核酸的生成和扩增的制作方法

1.本发明涉及核酸的生成和扩增。例如，本发明涉及对于由核糖核酸(rna)模板生成和扩增核酸有用的组合物和方法，具体而言，涉及用于使用特定的核酸聚合物通过逆转录反应进行核酸的生成和扩增的组合物和方法。本发明的组合物和方法例如用于抑制核糖体rna的逆转录，即用于抑制源自核糖体rna的dna合成。


背景技术：

2.据说，核糖体rna占生物体内rna的约80％～90％。在基因表达量的解析中，通常情况下，通过逆转录反应使表达的rna转换为cdna，基于该cdna来进行基因解析。在进行该逆转录反应时，若占生物体内rna的大部分的核糖体rna被逆转录并被扩增，则在原本希望逆转录和扩增的rna的表达解析中产生噪音。而且，近年开发出了能够以rna为模板得到大量的核酸扩增产物的rt
‑
ramda法等新技术(参照专利文献1)。在像这样能够以rna为模板得到大量的核酸扩增产物的rt
‑
ramda法等中，一旦发生核糖体rna的逆转录反应，则其在链置换反应中发生等温线性扩增，因此期望解析的rna的量会相对减少，影响很大。因此，在进行逆转录反应的核酸解析法中，期望抑制源自核糖体rna的dna合成。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：国际公开第2016/052619号


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.目的之一在于，提供用于抑制核糖体rna的逆转录的手段。
8.用于解决问题的方案
9.本发明人等为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现：在通过模板rna的逆转录合成dna的方法中，若使用特定的核酸聚合物，则能够抑制核糖体rna的逆转录、抑制源自核糖体rna的dna合成。本发明人等基于该见解反复进行了深入研究，从而完成了本发明。
10.即，本发明包括以下的方案。
11.项目1.
12.一种抑制源自核糖体rna的dna合成的方法，其中，在通过模板rna的逆转录合成dna的方法中，使用选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物、胸苷酸聚合物、尿苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、脱氧腺苷酸聚合物、脱氧胸苷酸聚合物及脱氧尿苷酸聚合物组成的组中的至少1种核酸聚合物。
13.项目2.
14.根据项目1所述的方法，其中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚腺苷酸、聚胸苷酸、聚尿苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸、聚脱氧
腺苷酸、聚脱氧胸苷酸、聚脱氧尿苷酸及它们的盐组成的组中的至少1种均聚物。
15.项目3.
16.根据项目1或2所述的方法，其中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸及它们的盐组成的组中的至少1种均聚物。
17.项目4.
18.根据项目1～3中任一项所述的方法，其中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚脱氧肌苷酸及它们的盐组成的组中的至少1种均聚物。
19.项目5.
20.根据项目1～4中任一项所述的方法，其中，上述核酸聚合物包含全长为30～10000碱基长的上述核酸聚合物。
21.项目6.
22.根据项目1～5中任一项所述的方法，其中，使用随机引物进行上述逆转录。
23.项目7.
24.根据项目6所述的方法，其中，上述随机引物的碱基序列与核糖体rna的碱基序列不完全互补。
25.项目8.
26.根据项目1～7中任一项所述的方法，其中，在rt
‑
pcr法或rt
‑
ramda法中进行上述逆转录。
27.项目9.
28.一种用于抑制核糖体rna的逆转录(或在基于模板rna的逆转录的dna合成中抑制源自核糖体rna的dna合成)的组合物，其含有选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物、胸苷酸聚合物、尿苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、脱氧腺苷酸聚合物、脱氧胸苷酸聚合物及脱氧尿苷酸聚合物组成的组中的至少1种核酸聚合物。
29.项目9a.
30.选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物、胸苷酸聚合物、尿苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、脱氧腺苷酸聚合物、脱氧胸苷酸聚合物及脱氧尿苷酸聚合物组成的组中的至少1种核酸聚合物在用于抑制核糖体rna的逆转录(或在基于模板rna的逆转录的dna合成中抑制源自核糖体rna的dna合成)中的应用。
31.项目10.
32.一种逆转录反应组合物，其用来制备用于下一代测序中的逆转录反应产物，所述逆转录反应组合物含有选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物、胸苷酸聚合物、尿苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、脱氧腺苷酸聚合物、脱氧胸苷酸聚合物及脱氧尿苷酸聚合物组成的组中的至少1种核酸聚合物。
33.项目11.
34.根据项目9或10所述的组合物或项目9a所述的应用，其中，在rt
‑
pcr法或rt
‑
ramda
法中进行上述逆转录。
35.项目12.
36.根据项目1～8中任一项所述的方法、项目9～11中任一项所述的组合物或项目9a所述的应用，其中，上述核酸聚合物在全部结构单元中包含60摩尔％以上的选自由肌苷酸、胞苷酸、鸟苷酸、脱氧肌苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧鸟苷酸、它们的衍生物及它们的盐组成的组中的核苷酸来源的结构单元。
37.项目13.
38.根据项目1～8和12中任一项所述的方法、项目9～12中任一项所述的组合物、或项目9a所述的应用，其中，上述核酸聚合物在全部结构单元中包含90摩尔％以上的选自由肌苷酸、胞苷酸、鸟苷酸、脱氧肌苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧鸟苷酸、它们的衍生物及它们的盐组成的组中的核苷酸来源的结构单元。
39.项目14.
40.根据项目1～8和12～13中任一项所述的方法、项目9～13中任一项所述的组合物、或项目9a所述的应用，其中，上述核酸聚合物在全部结构单元中包含60摩尔％以上的选自由肌苷酸、脱氧肌苷酸、它们的衍生物及它们的盐组成的组中的核苷酸来源的结构单元。
41.项目15.
42.根据项目1～8和12～14中任一项所述的方法、项目9～14中任一项所述的组合物、或项目9a所述的应用，其中，上述核酸聚合物在全部结构单元中包含90摩尔％以上的选自由肌苷酸、脱氧肌苷酸、它们的衍生物及它们的盐组成的组中的核苷酸来源的结构单元。
43.项目16.
44.根据项目1～8和12～15中任一项所述的方法，其中，上述模板rna是从细胞中提取的rna。
45.项目17.
46.一种在核酸聚合物(但是，不是引物)存在下通过将模板rna逆转录来制造dna的方法，上述核酸聚合物为选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物、胸苷酸聚合物、尿苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、脱氧腺苷酸聚合物、脱氧胸苷酸聚合物及脱氧尿苷酸聚合物组成的组中的至少1种。
47.项目18.
48.根据项目17所述的方法，其中，上述模板rna是从细胞中提取的rna。
49.项目19.
50.一种逆转录用组合物(其中，不包括含有硫氰酸胍的逆转录用组合物)，其含有肌苷酸聚合物。
51.项目20.
52.根据项目19所述的组合物，其中，肌苷酸聚合物的浓度低于1ng/μl。
53.项目21.
54.根据项目19或20所述的组合物，其用于rt
‑
pcr法或rt
‑
ramda法。
55.项目22.
