检测癌的方法和检测试剂

1.本发明涉及以天青杀素(
アズロシジン
，azurocidin)(以下称为“azu1”)作为测定对象的癌的检测方法和检测试剂。


背景技术：

2.作为用于检测癌的肿瘤标志物，通常可列举出表1所示者。然而，任意的标志物在癌早期的阳性率均低，也有很多在良性肿瘤、炎症中为假阳性、在恶性度高的癌中检测不到等课题。因此，期望发现能以高精度检测到这些癌的肿瘤标志物及开发出检测方法。
3.[表1]
[0004]
(表1)
[0005][0006]
另外，azu1是以别名肝素结合蛋白(hbp)或37kda阳离子型抗菌蛋白(cap37)而已知的一种非活性丝氨酸蛋白酶。作为其功能，azu1具有对单核细胞的化学迁移作用及对革兰氏阴性菌的抗菌作用。azu1存在于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，由迁移到感染部位的中性粒细胞释放而诱导血管渗漏和水肿形成，促进炎症并有助于生物体防御(非专利文献1～5)。
[0007]
对于azu1与疾病的关联，已经公开了通过测定体液中的azu1量来诊断感染症和败血症的诊断方法(专利文献1～3)。另外，近些年报道了通过分离体液中的细胞外囊泡并检测azu1来诊断肾细胞癌的方法(专利文献4、非专利文献6)。
[0008]
对于azu1与癌的关联，报道了azu1的信使rna表达量在乳腺癌、前列腺癌、大肠癌中增加(非专利文献6)。然而，迄今为止，在包括这些在内的肾细胞癌以外的癌中，没有关于azu1在能比活检低侵入性地采集的体液中的动态的报告，尚不清楚体液中的azu1是否能用于检测除肾细胞癌以外的癌。
[0009]
现有技术文献
[0010]
专利文献
[0011]
专利文献1：日本专利第5166522号公报
[0012]
专利文献2：日本专利第5488885号公报
[0013]
专利文献3：日本专利第5818916号公报
[0014]
专利文献4：国际公开第2018/079689号小册子
[0015]
非专利文献
[0016]
非专利文献1：j leukoc biol.2009mar；85(3)：344
‑
51
[0017]
非专利文献2：trends immunol.2009nov；30(11)：538
‑
46
[0018]
非专利文献3：nat med.2001oct；7(10)：1123
‑
7.
[0019]
非专利文献4：trends immunol.2009nov；30(11)：547
‑
56
[0020]
非专利文献5：thromb haemost.2009aug；102(2)：198
‑
205
[0021]
非专利文献6：int j cancer.2018feb 1；142(3)：607
‑
617


技术实现要素：

[0022]
发明要解决的问题
[0023]
本发明的课题在于，提供简便且高精度地检测癌的方法、及能用于前述方法的试剂。
[0024]
用于解决问题的方案
[0025]
为了解决上述课题，本发明人等进行了深入研究，结果得到了癌患者与健康人相比体液中的azu1会显示出显著高的值的见解，发现azu1能够成为癌的检测标志物，并完成了本发明。
[0026]
即，本发明包括以下的方式。
[0027]
[1]一种检测癌(其中不包括肾细胞癌)的方法，所述方法包括测定待检体中天青杀素(azu1)量的步骤，在测定值超过预先设定的基准值的情况下认为检测到了癌。
[0028]
[2]根据[1]所述的方法，其中，前述癌选自由胃癌、乳腺癌、大肠癌和肺癌组成的组。
[0029]
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，azu1量的测定使用特异性识别azu1的抗体来进行。
[0030]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其包括进一步检测前述待检体中存在于与存在azu1的细胞分泌微粒同一细胞分泌微粒上的第二标志物的步骤，前述第二标志物为表2中记载的至少任意1个。
[0031]
[5]根据[4]所述的方法，其中，前述第二标志物包含cd81、cd63、cd9和磷脂酰丝氨酸中的至少1个。
[0032]
[6]根据[4]或[5]所述的方法，其中，第二标志物的检测使用特异性识别第二标志
物的抗体或受体来进行。
[0033]
[7]一种用于检测癌(其中不包括肾细胞癌)的试剂，其包含特异性识别azu1的抗体。
[0034]
[8]根据[7]所述的试剂，其中，前述癌选自由胃癌、乳腺癌、大肠癌和肺癌组成的组。
[0035]
[9]根据[7]或[8]所述的试剂，其还包含特异性识别表2中记载的任意的第二标志物的抗体或受体。
[0036]
[10]根据[9]所述的试剂，其中，前述第二标志物包含cd81、cd63、cd9和磷脂酰丝氨酸中的至少1个。
[0037]
发明的效果
[0038]
根据本发明，提供简便且高精度地检测癌的方法、及能用于前述方法的试剂。
附图说明
[0039]
图1是示出实施例8中利用使用gpi锚定型azu1组成型表达cho
‑
k1细胞的celisa得到的、杂交瘤细胞培养上清液的筛选结果的图。
[0040]
图2是示出实施例9中利用使用分泌型azu1的elisa得到的、杂交瘤细胞培养上清液的筛选结果的图。
[0041]
图3是示出实施例13中利用使用细胞分泌微粒的elisa得到的、抗azu1单克隆抗体作为固相抗体的性能评价结果的图。
[0042]
图4是示出实施例13中利用使用细胞分泌微粒的elisa得到的、抗azu1单克隆抗体作为生物素标记抗体的性能评价结果的图。
[0043]
图5是示出实施例14中即使使用抗cd81抗体、抗cd9抗体、抗cd63抗体中的任意者作为elisa的固相抗体也能够检测到包含azu1的细胞分泌微粒的图。
[0044]
图6是示出实施例15
‑
1中健康人组和胃癌患者组的、使用抗cd81抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0045]
