿瘤靶标bcma的car
‑
t细胞的细胞毒活性。
35.图22a
‑
22c显示，caccr提高了bcma car
‑
t细胞针对原位多发性骨髓瘤的体内抗肿瘤活性和持久性。
36.图23显示，caccr提高了car
‑
t细胞针对已建立的实体瘤的抗肿瘤活性。
具体实施方式
37.本公开提供了组成型活性嵌合细胞因子受体(caccr)。组成型活性、可调的嵌合细胞因子受体的存在允许信号3的免疫增强，以满足免疫增强的需要。因此，当存在于携带嵌合抗原受体(car)的免疫细胞(car
‑
i细胞，例如car
‑
t细胞)上时，此类caccr允许增加免疫细胞激活、增殖、持久性和/或效力。本文还提供了制备和使用本文所述的caccr的方法。
38.本公开的caccr是可调的，并且具有用于增强car
‑
t细胞活性、持久性等的灵活的细胞因子信号传导输出。下面依次介绍其组分、制作方法和使用方法。
39.i.组成型活性嵌合细胞因子受体(caccr)
40.本公开的caccr由两个单体组成，每个单体包括：(a)跨膜结构域；(b)jak
‑
结合结构域；以及(c)募集结构域，其中所述单体是组成型二聚化的。在一些实施例中，本公开的caccr不包括细胞外配体结合结构域。
41.在一些实施例中，单体是相同的，从而产生组成型活性同源二聚体。在此类实施例中，需要在载体中表达的蛋白质的数量减少。在一些实施例中，单体是不同的，从而产生组
成型活性异源二聚体，这在某些情况下可能是合乎需要的。
42.本公开的caccr的单体能够自发地二聚化，并且可以在没有任何外源性刺激或配体的情况下激活信号传导(配体非依赖性二聚化)。可以通过引入到caccr的跨膜结构域中的突变来控制活性水平。本领域技术人员将理解，caccr的单体不是100％的时间都二聚化，并且可以作为单体存在。
43.a.跨膜结构域
44.本公开的caccr包括跨膜结构域。本公开的跨膜结构域含有序列，使得所述跨膜结构域允许与单体对的组成型二聚化，从而允许细胞内部分上的组成型jak激活，以及受体细胞质区域上例如stat的组成型募集和磷酸化。
45.跨膜结构域位于n端并且与c端上的细胞内/细胞质结构域偶联。在一些实施例中，偶联任选地通过接头实现。
46.如本文所使用的，跨膜结构域能够插入到细胞的膜中，在所述细胞中，所述跨膜结构域被表达。在一些实施例中，本公开的跨膜结构域跨越细胞膜，并且包括细胞外部分和/或细胞内部分。
47.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域是工程化的(合成的)并且不类似于任何天然存在的跨膜结构域，例如本公开的跨膜结构域是非自然发生的。
48.在其它实施例中，本公开的跨膜结构域衍生自天然存在的受体。
49.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自例如一种或多种以下受体：促红细胞生成素受体(epor)、白细胞介素6信号转导子(gp130或il6st)、催乳素受体(prlr)、生长激素受体(ghr)、粒细胞集落
‑
刺激因子受体(gcsfr)和血小板生成素受体/骨髓增殖性白血病蛋白受体(tpor/mplr)。当衍生自天然存在的受体时，整个受体或受体的整个跨膜序列可能不是实现细胞内部分上的组成型激活和组成型jak结合/激活所必需的。因此可以利用天然存在的受体的片段。此外，可以将某些突变引入衍生自天然受体的跨膜结构域中，以进一步调整下游信号传导。
50.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自天然存在的epor受体。
51.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自天然存在的gp130受体。
52.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自天然存在的prlr受体。
53.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自天然存在的ghr受体。
54.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自天然存在的gcsf受体。
55.在一些实施例中，本公开的跨膜结构域和/或jak
‑
激活结构域衍生自天然存在的tpor受体。
56.表1a提供了本公开中提供的天然存在的受体的示例性全长序列，跨膜蛋白衍生自该序列。表1a中提供的序列是参考序列，后面的突变相对于所述序列被表达，例如在表1b和1c中。
57.表1a：示例性天然存在的受体
58.59.[0060][0061][0062]
在一些实施例中，本公开的跨膜结构域衍生自表1a中所示的天然存在的tpor/mplr(骨髓增殖性白血病蛋白)受体的截短版本。
[0063]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括表1a的tpor受体的氨基酸478
‑
582。
[0064]
表1b提供了本公开的示例性跨膜结构域氨基酸序列，其中所述跨膜结构域衍生自天然存在的tpor受体。
[0065]
表1b：示例性跨膜结构域氨基酸序列
[0066][0067]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及至少在h499处的氨基酸取代。在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代h499l。
[0068]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及至少在s505处的氨基酸取代。在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代s505n。
[0069]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及至少在g509处的氨基酸取代。在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代g509n。
[0070]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及至少在w515处的氨基酸取代。在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代w515k。
[0071]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及h499和s505处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。
[0072]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及h499和w515处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。
[0073]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及h499、
s505和w515处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。
[0074]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及s505和w515处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。
[0075]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及h499和g509处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。
[0076]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代h499l和s505n(表1b中提供的序列)。
[0077]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代h499l和w515k(表1b中提供的序列)。
[0078]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代h499l和g509n(表1b中提供的序列)。
[0079]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代s505n和w515k(表1b中提供的序列)。
[0080]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及氨基酸取代h499l、s505n和w515k(表1b中提供的序列)。
[0081]
在一些实施例中，caccr的跨膜结构域包括tpor受体的氨基酸478
‑
582，以及h499和s505处的氨基酸取代(表1b中提供的序列)。
[0082]
本公开的caccr是可调的，以实现携带car的免疫细胞(例如car
‑
t细胞)中所需的并且在特定背景或条件下期望的信号3/免疫增强的水平。
[0083]
在一些实施例中，在携带car的免疫细胞(例如car
‑
t细胞)中需要stat5激活的低水平。举例来说，在此类实施例中，可以引入包括tpor受体的氨基酸478
‑
582以及氨基酸取代s505n、w515k或h499l/g509n的caccr的跨膜结构域。
[0084]
在一些实施例中，在携带car的免疫细胞(例如car
‑
t细胞)中需要增加的stat5激活水平。举例来说，在此类实施例中，可以引入包括tpor受体的氨基酸478
‑
582以及氨基酸取代h499l、s505n和w515k的caccr的跨膜结构域。举例来说，在此类实施例中，可以引入包括tpor受体的氨基酸478
‑
582以及氨基酸取代s505n和w515k的caccr的跨膜结构域。
[0085]
在一些实施例中，在携带car的免疫细胞(例如car
‑
t
‑
细胞)中需要增加向记忆t细胞的分化。举例来说，在此类实施例中，可以引入包括tpor受体的氨基酸478
‑
582以及氨基酸取代w515k或h499l/g509n的caccr的跨膜结构域。
[0086]
在一些实施例中，在携带car的免疫细胞(例如car
‑
t
‑
细胞)中需要增加向记忆t细胞的分化。举例来说，在此类实施例中，可以引入包括tpor受体的氨基酸478
‑
582以及氨基酸取代s505n/w515k和h499l/s505n/w515k的caccr的跨膜结构域。
[0087]
本文还提供了增加细胞毒性效力、反应持久性和增加持久性的取代，例如s505n/w515k和h499l/s505n/w515k取代。
[0088]
表1c：示例性跨膜+jak2结合结构域序列
[0089]
[0090]
[0091][0092]
b.janus激酶(jak)结合结构域
[0093]
本公开的caccr包括细胞内jak
‑
结合结构域。jak
‑
结合结构域直接或通过接头偶联到跨膜结构域的c端。jak
‑
结合结构域与嵌合细胞因子受体细胞内侧的跨膜结构域偶联。
[0094]
在一些实施例中，jak
‑
结合结构域是jak
‑
1结合结构域、jak
‑
2结合结构域、jak
‑
3结合结构域或tyk2结合结构域。
[0095]
在一些实施例中，本公开的caccr的jak
‑
结合结构域是天然存在的，并且衍生自天然存在的受体。
[0096]
在一些实施例中，本公开的caccr的jak
‑
结合结构域是合成的。
[0097]
表1b和表1c提供了本公开的跨膜和jak2结合结构域的示例性氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的caccr包括跨膜和jak2结合结构域，所述结构域包括选自表1b和1c中的序列的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的caccr包括跨膜和jak2结合结构域，所述结构域包括与表1b和1c中的任一序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0098]
c.募集结构域
[0099]
本公开的caccr包括细胞质募集结构域。募集结构域可以是stat
‑
募集结构域、ap1
‑
募集结构域、myc/max
‑
募集结构域；或nfkb
‑
募集结构域。在一些实施例中，募集结构域是信号转导子和转录激活子(stat)
‑
募集(stat
‑
激活)结构域，例如来自受体尾(细胞尾)或来自细胞因子受体尾。本公开的caccr的这些细胞内募集结构域允许信号3在包括car和嵌合细胞因子受体的免疫细胞(例如具有本公开的嵌合细胞因子受体的car
‑
t细胞)中传播。通过stat
‑
募集结构域传播的细胞因子信号传导允许细胞的基于细胞因子的免疫增强。在
一些实施例中，免疫增强是稳态的，例如信号传导导致携带car的免疫细胞增加。在一些实施例中，免疫增强是炎性的，例如信号传导导致携带car的免疫细胞的效力增加。在一些实施例中，免疫增强防止衰竭，例如信号传导保持携带car的免疫细胞的长期功能。
[0100]
在一些实施例中，本公开的募集结构域是合成的并且不类似于任何天然存在的受体片段。在一些实施例中，免疫增强防止衰竭，例如信号传导保持携带car的免疫细胞的长期功能。
[0101]
在一些实施例中，本公开的stat
‑
募集结构域是合成的并且不类似于任何天然存在的受体片段。
[0102]
在其它实施例中，本公开的stat
‑