56.根据项目9～15和19～21中任一项所述的组合物，其为试剂盒的形态。
57.发明的效果
58.通过使用本发明的核酸聚合物，能够抑制核糖体rna的逆转录或抑制源自核糖体rna的dna合成。
附图说明
59.图1是示出用成套试剂dna
‑
12000(株式会社岛津制作所制)测定实施例1～4中使用的聚肌苷酸钾盐的碱基长分布的结果(参考值)的图。
60.图2是示出用成套试剂dna
‑
12000(株式会社岛津制作所制)测定实施例4中使用的聚腺苷酸钾盐的碱基长分布的结果(参考值)的图。
具体实施方式
61.<在通过模板rna的逆转录合成dna的方法中，使用核酸聚合物来抑制源自核糖体rna(rrna)的dna合成的方法>
62.1.核酸聚合物
63.作为核酸聚合物，优选选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物、胸苷酸聚合物、尿苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、脱氧腺苷酸聚合物、脱氧胸苷酸聚合物及脱氧尿苷酸聚合物组成的组中的至少一种。其中，从能够更有效地抑制rrna的逆转录或抑制源自rrna的dna合成这样的观点出发，更优选选自由肌苷酸聚合物、胞苷酸聚合物、鸟苷酸聚合物、脱氧肌苷酸聚合物、脱氧胞苷酸聚合物及脱氧鸟苷酸聚合物组成的组中的至少一种，特别优选肌苷酸聚合物和/或脱氧肌苷酸聚合物。本发明中，可以使用两种以上上述那样的核酸聚合物，例如，可以组合使用肌苷酸聚合物和胞苷酸聚合物，或组合使用脱氧肌苷酸聚合物和胞苷酸聚合物。使用两种以上核酸聚合物的情况，其中的一种核酸聚合物优选为肌苷酸聚合物或脱氧肌苷酸聚合物。
64.以下对各聚合物进行详细说明。
65.(1)肌苷酸聚合物
66.肌苷酸聚合物以包括肌苷酸均聚物(聚肌苷酸)、肌苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。另外，在本领域中，肌苷酸均聚物(聚肌苷酸)于胞苷酸均聚物(聚胞苷酸)退火而成的称为聚(i：c)等的双链核酸聚合物是公知的。本发明中，肌苷酸聚合物中也包括如上述双链核酸聚合物那样的、双链中的至少一条链为肌苷酸聚合物(例如，聚肌苷酸)的双链核酸聚合物。
67.肌苷酸共聚物是具有肌苷酸(imp)来源的结构单元及除imp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。
68.imp等核苷酸来源的结构单元是指：如下式所示的由核苷酸构成的单元：
[0069][0070]
(式中，r为氢原子或羟基，base是肌苷、胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶等核酸碱基。)
[0071]
除imp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除imp以外的核苷酸的例子，可列举出脱氧肌苷酸(dimp)、胞苷酸(cmp)、脱氧胞苷酸(dcmp)、鸟苷酸(gmp)、脱氧鸟苷酸(dgmp)、腺苷酸(amp)、脱氧腺苷酸(damp)、胸苷酸(tmp)、脱氧胸苷酸(dtmp)、尿苷酸(ump)、脱氧尿苷酸(dump)、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选dimp。
[0072]
上述“衍生物”是指：保持原聚合物的基本骨架且一部分结构被改变的衍生物。改变例如包括氧化、还原、原子的置换、官能团的导入等。作为上述“衍生物”，优选：在原聚合物的至少一部分结构单元中，碱基部分导入有官能团(例如，氟原子、溴原子、碘原子、低级烷基(例如，甲基、乙基等c1～6烷基)、氨基、巯基、这些中的2种以上的组合)的衍生物和/或磷酸部分被硫代磷酸部分置换的衍生物。
[0073]
作为上述“盐”，优选碱金属盐，更优选钠盐、钾盐。
[0074]
肌苷酸聚合物中，imp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，imp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0075]
肌苷酸聚合物中，imp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，imp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0076]
(2)胞苷酸聚合物
[0077]
胞苷酸聚合物以包括胞苷酸均聚物(聚胞苷酸)、胞苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。另外，在本领域中，肌苷酸均聚物(聚肌苷酸)与胞苷酸均聚物(聚胞苷酸)退火而成的称为聚(i：c)等的双链核酸聚合物是公知的。本发明中，胞苷酸聚合物中也包括如上述双链核酸聚合物那样的、双链中的至少一条链为胞苷酸聚合物(例如，聚胞苷酸)的双链核酸聚合物。
[0078]
胞苷酸共聚物是具有cmp来源的结构单元及除cmp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除cmp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为
除cmp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、dcmp、gmp、dgmp、amp、damp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0079]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0080]
胞苷酸聚合物中，cmp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，cmp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0081]
胞苷酸聚合物中，cmp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，cmp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下，例如也可以是低于100个、95个以下或90个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0082]
(3)鸟苷酸聚合物
[0083]
鸟苷酸聚合物以包括鸟苷酸均聚物(聚鸟苷酸)、鸟苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为鸟苷酸聚合物(例如，聚鸟苷酸)的双链核酸聚合物也包括在鸟苷酸聚合物中。
[0084]
鸟苷酸共聚物是具有gmp来源的结构单元及除gmp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除gmp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除gmp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、dgmp、amp、damp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0085]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0086]
鸟苷酸聚合物中，gmp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，gmp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0087]
鸟苷酸聚合物中，gmp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，gmp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下，也可以是例如低于100个、95个以下或90个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0088]
(4)腺苷酸聚合物
[0089]
腺苷酸聚合物以包括腺苷酸均聚物(聚腺苷酸)、腺苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为腺苷酸聚合物(例如，聚腺苷酸)的双链核酸聚合物也包括在腺苷酸聚合物中。
[0090]
腺苷酸共聚物是具有amp来源的结构单元及除amp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除amp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除amp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、damp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0091]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0092]
腺苷酸聚合物中，amp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，amp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0093]
腺苷酸聚合物中，amp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，amp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0094]