图7是示出实施例15
‑
2中健康人组和胃癌患者组的、使用抗cd9抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0046]
图8是示出实施例15
‑
3中健康人组和胃癌患者组的、使用抗cd63抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0047]
图9是示出实施例15
‑
4中健康人组和胃癌患者组的、使用抗azu1抗体作为固相抗体且使用抗cd81抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0048]
图10是示出实施例15
‑
5中健康人组和胃癌患者组的、使用抗azu1抗体作为固相抗体且使用抗cd9抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0049]
图11是示出实施例15
‑
6中健康人组和胃癌患者组的、使用抗azu1抗体作为固相抗体且使用抗cd63抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0050]
图12是示出实施例16中健康人组和胃癌患者组的、使用tim4
‑
hfc作为固相受体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0051]
图13是示出比较例1中健康人组和胃癌患者组的cea测定值的箱形图的图。
[0052]
图14是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用抗cd81抗体作为固相
抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的受试者工作特征(roc)曲线解析的结果的图。
[0053]
图15是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用抗cd9抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的roc曲线解析的结果的图。
[0054]
图16是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用抗cd63抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的roc曲线解析的结果的图。
[0055]
图17是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用抗azu1抗体作为固相抗体且使用抗cd81抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的roc曲线解析的结果的图。
[0056]
图18是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用抗azu1抗体作为固相抗体且使用抗cd9抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的roc曲线解析的结果的图。
[0057]
图19是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用抗azu1抗体作为固相抗体且使用抗cd63抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的roc曲线解析的结果的图。
[0058]
图20是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的、使用tim4
‑
hfc作为固相受体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的roc曲线解析的结果的图。
[0059]
图21是示出实施例17中健康人组和胃癌患者组之间的cea测定值的roc曲线解析的结果的图。
[0060]
图22是示出实施例18
‑
1中健康人组和乳腺癌患者组的、使用抗cd81抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0061]
图23是示出实施例18
‑
2中健康人组和乳腺癌患者组的、使用抗cd9抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0062]
图24是示出实施例18
‑
3中健康人组和乳腺癌患者组的、使用抗cd63抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0063]
图25是示出实施例19
‑
1中健康人组和大肠癌患者组的、使用抗cd81抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0064]
图26是示出实施例19
‑
2中健康人组和大肠癌患者组的、使用抗cd9抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0065]
图27是示出实施例19
‑
3中健康人组和大肠癌患者组的、使用抗cd63抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0066]
图28是示出实施例20
‑
1中健康人组和肺癌患者组的、使用抗cd81抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0067]
图29是示出实施例20
‑
2中健康人组和肺癌患者组的、使用抗cd9抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0068]