募集结构域衍生自天然存在的受体的细胞质尾，例如衍生自天然存在的细胞因子受体。天然存在的受体的这些细胞质尾可能是受体跨膜结构域的jak
‑
激活结构域下游的区域。嵌合细胞因子受体的stat
‑
募集结构域包括来自至少一种受体的至少一个stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat1
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat2
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat3
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat4
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat5
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat6
‑
募集结构域。在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括至少一个stat7
‑
募集结构域。
[0103]
在一些实施例中，stat
‑
募集结构域所衍生自的天然存在的受体不是细胞因子受体。
[0104]
在一些实施例中，stat
‑
募集结构域所衍生自的天然存在的受体是细胞因子受体。t细胞免疫增强细胞因子通过其发出信号的示例性细胞因子受体包含但不限于il
‑
2受体、il
‑
7受体、il
‑
15受体和il
‑
21受体。在替代实施例中，stat
‑
募集结构域所衍生自的受体不是细胞因子受体。通过选择caccr的stat
‑
募集结构域，可以将受体重新定向到选择的信号传导。
[0105]
在一些实施例中，本公开的caccr包括在有或没有接头的情况下连接到跨膜/jak2结合结构域的c端的募集结构域。在一些实施例中，接头包括一或多个氨基酸残基残基。
[0106]
表2a提供了示例性受体，本公开的caccr的募集结构域衍生自该受体。表2b提供了本公开的募集结构域的示例性氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的caccr包括募集结构域，所述募集结构域包括选自表2b中的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的caccr包括募集结构域，所述募集结构域包括与表2b中的任一序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0107]
表2a
[0108]
募集结构域的来源blnkil2rgegfreporghrifnar1
ifnar2ifnar1/2ifnlr1il10r1il12rb1il12rb2il21ril2rbil2smallil7ril7rail9ril15ril21r
[0109]
表2b.募集结构域(细胞尾)序列
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114][0115]
在一些实施例中，本公开的caccr的stat
‑
募集结构域包括来自一种受体的stat
‑
募集结构域。
[0116]
为了生成多个输出，两个或更多个stat
‑
募集结构域可以串联连接以模拟来自一个或多个细胞因子的信号传导。
[0117]
在一些实施例中，两个或更多个stat
‑
募集结构域可以在有或没有接头的情况下串联连接。在一些实施例中，接头包括一或多个氨基酸残基残基。
[0118]
在一些实施例中，stat
‑
募集结构域包括多于一种受体的部分，例如包括多于一个stat
‑
募集结构域。在此类实施例中，提供串联的细胞因子信号传导结构域，从而允许增强的信号传导。因此，在一些实施例中，本公开的caccr的单体的stat
‑
募集结构域包括来自多于一种受体的stat
‑
募集结构域，例如包括来自两种、三种、四种、五种或甚至六种受体的stat
‑
募集结构域。例如，在一些实施例中，stat
‑
募集结构域可以串联连接以刺激多个通路(例如，用于促持久性stat5和促炎性stat4的il7r(316
‑
459)
‑
il12rb2(775
‑
825)片段融合；用于促持久性的il7r(316
‑
459)
‑
il2rbsmall(393
‑
433、518
‑
551)；用于促持久性和抗疲劳的il7r(316
‑
459)
‑
egfr(1122
‑
1165)；用于促持久性和抗疲劳的il2rbsmall(393
‑
433、518
‑
551)
‑
egfr(1122
‑
1165))。
[0119]
当生成多个输出时，单个stat
‑
募集结构域与细胞膜的接近度可以影响它们各自的信号传导输出的强度。表2c示出了具有双输出的caccr的实例，其中每个输出可以放置在细胞膜的近端或远端。在一些实施例中，本公开的caccr包括具有选自表2c的双输出的募集结构域。
[0120]
表2c：具有双输出的caccr的实例
[0121]
[0122]
[0123][0124]
不受理论或机制的束缚，在一些实施例中，jak
‑
蛋白(jak1、jak2、jak3或tyk2)与本公开的二聚化caccr结合。两个结合的jak
‑
蛋白被激活，这能够使caccr募集结构域上的酪氨酸残基磷酸化。然后，磷酸化的募集结构域能够结合募集的蛋白质(例如，磷酸化的stat
‑
募集结构域结合stat
‑
蛋白质)，这进而在细胞核中实现转录事件。
[0125]
d.示例性caccr
[0126]
表3示出了本公开的示例性caccr序列。受体可以用信号序列表达，例如序列malpvtalllplalllhaarp(seq id no:89)的cd8ss。
[0127]
在一些实施例中，本公开的caccr包括表3中的任一序列。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:90
‑
98和107
‑
139中的任一氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括seq id no:90
‑
98和107
‑
139中的任一氨基酸序列。
[0128]
在一些实施例中，所述caccr包括衍生自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域。在一些实施例中，本公开的caccr包括seq id no:6的天然存在的tpor/mplr受体的氨基酸478
‑
582。在一些实施例中，本公开的caccr包括与seq id no:17的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的caccr包括seq id no:17的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募
集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:90或119的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:90或119的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0129]
在一些实施例中，本公开的caccr包括来自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域，所述受体在h499、s505、g509或w515处包括一个或多个氨基酸取代。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括h499l取代。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括s505n取代。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括g509n取代。在一些实施例中，所述tpor/mplr受体包括w515k取代。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1
或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:92、94、121或123的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:92、94、121或123的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0130]
在一些实施例中，本公开的caccr包括来自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域，所述受体包括h499l和s505n取代。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:91、98、120或127的氨基酸序列
具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:91、98、120或127的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0131]
在一些实施例中，本公开的caccr包括来自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域，所述受体包括h499l和w515k取代或h499l和g509n取代。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0132]
在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。
[0133]
在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:97或126的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:97或126的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0134]
在一些实施例中，本公开的caccr包括来自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域，所述受体包括s505n和w515k取代。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结
构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:96、107、109、111、113、115、117、125、128、129、132、134、136或138的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:96、107、109、111、113、115、117、125、128、129、132、134、136或138的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0135]
在一些实施例中，本公开的caccr包括来自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域，所述受体包括h499l和w515k取代。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例
中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:93的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:93的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0136]
在一些实施例中，本公开的caccr包括来自tpor/mplr受体的跨膜结构域和/或jak
‑
结合结构域，所述受体包括h499l、s505n和w515k取代。在一些实施例中，所述caccr进一步包括募集结构域，所述募集结构域包括表2b中呈现的一个或多个受体序列的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr进一步包括选自由以下组成的组的一个或多个募集结构域：来自il7ra、il2rb、il12rb1、il12rb2和il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il7ra的stat
‑
募集结构域包括seq id no:46、68、69、70、71或72的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il2rb的stat
‑
募集结构域包括seq id no:47、73、74、75、76、77、78、106或143的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:67、86或87的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il12rb1或il12rb2的stat
‑