(5)胸苷酸聚合物
[0095]
胸苷酸聚合物以包括胸苷酸均聚物(聚胸苷酸)、胸苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为胸苷酸聚合物(例如，聚胸苷酸)的双链核酸聚合物也包括在胸苷酸聚合物中。
[0096]
胸苷酸共聚物是具有tmp来源的结构单元及除tmp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除tmp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除tmp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp、damp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0097]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0098]
胸苷酸聚合物中，tmp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，tmp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0099]
胸苷酸聚合物中，tmp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为
30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，tmp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下，例如，也可以是低于100个、95个以下或90个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0100]
(6)尿苷酸聚合物
[0101]
尿苷酸聚合物以包括尿苷酸均聚物(聚尿苷酸)、尿苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为尿苷酸聚合物(例如，聚尿苷酸)的双链核酸聚合物也包括在尿苷酸聚合物中。
[0102]
尿苷酸共聚物是具有ump来源的结构单元及除ump以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除ump以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除ump以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp、damp、tmp、dtmp、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0103]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0104]
尿苷酸聚合物中，ump来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，ump来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0105]
尿苷酸聚合物中，ump来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，ump来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0106]
(7)脱氧肌苷酸聚合物
[0107]
脱氧肌苷酸聚合物以包括脱氧肌苷酸均聚物(聚脱氧肌苷酸)、脱氧肌苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为脱氧肌苷酸聚合物(例如，聚脱氧肌苷酸)的双链核酸聚合物也包括在脱氧肌苷酸聚合物中。
[0108]
脱氧肌苷酸共聚物是具有dimp来源的结构单元及除dimp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除dimp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除dimp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp、damp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选imp。
[0109]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0110]
脱氧肌苷酸聚合物中，dimp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩
尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，dimp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0111]
脱氧肌苷酸聚合物中，dimp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，dimp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0112]
(8)脱氧胞苷酸聚合物
[0113]
脱氧胞苷酸聚合物以包括脱氧胞苷酸均聚物(聚脱氧胞苷酸)、脱氧胞苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为脱氧胞苷酸聚合物(例如，聚脱氧胞苷酸)的双链核酸聚合物也包括在脱氧胞苷酸聚合物中。
[0114]
脱氧胞苷酸共聚物是具有dcmp来源的结构单元及除dcmp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除dcmp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除dcmp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、gmp、dgmp、amp、damp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0115]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0116]
脱氧胞苷酸聚合物中，dcmp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，dcmp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0117]
脱氧胞苷酸聚合物中，dcmp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，dcmp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下，例如，也可以是低于100个、95个以下或90个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0118]
(9)脱氧鸟苷酸聚合物
[0119]
脱氧鸟苷酸聚合物以包括脱氧鸟苷酸均聚物(聚脱氧鸟苷酸)、脱氧鸟苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为脱氧鸟苷酸聚合物(例如，聚脱氧鸟苷酸)的双链核酸聚合物也包括在脱氧鸟苷酸聚合物中。
[0120]
脱氧鸟苷酸共聚物是具有dgmp来源的结构单元及除dgmp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除dgmp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除dgmp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、amp、damp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、
gmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp及gmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0121]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0122]
脱氧鸟苷酸聚合物中，dgmp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，dgmp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0123]
脱氧鸟苷酸聚合物中，dgmp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，dgmp来源的结构单元的重复数例如可以为10000个以下，8000个以下，优选为6500个以下，更优选为6000个以下，为5000个以下、3000个以下、1000个以下，例如，也可以是低于100个、95个以下或90个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0124]
(10)脱氧腺苷酸聚合物
[0125]
脱氧腺苷酸聚合物以包括脱氧腺苷酸均聚物(聚脱氧腺苷酸)、脱氧腺苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为脱氧腺苷酸聚合物(例如，聚脱氧腺苷酸)的双链核酸聚合物也包括在脱氧腺苷酸聚合物中。