图30是示出实施例20
‑
3中健康人组和肺癌患者组的、使用抗cd63抗体作为固相抗体且使用抗azu1抗体作为生物素标记抗体的elisa吸光度的箱形图的图。
[0069]
图31是示出实施例21中健康人、肺癌、大肠癌、乳腺癌和胃癌的各组的血清待检体中包含的游离azu1浓度的箱形图的图。
具体实施方式
[0070]
[1]本发明的检测癌的方法
[0071]
本发明的第一方式是检测癌(其中不包括肾细胞癌)的方法，其包括测定待检体中azu1量的步骤。其是基于与健康的待检体相比azu1特征性地存在于癌的血液等生物体试样中的方法。待检体中的azu1量的测定通常在体外(in vitro)进行。
[0072]
利用本发明的方法，如后述的实施例所示，与测定现有已知的cea等肿瘤标志物的情况相比，能够以高灵敏度和特异性检测癌。
[0073]
需要说明的是，本发明的方法是包括至检测癌为止的阶段的方法，不包括与癌诊断相关的最终的判断行为。医生参考基于本发明的方法的检测结果等来诊断癌或制定治疗方针。
[0074]
通常，检测癌的对象(待检动物)为人。
[0075]
作为本发明中成为测定对象的待检体，作为例子可列举出血液、尿液、唾液、眼泪、腹水、腹膜灌洗液、脑脊液、及细胞或组织的提取液等。考虑到待检体采集的容易性，优选血液、尿液、唾液和眼泪。考虑到与其它检测项目的通用性，更优选血液。对于血液，可以直接使用全血，也可以分离成血清、血浆、血细胞等血液成分而使用，但优选使用血清或血浆。待检体的稀释倍率没有特别限制，例如在不稀释～稀释100倍的范围内根据使用的待检体的种类、状态进行适宜选择即可。
[0076]
需要说明的是，待检体通常包含后述的由细胞分泌的微粒(细胞分泌微粒)。
[0077]
本发明所针对的疾病为癌(其中不包括肾细胞癌)。优选胃癌、乳腺癌、大肠癌和/或肺癌，更优选胃癌。
[0078]
本发明中，作为测定对象的azu1是至少包含uniplotkb的登录号p20160中公开的人azu1蛋白的氨基酸序列中的第27位残基的异亮氨酸到第248位残基的脯氨酸的序列的肽、或是包含与前述序列具有80％以上的一致性的氨基酸序列的肽。前述一致性优选90％以上、更优选95％以上。另外，该肽可以是由在前述序列中缺失、置换、插入或添加了1个或数个氨基酸的氨基酸组成的肽。需要说明的是，数个是指：优选2～20个、更优选2～10个、进一步优选2～5个。另外，也可以在前述序列的两侧具有其它肽片段。
[0079]
本发明中所测定的azu1可以测定作为可溶性蛋白存在的azu1，可以测定存在于由细胞分泌的微粒上的azu1，或者也可以测定这两者。测定存在于微粒上的azu1的情况下，可以测定在该微粒上与第二标志物共存的azu1。
[0080]
作为由细胞分泌的微粒的例子，可列举出外来体。外来体是指由脂质双层膜构成的通常具有50～200nm的直径的膜泡。外来体已知包含大量四次跨膜蛋白类(tetraspanins)、整合素类等膜蛋白、与多胞体形成相关的蛋白质、热休克蛋白等。另外，构成外来体的脂质双层膜已知在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸。将外来体中大量包含的代表性的分子示于表2。
[0081]
本发明中的第二标志物只要是存在于细胞分泌微粒上的分子就没有特别限制，优选指由前述的表2所示的蛋白质和磷脂酰丝氨酸组成的组中包含的至少1个，更优选包含cd81、cd63、cd9和磷脂酰丝氨酸中的至少1个。需要说明的是，表2所示的蛋白质中，还包括包含与其具有高同源性(80％以上、优选90％以上、更优选95％以上)的氨基酸序列的肽。
[0082]
第二标志物可以是2种以上，因此“第二”这一术语也可以理解为“除azu1以外的”这一意思。
[0083]
本发明中所检测的第二标志物只要是存在于细胞分泌微粒上的分子就没有特别
限制，优选为表2所示的蛋白质和磷脂酰丝氨酸，是存在于与存在azu1的细胞分泌微粒同一细胞分泌微粒的物质。
[0084]
[表2
‑
1]
[0085]
(表2)
[0086][0087]
[表2
‑
2]
[0088]
(续表2)
[0089][0090]
在本发明的检测方法中，测定azu1量的方法、及测定(检测)共存于细胞分泌微粒上的第二标志物中的至少1个和azu1的方法只要不妨碍测定azu1量就没有特别限制。例如可列举出使用特异性识别azu1的抗体的免疫测定法、利用了质谱分析法的方法。
[0091]
作为使用特异性识别azu1的抗体的免疫测定法的具体例，可列举出以下情况。
[0092]
[a]使用特异性识别azu1的抗体和经标记的azu1，利用经标记的azu1和待检体中包含的azu1与前述抗体竞争性地结合的竞争法。
[0093]
[b]使待检体与固定化有特异性识别azu1的抗体的芯片接触，使用检测依赖于该抗体与azu1的结合的信号的表面等离子共振的方法。
[0094]
[c]使用经荧光标记的特异性识别azu1的抗体，利用由于该抗体与azu1结合而荧光偏振度上升的荧光偏振免疫测定法。
[0095]
[d]使用特异性识别azu1的2个抗体(其中1个为经标记的抗体)，形成该2个抗体与azu1的3者的复合体的夹心法。此时该2个抗体优选为表位不同的2种抗体。
[0096]
[e]作为预处理，通过特异性识别azu1的抗体将待检体中的azu1浓缩后，利用质谱分析装置检测azu1与抗体的结合物的方法。
[0097]
[f]使用经荧光标记的特异性识别azu1的抗体，在使该抗体与azu1结合后，使测定对象排列在流路内，基于对每个颗粒照射激发光时获得的散射光和荧光对该抗体与测定对
象结合而成的复合体进行计数的流式细胞术法。
[0098]
这些当中[d]和[e]的方法简便且通用性高，但在处理大量待检体方面更优选[d]的方法，因为与试剂和装置相关的技术已充分确立起来。
[0099]