募集结构域包括seq id no:67、86或87的氨基酸序列。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il21r的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括与seq id no:54的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，来自il21r的stat
‑
募集结构域包括seq id no:54的氨基酸序列。在一些实施例中，所述caccr包括表2c中呈现的一个或多个募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il2rb的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb1的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述募集结构域包括来自il7ra和il12rb2的stat
‑
募集结构域。在一些实施例中，所述caccr包括与seq id no:95、108、110、112、114、116、118、124、130、131、133、135、137或139的氨基酸序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，所述caccr包括seq id no:95、108、110、112、114、116、118、124、130、131、133、135、137或139的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0137]
表3
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145][0146]
*带下划线的le和sr是可插入两个结构域之间的示例性任选的接头。
[0147]
e.caccr的表达
[0148]
本文提供了编码本文提供的任何一种caccr的多核苷酸。同样，本文提供了包括此类多核苷酸的表达载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，所述载体并非病毒载体。
[0149]
在一些实施例中，所述表达载体包括caccr和表达嵌合抗原受体(car)的多核苷酸。
[0150]
在一些实施例中，caccr和car的表达被表达为单个多肽链，被接头分开。图2示出了可用于共表达本公开的caccr和car的载体的示意图。一个或多个募集结构域可以串联连接以模拟来自一个或多个细胞因子的信号传导。
[0151]
ii.携带car的免疫细胞
[0152]
本文提供了工程化免疫细胞，其包括编码本公开的嵌合抗原受体(car)和caccr的多核苷酸；并且本文提供了表达本公开的嵌合抗原受体(car
‑
i细胞)和caccr的工程化免疫细胞。免疫细胞的实例包含t细胞(例如，α/βt细胞和γ/δt细胞)、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、不变nkt细胞、肥大细胞、髓源性吞噬细胞、树突状细胞、杀伤树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞。免疫细胞也指衍生自，例如但不限于，干细胞的细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞，更具体地说，非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导的多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。
[0153]
因此，在一些实施例中，本文提供了包括本公开的caccr的car
‑
t细胞。
[0154]
在一些实施例中，car可以包括细胞外配体结合结构域(例如，单链可变片段(scfv))、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域在一个多肽中，即在单链中。本文还提供了多链car和多肽。在一些实施例中，多链car包括：包括跨膜结构域和至少一个细胞外配体结合结构域的第一多肽，以及包括跨膜结构域和至少一个细胞内信号传导结构域的第二多肽，其中所述多肽组装在一起形成多链car。
[0155]
car的细胞外配体结合结构域特异性结合所关注的靶标。所关注的靶标可以是任何所关注的分子，包含例如但不限于bcma、egfrviii、flt
‑
3、wt
‑
1、cd20、cd23、cd30、cd38、cd70、cd33、cd133、ley、nkg2d、cs1、cd44v6、ror1、cd19、claudin
‑
18.2(claudin
‑
18a2或
claudin18同种型2)、dll3(delta样蛋白3、果蝇delta同源物3、delta3)、muc17(mucin17、muc3、muc3)、fapα(成纤维细胞激活蛋白α)、ly6g6d(淋巴细胞抗原6复合位点蛋白g6d、c6orf23、g6d、megt1、ng25)和/或rnf43(e3泛素蛋白连接酶rnf43、ring指蛋白43)。
[0156]
在一些实施例中，car的细胞外配体结合结构域包括scfv，所述scfv包括通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变(vl)区和重链可变(vh)区。单链可变区片段是通过使用短连接肽(bird等人,《科学(science)》242:423
‑
426,1988)(例如含有甘氨酸
‑
丝氨酸的接头)连接轻链和/或重链可变区来制备的。通常，接头可以是短的、灵活的多肽并且通常由约20个或更少的氨基酸残基组成。接头进而可以被修饰以实现附加功能，如附着药物或附着在固体支持物上。单链变体可以通过重组或合成产生。对于scfv的合成生产，可以使用自动合成仪。对于scfv的重组生产，可以将含有编码scfv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞(如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞等真核细胞或如大肠杆菌等原核细胞)中。编码所关注的scfv的多核苷酸可以通过常规操作(如多核苷酸的连接)来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得scfv。
[0157]
根据本发明的car的细胞内信号传导结构域负责在细胞外配体结合结构域与靶标结合之后产生细胞内信号传导，从而导致免疫细胞的激活和免疫反应(信号1和/或2)。细胞内信号传导结构域能够激活表达car的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。例如，t细胞的效应子功能可以是细胞溶解活性或辅助活性(包含细胞因子的分泌)。
[0158]
在一些实施例中，用于car的细胞内信号传导结构域可以是例如但不限于t细胞受体和共同受体的细胞质序列，所述受体在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。细胞内信号传导结构域包括两种不同类型的细胞质信号传导序列：启动抗原依赖性初级激活的细胞质信号传导序列，以及以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的细胞质信号传导序列。初级细胞质信号传导序列可以包括信号传导基序，其被称为免疫受体酪氨酸激活基序itam。itam是在各种受体的胞质内尾发现的明确定义的信号传导基序，其充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点。本发明中使用的itam的实例可以包含作为非限制性实例的衍生自tcrζ、fcrγ、fcrβ、fcrε、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在一些实施例中，car的细胞内信号传导结构域可以包括cd3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包括共刺激分子的结构域。
[0159]
在一些实施例中，本发明的car的细胞内信号传导结构域包括选自由41bb(genbank:aaa53133.)和cd28(np_006130.1)的片段组成的组的共刺激分子的一部分。
[0160]
car在细胞的表面膜上表达。因此，car包括跨膜结构域。本文公开的car的合适跨膜结构域具有以下能力：(a)在细胞表面表达，优选地免疫细胞，如例如但不限于淋巴细胞或自然杀伤(nk)细胞；以及(b)与配体结合结构域和细胞内信号传导结构域相互作用，以指导免疫细胞对预定靶细胞的细胞反应。跨膜结构域可以衍生自天然的或合成的来源。跨膜结构域可以衍生自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是t细胞受体(如α、β、γ或δ、构成cd3复合物的多肽、il
‑
2受体p55(a链)、p75(β链)或γ链、fc受体的亚基链，具体地说，fcγ受体iii或cd蛋白)的亚基。可替代地，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域衍生自人cd8α链(例如，np_001139345.1)。跨膜结构域可以进一步包括位于细胞外配体结合结构
域和所述跨膜结构域之间的茎结构域(stalk domain)。茎结构域可以包括多达300个氨基酸，优选地，10到100个氨基酸，并且最优选地，25到50个氨基酸。茎区域可以衍生自天然存在的分子的全部或部分，如衍生自cd8、cd4或cd28的细胞外区域的全部或部分，或衍生自抗体恒定区的全部或部分。可替代地，茎结构域可以是对应于天然存在的茎序列的合成序列，或者可以是完全合成的茎序列。在一些实施例中，所述茎结构域是人cd8α链的一部分(例如，np_001139345.1)。在另一个特定的实施例中，所述跨膜和铰链结构域包括人cd8α链的一部分。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括cd3ζ信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括cd3ζ信号传导结构域和另外的第二信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包括cd3ζ信号传导结构域和4
‑
1bb信号传导结构域。在一些实施例中，本文公开的car可以包括特异性结合bcma或egfrviii、cd8α人铰链和跨膜结构域、cd3ζ信号传导结构域和4
‑
1bb信号传导结构域的细胞外配体结合结构域。在一些实施例中，egfrviii特异性car包括seq id no:140的氨基酸序列。在一些实施例中，bcma特异性car包括seq id no:141或142的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0161]
在一些方面，car
‑
免疫细胞是包括本公开的caccr的bcma car
‑
t细胞。在一些实施例中，bcma car
‑
t细胞的caccr包括seq id no:6的天然存在的tpor/mplr受体的氨基酸478
‑
582的跨膜/jak
‑
结合结构域，具有h499l、s505n和w515k三重取代，或s505n和w515k双重取代(例如，seq id no:12或13)。在一些实施例中，所述caccr进一步包括来自il2rb的募集结构域。在一些实施例中，bcma car
‑
t细胞的caccr进一步包括来自il2rb(393
‑
433、518
‑
551)或il2rb(339
‑
379、393
‑
433、518
‑
551)的募集结构域(例如，seq id no:77或78)。在一些实施例中，bcma特异性car包括seq id no:141或142的氨基酸序列，带或不带信号序列。在一些实施例中，bcma car
‑
t细胞包括这样的caccr，其包括seq id no:113、114或116的氨基酸序列，带或不带信号序列。
[0162]
在一些实施例中，car可以作为转基因通过质粒载体被引入免疫细胞中。在一些实施例中，质粒载体还可以含有，例如，提供用于鉴定和/或选择接受载体的细胞的选择标志物。
[0163]
表4提供了可用于本文公开的car和本文示例的抗体和/或car序列的car组分的示例性序列。
[0164]
表4：与car相关的序列
[0165][0166]
[0167]
在一些实施例中，本公开的car
‑
免疫细胞(例如，car
‑
t细胞)包括编码自杀多肽的多核苷酸，如例如rqr8。参见例如wo2013153391a，其通过引用整体并入本文。在一些实施例中，自杀多肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，自杀多肽包含在car构建体中。在一些实施例中，自杀多肽不是car构建体的一部分。
[0168]
在一些实施例中，本文公开的任何一种car的细胞外结构域可以包括一个或多个对单克隆抗体具有特异性(被其特异性识别)的表位。这些表位在本文中也被称为mab特异性表位。示例性mab特异性表位在国际专利公开号wo 2016/120216中公开，所述国际专利整体并入本文。在这些实施例中，car的细胞外结构域包括与所关注的靶标特异性结合的抗原结合结构域和与一个或多个单克隆抗体(mab)结合的一个或多个表位。包括mab特异性表位的car可以是单链或多链的。
[0169]