[0126]
脱氧腺苷酸共聚物是具有damp来源的结构单元及除damp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除damp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除damp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp、tmp、dtmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp及amp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0127]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0128]
脱氧腺苷酸聚合物中，damp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，damp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0129]
脱氧腺苷酸聚合物中，damp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，进一步优选为60个以上，进而更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，damp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0130]
(11)脱氧胸苷酸聚合物
[0131]
脱氧胸苷酸聚合物以包括脱氧胸苷酸均聚物(聚脱氧胸苷酸)、脱氧胸苷酸共聚
物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为脱氧胸苷酸聚合物(例如，聚脱氧胸苷酸)的双链核酸聚合物也包括在脱氧胸苷酸聚合物中。
[0132]
脱氧胸苷酸共聚物是具有dtmp来源的结构单元及除dtmp以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除dtmp以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除dtmp以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp、damp、tmp、ump、dump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0133]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0134]
脱氧胸苷酸聚合物中，dtmp来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，dtmp来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0135]
脱氧胸苷酸聚合物中，dtmp来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，优选为60个以上，更优选为70个以上，也可以是例如100个以上、150个以上。另外，dtmp来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0136]
(12)脱氧尿苷酸聚合物
[0137]
脱氧尿苷酸聚合物以包括脱氧尿苷酸均聚物(聚脱氧尿苷酸)、脱氧尿苷酸共聚物、它们的衍生物及它们的盐的含义使用。本发明中，双链中的至少一条链为脱氧尿苷酸聚合物(例如，聚脱氧尿苷酸)的双链核酸聚合物也包括在脱氧尿苷酸聚合物中。
[0138]
脱氧尿苷酸共聚物是具有dump来源的结构单元及除dump以外的核苷酸来源的结构单元的聚合物。除dump以外的核苷酸没有特别限定，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。作为除dump以外的核苷酸的例子，可列举出imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp、damp、tmp、dtmp、ump、这些中的2种以上的组合等。这些当中，优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、amp及damp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp及dgmp组成的组中的至少一种，更优选选自由imp和dimp组成的组中的至少一种。
[0139]
作为上述“衍生物”和“盐”，可列举出与上述“(1)肌苷酸聚合物”中记载的那些同样者。
[0140]
脱氧尿苷酸聚合物中，dump来源的结构单元在全部结构单元中例如超过50摩尔％、优选为60摩尔％以上、更优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。另外，dump来源的结构单元在全部结构单元中可以是100摩尔％(即，均聚物)，也可以是例如99.9摩尔％以下或99摩尔％以下。
[0141]
脱氧尿苷酸聚合物中，dump来源的结构单元的重复数(也可以表述为碱基长等)例如为30个以上，优选为40个以上，更优选为50个以上，优选为60个以上，更优选为70个以上，
也可以是例如100个以上、150个以上。另外，dump来源的结构单元的重复数例如可以是10000个以下、8000个以下、5000个以下、3000个以下、1000个以下。重复可以是连续或断续的，优选为连续的。
[0142]
在优选的一实施方式中，上述核酸聚合物是在全部结构单元中包含例如60摩尔％以上、优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上的选自由imp、dimp、cmp、dcmp、gmp、dgmp、它们的衍生物及它们的盐组成的组中的核苷酸来源的结构单元的核酸聚合物。上限值没有特别限定，例如，可以是在全部结构单元中这些结构单元可以是100摩尔％、也可以是99.9摩尔％以下或99摩尔％以下的核酸聚合物。
[0143]
在更优选的一实施方式中，上述核酸聚合物是在全部结构单元中包含例如60摩尔％以上、优选为65摩尔％以上、更优选为70摩尔％以上、更优选为75摩尔％以上、更优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上的选自由imp、dimp、它们的衍生物及它们的盐组成的组中的核苷酸来源的结构单元的核酸聚合物。上限值没有特别限定，例如，可以是在全部结构单元中这些结构单元可以是100摩尔％、也可以是99.9摩尔％以下或99摩尔％以下的核酸聚合物。
[0144]
在优选的一实施方式中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚腺苷酸、聚胸苷酸、聚尿苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸、聚脱氧腺苷酸、聚脱氧胸苷酸、聚脱氧尿苷酸及它们的盐组成的组中的至少一种。
[0145]
在更优选的一实施方式中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚腺苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸、聚脱氧腺苷酸及它们的盐组成的组中的至少一种。
[0146]
在更优选的一实施方式中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚胞苷酸、聚鸟苷酸、聚脱氧肌苷酸、聚脱氧胞苷酸、聚脱氧鸟苷酸及它们的盐组成的组中的至少一种。
[0147]
在更优选的一实施方式中，上述核酸聚合物为选自由聚肌苷酸、聚脱氧肌苷酸及它们的盐组成的组中的至少一种。
[0148]
上述核酸聚合物优选包含全长为25～15000碱基长的上述核酸聚合物、优选包含30～10000碱基长的上述核酸聚合物、更优选包含全长为40～9000碱基长的上述核酸聚合物、更优选包含全长为50～8000碱基长的上述核酸聚合物，也可以是例如100～5000碱基长。例如，全长为25～15000碱基长、30～10000碱基长、40～9000碱基长、50～8000碱基长、或100～5000碱基长的上述核酸聚合物的含量相对于上述核酸聚合物整体分别为例如70摩尔％以上、优选为80摩尔％以上、更优选为85摩尔％以上、更优选为90摩尔％以上、更优选为95摩尔％以上。
[0149]
即，上述核酸聚合物可以是各种碱基长的核酸聚合物的混合物，例如，可以是实质上分布在25～15000碱基长的范围内的核酸聚合物的混合物，优选为实质上分布在30～10000碱基长的范围内的核酸聚合物的混合物，更优选为实质上分布在40～9000碱基长的范围内的核酸聚合物的混合物，进一步优选为实质上分布在50～8000碱基长的范围内的核酸聚合物的混合物，例如，还可以使用实质上分布在100～5000碱基长的范围内的核酸聚合物的混合物。“实质上分布在碱基长a～b的范围内”是指：碱基长a～b的核酸聚合物例如占核酸聚合物整体的70摩尔％以上。
[0150]
核酸聚合物例如可以是显示出在30～3000碱基长附近具有峰(或平均值或众数值)那样的分布的核酸聚合物的混合物，也可以是显示出在50～1500碱基长附近具有峰(或平均值或众数值)那样的分布的核酸聚合物的混合物，优选为显示出在60～1000碱基长附近具有峰(或平均值或众数值)那样的分布的核酸聚合物的混合物，还可以使用显示出在70～800碱基长附近具有峰(或平均值或众数值)那样的分布的核酸聚合物的混合物。“附近”是指下限值和/或上限值可以增减10％。
[0151]