特异性识别azu1的抗体没有特别限制，可以通过将azu1蛋白本身、由azu1的部分区域组成的寡肽、编码azu1的全长或部分区域的多核苷酸等作为免疫原使动物免疫而得到。
[0100]
需要说明的是，使用azu1蛋白本身或由azu1的部分区域组成的寡肽作为免疫原时，在制备前述蛋白质或前述寡肽的过程中其结构有可能发生变化。因此，得到的抗体有可能对期望的抗原不具有高的特异性、结合力，作为结果有可能变得无法准备定量待检体中包含的azu1。另一方面，使用包含编码azu1的全长或部分区域的多核苷酸的表达载体作为免疫原时，在被免疫的动物的体内表达azu1且不发生结构变化，因此可以得到对期望的抗原具有高的特异性和结合力(即高亲和性)的抗体，故而优选。
[0101]
免疫中使用的动物只要是具有抗体产生能力者就没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、兔子等通常免疫中使用的哺乳动物，也可以使用鸡等禽类。
[0102]
特异性识别azu1的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。
[0103]
关于产生特异性识别azu1的抗体的杂交瘤细胞的建立，从已确立了技术的方法中适宜选择来进行即可。作为一例，从利用前述的方法免疫的动物中采集b细胞，使前述b细胞与骨髓瘤细胞电融合或在聚乙二醇的存在下融合，利用hat培养基进行产生期望的抗体的杂交瘤细胞的选择，利用有限稀释法对所选择的杂交瘤细胞进行克隆，由此能够建立产生特异性识别azu1的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
[0104]
本发明中使用的特异性识别azu1的抗体的选择可以基于源自宿主表达系统的针对糖基化磷脂酰肌醇(gpi)锚定型azu1的亲和性来进行。
[0105]
需要说明的是，作为前述宿主，没有特别限定，本领域技术人员从通常用于蛋白质的表达的大肠杆菌、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、动物细胞中适宜选择即可，优选使用能够通过二硫键或糖链添加之类的翻译后修饰而表达具有接近天然型的azu1的结构的蛋白质的哺乳细胞作为宿主。作为哺乳细胞的一例，可列举出一直以来使用的人胎肾来源293t细胞株、猴肾来源cos
‑
7细胞株、中国仓鼠卵巢来源cho
‑
k1细胞株或从人体分离出的癌细胞等。
[0106]
关于本发明的癌检测方法中使用的抗体的纯化，从已确立了技术的方法中适宜选择来进行即可。作为一例，培养利用前述的方法确立的产生抗体的杂交瘤细胞后，回收该培养上清液，根据需要通过硫酸铵沉淀进行抗体浓缩后，利用离子交换层析、疏水性相互作用层析或使用固定化有蛋白a、蛋白g或蛋白l等的载体的亲和色谱，由此能够进行抗体的纯化。
[0107]
本发明中，在同时进行同一细胞分泌微粒上存在的azu1量的测定及第二标志物的检测时，除了识别azu1的抗体之外，优选进一步使用特异性识别第二标志物的抗体或受体(以下也记为“抗体等”)。
[0108]
作为本发明中第二标志物，优选包含cd81、cd63、cd9和磷脂酰丝氨酸中的至少1个，作为特异性识别这些的抗体或受体，优选为抗cd81抗体、抗cd63抗体、抗cd9抗体或磷脂
酰丝氨酸受体。
[0109]
本发明中使用的抗cd81抗体、抗cd63抗体和抗cd9抗体可以利用与前述的识别azu1的抗体同样的方法而得到。
[0110]
本发明中使用的磷脂酰丝氨酸受体没有特别限制，例如可列举出膜联蛋白v、mfg
‑
e8、tim1、tim3、tim4，优选对于磷脂酰丝氨酸具有高的特异性与结合力的tim4(国际公开第2016/088689号)。tim4只要至少具有与磷脂酰丝氨酸的结合域(igv域)的氨基酸序列即可，可以使用例如tim4蛋白本身、由包含tim4的igv域的部分区域组成的肽、在包含tim4的igv域的部分区域结合有其它肽片段的融合蛋白。
[0111]
需要说明的是，利用前述的夹心法进行结合定量法时所使用的经标记的抗体等用如下物质标记即可，所述物质为：过氧化物酶或碱性磷酸酶之类的酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素或功能性微粒之类的能利用检测装置检测的物质；或者如亲合素与生物素那样存在特异性结合的另一方的物质等，该标记也可以使用已确立了技术的方法来进行。
[0112]
以下具体地说明在本发明的方法中利用质谱分析法检测azu1并进行定量测定的方法。
[0113]
待检体为血液的情况下，作为预处理工序，优选：利用agilent human 14等去除血液中大量包含的白蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等蛋白质后，通过离子交换、凝胶过滤或反相色谱法等进行进一步分级。
[0114]
测定可以通过串联质谱分析(ms/ms)、液相色谱/串联质谱分析(lc/ms/ms)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析(maldi
‑
tof/ms)、表面增强激光解吸电离质谱分析(seldi
‑
ms)等进行。
[0115]
在本发明的检测方法中，优选：在通过测定而得到的azu1量超过由对照计算出的基准值(截止值)的情况下，判断检测到癌。
[0116]
判定时使用的azu1量可以是测定值或换算浓度值的任意者。需要说明的是，换算浓度值是指：基于以azu1作为标准试样制得的标准曲线由测定值换算的值。关于标准试样的浓度确定，可以设为基于使用质谱分析的标准肽的标准曲线由测定值换算的值。
[0117]
对于截止值，可以分别测定从健康人和癌患者中采集的待检体，通过受试者工作特征(roc)曲线适宜设定显示出最佳的灵敏度和特异性的测定值。
[0118]
本发明的检测癌的方法可以用于治疗癌的方法。即，根据本发明，提供治疗患者中的癌(其中不包括肾细胞癌)的方法，所述方法包括如下工序：
[0119]