在本文所述的car的细胞外结构域中包含对单克隆抗体具有特异性的表位允许分选和耗竭表达car的工程化免疫细胞。在一些实施例中，允许耗竭在有害影响的情况下提供了安全开关，例如，在施用于受试者时。
[0170]
本文还提供了制备用于免疫疗法的工程化免疫细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括将caccr和car引入免疫细胞中，并扩增细胞。在一些实施例中，本发明涉及对免疫细胞进行工程改造的方法，所述包括：提供细胞并表达caccr，并在细胞表面表达至少一种car。在一些实施例中，所述方法包括：用至少一种编码caccr的多核苷酸和至少一种编码car的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。在一些实施例中，所述方法包括：用至少一种编码caccr的多核苷酸、至少一种编码car的多核苷酸转染细胞，并在细胞中表达多核苷酸。
[0171]
在一些实施例中，编码caccr和car的多核苷酸存在于一个或多个表达载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施例中，多核苷酸存在于病毒载体中，以在细胞中稳定表达。在一些实施例中，病毒载体可以是例如慢病毒载体或腺病毒载体。
[0172]
在一些实施例中，编码根据本公开的多肽的多核苷酸可以是例如通过电穿孔被直接引入细胞中的mrna。在一些实施例中，cytopulse电穿孔技术(如pulseagile)可用于瞬时透化活细胞以将材料递送到细胞中(例如us 6,078,490；pct/us2011/000827；和pct/us2004/005237)。可以修改参数以确定高转染效率和最低死亡率的条件。
[0173]
本文还提供了转染免疫细胞(例如t细胞)的方法。在一些实施例中，所述方法包括：使t细胞与rna接触并向t细胞施加敏捷脉冲序列。在一些实施例中，转染免疫细胞(例如t细胞)的方法包括使免疫细胞与rna接触并向细胞施加敏捷脉冲序列。
[0174]
在一些实施例中，所述方法可以进一步包括以下步骤：通过使表达例如但不限于tcr的组分、免疫抑制剂的靶标、hla基因和/或免疫检查点蛋白(如例如pdcd1或ctla
‑
4)的至少一个基因灭活来对细胞进行基因修饰。使基因灭活旨在使所关注的基因不以功能性蛋白质形式表达。在一些实施例中，待灭活的基因选自由以下组成的组：例如但不限于tcrα、tcrβ、cd52、gr、脱氧胞苷激酶(dck)、pd
‑
1和ctla
‑
4。在一些实施例中，所述方法包括通过将能够通过选择性dna切割选择性灭活基因的稀切核酸内切酶引入细胞来使一个或多个基因灭活。在一些实施例中，稀切核酸内切酶可以是例如转录激活因子样效应核酸酶(tale
‑
核酸酶)或基于crispr的核酸内切酶(例如cas
‑
9或cas12a)。
[0175]
在另一方面，对细胞进行基因修饰的步骤可以包括：通过使表达免疫抑制剂靶标
的至少一个基因灭活来修饰免疫细胞(例如t细胞)，以及；扩增细胞，任选地在存在免疫抑制剂的情况下。
[0176]
在一些实施例中，相对于不表达caccr的工程化免疫细胞，本文提供的工程化免疫细胞(例如t细胞)表现出提高的细胞毒性、增加的扩增和/或增加的记忆表型标志物的水平。
[0177]
在一些实施例中，相对于不表达caccr的工程化免疫细胞，本文提供的工程化免疫细胞(例如t细胞)结构性地表现出(i)增加的体内持久性、(ii)增加的stat激活、(iii)增加的细胞毒性、(iv)增加的记忆表型标志物的水平、(v)增加的扩增(增殖)或这些功能特征的组合。在一些实施例中，本文所述的一种或多种功能特征的改善是可调的，取决于引入到caccr的突变/修饰。在一些实施例中，被包括公开的一种或多种caccr的工程化免疫细胞激活的stat是stat1、stat2、stat3、stat4、stat5、stat6或其组合。在一个实施例中，由包括caccr的免疫细胞增加或维持的记忆表型标志物包含干细胞记忆(tscm)标志物和中枢记忆(tcm)标志物。
[0178]
在一些实施例中，与不表达caccr的免疫细胞相比，包括本文提供的caccr的工程化免疫细胞表现出的一个或多个功能特征的改善是至少约2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍或甚至约10500倍，包含其间的值和范围。
[0179]
在一些实施例中，与不表达caccr的工程化免疫细胞相比，包括本文提供的caccr的工程化免疫细胞表现出的一个或多个功能特征的改善是至少约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、125％、150％、200％、250％、300％、350％、400％或甚至约80％500％，包含其间的值和范围。
[0180]
iii.治疗方法
[0181]
本文提供了包括携带本公开的caccr和car的细胞的药物组合物。
[0182]
通过上述方法获得的携带工程化caccr和携带car的免疫细胞(例如t细胞)或衍生自此类工程化免疫细胞的细胞系可以用作药物。在一些实施例中，此类药物可用于治疗病症，如例如病毒性疾病、细菌性疾病、癌症、炎性疾病、免疫疾病或衰老相关疾病。在一些实施例中，所述癌症是实体癌。在一些实施例中，所述癌症是液体癌症。所述癌症可以选自由以下组成的组：胃癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、头颈癌、胸腺癌、上皮癌、唾液癌、肝癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、胰腺癌、神经胶质瘤、白血病、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、口腔癌、皮肤癌和黑色素瘤。在一些实施例中，受试者是患有局部晚期或转移性黑素瘤、鳞状细胞头颈癌(schnc)、卵巢癌、肉瘤或复发性或难治性经典霍奇金淋巴瘤(chl)的先前经治疗的成年受试者。
[0183]
在一些实施例中，工程化免疫细胞或衍生自工程化免疫细胞的细胞系可用于制造用于治疗有需要的受试者的病症的药物。在一些实施例中，所述病症可以是例如癌症、自身免疫病症或感染。
[0184]
本文还提供了用于治疗需要这种治疗的受试者的方法。
[0185]
如本文所使用的，术语“受试者”是指任何脊椎动物，包含但不限于人类和其它灵长类动物(例如，黑猩猩、食蟹猴和其它猿类和猴种)、农场动物(例如，牛、羊、猪、山羊和
马)、家养哺乳动物(例如，狗和猫)、实验室动物(例如，兔子、啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠)和鸟类(例如，家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其它鸡类禽类、鸭、鹅等)。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在示例性实施例中，所述受试者是人。
[0186]
在一些实施例中，所述方法包括向有需要的受试者提供携带本文所述的caccr和car的本公开的免疫细胞。
[0187]
在一些实施例中，本发明的携带caccr和car的t细胞可以经历强大的体内t细胞扩增并且可以持续延长的时间量。
[0188]
本发明的治疗方法可以是改善、治愈或预防。本发明的方法可以是自体免疫疗法的一部分或同种异体免疫疗法的一部分。
[0189]
在另一方面，本发明提供了一种抑制患有肿瘤的受试者中的肿瘤生长或进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的表达caccr和表达car的免疫细胞。在另一方面，本发明提供了一种抑制或预防受试者中的癌细胞转移的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的工程化免疫细胞。在另一方面，本发明提供了一种在患有肿瘤的受试者中诱导肿瘤消退的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文所述的工程化免疫细胞。
[0190]
在一些实施例中，本文的工程化t细胞可以在受试者中肠胃外施用。
[0191]
还提供了本文提供的任何一种工程化t细胞在制备用于治疗癌症或用于抑制有需要的受试者中的肿瘤生长或进展的药物中的用途。
[0192]
在一些实施例中，治疗可以施用于经历免疫抑制治疗的受试者。实际上，本发明优选地依赖于由于编码此类免疫抑制剂的受体的基因失活而对至少一种免疫抑制剂产生抗性的细胞或细胞群。在这方面，免疫抑制治疗应该有助于在受试者体内选择和扩增根据本发明的t细胞。根据本发明的细胞或细胞群的施用可以以任何方便的方式进行，包含雾化吸入、注射、摄入、灌输、植入或移植。可以将本文所述的组合物皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内或淋巴管内注射或腹膜内施用于受试者。携带本公开的caccr和car的细胞或其药物组合物可以通过以下一种或多种施用途径施用：静脉内、眼内、玻璃体内、肌肉内、皮下、局部、口服、透皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内、通过耳朵或鼻内。
[0193]
在一些实施例中，细胞或细胞群(携带本公开的caccr和car)的施用可以包括施用例如每kg体重约104到约109个细胞，包含这些范围内细胞数的所有整数值。在一些实施例中，细胞或细胞群的施用可以包括施用约104到105个细胞/kg体重、105到106个细胞/kg体重、106到107个细胞/kg体重、107到108个细胞/kg体重或108到109个细胞/kg体重。细胞或细胞群可以按一个或多个剂量施用。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以作为单剂量施用。在一些实施例中，所述有效量的细胞可以在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内，并取决于受试者的临床状况。细胞或细胞群可以从任何来源获得，如血库或供体。虽然个体需求各不相同，但对用于治疗特定疾病或病状的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定在本领域技术范围内。有效量意指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重、同期治疗(如果有的话)的种类、治疗频率和期望的效果的性质。在一些实施例中，肠胃外施用有效量的细胞或包括那些细胞的组合物。在一些实施例中，施用可以是静脉内施用。在一些实施例中，施用可以通过注射到
肿瘤内直接进行。
[0194]
所述方法可以进一步包括在施用携带本文提供的car和caccr的工程化免疫细胞之前向受试者施用一种或多种药剂。在某些实施例中，所述药剂是淋巴清除(预处理)方案。例如，对需要此类疗法的受试者进行淋巴清除的方法包括向所述受试者施用指定有益剂量的环磷酰胺(介于200mg/m2/天和2000mg/m2/天之间、约100mg/m2/天和约2000mg/m2/天之间；例如，约100mg/m2/天、约200mg/m2/天、约300mg/m2/天、约400mg/m2/天、约500mg/m2/天、约600mg/m2/天、约700mg/m2/天、约800mg/m2/天、约900mg/m2/天、约1000mg/m2/天、约1500mg/m2/天或约2000mg/m2/天)和指定剂量的氟达拉滨(介于20mg/m2/天和900mg/m2/天之间、介于约10mg/m2/天和约900mg/m2/天之间；例如，约10mg/m2/天、约20mg/m2/天、约30mg/m2/天、约40mg/m2/天、约40mg/m2/天、约50mg/m2/天、约60mg/m2/天、约70mg/m2/天、约80mg/m2/天、约90mg/m2/天、约100mg/m2/天、约500mg/m2/天或约900mg/m2/天)。示例性施用方案涉及治疗受试者，包括：在向患者施用治疗有效量的工程化免疫细胞之前三天，联合施用或在施用约30mg/m2/天的氟达拉滨之前或之后，每天向患者施用约300mg/m2/天的环磷酰胺。
[0195]
在一些实施例中，特别是在本文提供的工程化细胞已被基因编辑以消除或最小化cd52的表面表达的情况下，淋巴清除进一步包括施用抗cd52抗体，如阿仑单抗。在一些实施例中，以约1
‑
20mg/天(例如，约13mg/天)的剂量静脉注射(iv)施用cd52抗体，持续1天、2天、3天或更多天。抗体可以与淋巴清除方案的其它成分(例如，环磷酰胺和/或氟达拉滨)联合施用，或在施用所述其它成分之前或之后施用。
[0196]
在某些实施例中，包括本文公开的表达caccr和car的免疫效应细胞的组合物可以与任何数量的化学治疗剂联合施用。
[0197]
iv.试剂盒和制品
[0198]
本公开提供了包括任何一种或多种本文所述的携带caccr和car的细胞及其药物组合物的试剂盒。本公开还提供了包括任何一种或多种本文所述的携带caccr和car的car
‑
i细胞、其药物组合物和本文所述的试剂盒的制品。
[0199]
仅出于说明性目的包含以下实例，并且所述实例并不旨在限制本公开的范围。
[0200]
本公开通篇引用的所有专利和非专利文件出于所有目的通过引用整体并入本文
[0201]
实例
[0202]
实例1：组成性地激活细胞因子信号传导的tpor tm突变体的鉴定
[0203]
使用来自血小板生成素受体(tpor)的序列设计了原型组成型活性嵌合细胞因子受体(caccr)。tpor能够激活jak
‑