上述核酸聚合物的全长例如为30碱基以上，优选为40碱基以上，更优选为50碱基以上，进一步优选为60碱基以上，进而更优选为70碱基以上，也可以是例如100碱基以上、150碱基以上。由此，上述核酸聚合物的全长优选比设计为探针或引物的碱基长还长。另外，上述核酸聚合物的全长例如可以是10000碱基以下，进而可以是8000碱基以下，也可以是例如5000碱基以下。
[0152]
核酸聚合物可以利用能够用于合成寡核苷酸的任意方法、例如磷酸三酯法、h
‑
亚磷酸酯法、硫代亚磷酸酯法等而合成。另外，可以使用天然物，也可以适宜地使用市售品。作为市售品，例如可以使用聚肌苷酸钾盐(sigma公司制)、聚腺苷酸钾盐(sigma公司制)、聚肌苷酸钾盐(santa cruz biotechnology公司制)等市售的核酸聚合物。
[0153]
2.通过模板rna的逆转录合成dna的方法
[0154]
通过模板rna的逆转录合成dna的方法没有特别限制，可以采用一直以来公知的各种方法。该方法典型地包括如下工序：对包含逆转录酶等具有逆转录活性的蛋白质的逆转录用组合物(或逆转录反应用溶液)进行孵育。
[0155]2‑
1.逆转录用组合物
[0156]
逆转录用组合物例如包括上述核酸聚合物、模板rna、引物、脱氧核糖核苷酸及逆转录酶。另外，逆转录用组合物可以任选包含dna聚合酶等其它成分等。
[0157]
逆转录用组合物中，从抑制rrna的逆转录、抑制源自rrna的dna合成的观点出发，上述核酸聚合物的浓度例如为0.1ng/μl以上，优选为0.2ng/μl以上，更优选为1ng/μl以上，进一步优选为1.5ng/μl以上，也可以是例如2ng/μl以上、3ng/μl以上、4ng/μl以上、5ng/μl以上。另外，上述核酸聚合物的浓度例如可以是50ng/μl以下，优选为25ng/μl以下，更优选为20ng/μl以下，也可以是例如10ng/μl以下、5ng/μl以下、3ng/μl以下、2.5ng/μl以下、2ng/μl以下、1ng/μl以下、低于1ng/μl。即使在使用这样的低浓度的核酸聚合物的情况下，根据本发明也能够抑制rrna的逆转录、抑制源自rrna的dna合成。
[0158]
上述核酸聚合物的含量相对于逆转录用组合物中包含的rna(包括rrna)的总量100质量份例如为100～50000质量份、优选为1000～10000质量份、更优选为1000～5000质量份。
[0159]
(1)模板rna
[0160]
作为模板rna，可以是由组织、细胞提取的rna(例如，利用苯酚氯仿提取等本领域中公知的任意的提取手段进行处理而得到的提取rna)；在由组织、细胞进行提取处理后进一步进行纯化而得到的rna(例如，利用乙醇沉淀、柱纯化等本领域中公知的任意的纯化手段进行处理而得到的纯化rna)等任意的rna，但其中优选使用从细胞中提取的rna。从细胞中提取的rna通常除了成为模板rna的mrna等之外不可避免地混入rrna，但在上述核酸聚合物的存在下rrna的逆转录被抑制，因此即使直接将从细胞中提取的rna用作模板rna，也能
够特异性地逆转录模板rna。即，可以省略从提取自细胞的rna中去除rrna的工序。
[0161]
提取rna的细胞的种类没有特别限制，可以是所有种类的细胞。细胞的个数可以利用细胞分选仪进行适宜调整。例如可以使用从少数(例如1～100个、优选为1～10个、更优选为1或2个、更优选为1个)的细胞中提取的rna。
[0162]
从细胞中提取rna的方法通常包括下述工序：使用包含细胞溶解剂的细胞溶解用组合物将细胞溶解。
[0163]
作为细胞溶解剂，例如可列举出表面活性剂、离液剂等。表面活性剂包括：阴离子型表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠)、阳离子型表面活性剂(例如，十六烷基三甲基溴化铵)、非离子型表面活性剂(例如，辛基酚乙氧基化物、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯硬脂基醚、聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯)及两性表面活性剂(例如，3
‑
[(3
‑
胆酰胺丙基)二甲基铵基]
‑1‑
丙磺酸)。作为离液剂，例如可列举出脲、高氯酸锂盐等锂盐。细胞溶解剂通常溶解于水(优选为无核酸酶水)中而以水溶液的形态使用。
[0164]
细胞溶解用组合物可以包含蛋白酶(例如，蛋白酶k)、rnase抑制剂、这些中的2种以上的组合。
[0165]
细胞溶解用组合物可以包含或不包含上述核酸聚合物。在使用包含上述核酸聚合物的细胞溶解用组合物从细胞中提取rna、并且将其作为模板rna的情况下，也可以不另外向逆转录用组合物中添加上述核酸聚合物。
[0166]
关于细胞溶解用组合物的详情，美国专利申请公开公报2011/0111463(通过参照将其整体引入说明书)等中有记载。
[0167]
逆转录用组合物中，rna(含rrna)的浓度例如为1～10000pg/μl、优选为10～1000pg/μl、更优选为1～100pg/μl。
[0168]
(2)引物
[0169]
作为引物，可列举出针对模板rna的特异性引物、寡聚dt引物、随机引物、这些中的2种以上的组合。这些当中，寡聚dt引物、随机引物与特定序列特异性的引物相比，有容易与任意的rna退火的倾向，容易引起由rrna合成dna。根据本发明，即使使用这样的寡聚dt引物、随机引物的情况下，也能够有效地抑制由rrna合成dna。从上述观点出发，本发明在进行使用寡聚dt引物和/或随机引物的逆转录反应的情况下是有利的，在使用寡聚dt引物和随机引物的组合来进行逆转录反应的情况下是特别有利的。寡聚dt引物和随机引物的摩尔比例如为1：5～1：15、优选为1：8～1：12。
[0170]
作为随机引物，例如可列举出完全随机引物、nsr(not so random，不怎么随机的)引物。
[0171]
完全随机引物是具有各种碱基序列的引物的混合物，各碱基序列是完全随机的碱基序列。完全随机引物可以包含与rrna序列完全一致的(或完全互补的)序列。作为完全随机引物，可以示例出完全随机五聚体、完全随机六聚体、完全随机七聚体、完全随机八聚体、它们的组合等。例如，完全随机六聚体也可以是4种核苷酸(a、t、c、g)所能形成的所有碱基序列(46种)的混合物。
[0172]
nsr引物例如是从完全随机引物中去除了具有与rrna序列完全互补的序列的六聚体的引物。作为所去除的rrna序列，例如可列举出18s rrna序列、28s rrna序列、12s rrna序列、16s rrna序列、它们的组合。
[0173]
作为nsr引物，例如可列举出从完全随机六聚体中去除了具有与rrna序列完全互补的序列的六聚体的引物。另外，也可以将从完全随机五聚体、完全随机七聚体、完全随机八聚体等引物组中去除了具有与rrna序列完全互补的序列的引物而得的引物作为nsr引物。
[0174]
通过使用这样的nsr引物，从而能够对mrna等进行解析而改善灵敏度。
[0175]
关于nsr引物的详情，在1)amour et al.,digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cdna synthesis,nature methods,vol.6,no.9,2009,pp.647
‑
649；2)ozsolak et al.,digital transcriptome profiling from attomole
‑
levelrna samples,genome research,vol.20,2010,pp.519
‑
525、3)美国专利申请公开公报2010/0029511(通过参照将其整体引入本说明书)等中有记载。
[0176]
尽管nsr引物被设计成其碱基序列与rrna的碱基序列不完全互补，但一部分的引物可以与rrna结合，在逆转录产物中，源自模板rna的dna中可能混入源自rrna的dna。然而，通过使用上述核酸聚合物，能够抑制源自rrna的dna合成。对于其理由，尽管不受理论束缚，但原因之一可推测为上述核酸聚合物竞争性抑制nsr引物等引物与rrna的结合。
[0177]
从退火的观点出发，引物的长度为例如5碱基以上，优选为6碱基以上，从合成的观点出发，例如为30碱基以下，优选为25碱基以下，更优选为20碱基以下。
[0178]
逆转录用组合物中，引物的浓度没有特别限制，例如为1～10μm、优选为2～6μm、更优选为3～5μm。
[0179]
(3)脱氧核糖核苷酸
[0180]
作为脱氧核糖核苷酸，优选脱氧核糖核苷三磷酸。作为脱氧核糖核苷三磷酸，例如可列举出脱氧胞苷三磷酸(dctp)、脱氧鸟苷三磷酸(dgtp)、脱氧腺苷三磷酸(datp)、脱氧胸苷三磷酸(dttp)、脱氧尿苷三磷酸(dutp)、它们的衍生物、这些中的2种以上的组合。这些当中，优选dctp、dgtp、datp及dttp的混合物；dctp、dgtp、datp及dutp的混合物；dctp、dgtp、datp、dttp及dutp的混合物等。
[0181]
(4)逆转录酶
[0182]
逆转录酶是指具有逆转录活性(rna依赖性dna聚合酶活性)的任意的蛋白质(酶)，没有特别限制，优选显示出逆转录酶活性的聚合酶。另外，逆转录酶优选rnase h活性低或不具有rnase h活性。作为逆转录酶的例子，例如可列举出禽成髓细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus)逆转录酶(amv
‑
rt)、莫洛尼氏鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)逆转录酶(mmlv
‑
rt)、人类免疫缺陷病毒(human immunovirus)逆转录酶(hiv
‑
rt)、eirv
‑
rt、rav2
‑
rt、生氢氧化碳嗜热菌(c.hydrogenogormans)dna聚合酶、rtthdna聚合酶、superscript i、superscript ii、它们的突变体及它们的衍生物。这些当中，优选mmlv
‑
rt。
[0183]