(i)将azu1量的测定值超过预先设定的基准值的人鉴定为患者的工序；及
[0120]
(ii)对前述鉴定出的患者实施治疗的工序。
[0121]
在前述工序(i)的鉴定中，azu1量的测定可以使用特异性识别azu1的抗体进行，也可以使用质谱分析法进行。
[0122]
作为前述工序(ii)的治疗，可列举出外科切除、药物疗法、放射线疗法等，但没有特别限定。
[0123]
[2]本发明的检测癌的试剂
[0124]
本发明的第二方式是用于检测癌(其中不包括肾细胞癌)的试剂，其包括特异性识别azu1的抗体。
[0125]
本发明的试剂进一步优选还包含特异性识别表2所示的第二标志物的抗体或受体。特异性识别第二标志物的抗体或受体(抗体等)没有特别限制，优选为特异性识别例如cd81、cd63、cd9和磷脂酰丝氨酸中的至少1个的抗体或受体，更优选为抗cd81抗体、抗cd63抗体、抗cd9抗体或磷脂酰丝氨酸受体中的任意者。磷脂酰丝氨酸受体没有特别限制，例如可列举出膜联蛋白v、mfg
‑
e8、tim1、tim3、tim4，优选对磷脂酰丝氨酸具有高的特异性和结合力的tim4。tim4只要至少具有与磷脂酰丝氨酸的结合域(igv域)的氨基酸序列即可，例如可以使用tim4蛋白质本身、由包含tim4的igv域的部分区域组成的肽、在包含tim4的igv域的部分区域结合有其它肽片段的融合蛋白。
[0126]
对于本发明的试剂和测定方法，以下具体地说明前述的夹心法的3个方式。但是，本发明的试剂和测定方法不限定于这3个方式。
[0127]
[方式1]两步夹心法
[0128]
本方式中使用的试剂包含2种抗体等(以下记作“抗体等1”和“抗体等2”)。抗体等1和抗体等2优选与测定对象物质的结合位点彼此不同。抗体等1和抗体等2的组合例如可列举出下述[a]～[c]这三组。
[0129]
[a]抗体等1：特异性识别azu1的抗体、抗体等2：特异性识别azu1且与抗体等1相同或不同的抗体
[0130]
[b]抗体等1：特异性识别azu1的抗体、抗体等2：特异性识别第二标志物的抗体或受体
[0131]
[c]抗体等1：特异性识别第二标志物的抗体或受体、抗体等2：特异性识别azu1的抗体
[0132]
本方式的试剂可以利用以下的[1]～[3]所示的方法制作。
[0133]
[1]首先，使抗体等1结合于免疫板、磁性颗粒等能b/f分离的载体上。结合方法可以是利用了疏水键的物理结合，也可以是使用能使两种物质之间交联的连接试剂等的化学结合。
[0134]
[2]使前述抗体等1结合于载体后，为了避免非特异性结合，用牛血清白蛋白、脱脂乳、市售的免疫法用封闭剂等对载体表面进行封闭处理，作为1次试剂。
[0135]
[3]标记另一者、即抗体等2，从而准备包含得到的标记抗体等的溶液作为2次试剂。作为对抗体等2进行标记的物质，优选：过氧化物酶或碱性磷酸酶之类的酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素或功能性微粒之类的能用检测装置检测的物质；或者如亲合素与生物素那样存在特异性结合的另一者的物质等。另外，作为2次试剂的溶液，优选能良好地进行抗原抗体反应的缓冲液、例如磷酸盐缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液等。
[0136]
如此制作的本方式的试剂可以根据需要进行冷冻干燥。
[0137]
接着，使用本方式中制作的试剂检测、测定azu1时，利用以下的[4]～[6]所示的方法进行即可。
[0138]
[4]使前述的[2]中制作的1次试剂与待检体在一定温度下接触一定时间。反应条件在温度4℃至40℃的范围内使其反应5分钟到180分钟即可。
[0139]
[5]通过b/f分离去除未反应物质，接着与[3]中制作的2次试剂在一定温度下接触一定时间，形成夹心复合体。关于反应条件，在温度4℃至40℃的范围内使其反应5分钟到180分钟即可。
[0140]
[6]通过b/f分离去除未反应物质，对标记抗体等标志物质进行定量，利用以已知浓度的azu1作为标准而制作的标准曲线对待检体中的azu1浓度进行定量。
[0141]
[方式2]一步夹心法
[0142]
本方式中使用的试剂与前述的方式1同样地包含抗体等1和抗体等2。
[0143]
制作本方式的试剂时，可以利用方式1的[1]～[2]所示的方法制作使抗体等1结合于载体并进行封闭处理而得的物质，向前述抗体等固定化载体中进一步添加包含经标记的抗体等2的缓冲液。
[0144]
如此制作的本方式的试剂可以根据需要进行冷冻干燥。
[0145]
接着，使用本方式中制作的试剂检测、测定azu1时，利用以下的[7]～[8]所示的方法进行即可。
[0146]
[7]使前述的方法中制作的试剂与待检体在一定温度下接触一定时间，形成夹心复合体。关于反应条件，在温度4℃至40℃的范围内使其反应5分钟到180分钟即可。
[0147]
[8]通过b/f分离去除未反应物质，对标记抗体等标志物质进行定量，利用以已知浓度的azu1作为标准而制作的标准曲线对待检体中的azu1浓度进行定量。
[0148]
[方式3]均相夹心法
[0149]
本方式中使用的试剂与前述的方式1和2同样地包含抗体等1和抗体等2，还包含被链霉亲和素覆盖的能被激发光激发的标志物质。作为前述的链霉亲和素覆盖标志物质，可以适宜地使用例如alphascreen链霉亲和素供体珠(perkinelmer制)。
[0150]
本方式的试剂可以利用以下的[9]～[10]中记载的方法制作。
[0151]
[9]首先，用生物素标记抗体等1。前述生物素标记通过现有公知的方法进行即可，例如可列举出使用biotin labeling kit
‑
nh2标记试剂盒(同仁化学研究所制)的方法。
[0152]
[10]用通过单线态氧而发出信号的物质标记另一者、即抗体等2。在激发前述链霉亲和素覆盖标志物质时会产生该单线态氧。前述信号优选荧光信号。作为前述信号发生物质，例如可以适宜地使用alphalisa受体珠(perkinelmer制)。抗体等2与信号发生物质的结合方法没有特别限制，例如可列举出利用了氰基硼氢化钠与信号发生物质表面的醛基的还原胺化交联。