stat信号传导通路并作为同源二聚体受体发出信号。tpor活性中的单点突变(氨基酸取代)已被证明可以调节受体活性(《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci u s a.)》2013年2月12日；110(7):2540
‑
5；《美国实验生物学联合会会志(faseb j.)》2011年7月；25(7):2234
‑
44；《生物化学杂志(j biol chem.)》2016年2月5日；291(6):2974
‑
87)。在此实例中，组成型活性嵌合细胞因子受体由天然存在的tpor受体工程改造而来：天然tpor受体的细胞外结构域被去除，因此其不再具有配体结合能力；1
‑
3个突变被引入其跨膜结构域中；并且tpor细胞尾被所需/描述的细胞因子受体的细胞尾取代。图1示出了工程化的组成型活性嵌合细胞因子受体的示意图。
[0204]
为了证明组成型活性嵌合细胞因子受体在car
‑
t细胞背景下的效用，将每个tpor
跨膜(tm)变体克隆到编码第二代egfrviii特异性car的慢病毒载体中(2173scfv；描述于以下文献中：《科学转化医学(sci transl med.)》2015年2月18日；7(275):275ra22.)。为了允许细胞因子受体和car的化学计量共表达，将这两个基因通过p2a肽连接。为了便于检测转导的细胞，将v5表位标签(kpipnpllgldst)seq id no:144)插入scfv和cd8铰链结构域之间。
[0205]
图2示出了用于共表达组成型活性嵌合细胞因子受体和car的慢病毒载体的示意图。
[0206]
表4示出了与所用构建体相关的序列。
[0207]
使用hek293t细胞报告基因测定来筛选能够进行组成型细胞因子信号传导的tpor tm变体。简而言之，将20,000个hek293t细胞接种到聚l
‑
赖氨酸包被的96孔平底板的每个孔中，并使其粘附过夜。将细胞因子受体
‑
car构建体(2.5ng)、驱动萤火虫荧光素酶的stat响应元件(100ng；promega)和海肾荧光素酶对照报告载体(1ng；promega)在opti
‑
mem(gibco)中以5ul的最终体积混合(“dna混合物”)。作为阴性对照，用缺乏所有细胞因子信号传导结构域的bfp car构建体转染细胞。作为阳性对照，用编码全长人epor(代替细胞因子受体
‑
car构建体的促红细胞生成素受体)的载体转染细胞，以便通过添加外源性重组人epo诱导stat5信号传导。将5ul opti
‑
mem中的0.3ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将10ul的总体积添加到含有hek
‑
293t的每个孔中。转染后48小时，使用dual
‑
glo荧光素酶测定系统(promega)评估stat5报告基因活性。将stat5报告基因活性的诱导倍数相对于用除嵌合细胞因子受体外的所有载体转染的hek293t细胞和未经处理的细胞的诱导倍数进行归一化。
[0208]
图3a和3b示出了组成性地激活细胞因子受体信号传导的tpor tm突变体的鉴定。图3a示出了所用慢病毒载体的示意图。其携带il7r(316
‑
459)细胞尾以模拟car
‑
t细胞中的il7信号传导。图3b示出了通过dual
‑
glo荧光素酶测定确定的stat5报告基因活性。携带野生型tpor tm结构域(tpor(478
‑
582))的细胞因子受体不会自发激活stat5。tpor(478
‑
582；s505n)、tpor(478
‑
582；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l、g509n)突变体导致弱stat5激活。tpor(478
‑
582；h499l、s505n、w515k)允许中等的stat5活性，而tpor(478
‑
582；s505n、w515k)生成最强的stat5信号。
[0209]
实例2：表达组成型活性嵌合细胞因子受体的car
‑
t细胞的生成
[0210]
我们接下来测试了这些细胞因子受体是否在原代人car
‑
t细胞的背景下发出信号。为了制备编码细胞因子受体
‑
car的慢病毒，在转染前一天，将hek293t细胞以45万个细胞/ml接种在6孔板的每孔中补充有10％fbs(hyclone)的2ml dmem(gibco)中。在转染当天，通过将慢病毒包装载体1.5ug pspax2、0.5ug pmd2g和0.5ug适当的转移car载体混合在6孔板的每孔250ul opti
‑
mem(gibco)中(“dna混合物”)来制备慢病毒。将250ul opti
‑
mem中的10ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将500ul的总体积缓慢添加到含有hek293t的孔的侧面。转染后1天，将6孔板中hek293t细胞每孔的培养基替换为每孔2ml的t细胞转导培养基，即补充有10％fbs的x
‑
vivo
‑
15。转染后2天，收集来自hek293t细胞的慢病毒上清液并通过0.45微米过滤器(emd millipore)去除细胞碎片，根据制造商的说明使用lenti
‑
x浓缩器(takara bio)浓缩25倍，然后分装速冻。通过将冷冻的慢病毒的等分试样解冻、进行4倍连续稀释并
对jurkat细胞(克隆e6
‑
1；atcc)进行有限稀释滴定来确定慢病毒滴度。在第0天，在grex
‑
24板(wilson wolf，目录号80192m)中的x
‑
vivo
‑
15培养基(lonza)中激活纯化的t细胞，所述培养基补充有100iu/ml人il
‑
2(miltenyi biotec)、10％fbs(hyclone)和人t transact(miltenyi biotec，目录号130
‑
111
‑
160，1:100稀释)。在第2天，将t细胞以50万个细胞/ml重新悬浮在t细胞转导培养基中，用moi＝5的相应慢病毒原液以及100iu/ml人il
‑
2转导在grex
‑
24板中。在转导完成的第5天，收获细胞并洗涤以去除残留的il
‑
2。然后将细胞重新悬浮在t细胞扩增培养基中，即补充有5％人ab血清(gemini bio)的x
‑
vivo
‑
15中，并将每个样品均分为2份，其中一份按照标准方案接受100iu/ml人il
‑
2，另一个接受较低浓度的25iu/ml人il
‑
2。根据需要使用t细胞扩增培养基和相应浓度的人il
‑
2将细胞扩增到更大的g
‑
rex器皿(wilson wolf)中。在第5天、第9天和第14天，计算每个样品中t细胞的绝对数量，并通过使用流式细胞术检测结合fitc缀合的v5标签单克隆抗体(thermo fisher)的t细胞的百分比来确定转导效率。在第14天或第15天，将car
‑
t细胞产品冷冻保存并根据需要解冻以进行进一步分析。
[0211]
图4a
‑
4c示出了生成共表达组成型活性嵌合细胞因子受体的car
‑
t细胞的结果。与具有野生型tpor tm细胞因子受体(tpor(478
‑
582))的car
‑
t细胞培养物相比，携带tpor tm突变体的car
‑
t细胞培养物在总t细胞数(图4a)和car
‑
t细胞数(图4b)两方面都经历了更强劲的扩增。图4a
‑
4c显示，tpor tm突变体的转导效率等于或优于其野生型tpor(478
‑
582)对应物。tpor tm突变体允许更高产量的car
‑
t细胞产物。此外，在较低il
‑
2浓度下扩增tpor tm突变体不影响car
‑
t细胞的扩增或产量(图4c)。
[0212]
在car
‑
t细胞产生的第14天，确定了car
‑
t细胞的记忆表型。简而言之，将样品用pbs洗涤，进行fc阻断，然后用稀释在pbs+1％bsa中的以下抗体混合物染色：buv395缀合的抗人cd3、bv510缀合的抗人cd8、bv605缀合的人cd4和fitc缀合v5标签(用于car检测)、pe/cy7缀合的抗人cd62l(biolegend)和bv785缀合的抗人cd45ro(biolegend)。最后，在pbs中洗涤样品，并将细胞沉淀重新悬浮在130ul pbs+1％bsa中，用于facs分析。
[0213]
图5示出了car
‑
t细胞产品中的记忆t细胞亚群分布。与其野生型tpor(478
‑
582)对应物相比，tpor(478
‑
582；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l、g509n)突变体在标准100iu/ml il
‑
2条件下扩增时表现出更大的分化。在低il
‑
2条件下的扩增改善了分化。与标准浓度的il
‑
2一致，由tpor(478
‑
582；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l、g509n)突变体诱导的更强的stat5信号传导可能导致加速的car
‑
t细胞分化，并且在表达组成型细胞因子受体的car
‑
t细胞的背景下，低il
‑
2条件下的扩增可能更有利。
[0214]
实例3：tpor tm突变体组成性地激活人car
‑
t细胞中的细胞因子信号传导
[0215]
为了确定由tpor tm突变体介导的细胞因子信号传导的强度，将携带tpor tm细胞因子受体变体的car
‑
t细胞在100ul无血清rpmi(corning)中在37℃和5％co2的加湿培养箱中血清饥饿4小时。作为阳性对照，在4小时血清饥饿的最后30分钟期间添加外源性重组人il
‑
7(10ng/ml；miltenyi)。4小时后，将包括buv395缀合的抗人cd3(biolegend)和fitc缀合的v5标签单克隆抗体(thermo fisher)的抗体混合物添加到细胞中，并使其孵育最后20分钟。然后通过向每100ul样品中添加35ul的16％多聚甲醛来固定细胞，并使其在37℃下孵育15分钟。然后将细胞用pbs洗涤三次，并在
‑
20℃下在100％冷甲醇中透化1晚或2晚。在facs分析当天，将细胞用pbs洗涤三次，进行fc阻断，并用稀释在pbs+1％bsa中的alexafluor647
缀合的抗小鼠/人stat5(py694)(bd biosciences)染色。在室温下避光孵育1小时后，将细胞洗涤三次，然后进行facs分析。
[0216]
图6a
‑
6b示出了由每个tpor tm变体介导的组成型细胞因子信号传导的程度，如pstat5+细胞的百分比(图6a)和pstat5染色的几何平均荧光强度(gmfi)(图6b)所反映的。虽然tpor tm单突变体(tpor(478
‑
582；s505n)和tpor(478
‑
582；w515k))并未诱导明显的stat5激活，但tpor tm双突变体(tpor(478
‑
582；s505n、w515k)和三突变体(tpor(478
‑
582；h499l、s505n、w515k))诱导了相当强的组成型stat5激活。在低il
‑
2和标准il
‑
2浓度下扩增的car
‑
t细胞生成了相当的stat激活谱。由于stat5仅激活了同一培养物中的携带car的t细胞(car+)和不携带car的t细胞(car
‑
)，这表明细胞因子信号传导是car
‑
t细胞特异性的。
[0217]
实例4：组成型细胞因子受体增强的car
‑
t细胞细胞毒性效力和延长的反应持久性
[0218]
为了测试组成型细胞因子受体信号传导是否增强了car
‑
t细胞的细胞毒活性，我们使用u87ko
‑
egfrviii
‑
nucgfp作为靶细胞。u87ko
‑
egfrviii是cellectis sa(法国巴黎)赠送的礼物。通过首先使用转录激活因子样效应核酸酶(talen)敲除内源性野生型egfr，然后通过慢病毒转导稳定过表达全长人egfrviii，从亲本细胞系u87mg(atcc)中衍生u87ko
‑
egfrviii。为了通过incucyte活细胞分析成像系统促进靶标t细胞成像，通过使用incucyte nuclight green慢病毒试剂(sartorius)进行第二次慢病毒转导，从u87ko
‑
egfrviii中衍生u87ko
‑
egfrviii
‑
nucgfp靶细胞。接种5,000个u87ko
‑
egfrviii
‑
nucgfp靶细胞，并使其在含有10％fbs(hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠和20
‑
25mm hepes的50ul rpmi中附着在具有黑色壁和平坦透明底部的96孔板中。将携带tpor tm变异细胞因子受体的egfrviii car(2173scfv)t细胞解冻，并以1:8和1:2的效应子:靶标(e:t)比率添加到接种的靶细胞中。为了进行比较，试验中包含了添加和不添加外源性重组人il
‑
7的野生型tpor(478
‑
582)car
‑
t细胞。在适用的情况下，通过将悬浮细胞从原始平板转移到新的靶细胞平板上，在指定的时间点对car
‑
t细胞进行再次攻击。为每种条件建立双孔。通过使用incucyte活细胞分析成像系统计算每个时间点的活靶细胞数量来确定细胞毒性。
[0219]
图7a
‑
7d示出了tpor tm突变体在e:t比为1:8时的细胞毒活性。与携带野生型tpor(478
‑
582)对照的对应物相比，单个tpor tm突变体tpor(478
‑
582；s505n)(图7a)和tpor(478
‑
582；w515kn)(图7b)未显示功能增强，这与其无法有效激活stat5(图6a
‑
6b)一致。图7c显示，在标准il
‑
2浓度下扩增的tpor双突变体car
‑
t细胞没有被增强；而在低il
‑
2条件下扩增的tpor双突变体car
‑
t细胞在靶细胞裂解方面更有效。图7d显示，tpor三突变体car
‑
t细胞在靶细胞裂解方面更有效，无论car
‑
t细胞生产过程中的il
‑