(5)dna聚合酶
[0184]
逆转录用组合物可以包含或不包含下述的dna聚合酶：
[0185]
taq、tbr、tfl、tru、tth、tli、tac、tne、tma、tih、tfi、pfu、pwo、kod、bst、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4、vent(商标)、deepvent(商标)、它们的突变体
[0186]
(6)rnase抑制剂
[0187]
逆转录用组合物可以包含rnase抑制剂。rnase抑制剂没有特别限制，例如可列举
出人胎盘来源、大鼠肺来源、或猪肝脏来源的蛋白质。
[0188]
(7)添加剂
[0189]
逆转录用组合物可以包含添加剂。作为添加剂，例如可列举出缓冲剂、盐、这些中的2种以上的组合。
[0190]
作为缓冲剂，例如可列举出tris、tricine、bis
‑
tricine、hepes、mops、tes、taps、pipes、caps、这些中的2种以上的组合。缓冲剂通常溶解于水(优选为无核酸酶水)中而以水溶液的形态使用。
[0191]
作为盐，例如可列举出氯化物(例如，氯化锂、氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化锰)、乙酸盐(例如，乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁、乙酸锰)、硫酸盐(例如，硫酸钾、硫酸镁、硫酸锰)、这些中的2种以上的组合。
[0192]2‑
2.孵育
[0193]
逆转录用组合物的孵育条件只要模板rna的逆转录可进行就没有特别限制，也可以采用本领域中已知的任意条件。孵育的温度例如为30～65℃、优选为35～60℃。孵育时间例如为5～120分钟、优选为10～60分钟。
[0194]2‑
3.在以rna为模板使cdna扩增的扩增逆转录法(也称为rt
‑
ramda法)中进行模板rna的逆转录的情况
[0195]
rt
‑
ramda法是核酸扩增方法，其包括下述工序：对包含模板rna、引物、dna链特异性rna：dna杂交链分解酶、rnase h负型逆转录酶及底物的混合物进行孵育。rt
‑
ramda法中，通过rnase h负型逆转录酶的rna依赖性dna聚合酶活性而合成模板rna的互补链dna(cdna)，通过dna链特异性rna：dna杂交链分解酶随机切割rna与cdna的杂交链中的cdna链，上述的切断位点成为起点，通过rnase h负型逆转录酶的链置换活性从rna上剥离3’侧的cdna链，在通过rnase h负型逆转录酶而剥离的部分合成新的cdna链。关于rt
‑
ramda法的详情，在美国专利申请公开公报2017/0275685(通过参照将其整体引入本说明书)等中有记载。
[0196]
在rt
‑
ramda法中进行模板rna的逆转录的情况下，逆转录用组合物包含dna链特异性rna：dna杂交链分解酶。
[0197]
dna链特异性rna：dna杂交链分解酶优选为具有切割rna与dna的杂交链中的dna链的活性的酶。作为该酶，例如可以使用双链特异性dna分解酶、非特异性dna分解酶。
[0198]
双链特异性分解酶(双链特异性核酸酶；也称为dsn)可以使用源自原核生物或真核生物的酶，但可以优选使用甲壳类来源的双链特异性dna分解酶或其变体。作为具体的例子，可列举出以下物质。
[0199]
·
solenocera melantho(大管鞭虾)dnase
[0200]
·
penaeus japonicus(日本对虾)dnase
[0201]
·
paralithodes camtschaticus(堪察加拟石蟹)dsn
[0202]
·
pandalus borealis(北极甜虾)dsdnase
[0203]
·
chionoecetes opilio(灰眼雪蟹)dsn
[0204]
·
其它dsn同源物
[0205]
双链特异性dna分解酶优选为即使在低于60℃下也具有dna分解活性的酶。上述中，优选源自虾的双链特异性dna分解酶或其变体。
[0206]
作为双链特异性dna分解酶，可以使用市售品。作为市售品，可以列举出dsdnase(arcticzymes公司)、hl
‑
dsdnase(arcticzymes公司)、dsdnase(thermo scientific公司)、shrimp dnase、recombinant(affymetrix公司)、atlantis dsdnase(zymo research公司)、thermolabile nuclease(roche公司)等。
[0207]
作为非特异性dna分解酶，可以列举出：具有切割rna与dna的杂交链的dna链的活性、实质上不具有切割rna与dna的杂交链的rna链、单链rna的活性、优选为与切割rna与dna的杂交链的dna链的活性相比切割单链dna的活性降低的酶。非特异性dna分解酶优选为即使在低于60℃下也具有dna分解活性的酶。作为这样的非特异性dna分解酶，可以使用市售品，例如可以使用dnasei(thermo fisher公司制、dnasei)等。非特异性dna分解酶可以使用源自原核生物或真核生物的酶，可以优选使用源自哺乳类的非特异性dna分解酶或其改变体、更优选使用源自牛的非特异性dna分解酶或其改变体。
[0208]
上述改变体是指通过对天然来源的氨基酸序列进行改变而得到的酶。具体而言是如下酶：由与天然来源的氨基酸序列具有80％以上(优选为90％以上，更优选为95％以上)的序列同一性的氨基酸序列组成的酶；以及在由天然来源的氨基酸序列中具有1个或多个(例如，1～10个、优选为1～5个、更优选为1～3个)氨基酸的缺失、置换及/或添加的氨基酸序列组成的酶。
[0209]
在rt
‑
ramda法中进行模板rna的逆转录的情况，逆转录用组合物可以包含单链dna结合蛋白。单链dna结合蛋白通常与dna链特异性rna：dna杂交链分解酶一起使用。作为单链dna结合蛋白，例如可列举出t4噬菌体基因32编码蛋白、reca、单链dna结合蛋白(ssb：single
‑
stranded dna binding protein)、这些中的2种以上的组合。
[0210]
在rt
‑
ramda法中进行模板rna的逆转录的情况，逆转录用组合物的孵育可以在等温条件下进行，也可以在热循环条件下进行。
[0211]
(1)等温条件
[0212]
在等温条件下进行孵育时，例如可以在25℃以上且低于50℃之间的规定温度、优选为30～45℃之间的规定温度、更优选为35～40℃之间的规定温度、例如在37℃下进行规定时间(例如5～180分钟、优选为10～150分钟)。
[0213]
在25℃以上且低于50℃之间的规定温度下的孵育可以分成2个以上阶段来进行。例如可以在25℃以上且低于30℃之间的规定温度下孵育5～15分钟、接着在30℃以上且低于35℃之间的规定温度下孵育5～15分钟、接着在35℃以上且低于50℃之间的规定温度下孵育规定时间(例如5～60分钟)。
[0214]
在25℃以上且低于50℃之间的规定温度下孵育后，也可以在例如50℃以上且低于100℃之间的规定温度下进行孵育。在50℃以上且低于100℃之间的规定温度下的孵育也可以分成2个以上阶段来进行。例如在50℃以上且低于80℃之间的规定温度下培养5～15分钟、接着在80～90℃之间的规定温度下孵育5～15分钟。
[0215]
(2)热循环条件
[0216]
在热循环条件下进行孵育的情况下，例如将在20℃以上且低于30℃之间的规定温度t1(例如25℃)与在30～45℃之间的规定温度t2(例如37℃)组合，并在t1下进行规定时间(例如1～3分钟、作为一例为2分钟)与在t2下进行规定时间(例如1～3分钟、作为一例为2分钟)作为1次循环，优选为将该循环重复进行10～40次循环、更优选重复进行15～35次循环。
需要说明的是，在上述的热循环之前，例如可以在25℃以上且低于30℃之间的规定温度下孵育规定时间(例如5～15分钟)、接着在30℃以上且低于35℃之间的规定温度下孵育规定时间(例如5～15分钟)、接着在35℃以上且低于50℃之间的规定温度下孵育规定时间(例如1～5分钟)。另外，上述的热循环之后，例如可以在50℃以上且低于80℃之间的规定温度下孵育规定时间(例如5～15分钟)、接着在80～90℃之间的规定温度下孵育规定时间(例如5～15分钟)。
[0217]2‑
4.在rt
‑
pcr法中进行模板rna的逆转录的情况
[0218]
在rt
‑
pcr法中进行模板rna的逆转录的情况系，逆转录用组合物的孵育可以在2
‑
2.记载的条件下进行，然后，可以根据需要使逆转录酶失活。逆转录的失活方法没有特别限定，例如，可以是在90～100℃下孵育规定时间(例如1～10分钟)的方法。
[0219]
在rt
‑
pcr法中进行模板rna的逆转录的情况下，通过模板rna的逆转录合成dna的方法包括使经上述孵育的逆转录用组合物(也称为逆转录产物)中包含的dna扩增的工序。使dna扩增的工序典型地包括在热循环条件下孵育dna扩增用组合物的工序。
[0220]
dna扩增用组合物中，可以以原状态含有逆转录产物，也可以含有用水、优选用无核酸酶水将逆转录产物稀释而成者。例如可以将逆转录产物的质量稀释为1/20～1/30。
[0221]
dna扩增用组合物除了逆转录产物之外包含例如引物、脱氧核糖核苷酸及dna聚合酶。另外，在上述2
‑
1.记载的逆转录用组合物包含dna聚合酶等dna扩增反应所需的成分的情况下，该逆转录用组合物可以直接作为dna扩增用组合物，两组合物可以互换称呼。
[0222]
作为引物，优选对dna(包括从rna逆转录而得的dna)具有特异性的引物(正向引物、反向引物)。
[0223]
脱氧核糖核苷酸和dna聚合酶可以使用与上述2
‑
1.(3)和(5)记载的那些同样者。
[0224]
dna扩增用组合物可以包含抗dna聚合酶抗体、反应缓冲剂、金属离子(镁离子等)、荧光色素、荧光标识探针、这些中的2种以上的组合。
[0225]