[0153]
接着，使用本方式中制作的试剂检测、测定azu1时，利用以下的[11]～[13]所示的方法进行即可。
[0154]
[11]使前述的[9]中制作的生物素标记抗体等1、[10]中制作的信号发生物质标记抗体等2和待检体在一定温度、遮光条件下接触一定时间，形成夹心复合体。关于反应条件，在温度4℃至40℃的范围内使其反应5分钟到180分钟即可。
[0155]
[12]接着添加链霉亲和素覆盖标志物质使其在一定温度、遮光条件下接触一定时间，使生物素标记抗体与链霉亲和素覆盖标志物质结合。关于反应条件，在温度4℃至40℃的范围内使其反应5分钟到180分钟即可。
[0156]
[13]使用分析装置，对照射激发光时从信号发生物质标记抗体等21发出的信号进行定量，利用以已知浓度的azu1作为标准而制作的标准曲线对待检体中的azu1浓度进行定量。作为分析装置，例如可以适宜地使用enspire(perkinelmer制)。
[0157]
本发明的试剂中包含的试剂成分的量根据待检体量、待检体的种类、试剂的种类、测定的方法等各种条件进行适宜设定即可。例如，在使用20μl的血清或血浆作为待检体以
夹心法进行azu1量的测定时，将该待检体20μl作为与抗体等进行反应的反应体系，与载体结合的抗体等1的量可以为100ng至1000μg，经标记的抗体等2的量可以为2ng至20μg。
[0158]
本发明的试剂也可以用于手工方法(manual measurement)的测定中，也可以用于使用自动免疫诊断装置的测定。特别是使用自动免疫诊断装置的测定可以在不受待检体中包含的内源性的测定干扰因素、竞争酶的影响的前提下进行测定，且能够在短时间内定量待检体中的azu1，故而优选。
[0159]
本发明第二方式的另一方案为特异性识别azu1的抗体在制造用于检测癌(其中不包括肾细胞癌)的试剂中的应用。另外，为特异性识别azu1的抗体和特异性识别表2中记载的任意的第二标志物的抗体或受体在制造用于检测癌(其中不包括肾细胞癌)的试剂中的应用。
[0160]
另外，本发明的另一方案为特异性识别azu1的抗体在检测癌(其中不包括肾细胞癌)中的应用。另外，为特异性识别azu1的抗体、和特异性识别表2中记载的任意的第二标志物的抗体或受体在检测癌(其中不包括肾细胞癌)中的应用。
[0161]
实施例
[0162]
以下为了对本发明进行具体地说明而示出实施例，但这些实施例用于示出本发明的一例，本发明不限定于实施例。
[0163]
[实施例1]gpi锚定型azu1表达质粒的制作
[0164]
利用pcr法扩增了编码人azu1蛋白的氨基酸序列中的第27位残基的异亮氨酸至第248位残基的脯氨酸为止的序列的区域。使用in
‑
fusion hd cloning kit(takara bio inc.制)将前述的pcr扩增产物插入包含由氨基酸序列dykddddk(序列号1)组成的flag标签肽的编码区域、及源自胎盘型碱性磷酸酶的gpi锚定的信号肽的编码区域的质粒pflag1(sigma
‑
aldrich制)中，制作了能够表达在n末端侧添加了flag标签肽、在c末端侧添加了gpi锚定的信号肽的gpi锚定型azu1的质粒。
[0165]
[实施例2]分泌型azu1表达质粒的制作
[0166]
使用in
‑
fusion hd cloning kit(takara bio inc.制)将实施例1中制作的azu1编码区域的pcr扩增产物插入包含flag标签肽的编码区域、及由bnp(脑性钠利尿肽)的c末端侧7氨基酸序列ckvlrrh(序列号2)组成的bnc肽(日本特开2009
‑
240300号)的编码区域的质粒pflag1(sigma
‑
aldrich制)中，制作了能够表达在n末端侧添加了flag标签肽、在c末端侧添加了bnc肽的分泌型azu1的质粒。
[0167]
[实施例3]gpi锚定型azu1组成型表达cho
‑
k1细胞的制作
[0168]
依据常规方法将实施例1中制作的gpi锚定型azu1表达质粒导入至中国仓鼠卵巢来源cho
‑
k1细胞株后，使用添加了10％fbs的ham’s f12培养基(fujifilm wako pure chemical corporation制)在5％co2恒温箱中以37℃培养24小时。培养后，以成为250μg/ml的方式添加抗生素g418溶液(thermo fisher scientific制)，进而培养3周。使用抗flag抗体通过细胞分选仪获得了组成型表达gpi锚定型azu1的cho
‑
k1细胞。
[0169]
[实施例4]分泌型azu1瞬时表达293t细胞的制作
[0170]
依据常规方法将实施例2中制作的分泌型azu1表达质粒导入至人胎肾来源293t细胞株后，使用添加了10％fbs的d
‑
mem培养基(fujifilm wako pure chemical corporation制)在5％co2恒温箱中以37℃培养，azu1被瞬时表达。
[0171]
[实施例5]分泌型azu1溶液的回收
[0172]
将实施例4中制作的分泌型azu1瞬时表达293t细胞培养72小时后，将培养液离心分离，回收了上清液作为分泌型azu1溶液。
[0173]
[实施例6]基于超离心分离法的细胞分泌微粒的回收
[0174]
对于293t细胞株、实施例4中制作的分泌型azu1瞬时表达293t细胞、人肾癌来源achn细胞株、以及azu1
‑
flag表达achn细胞(专利文献4和非专利文献6)，使用用amicon ultra
‑
15、100kda截留(merck millipore制)超滤的添加了10％fbs的d
‑
mem培养基在5％co2恒温箱中以37℃下培养48小时后，利于以下的方法回收了细胞分泌微粒。
[0175]
[1]将培养液60ml以4℃、2000
×
g进行30分钟离心分离，回收了上清液。