2浓度如何。这表明组成型细胞因子受体信号传导增强了car
‑
t细胞的效力。
[0220]
图8a
‑
8b示出了tpor tm双突变体(图8a)和三突变体(图8b)在1:2的e:t比率下的细胞毒活性。在初次反应期间，无论细胞因子受体活性如何，car
‑
t细胞都同样有效地消除了靶细胞。然而，当用新鲜靶标再次攻击时，只有表达组成型活性嵌合细胞因子受体的car
‑
t细胞保持功能，这表明组成型细胞因子受体信号传导增强了car
‑
t细胞反应的持久性。
[0221]
实例5：组成型细胞因子受体增强car
‑
t细胞持久性并促进car+tscm扩增
[0222]
为了观察在没有靶标或外源性细胞因子的情况下组成型细胞因子受体信号传导对car
‑
t细胞持久性的增强作用，进行了生长因子非依赖性测定。简而言之，通过添加非转导(ntd)t细胞，将所有样品中car
‑
t细胞的百分比相对于转导效率最低的样品(35.7％)进
行归一化。携带0.25x106个car的t细胞/ml，在含有10％fbs(hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠和20
‑
25mm hepes的4ml rpmi中。然后将细胞接种在t25组织培养瓶中。作为阳性对照，将外源性人il
‑
7(10ng/ml；miltenyi)添加到缺乏组成型细胞因子受体信号传导(野生型tpor(478
‑
582))的car
‑
t细胞中。在指定的日子里，从每种条件下收获200ul的双份样品，并使用zombie nir可修复活力试剂盒(biolegend)染色。将样品用pbs洗涤，进行fc阻断，然后用稀释在pbs+1％bsa中的以下抗体混合物染色：buv395缀合的抗人cd3、bv510缀合的抗人cd8、bv605缀合的人cd4和fitc缀合v5标签(用于car检测)、pe/cy7缀合的抗人cd62l(biolegend)和bv785缀合的抗人cd45ro(biolegend)。最后，在pbs中洗涤样品，并将细胞沉淀重新悬浮在含有123个ebead计数珠(thermo fisher)的130ul pbs+1％bsa中(10ul计数珠，在120ul pbs+1％bsa中)，然后进行facs分析。
[0223]
图9示出了在生长因子非依赖性测定中car
‑
t细胞随时间推移的富集。虽然携带野生型tpor tm(tpor(478
‑
582)和tpor tm单突变体(tpor(478
‑
582；s505n)和tpor(478
‑
582；w515kn))的car
‑
t细胞并未富集，但携带tpor tm双突变体和三突变体的car
‑
t细胞随着时间的推移而富集，这表明接受组成型细胞因子受体信号传导的携带car的t细胞优先存活。
[0224]
图10a
‑
10b示出了在生长因子非依赖性测定中car
‑
t细胞随时间推移的扩增倍数。通过将每个时间点的car
‑
t细胞的绝对数量相对于测定第0天的car
‑
t细胞数量进行归一化来确定扩增倍数。图10a显示，不能有效激活细胞因子受体信号传导的tpor tm单突变体以与携带野生型tpor tm(tpor(478
‑
582)的car
‑
t细胞相同的速率下降。相比之下，图10b显示，携带tpor tm双突变体或三突变体的car
‑
t细胞在没有靶标和外源性细胞因子的情况下延长了存活时间。与在标准il
‑
2条件下扩增的对应物相比，在低il
‑
2条件下扩增的tpor tm双突变体car
‑
t细胞显示出增加的持久性。在低和标准il
‑
2条件下制造的tpor tm三突变体car
‑
t细胞显示出相当的中等持久性增强。值得注意的是，尽管tpor双突变体和三突变体car
‑
t细胞持续时间更长，二者最终下降，这表明组成型细胞因子受体信号传导不太可能导致car
‑
t细胞永生化或转化。
[0225]
图11示出了在生长因子非依赖性测定中car+ t细胞之间随时间推移的记忆t细胞亚群分布。与野生型tpor tm(tpor(478
‑
582))相比，携带组成型活性细胞因子受体的car
‑
t细胞(在这种情况下示出的是在低il
‑
2条件下扩增的tpor tm三突变体)显示干细胞记忆t细胞(tscm)的绝对数量增加，所述干细胞记忆t细胞是介导长寿命抗肿瘤免疫的子集。值得注意的是，tpor tm三突变体的组成型信号传导比外源性人il
‑
7补充剂在扩增tscm car
‑
t细胞方面更有效。
[0226]
实例6：可以定制组成型细胞尾以激活所关注的信号传导通路
[0227]
细胞因子调控car
‑
t细胞命运和功能的能力源于它们引发不同下游信号传导通路的能力。例如，il
‑
7/il
‑
2/il
‑
15介导的stat5激活增强t细胞存活和扩增，而il
‑
12介导的stat4激活驱动末端分化为短寿命效应子。设计可以模拟更广泛的细胞因子信号的募集结构域(即，细胞尾)将为用户可编程的信号传导结果提供灵活性，从而控制car
‑
t细胞的命运和功能。
[0228]
为了询问caccr是否可以传递通过额外的细胞因子受体介导的信号，将来自图3的il7ra(316
‑
459)细胞尾替换为衍生自il2rb或il12rb2的细胞内信号传导结构域的替代性细胞尾。然后使用hek293t细胞报告基因测定来评估这些嵌合体的信号传导能力。简而言
之，将20,000个hek293t细胞接种到聚l
‑
赖氨酸包被的96孔平底板的每个孔中，并使其粘附过夜。将细胞因子受体
‑
car构建体(2.5ng)、驱动萤火虫荧光素酶的stat响应元件(100ng；promega)和海肾荧光素酶对照报告载体(1ng；promega)在opti
‑
mem(gibco)中以5ul的最终体积混合(“dna混合物”)。作为阴性对照，用缺乏所有细胞因子信号传导结构域的bfp
‑
car构建体或缺乏跨膜突变因此不能组成性地发出信号的tpor(478
‑
582).il7ra(316
‑
459)构建体转染细胞。将5ul opti
‑
mem中的0.3ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将10ul的总体积添加到含有hek
‑
293t的每个孔中。转染后48小时，使用dual
‑
glo荧光素酶测定系统(promega)评估各个stat报告基因的活性。将stat5报告基因活性的诱导倍数相对于用对照bfp
‑
car构建体转染的hek293t细胞的诱导倍数进行归一化。
[0229]
图12显示，具有不同信号传导结构域的构建体优先激活不同的stat通路。具体地说，il2rb(333
‑
551)和il7ra(316
‑
459)激活stat5，而il12rb2(714
‑
862)激活stat4，这反映了各个亲本受体的预期信号传导。这表明可以通过与所关注的信号传导结构域融合来对caccr进行编程以激活期望的信号传导通路。此外，与图3一致，携带tpor(478
‑
582；s505n、w515k)二聚化结构域的caccr比其tpor(478
‑
582；h499l、s505n、w515k)对应物产生更强的信号传导。因此，caccr信号传导输出的强度可以通过与这些二聚化结构域中的任何一个结构域融合来进一步调整。
[0230]
实例7：可以优化caccr信号传导结构域以调节信号强度，同时减小载体货物大小
[0231]
目前，基于病毒的基因递送方法(例如慢病毒和逆转录病毒介导的基因转移)通常用于car
‑
t细胞制造。随着货物大小的增加，转导效率和car
‑
t细胞产量下降。因此，减小货物的大小将有利于确保制造成功。出于两个原因，caccr优化的募集/信号传导结构域为此提供了一种手段。首先，与il2rb(333
‑
551)的情况一样，细胞因子受体衍生的信号传导结构域长度可达200多个氨基酸，并在转移载体中代表650多个碱基对。其次，虽然信号传导结构域内的酪氨酸残基对于启动和传播下游信号转导很重要，但其中一些残基还可以参与限制信号传导持续时间和强度的负反馈回路。因此，修剪细胞尾信号传导结构域不仅可以减小载体货物的大小，而且还为调节细胞尾信号传导提供了机会。为此，我们鉴定了全长il12rb2(714
‑
862)和il2rb(331
‑
551)尾内的酪氨酸残基，并生成了变体以鉴定能够介导细胞尾信号传导的截短构建体。
[0232]
全长il12rb2(714
‑
862)含有两个可磷酸化的酪氨酸残基y767和y800，它们可能参与下游信号传导。我们生成了仅含有y800的截短的il12rb2(775
‑
825)尾，并使用hek293t细胞报告基因测定评估了其激活stat4的能力。简而言之，将20,000个hek293t细胞接种到聚l
‑
赖氨酸包被的96孔平底板的每个孔中，并使其粘附过夜。将caccr
‑
car构建体(2.5ng)、驱动萤火虫荧光素酶的stat响应元件(100ng；promega)和海肾荧光素酶对照报告载体(1ng；promega)在opti
‑
mem(gibco)中以5ul的最终体积混合(“dna混合物”)。作为阴性对照，用缺乏所有细胞因子信号传导结构域的bfp
‑
car构建体转染细胞。将5ul opti
‑
mem中的0.3ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将10ul的总体积添加到含有hek
‑
293t的每个孔中。转染后48小时，使用dual
‑
glo荧光素酶测定系统(promega)评估stat4报告基因的活性。将stat4报告基因活性的诱导倍数相对于用对照bfp
‑
car构建体转染的hek293t细胞的诱导倍数进行归一
化。
[0233]
图13a
‑
b示出了能够与全长il12rb2(714
‑
862)细胞尾相当地激活stat4的截短的il12rb2(775
‑
825)细胞尾的鉴定。图13a示出了全长il12rb(714
‑
862)尾和截短的il12rb(775
‑
825)细胞尾的示意图。包含在每个尾中的酪氨酸残基(y)的位置如图所示。图13b显示，当与较强的tpor(478
‑
582；s505n、w515k)二聚化结构域融合时，截短的il12rb2(775
‑
825)细胞尾完全概括了全长il12rb2(714
‑
862)细胞尾的stat4信号传导强度。当与较弱的tpor(478
‑
582；h499l、s505n、w515k)二聚化结构域融合时，截短的il12rb2(775
‑
825)细胞尾部分概括了全长il12rb2(714
‑
862)细胞尾的stat4信号传导强度。
[0234]
全长il2rb(333
‑
551)细胞尾含有六个可能参与下游信号传导的酪氨酸残基。其中，据报道y364(最接近受体跨膜结构域的酪氨酸残基)可激活pi3k以促进t细胞分化和增殖，以及细胞骨架重组以诱导受体内化；因此，虽然y364可以促进t细胞效应子功能，但其也可能限制il2rb信号传导强度和持续时间。我们生成了截短的il2rb细胞尾，其含有六个酪氨酸残基中的三个(y364、y418和y436)或六个酪氨酸残基中的两个(y418和y436)，并使用hek293t细胞报告基因测定评估了其激活stat5的能力。简而言之，将20,000个hek293t细胞接种到聚l
‑
赖氨酸包被的96孔平底板的每个孔中，并使其粘附过夜。将caccr
‑
car构建体(2.5ng)、驱动萤火虫荧光素酶的stat响应元件(100ng；promega)和海肾荧光素酶对照报告载体(1ng；promega)在opti
‑
mem(gibco)中以5ul的最终体积混合(“dna混合物”)。作为阴性对照，用缺乏所有细胞因子信号传导结构域的bfp
‑
car构建体转染细胞。将5ul opti
‑
mem中的0.3ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将10ul的总体积添加到含有hek
‑
293t的每个孔中。转染后48小时，使用dual
‑
glo荧光素酶测定系统(promega)评估stat5报告基因的活性。将stat5报告基因活性的诱导倍数相对于用对照bfp
‑
car构建体转染的hek293t细胞的诱导倍数进行归一化。
[0235]
图14a
‑
b示出了相对于全长il2rb(333
‑
551)尾能够相等或更好地激活stat5的截短的il2rb尾的鉴定。图14a示出了全长il2rb(333
‑
551)尾和两个截短的il2rb尾的示意图。包含在每个尾中的酪氨酸残基(y)的位置如图所示。虚线代表全长il2rb(333
‑
551)尾中的相互连接区域，这些区域已从截短的尾中移除。图14b示出了来自hek293t细胞报告基因测定的结果，其中全长il2rb(333
‑
551)的stat5信号传导完全被含有y364、y418和y536的tpor(478
‑
582；h499l、s505n、w515k)il2rb(339
‑
379、393
‑
433、518
‑
551)的细胞尾概括。在tpor(478
‑
582；s505n、w515k).il2rb(393
‑
433、518
‑
551)细胞尾中，额外去除介导受体内化的y364导致stat5信号传导强度显著提高。
[0236]
hek293t细胞测定是一种短期测定，其读数在细胞尾转染的48小时内测量。虽然它为细胞尾活性提供了一个有效的筛选平台，但该检测的有限持续时间并没有反映在长期组成型细胞因子和细胞尾信号传导后触发的负反馈回路的复杂性。为了更准确地评估减少的il2rb尾变体的长期信号传导活性，我们使用2周的生产过程生成了caccr car
‑
t细胞，并通过细胞内流式细胞术评估了stat5激活。为此，将caccr car
‑
t细胞在100ul无血清rpmi(corning)中在37℃和5％co2的加湿培养箱中血清饥饿4小时。作为阳性对照，在4小时血清饥饿的最后30分钟期间添加外源性重组人il