对于热循环条件下的孵育而言，例如可以将在80℃以上且低于100℃之间的规定温度下进行规定时间(例如10～30秒)和在50～70℃之间的规定温度下进行规定时间(例如30秒～2分钟)作为1次循环，将该循环重复进行优选10～50次循环、更优选15～40次循环。
[0226]
3.使用核酸聚合物来抑制源自rrna的dna合成的方法
[0227]
使用上述核酸聚合物来抑制源自rrna的dna合成的方法典型地包括在上述核酸聚合物的存在下将模板rna逆转录的工序。通过该工序，模板rna被特异性地逆转录，能够特异性地合成源自模板rna的dna，能够抑制源自rrna的dna合成。rrna优选为18s rrna、28s rrna、12s rrna、16s rrna、或这些中的2种以上的组合。逆转录的条件如上述2
‑
1.～2
‑
4.中记载所述。
[0228]
<用于抑制rrna的逆转录(或抑制源自rrna的dna合成)的含有核酸聚合物的组合物、核酸聚合物的用于抑制rrna的逆转录(或抑制源自rrna的dna合成)的应用>
[0229]
用于抑制rrna的逆转录的组合物优选含有上述核酸聚合物。另外，为了抑制rrna的逆转录，优选使用上述核酸聚合物。rrna的逆转录只要是至少包含rrna的rna试样的逆转录就没有特别限制，也可以是包含模板rna和rrna的rna试样的逆转录。包含模板rna和rrna的rna试样也可以是从细胞、组织中提取的rna；在从细胞、组织中进行提取处理后进一步进行纯化而得到的rna等，但优选是从细胞中提取的rna。该rna可以使用与上述2
‑
1.(1)记载
的那些同样者。
[0230]
逆转录的条件例如可以采用与上述2
‑
2.～2
‑
4.记载的条件同样的条件。
[0231]
用于抑制rrna的逆转录的组合物除了上述核酸聚合物之外可以包含上述2
‑
1.、2
‑
2.及2
‑
3.中记载那样的成分(特别是，逆转录所需的成分)。
[0232]
用于抑制rrna的逆转录的组合物可以是各成分的混合物的形态，也可以是分别具备各成分的试剂盒的形态。
[0233]
<用来制备用于下一代测序中的逆转录反应产物的逆转录反应组合物>
[0234]
用于制备下一代测序(ngs解析：next
‑
generation sequencing、也称为下一代测序解析等)中使用的逆转录反应产物的逆转录反应组合物优选含有上述核酸聚合物。下一代测序典型地是指能够同时实施数百万至数十亿的膨大的测序反应的测序技术。作为下一代测序，例如可列举出使用乳液pcr、桥式pcr等扩增技术、单分子观察等高灵敏度检测技术并行地进行序列解析的方法。作为进行下一代测序的装置(测序仪)，没有特别限定，例如可列举出miseq、hiseq、novaseq(illumina公司)；genetic analyzer v2.0、ion proton(thermo fisher scientific k.k.)；minion、promethion(nanopore公司)等。关于下一代测序，例如美国专利申请公开公报2014/178438(通过参照将其整体引入说明书)等中有记载。
[0235]
根据本发明，能够有效地抑制在下一代测序等大量的基因表达解析中可能成为噪音的来自rrna的逆转录反应产物。ngs解析中，在1次解析中可以获得的读取数通常受到限制，重要的是减少无用的rrna来源的dna的读取。根据本发明，能够减少不需要解析的rrna来源的dna的读取，能够增加有用的读取数(rrna以外的读取数：基因信息量)，因此是优异的，进而由于也可使ngs解析次数减少，因此在成本方面也是有利的。因此，利用本发明制备的、来自可能包含rrna的rna试样的逆转录反应产物适用于下一代测序。可能包含rrna的rna试样也可以是包含模板rna和rrna的rna试样的逆转录。包含模板rna和rrna的rna试样也可以是从细胞、组织中提取的rna；在从细胞、组织中进行提取处理后进一步进行纯化而得到的rna等，但优选是从细胞中提取的rna。该rna可以使用与上述2
‑
1.(1)记载的那些同样者。
[0236]
逆转录的条件例如可以采用与上述2
‑
2.～2
‑
4.记载的条件同样的条件。
[0237]
用来制备用于下一代测序中的逆转录反应产物的逆转录反应组合物除了上述核酸聚合物之外可以包含如上述2
‑
1.、2
‑
2.及2
‑
3.中记载那样的成分(特别是，逆转录所需的成分)。
[0238]
用来制备用于下一代测序中的逆转录反应产物的逆转录反应组合物可以是各成分的混合物的形态，也可以是分别具备各成分的试剂盒的形态。
[0239]
实施例
[0240]
以下，基于实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明不受这些实施例限定。
[0241]
实施例1：在rt
‑
pcr法中肌苷酸聚合物对源自rrna的dna合成的抑制(纯化rna 10pg)
[0242]
本实施例中，为了确认在rt
‑
pcr法中肌苷酸聚合物存在下的源自核糖体rna的dna合成量，而进行了以下的试验。
[0243]
在样品溶液中添加肌苷酸聚合物作为聚肌苷酸钾盐(肌苷酸均聚物(也将其称为
聚i)的钾盐)，通过逆转录反应进行了单链cdna的合成。然后，通过定量聚合酶链式反应(qpcr)比较在有和没有聚肌苷酸钾盐下源自核糖体rna的dna合成量。具体而言，利用以下方法进行。
[0244]
对于本实施例中使用的核酸片段样品，使用利用rneasy mini kit(qiagen公司)将nih3t3细胞纯化而得到的rna1opg。
[0245]
将为了进行该rna10pg的逆转录反应而在本实施例中使用的样品溶液中包含的成分及该样品溶液中的最终浓度示于以下的表1。
[0246]
[表1]
[0247]
终浓度成分100mmtris
‑
hcl(ph 8.0)10mm氯化镁50mm氯化钾1mmdatp1mmdttp1mmdgtp1mmdctp0.4μm寡聚(dt)18引物4μm随机六聚体引物1u/μl逆转录酶(东洋纺株式会社制、revertra ace)0.5u/μlrnase抑制剂(东洋纺株式会社制、rnase inhibitor)0或5ng/μl聚肌苷酸钾盐*(sigma公司制、酶合成品)
[0248]
*：对于聚肌苷酸钾盐的碱基长分布，使用成套试剂dna
‑
12000(株式会社岛津制作所制)，用微型芯片电泳装置(株式会社岛津制作所制)进行了分析，结果可知：聚肌苷酸钾盐如图1所示峰碱基长为约450碱基长，包含约150～8000碱基长的聚肌苷酸(参考值)。
[0249]
使用在上述组成中添加了纯化rna的样品溶液，进行逆转录反应。该反应在37℃下反应10分钟，接着在95℃进行5分钟反应，由此合成了单链cdna。
[0250]
然后，通过以下的定量聚合酶链式反应(qpcr)进行了dna量的比较。
[0251]
用无核酸酶水(qiagen公司)稀释逆转录反应液，将1/25量用于qpcr反应。qpcr使用stepone plus(life technologies公司)，在以下的条件下进行。
[0252]
对qpcr反应用溶液[20μl(thunderbird(商标)sybr qpcr mix(toyobo公司)、6pmol正向引物、6pmol反向引物、2μl稀释逆转录反应液、无核酸酶水]进行95℃1分钟处理而激活酶，然后将95℃15秒的变性和60℃1分钟的延伸反应进行40次循环。
[0253]
熔解曲线分析通过95℃下15秒、60℃下15秒及95℃下15秒而进行。
[0254]
作为靶基因，使用作为信使rna(mrna)的β肌动蛋白、hprt
‑
1、作为长链非编码rna(lncrna)的neat
‑
1及作为18s核糖体rna的rn18s。
[0255]
各基因的引物如下所述。
[0256]
β肌动蛋白(mrna)
[0257]
正向引物：cagctgagagggaaatcgtg(序列号1)；反向引物：cgttgccaatagtgatgacc(序列号2)
[0258]
neat
‑
1(lncrna)
[0259]
正向引物：gatcgggaccccagtgacct(序列号3)；反向引物：agctttccccaacacccaca(序列号4)
[0260]
hprt
‑
1(mrna)
[0261]
正向引物：tcagtcaacgggggacataaa(序列号5)；反向引物：ggggctgtactgcttaaccag(序列号6)
[0262]
rn18s(核糖体rna)
[0263]
正向引物：ctcaacacgggaaacctcac(序列号7)；反向引物：cgctccaccaactaagaacg(序列号8)
[0264]
将其结果示于表2。
[0265]
[表2]
[0266][0267]
将从添加了聚肌苷酸钾盐的条件的平均ct值中减去未添加聚肌苷酸钾盐的条件的平均ct值而得到的值作为δct。
[0268]
比较了作为mrna的β肌动蛋白和hprt
‑
1、以及作为lncrna的neat
‑
1在有和没有聚肌苷酸钾盐时的ct值的差值(源自mrna、lncrna的dna合成量的差值)，作为核糖体rna的rn18s在有和没有聚肌苷酸钾盐时的ct值的差值变大。由该结果确认了：与其它rna相比，rn18s的情况下，添加聚肌苷酸钾盐使ct值变慢(变大)，源自核糖体rna的dna合成量减少。
[0269]
由此确认，肌苷酸聚合物抑制了通常不希望被逆转录的源自核糖体rna的dna合成。
[0270]
实施例2：在rt
‑
ramda法中肌苷酸聚合物对源自核糖体rna的dna合成的抑制(纯化rna 10pg)
[0271]
本实施例中，为了确认在rt
‑
ramda法中肌苷酸聚合物存在下的源自核糖体rna的dna合成量，而进行了以下试验。
[0272]
在样品溶液中添加聚肌苷酸钾盐，通过rt
‑
ramda法进行单链cdna的合成，生成了克列诺(klenow)片段的双链cdna。然后使用nexteta(illumina公司)来制备文库，使用miseq reagent kit v3(150次循环)(illumina公司)并通过miseq(illumina公司)实施了ngs(下一代测序)。步骤依据操作说明书进行。解析使用illumina basespace tophat