[0176]
[2]将上述的离心分离上清液以4℃、16000
×
g进行30分钟离心分离，回收了上清液。
[0177]
[3]将上述的离心分离上清液以4℃、100000
×
g进行16小时超离心分离，去除上清液并回收了沉淀。
[0178]
[4]在上述的超离心分离沉淀中加入pbs，以4℃、100000
×
g进行16小时超离心分离，去除上清液并回收了沉淀。
[0179]
[5]在上述的超离心分离沉淀中添加200μl的pbs，通过移液使其悬浮，回收了细胞分泌微粒。
[0180]
[实施例7]免疫和细胞融合
[0181]
对4只balb/c小鼠，每7天以40μg/只给予实施例1中构建的gpi锚定型azu1表达质粒，共计进行6次，然后采集脾细胞。依据常规方法，使回收的脾细胞和小鼠骨髓瘤sp2/0细胞株在聚乙二醇的存在下融合，用添加了hat(sigma
‑
aldrich制)的git培养基(fujifilm wako pure chemical corporation制)培养约10天，由此选择了杂交瘤细胞。
[0182]
[实施例8]抗azu1抗体产生细胞的筛选(1)
[0183]
使用实施例3中制作的gpi锚定型azu1组成型表达cho
‑
k1细胞，利用以下所示的细胞酶免疫测定法(celisa)筛选了产生抗azu1抗体的杂交瘤细胞。
[0184]
[1]在96孔微孔板(falcon制)中添加gpi锚定型azu1组成型表达cho
‑
k1细胞5
×
104个/孔，使用添加了10％fbs的ham’s f12培养基(fujifilm wako pure chemical corporation制)在5％co2恒温箱中以37℃培养24小时。
[0185]
[2]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释至2μg/ml的小鼠igg(阴性对照、nc)和市售的小鼠抗azu1抗体(r&d systems制)(阳性对照、pc)以及无稀释的杂交瘤细胞培养上清液，在室温下放置1小时。
[0186]
[3]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释20000倍的辣根过氧化酶(hrp)标记抗小鼠免疫球蛋白g
‑
fc抗体(sigma
‑
aldrich制)，在室温下放置1小时。
[0187]
[4]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加tmb microwell peroxidase substrate(seracare life sciences制)，在室温下放置10分钟。
[0188]
[5]以50μl/孔添加1mol/l磷酸水溶液，使反应停止。
[0189]
[6]通过光吸收酶标仪测定了450nm的吸光度。
[0190]
将测定结果示于图1。从6个杂交瘤细胞培养上清液(1
‑
2、1
‑
7、1
‑
8、1
‑
13、1
‑
14和1
‑
15)中检测到高信号。
[0191]
[实施例9]抗azu1抗体产生细胞的筛选(2)
[0192]
使用实施例5中制作的分泌型azu1溶液，利用以下所示的夹心elisa筛选了产生抗azu1抗体的杂交瘤。
[0193]
[1]在maxisorp 96孔微孔板(thermo fisher scientific制)中以50μl/孔添加用碳酸盐缓冲液(ph9.8)稀释至2μg/ml的抗flag抗体，在4℃下放置一夜进行固相化。
[0194]
[2]用包含0.05％tween 20的tbs(tbst)进行3次清洗，以200μl/孔添加superblock(pbs)(thermo fisher scientific制)，在室温下放置1小时。
[0195]
[3]用tbst进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释5倍的实施例5中制作的分泌型azu1，在室温下放置2小时。
[0196]
[4]用tbst进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释至2μg/ml的小鼠igg(阴性对照、nc)和市售的小鼠抗azu1抗体(r&d systems制)(阳性对照、pc)以及无稀释的杂交瘤细胞培养上清液，在室温下放置1小时。
[0197]
[5]用tbst进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释20000倍的辣根过氧化酶(hrp)标记抗小鼠免疫球蛋白g
‑
fc抗体(sigma
‑
aldrich制)，在室温下放置1小时。
[0198]
[6]用tbst进行3次清洗，以50μl/孔添加sureblue reserve tmb(seracare life sciences制)，在室温下放置10分钟。
[0199]
[7]以50μl/孔添加1mol/l磷酸水溶液，使反应停止。
[0200]
[8]通过光吸收酶标仪测定了450nm的吸光度。
[0201]
将测定结果示于图2。从7个杂交瘤细胞培养上清液(1
‑
2、1
‑
5、1
‑
7、1
‑
8、1
‑
13、1
‑
14和1
‑
15)中检测到高信号。
[0202]
[实施例10]抗azu1抗体产生细胞的克隆
[0203]
利用有限稀释法对基于实施例8和实施例9的结果选择的3个杂交瘤细胞(1
‑
2、1
‑
8和1
‑
14)进行克隆，进行由添加了ht(sigma
‑
aldrich制)的git培养基向不包含ht的git培养基的驯化培养，最终建立了3个抗azu1抗体产生细胞株(克隆1
‑
2、1
‑
8和1
‑
14)。
[0204]
[实施例11]抗azu1单克隆抗体的制作
[0205]
由实施例10中建立的3个抗azu1抗体产生细胞(克隆1
‑
2、1
‑
8和1
‑
14)的培养上清液，使用蛋白g柱并依据常规方法将单克隆抗体纯化。用pbs将各纯化抗体透析后，测定280nm处的吸光度并定量了蛋白质浓度。