‑
2(10ng/ml；miltenyi)。4小时后，将包括buv395缀合的抗人cd3(biolegend)和fitc缀合的v5标签单克隆抗体(thermo fisher)的抗
体混合物添加到细胞中，并使其孵育最后20分钟。然后通过向每100ul样品中添加35ul的16％多聚甲醛来固定细胞，并使其在37℃下孵育15分钟。然后将细胞用pbs洗涤三次，并在
‑
20℃下在100％冷甲醇中透化1晚或2晚。在facs分析当天，将细胞用pbs洗涤三次，进行fc阻断，并用稀释在pbs+1％bsa中的alexafluor647缀合的抗小鼠/人stat5(py694)(bd biosciences)染色。在室温下避光孵育1小时后，将细胞洗涤三次，然后进行facs分析。
[0237]
图15示出了携带全长或截短的il2rb细胞尾的原代caccr car
‑
t细胞中的stat5激活。最大的stat5激活是由caccr car
‑
t细胞引发的，所述细胞携带缺乏y364内化基序的截短的il2rb(393
‑
433、518
‑
551)细胞尾。在携带截短的il2rb(339
‑
379、393
‑
433、518
‑
551)细胞尾的caccr car
‑
t细胞中观察到中间stat5激活。在相同培养物中的car阴性群体中未观察到stat5激活，这表明了细胞尾信号传导的car
‑
t细胞特异性性质。值得注意的是，在携带全长il2rb(333
‑
551)细胞尾的caccr car
‑
t细胞中几乎没有检测到stat5活性；这可能是由于全长il2rb(333
‑
551)细胞尾中存在的其它三个酪氨酸残基可能会诱导长期的负调控。因此，优化细胞尾信号传导结构域以消除此类负调控基序有利于确保长期维持组成型和生产型信号传导。由于强细胞尾可能引发强烈的负反馈反应，因此对于长期刺激，可能优选弱细胞尾。
[0238]
实例7：优化的il2rb衍生细胞尾更接近地模拟il
‑
15而非il
‑
2的信号传导
[0239]
il
‑
2和il
‑
15是两种细胞因子，它们通过由共同γ链和il2rb组成的异二聚体细胞因子受体自然地发出信号。尽管共享相同的天然受体，但il
‑
2和il
‑
15对t细胞分化和持久性产生不同的影响。il
‑
2诱导短寿命的效应细胞分化，而il
‑
15促进长寿命的记忆t细胞的生成。此外，增加的il
‑
15血清浓度已被证明与患者对car
‑
t细胞疗法的反应呈正相关。因此，模拟il
‑
15而非il
‑
2的信号传导和作用的细胞尾是优选的。我们试图确定减少的il2rb细胞尾是否更接近地模拟il
‑
2或il
‑
15信号传导。
[0240]
为此，我们使用了包括示例性car的car
‑
t细胞，所述示例性car携带针对bcma的p5a2 scfv，偶联至利妥昔单抗模拟表位、4
‑
1bb和cd3z信号传导结构域(参见us10,294,304，其通过引用并入本文)。生成了共表达截短的il2rb尾的bcma特异性car
‑
t细胞，并将其基因表达谱与暴露于外源性重组人il
‑
2或il
‑
15的对照car
‑
t细胞进行比较。为了制备编码caccr和car的慢病毒，在转染前一天，将hek293t细胞以45万个细胞/ml接种在6孔板的每孔中补充有10％fbs(hyclone)的2ml dmem(gibco)中。在转染当天，通过将慢病毒包装载体1.5ug pspax2、0.5ug pmd2g和0.5ug适当的转移car载体混合在6孔板的每孔250ul opti
‑
mem(gibco)中(“dna混合物”)来制备慢病毒。将250ul opti
‑
mem中的10ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将500ul的总体积缓慢添加到含有hek293t的孔的侧面。转染后一天，将6孔板中hek293t细胞每孔的培养基替换为每孔2ml的t细胞转导培养基，即补充有10％fbs的x
‑
vivo
‑
15。转染后两天，收集来自hek293t细胞的慢病毒上清液并通过0.45微米过滤器(emd millipore)去除细胞碎片，并将粗制慢病毒上清液直接用于t细胞转导。在第0天，在grex
‑
24板(wilson wolf，目录号80192m)中的x
‑
vivo
‑
15培养基(lonza)中激活纯化的t细胞，所述培养基补充有100iu/ml人il
‑
2(miltenyi biotec)、10％fbs(hyclone)和人t transact(miltenyi biotec，目录号130
‑
111
‑
160，1:100稀释)。在第2天，将t细胞以50万个细胞/ml重新悬浮在t细胞转导培养基中，用等体积的粗制慢病毒上清液以及100iu/ml人il
‑
2转导
在grex
‑
24板中。在第5天，通过用t细胞扩增培养基(即补充有5％人ab血清(gemini bio)的x
‑
vivo
‑
15)以及100iu/ml人il
‑
2替换用过的培养基来喂养表达细胞尾的car
‑
t细胞。此时，缺乏细胞尾的对照car
‑
t细胞在仅100u/ml人il
‑
2中扩增，或在100u/ml人il
‑
2和10ng/ml人il
‑
15(miltenyi biotec)中扩增。根据需要使用t细胞扩增培养基和相应浓度的重组细胞因子将细胞扩增到更大的g
‑
rex器皿(wilson wolf)中。在第13天，将细胞用zombie nir可修复活力试剂盒(biolegend)染色，用buv395缀合的cd3抗体(biolegend)和对p5a2 scfv具有特异性的抗独特型抗体标记，然后进行facs分选以富集car+ t细胞。然后将分选的car+ t细胞在grex
‑
24板中在t细胞扩增培养基中再培养2天，caccr car+ t细胞在没有外源性细胞因子的情况下留下，而分选的对照car+ t细胞在没有外源性细胞因子的情况下留下、经100u/ml人il
‑
2处理或经10ng/ml人il
‑
15处理。在第15天，使用easy sep死细胞去除试剂盒(stemcell technologies)富集活car+ t细胞，然后快速冷冻细胞沉淀，用于随后的rna提取和nanostring基因表达分析(人car
‑
t板；nanostring technologies)。
[0241]
数据显示，携带截短的il2rb尾的caccr car
‑
t细胞更接近地模拟il
‑
15而非il
‑
2信号传导。例如，我们测试了细胞尾tpor(478
‑
582；s505n、w515k).il2rb(393
‑
433、518
‑
551)和tpor(478
‑
582；h499l、s505n、w515k).il2rb(339
‑
379、393
‑
433、518
‑
551)。图16a是样品制备的实验设计和工作流程的示意图。图16b示出了在第13
‑
15天，与用il
‑
2处理的对照car
‑
t细胞的基因表达谱相比，caccr car
‑
t细胞的基因表达谱。图16c示出了在第13
‑
15天，与用il
‑
15处理的对照car
‑
t细胞的基因表达谱相比，caccr car
‑
t细胞的基因表达谱。通过相对于在第13
‑
15天未经处理的对照car
‑
t细胞进行归一化，计算每个样品的log2变化倍数(fc)。通过线性回归分析确定的r2值和最佳拟合线(实线)示出在每个图上。示出的数据是两个供体中的一个代表。虽然据显示，caccr car
‑
t细胞的基因表达谱与经il
‑
2处理的样品没有相关性(图16b)，但这些基因表达谱与经il
‑
15处理的样品呈正相关(图16c)。这些表明，携带截短的il2rb尾的细胞尾更接近地模拟il
‑
15而非il
‑
2的下游信号传导和转录反应。
[0242]
实例9：可以针对组合型信号传导输出对组成型细胞尾进行编程
[0243]
如图12所示，携带来自各种细胞因子受体的信号传导结构域的caccr可以激活让人联想到亲本受体的信号传导。我们假设细胞尾可以被设计成通过串联融合多于一个细胞尾来模拟来自多个亲本受体的同时信号传导，从而实现组合型信号传导结果。为了测试来自串联细胞尾的组合型信号传导输出，我们通过将il7ra(316
‑
459)细胞尾与截短的il12rb2(775
‑
825)细胞尾融合并使用hek293t细胞报告基因测定评估信号传导，生成了组成型7.12尾。
[0244]
图17a
‑
d示出了组成型串联细胞尾的设计和信号传导能力，如通过7.12尾所例示的。图17a示出了组成型7.12尾的示意图。图17b示出了慢病毒载体的示意图，不同之处仅在于它们的tpor(478
‑
582)二聚化/jak
‑
结合结构域，所述慢病毒载体用于共表达7.12尾变体和car。图17c
‑
d示出了携带分别融合至指定细胞尾的tpor(478
‑
582；s505n；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l；s505n；w515k)二聚化/jak
‑
结合结构域的构建体的stat报告基因活性。虽然il7ra(316
‑
459)细胞尾强烈激活stat5，而il12rb2(775
‑
825)细胞尾强烈激活stat4。然而，正如在il7ra(316
‑
459)il12rb2(775
‑
825)细胞尾中观察到的那样，串联融合两个细胞尾导致stat5和stat4的同时和组合激活。这表明，通常需要两个或更多个不同天然细胞因
子受体的多个信号传导通路可以用单个细胞尾实现。
[0245]
实例10：组成型细胞尾可以通过单个或多个输出进行定制，以指导car
‑
t细胞表型和功能
[0246]
我们接下来确定了具有不同信号传导输出的组成型细胞尾是否可以不同地影响原代人car
‑
t细胞的表型和功能。与驱动t细胞存活和记忆维持的il
‑
7不同，il12是一种促炎细胞因子，其可促进t细胞分化。因此，我们试图询问通过il7ra或il12rb衍生的细胞尾进行信号传导是否可以不同地引导这些不同的表型，并评估串联融合两个尾的净组合效应。
[0247]
为此，我们生成了共表达7尾(即il7ra(316
‑
459))或12尾的变体(即il12rb2(775
‑
825)或il12rb2(714
‑
862))的人原代car
‑
t细胞。参见图13a。为了制备编码caccr和car的慢病毒，在转染前一天，将hek293t细胞以45万个细胞/ml接种在6孔板的每孔中补充有10％fbs(hyclone)的2ml dmem(gibco)中。在转染当天，通过将慢病毒包装载体1.5ug pspax2、0.5ug pmd2g和0.5ug适当的转移car载体混合在6孔板的每孔250ul opti
‑
mem(gibco)中(“dna混合物”)来制备慢病毒。将250ul opti
‑
mem中的10ul lipofectamine 2000(invitrogen)在室温下孵育5分钟，然后添加到dna混合物中。将混合物在室温下孵育20分钟，并将500ul的总体积缓慢添加到含有hek293t的孔的侧面。转染后1天，将6孔板中hek293t细胞每孔的培养基替换为每孔2ml的t细胞转导培养基，即补充有10％fbs的x
‑
vivo
‑
15。转染后2天，收集来自hek293t细胞的慢病毒上清液并通过0.45微米过滤器(emd millipore)去除细胞碎片，并将粗制慢病毒上清液直接用于t细胞转导。在第0天，在grex
‑
24板(wilson wolf，目录号80192m)中的x
‑
vivo
‑
15培养基(lonza)中激活纯化的t细胞，所述培养基补充有100iu/ml人il
‑
2(miltenyi biotec)、10％fbs(hyclone)和人t transact(miltenyi biotec，目录号130
‑
111
‑
160，1:100稀释)。在第2天，将t细胞以50万个细胞/ml重新悬浮在t细胞转导培养基中，用等体积的粗制慢病毒上清液以及100iu/ml人il
‑
2转导在grex
‑
24板中。在第5天，通过用t细胞扩增培养基(即补充有5％人ab血清(gemini bio)的x
‑
vivo
‑
15)以及100iu/ml人il
‑
2替换用过的培养基来喂养细胞。根据需要使用t细胞扩增培养基和相应浓度的人il
‑
2将细胞扩增到更大的g
‑
rex器皿(wilson wolf)中。在第14天，通过使用fitc缀合的v5标签单克隆抗体(thermo fisher)检测car转导的细胞并通过流式细胞术与pe/cy7缀合的cd62l抗体(biolegend)和bv785缀合的cd45ro抗体(biolegend)共染色，对car
‑
t细胞产物进行记忆表型分析。作为缺乏caccr信号传导的阴性对照，平行生成共表达bfp或与7尾偶联的野生型tpor(478
‑
582)跨膜结构域的car
‑
t细胞。
[0248]
图18描绘了细胞尾对car
‑
t细胞产物的记忆分化的影响。示出了从2个健康供体生成的第14天caccr car
‑
t细胞产物的记忆表型。虽然共表达il7ra(316
‑
459)细胞尾的car
‑
t细胞保留了干细胞记忆(tscm)群体，但携带il12rb2衍生细胞尾的car
‑
t细胞显示出tscm群体显著减少，同时中枢记忆(tcm)群体增加。这些表明,在没有car参与的情况下，通过il12rb2衍生细胞尾进行的组成型il12样信号传导可驱动从tscm到tcm的渐进分化。此外，共表达串联il7ra(316
‑
459)il12rb2(775
‑
825)细胞尾的car
‑
t细胞显示出tscm群体的恢复并模拟了携带单个il7ra(316
‑
459)细胞尾的car
‑
t细胞的表型，这表明可以通过串联细胞尾的组合型信号传导来减轻单个细胞尾的负作用。
[0249]