(illumina公司)，计算出读取中的核糖体rna的比率。步骤依据操作说明书进行。
[0273]
具体而言，利用以下的方法进行。
[0274]
对于本实施例中使用的核酸片段样品，使用利用rneasy mini kit(qiagen公司)将nih3t3细胞纯化而得到的rna10pg。
[0275]
将为了将该rna10pg供于rt
‑
ramda法而在本实施例中使用的样品溶液中包含的成分及该样品溶液中的最终浓度示于以下的表3。需要说明的是，nsr引物(六聚体)利用sigma公司常规寡核苷酸而合成，以成为ozsolak et al.，digital transcriptome profiling from attomole
‑
levelrna samples，genome research，vol.20，2010，pp.519
‑
525记载的引物组成的方式进行混合而使用。
[0276]
[表3]
[0277]
最终浓度成分100mmtris
‑
hcl(ph 8.0)10mm氯化镁50mm氯化钾1mmdatp1mmdttp1mmdgtp1mmdctp0.4μm寡聚(dt)18引物4μmnsr引物(六聚体)1u/μl逆转录酶(东洋纺株式会社制、revertra ace)0.5u/μlrnase抑制剂(东洋纺株式会社制、rnase抑制剂)0.2u/μldnase i(thermo fisher公司制、dnase i)50ng/μlt4噬菌体基因32编码蛋白0、1、或3ng/μ1实施例1中使用的聚肌苷酸钾盐
[0278]
使用将纯化rna添加至上述组成中的样品溶液，进行了rt
‑
ramda法。该方法通过25℃下10分钟、30℃下10分钟、37℃下30分钟、50℃下5分钟及85℃下5分钟而进行反应。
[0279]
将其结果示于表4。
[0280]
[表4]
[0281][0282]
表4的读取数是得到的总读取的数量。完全一致％表示总读取中的与包含核糖体rna的参照基因组(ucsc mm10)一致的读取的比率，过剩％表示核糖体rna的比率。过剩％/完全一致％表示与参照基因组一致的读取中的核糖体rna的比率。
[0283]
与未添加聚肌苷酸钾盐的条件相比，添加了聚肌苷酸钾盐的条件的过剩％/完全
一致％的比率降低，核糖体rna的比率减少。
[0284]
由此确认，肌苷酸聚合物在rt
‑
ramda法中抑制了源自核糖体rna的dna合成。
[0285]
实施例3：在rt
‑
ramda法中肌苷酸聚合物对源自核糖体rna的dna合成的抑制(nih3t3细胞)
[0286]
本实施例中，为了确认在ramda反应中肌苷酸聚合物存在下源自核糖体rna的dna合成量，而进行了以下的试验。
[0287]
在样品溶液中添加聚肌苷酸钾盐，通过rt
‑
ramda法进行单链cdna的合成，生成了克列诺片段的双链cdna。然后使用nexteta(illumina公司)来制备文库，使用miseq reagent kit v3(150次循环)(illumina公司)并通过miseq(illumina公司)实施了ngs(下一代测序)。步骤依据操作说明书进行。解析使用illumina basespace tophat(illumina公司)，计算出读取中的核糖体rna的比率。步骤依据操作说明书进行。
[0288]
具体而言，利用以下的方法进行。
[0289]
本实施例中使用的细胞样品利用以下的组成进行制备。
[0290]
使用胰蛋白酶溶液(nacalai tesque,inc.)使nih3t3细胞在37℃下反应2分钟，分解为单细胞。分解后立即置换成pbs(
‑
)使反应终止。使用facs melody细胞分选仪(bd公司)将死细胞荧光标记物色素pi阴性的细胞作为活细胞级分，从该级分中分取40个细胞至3μl的以下所示的裂解缓冲液中。分取后立即进行离心分离，保存在
‑
80℃下。在用于逆转录反应时，溶解后加入117μl的裂解缓冲液而稀释40倍，将所得的细胞溶解液3μl用作单细胞溶解液。
[0291]
裂解缓冲液
[0292]
0.1mg/ml蛋白酶k
[0293]
0.5％tritonx
‑
100
[0294]
0或5ng/ul实施例1中使用的聚肌苷酸钾盐
[0295]
1u/ul rnase抑制剂(东洋纺株式会社制、rnase抑制剂)
[0296]
将为了将该单细胞溶解液供于rt
‑
ramda法而在本实施例中使用的样品溶液中包含的成分及该样品溶液中的最终浓度示于以下的表5。
[0297]
[表5]
[0298]
最终浓度成分100mmtris
‑
hcl(ph 8.0)10mm氯化镁50mm氯化钾1mmdatp1mmdttp1mmdgtp1mmdctp0.4um寡聚(dt)18引物4μm实施例2中使用的nsr引物(六聚体)1u/μl逆转录酶(东洋纺株式会社制、revertra ace)0.5u/μlrnase抑制剂(东洋纺株式会社制、rnase抑制剂)
0.2u/μldnase i(thermo fisher公司制、dnase i)50ng/μlt4噬菌体基因32编码蛋白
[0299]
将单细胞溶解液3μl在70℃下进行2分钟热处理，添加至上述组成的样品液6μl中，进行rt
‑
ramda法(反应液中的聚肌苷酸钾盐的最终浓度为0或1.67ng/μl)。该方法通过25℃下10分钟、30℃下10分钟、37℃下30分钟、50℃下5分钟及85℃下5分钟而进行反应。
[0300]
将其结果示于表6。
[0301]
[表6]
[0302][0303]
与未添加聚肌苷酸钾盐的条件相比，添加了聚肌苷酸钾盐的条件的过剩％/完全一致％的比率降低，核糖体rna的比率减少。
[0304]
因此确认，通过在细胞溶解液中包含聚肌苷酸钾盐，从而在rt
‑
ramda法的样品溶液中也添加有聚肌苷酸钾盐，聚肌苷酸钾盐抑制了源自核糖体rna的dna合成。
[0305]
实施例4：在rt
‑
pcr法中肌苷酸聚合物、脱氧鸟苷酸聚合物、腺苷酸聚合物及脱氧胸苷酸聚合物对源自核糖体rna的dna合成的抑制(nih3t3细胞)
[0306]
本实施例中，为了确认在rt
‑
pcr法中4种核酸聚合物(作为肌苷酸聚合物的聚肌苷酸钾盐；作为脱氧鸟苷酸聚合物的聚脱氧鸟苷酸；作为腺苷酸聚合物的聚腺苷酸钾盐；作为脱氧胸苷酸聚合物的聚脱氧胸苷酸)存在下源自核糖体rna的dna合成量，而进行了以下的试验。
[0307]
在细胞溶解液中添加核酸聚合物，通过逆转录反应来进行单链cdna的合成。然后，通过定量聚合酶链式反应(qpcr)进行了dna合成量的比较。具体而言，利用以下的方法进行。
[0308]
本实施例中使用的细胞样品利用以下的组成进行制备。
[0309]
使用胰蛋白酶溶液(nacalai tesque,inc.)使nih3t3细胞在37℃下反应2分钟，分解为单细胞。分解后立即置换成pbs(
‑
)使反应终止。使用facs melody细胞分选仪(bd公司)将死细胞荧光标记物色素pi阴性的细胞作为活细胞级分，从该级分中分取10个细胞至3μl的以下所示的裂解缓冲液中。分取后立即进行离心分离，保存在
‑
80℃下。在用于逆转录反应时，溶解后进行热处理，将3μl用作10细胞溶解液。
[0310]
裂解缓冲液
[0311]
0.1mg/ml蛋白酶k
[0312]
0.1％诺乃洗涤剂
‑
40
[0313]
1u/μl rnase抑制剂(东洋纺株式会社制、rnase抑制剂)
[0314]
将为了进行该细胞溶解液的逆转录反应而在本实施例中使用的样品溶液中包含的成分及该样品溶液中的最终浓度示于以下的表7。
[0315]
[表7]
[0316][0317]
*：对于聚腺苷酸钾盐的碱基长分布，使用成套试剂dna
‑
12000(株式会社岛津制作所制)，用微型芯片电泳装置(株式会社岛津制作所制)进行分析，结果可知：聚腺苷酸钾盐如图2所示峰碱基长为约300碱基长，包含约100～5000碱基长的聚腺苷酸(参考值)。
[0318]
将10个细胞的细胞溶解液3μl在70℃下进行2分钟热处理，添加至上述组成中，进行逆转录反应。该反应通过在37℃下反应10分钟、接着在95℃下反应5分钟而合成了单链cdna。
[0319]
然后，通过以下的定量聚合酶链式反应(qpcr)进行了dna扩增量的比较。
[0320]
用无核酸酶水(qiagen公司)稀释逆转录反应液，将1/25量用于qpcr反应。qpcr使用stepone plus(life technologies公司)，在以下的条件下进行。将qpcr反应用溶液[20μl(thunderbird(商标)sybr qpcr mix(toyobo公司)、6pmol正向引物、6pmol反向引物、2μl稀释逆转录反应液、无核酸酶水)在95℃下1分钟而激活酶，然后将95℃15秒的变性和60℃1分钟的延伸反应进行40次循环。熔解曲线分析通过95℃下15秒、60℃下15秒及95℃下15秒而进行。作为靶基因，使用β肌动蛋白(mrna)和rn18s(18s核糖体rna)。
[0321]
将其结果示于表8。
[0322]
[表8]
[0323][0324]
将从添加了各核酸聚合物的条件的平均ct值中减去未添加各核酸聚合物的条件的平均ct值而得到的值作为δct。
[0325]
比较作为mrna的β肌动蛋白在有和没有核酸聚合物时的ct值的差值(源自mrna的dna合成量的差值)，作为核糖体rna的rn18s在有和没有核酸聚合物时的ct值的差值变大。该结果证实：与其它rna相比，rn18s通过添加聚肌苷酸钾盐、聚脱氧鸟苷酸而使ct值大幅变慢(变大)，抑制了源自rrna的dna合成。另外确认了：通过增加聚肌苷酸钾盐、聚脱氧鸟苷酸的添加量，从而进一步抑制了rrna的dna合成。尽管聚腺苷酸钾盐比使用聚肌苷酸钾盐、聚脱氧鸟苷酸的情况稍差，但ct值也变慢(变大)，抑制了源自rrna的dna合成。确认了：聚脱氧胸苷酸与其它核酸聚合物相比ct值的延迟小，但ct值稍微变慢。
[0326]
由此确认：通过添加核酸聚合物，抑制了通常不希望进行逆转录的源自核糖体rna的dna合成。