我们进一步研究了caccr信号传导是否可以指导car
‑
t细胞功能结果，包含存活率和细胞毒性。与促进长期t细胞存活的il
‑
7信号传导相比，il
‑
12信号传导反而驱动分化为
短寿命的末端效应子。为了支持这一点，能够长期存活并被认为介导延长的car
‑
t细胞持久性的tscm群体在携带il12rb2衍生尾的car
‑
t细胞中很少见。为了询问通过不同细胞尾的信号传导是否可以对car
‑
t细胞的存活和分化进行编程，我们进行了一项生长因子非依赖性测定，其中在没有靶细胞或外源性补充细胞因子的情况下培养共表达caccr的car
‑
t细胞。在这些条件下，随着时间的推移监测car
‑
t细胞数量和记忆分化。
[0250]
简而言之，将冷冻保存的car
‑
t细胞解冻、计数，并且通过添加非转导(ntd)t细胞，将所有样品中car
‑
t细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。作为对照，使用共表达bfp(bfp car)的car
‑
t细胞代替细胞尾。然后将含有10％fbs(hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠和20
‑
25mm hepes的1.5ml rpmi中的0.25x106个car+ t细胞/ml接种到24孔组织培养板中。在指定的日子里，从每种条件下收获100ul的双份样品，并使用zombie nir可修复活力试剂盒(biolegend)染色。将样品用pbs洗涤，进行fc阻断，然后用稀释在pbs+1％bsa中的以下抗体混合物染色：buv395缀合的抗人cd3、bv510缀合的抗人cd8、bv605缀合的人cd4和fitc缀合v5标签(用于car检测)、pe/cy7缀合的抗人cd62l(biolegend)和bv785缀合的抗人cd45ro(biolegend)。最后，在pbs中洗涤样品，并将细胞沉淀重新悬浮在含有123个ebead计数珠(thermo fisher)的130ul pbs+1％bsa中(10ul计数珠，在120ul pbs+1％bsa中)，然后进行facs分析。
[0251]
图19a
‑
b示出了来自2个供体的细胞的代表性数据。图19a和图19b示出了对于携带分别融合至指定细胞尾的tpor(478
‑
582；s505n；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l；s505n；w515k)二聚化/jak
‑
结合结构域的构建体，car
‑
t细胞相对于测定开始时(第0天)的输入的扩增倍数。与对照bfp car
‑
t细胞相比，携带il7ra(316
‑
459)细胞尾的car
‑
t细胞以较慢的速率下降，这表明通过il7ra(316
‑
459)细胞尾的组成型信号传导提高了car
‑
t细胞的存活率。相比之下，携带il12rb2衍生细胞尾的car
‑
t细胞以与bfp car
‑
t细胞相似的速率下降，这表明缺乏生存益处。值得注意的是，携带串联il7ra(316
‑
459)il12rb2(775
‑
825)细胞尾的car
‑
t细胞赋予与il7ra(316
‑
459)细胞尾更相似的生存益处。图19c
‑
d示出了对于携带分别融合至指定细胞尾的tpor(478
‑
582；s505n；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l；s505n；w515k)二聚化/jak
‑
结合结构域的构建体，生长因子非依赖性测定在第7天的car
‑
t细胞分化。与对照bfp car
‑
t细胞和携带il12rb2衍生细胞尾的car
‑
t细胞相比，携带il7ra(316
‑
459)细胞尾的car
‑
t细胞不仅更丰富，而且在tscm群体中也更富集。参见图19c
‑
d。携带串联il7ra(316
‑
459)il12rb2(775
‑
825)细胞尾的car
‑
t细胞提高了tscm富集。不受任何特定机制的限制，结果表明，与il7ra(316
‑
459)细胞尾的融合覆盖了单个il12rb2(775
‑
825)细胞尾的表型。总之，这些数据重申了串联细胞尾信号传导的组合型功能效应，并证明了不同细胞尾构建体的可调性。
[0252]
在tscm群体中富集的car
‑
t细胞产物与提高的扩增、持久性和活性相关。然而，末端分化的car
‑
t细胞寿命短，并且增殖潜力有限，从而导致疗效降低。鉴于这些特征受il7ra(316
‑
459)和il12rb2衍生细胞尾的不同影响，我们评估了这些细胞尾影响car
‑
t细胞毒性的能力。
[0253]
为此，接种5,000个u87ko
‑
egfrviii
‑
nucgfp靶细胞，并使其在含有10％fbs(hyclone)、非必需氨基酸、丙酮酸钠和20
‑
25mm hepes的50ul rpmi中附着在具有黑色壁和平坦透明底部的96孔板中。将携带il7ra(316
‑
459)或il12rb衍生细胞尾的egfrviii car
(2173scfv)t细胞解冻，并以1:3的e:t比率添加到接种的靶细胞中。由于靶细胞数量超过car
‑
t细胞，因此控制靶细胞生长需要car
‑
t细胞进行反复或连续杀死。作为对照，使用共表达bfp car的car
‑
t细胞代替细胞尾。通过incucyte活细胞分析成像系统监测随时间推移的活靶细胞数量。
[0254]
图20a
‑
b描绘了共表达多种caccr的car
‑
t细胞的细胞毒活性。图20a
‑
b示出了携带分别融合至指定细胞尾的tpor(478
‑
582；s505n；w515k)和tpor(478
‑
582；h499l；s505n；w515k)二聚化/jak
‑
结合结构域的caccr car
‑
t细胞对靶细胞的清除。与bfp car
‑
t细胞相比，携带il12rb2衍生细胞尾的car
‑
t细胞在体外连续杀伤活性方面表现出一些改善到没有改善，这可能是由于它们的增殖潜力有限和寿命短。相比之下，携带il7ra(316
‑
459)细胞尾的car
‑
t细胞表现出提高的连续杀伤活性，这可能是由于增强的增殖和持久性。值得注意的是，携带串联il7ra(316
‑
459).il12rb2(775
‑
825)细胞尾的car
‑
t细胞显示出与il7ra(316
‑
459)细胞尾相同或更好的连续杀伤活性，这表明组合单个细胞尾中的促持久性il7ra(316
‑
459)信号传导结构域和前效应子il12rb2(775
‑
825)信号传导结构域可以同时增强car
‑
t细胞的寿命、扩增和即时效应子功能。
[0255]
实例11：组成型细胞因子受体增强针对液体肿瘤靶标的car的体外细胞毒性
[0256]
我们已经证明caccr可以增强针对egfrviii(实体瘤(例如，胶质母细胞瘤)的靶标)的car的活性。为了确定caccr是否广泛适用于针对血液肿瘤靶标的不同scfv，我们另外将caccr克隆到针对血液恶性肿瘤标志物(即bcma)的car构建体中，并评估了对bcma阳性靶细胞系的长期细胞毒性。
[0257]
通过慢病毒转导生成了稳定表达萤火虫荧光素酶和gfp报告基因的靶细胞。将10,000个luc
‑
gfp标记的靶细胞以100ul/孔接种在白色平底96孔组织培养板中。将冷冻保存的car
‑
t细胞解冻、计数，并且通过添加非转导(ntd)t细胞，将所有样品中car
‑
t细胞的百分比相对于转导效率最低的样品进行归一化。然后将100ul体积的car
‑
t细胞以指定的效应子:靶物(e:t)比率一式三份地添加到每个靶细胞孔中。作为“仅靶标”阴性对照，将100ul培养基(而非t细胞)添加到靶细胞中。两三天后，通过轻轻移液使孔混合，将100ul每个含t细胞的孔转移到新的白色平底96孔组织培养板中，所述组织培养板含有10,000个新鲜接种的luc
‑
gfp标记的靶细胞(100ul)。“仅靶标”孔接受新鲜培养基代替t细胞。将新板在37℃下孵育，同时根据制造商的说明使用one
‑
glo荧光素酶测定系统(promega)确定旧96孔板中剩余的活靶细胞数。通过将荧光素酶信号相对于“仅靶标”孔的信号进行归一化来计算活靶细胞的百分比，并将细胞毒性百分比计算为100％
‑
％活靶细胞。每两到三天连续转移到新鲜的靶细胞和荧光素酶读数，直到所有细胞毒活性停止。
[0258]
图21显示，caccr提高了针对bcma(一种液体肿瘤靶标)的car
‑
t细胞的细胞毒活性。图21示出了bcma car(p5a2 scfv)在e:t＝10:1时对mm1.s多发性骨髓瘤细胞系的细胞毒性，其表明caccr的共表达增加了car
‑
t细胞的长期细胞毒性。
[0259]
实例12：caccr增强car
‑
t细胞的体内活性
[0260]
car
‑
t细胞疗法，如靶向cd19和bcma的疗法，在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了前所未有的临床成功。虽然已经实现了很高的完全缓解率，但这是短暂的，因为大多数患者最终会复发。此外，car
‑
t细胞在治疗实体瘤方面取得的成功更为有限。复发和缺乏反应的原因包含car
‑
t细胞扩增和持久性不足，以及免疫抑制微环境对car
‑
t细胞功能的抑制。由
于我们对caccr car
‑
t细胞的体外表征揭示了靶标驱动的增殖、持久性、效力和耗竭情况的改善，我们接下来研究了这些功能增强是否会转化为提高的体内抗肿瘤活性。
[0261]
为了询问caccr car
‑
t细胞在血液恶性肿瘤背景下的体内活性，我们在多发性骨髓瘤的原位异种移植模型中使用了携带偶联至4
‑
1bb和cd3ζ信号传导结构域的bcma特异性p5a2 scfv的car
‑
t细胞。通过转录激活因子样效应核酸酶(talen)介导的敲除生成t细胞受体(tcr)缺陷型bcma car
‑
t细胞，以避免来自tcr驱动的异种反应性的潜在混杂。将8
‑
10周龄雌性nsg小鼠在静脉接种5
×
106个mm1.s
‑
luc
‑
gfp前一天用1gy照射。肿瘤植入后14天，根据肿瘤负荷随机分配小鼠，并对其静脉注射1
×
106个或3
×
106个指定的car
‑
t细胞(每组n＝10)。通过生物发光成像监测肿瘤进展。在t细胞给药后第30天，对接受了3
×
106个car
‑
t细胞的小鼠进行放血，以计数外周的bcma car
‑
t细胞。具体地说，使用ack裂解缓冲液(gibco)对来自每只小鼠的50ul全血进行红细胞裂解，fc阻断并用稀释在pbs+1％bsa中的以下抗体混合物染色：fitc缀合的抗小鼠cd45(biolegend)、bv421缀合的抗人cd45(biolegend)和对p5a2 scfv具有特异性的抗独特型抗体。最后，在pbs中洗涤样品，并将细胞沉淀重新悬浮在含有123个ebead计数珠(thermo fisher)的130ul pbs+1％bsa中(10ul计数珠，在120ul pbs+1％bsa中)，然后进行facs分析。
[0262]
图22a
‑
c显示，caccr提高了bcma car
‑
t细胞针对原位多发性骨髓瘤的体内抗肿瘤活性和持久性。图24a
‑
b分别示出了响应于用1
×
106个或3
×
106个指定car
‑
t细胞治疗的肿瘤进展。尽管对照bcma car
‑
t细胞能够介导最初的肿瘤消退，但这种反应是短暂的，因为肿瘤在细胞输注22天后复发。然而，共表达caccr的car
‑
t细胞显著延迟了肿瘤复发并提高了反应的持久性。图24a
‑
b中的统计数据代表**p<0.01和***p<0.001，基于重复测量单向anova与图22a的第6
‑
34天和图22b的第6
‑
44天的tukey多重比较。图22c示出了在t细胞输注30天后用3
×
106个car
‑
t细胞治疗的小鼠的外周血中存在的bcma car
‑
t细胞的数量。与在用对照bcma car
‑
t细胞治疗的小鼠中观察到的肿瘤复发一致，在外周中无法再检测到对照bcma car
‑
t细胞。相比之下，在预防肿瘤复发方面具有优势的caccr bcma car
‑
t细胞在体内也更丰富。图24c中的统计数据代表*p<0.05和****p<0.0001，基于普通单向anova与tukey多重比较。这些表明，提高的caccr car
‑
t细胞持久性部分介导了增强的长期肿瘤控制和延长的反应持久性。
[0263]
我们还评估了在已知抵抗car
‑
t细胞疗法的实体瘤(如胶质母细胞瘤)背景下caccr对car
‑
t细胞活性的影响。为此，我们利用了携带偶联至4
‑
1bb和cd3ζ信号传导结构域的2173scfv的egfrviii特异性car，以及稳定过表达egfrviii的ln229人胶质母细胞瘤细胞系(ln229
‑
egfrviii)。对8
‑
10周龄雌性nsg小鼠皮下植入3
×
106个ln229
‑
egfrviii。25天后，当肿瘤形成时，根据肿瘤负荷随机分配小鼠，并对其静脉注射1.5
×
106个或3
×
106个指定的car
‑
t细胞(每组n＝8
‑
10)。通过卡尺测量每周两次监测肿瘤进展。
[0264]
图23显示，caccr提高了car
‑
t细胞针对已建立的实体瘤的抗肿瘤活性。尽管用对照egfrviii car
‑
t细胞治疗可以延缓ln229
‑
egfrviii肿瘤的生长，但随着肿瘤最终进展，这种反应是短暂的和次优的。相比之下，用caccr car
‑
t细胞治疗导致肿瘤完全消退。值得注意的是，即使是低剂量的(1.5
×
106个)caccr car
‑
t细胞也足以消除肿瘤。与用3
×
106个对照car
‑
t细胞治疗相比，统计数据表示**p<0.01，基于重复测量单向anova以及第3
‑
38天的tukey多重比较。这些结果重申了caccr与car
‑
t细胞中的信号传导结构域非冗余地协同
作用以提高活性的能力。