[0206]
[实施例12]生物素标记抗体的制作
[0207]
使用biotin labeling kit
‑
nh2标记试剂盒(同仁化学研究所制)，分别对抗cd81抗体、抗cd9抗体和抗cd63抗体(均为frontier institute co.,ltd.制)以及实施例11中制备的3个抗azu1抗体(克隆1
‑
2、1
‑
8和1
‑
14)依据产品操作说明书中记载的方案进行了生物素标记。
[0208]
[实施例13]抗azu1单克隆抗体的性能评价(1)
[0209]
利用表3中记载的8种夹心elisa测定了实施例6中制作的293t、293t
‑
azu1、achn、achn
‑
azu1细胞来源的分泌微粒。
[0210]
[表3]
[0211]
(表3)
[0212][0213]
以下示出具体的方法。
[0214]
[1]在maxisorp 96孔微孔板(thermo fisher scientific制)中以50μl/孔添加用碳酸盐缓冲液(ph9.8)稀释至4μg/ml的表3中记载的固相抗体，在4℃下放置一夜进行固相化。
[0215]
[2]用pbs进行3次清洗，以300μl/孔添加superblock(pbs)(thermo fisher scientific制)，在室温下放置1小时。
[0216]
[3]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释10倍的超离心分离沉淀，在室温下放置2小时。
[0217]
[4]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释至2μg/ml的表3中记载的生物素标记抗体，在室温下放置1小时。
[0218]
[5]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释50000倍的streptavidin
‑
polyhrp40(stereospecific detection technologies制)，在室温下放置30分钟。
[0219]
[6]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加sureblue reserve tmb(seracare life sciences制)，在室温下放置10分钟。
[0220]
[7]以50μl/孔添加1mol/l磷酸水溶液，使反应停止。
[0221]
[8]通过光吸收酶标仪测定了450nm的吸光度。
[0222]
将测定结果示于图3和图4(nc为阴性对象)。显示出：通过将抗azu1抗体用于固相抗体、生物素标记抗体中的任意者，能够检测包含azu1的细胞分泌微粒。特别是，显示出克隆1
‑
14具有高检测灵敏度。
[0223]
后文只要没有特别声明，抗azu1抗体是指克隆1
‑
14。
[0224]
[实施例14]抗azu1单克隆抗体的性能评价(2)
[0225]
利用表4中记载的3种夹心elisa测定了实施例6中制作的293t、293t
‑
azu1、achn、achn
‑
azu1细胞来源的分泌微粒。
[0226]
[表4]
[0227]
(表4)
[0228][0229]
具体的方法与实施例13同样。
[0230]
将测定结果示于图5(nc为阴性对象)。显示出：即使使用抗cd81抗体、抗cd9抗体、抗cd63抗体中的任意者作为固相抗体，也能够检测到包含azu1的细胞分泌微粒。
[0231]
[实施例15]健康人和胃癌患者的血清待检体的azu1测定(1)
[0232]
将本实施例中使用的健康人血清待检体的详情示于表5。健康人血清均获得东曹株式会社生物科学事业部伦理委员会的批准和待检体提供者的同意，在东曹株式会社东京研究中心健康管理中心采集。
[0233]
[表5]
[0234]
(表5)
[0235][0236]
将本实施例中使用的胃癌患者血清待检体的详情示于表6。胃癌患者血清从promeddx公司和bioivt公司购入。各公司的产品随附资料都明确记载了以经伦理委员会批准的方案收集。
[0237]
[表6]
[0238]
(表6)
[0239]
[0240]
利用表7中记载的6种夹心elisa测定了上述的血清待检体。
[0241]
[表7]
[0242]
(表7)
[0243][0244]
以下示出具体的方法。
[0245]
[1]在maxisorp 96孔微孔板(thermo fisher scientific制)中以50μl/孔添加用碳酸盐缓冲液(ph9.8)稀释至4μg/ml的表7所述的固相抗体，在4℃下放置一夜进行固相化。
[0246]
[2]用pbs进行3次清洗，以300μl/孔添加superblock(pbs)(thermo fisher scientific制)，在室温下放置1小时。
[0247]
[3]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa和0.05mg/ml异嗜性封闭试剂hbr1(scantibodies laboratory制)的pbs稀释5倍的血清待检体，在室温下放置2小时。
[0248]
[4]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释至2μg/ml的表7所述的生物素标记检测抗体，在室温下放置1小时。
[0249]
[5]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa的pbs稀释50000倍的streptavidin
‑
polyhrp40(stereospecific detection technologies制)，在室温下放置1小时。
[0250]
[6]用pbs进行3次清洗，以50μl/孔添加sureblue reserve tmb(seracare life sciences制)，在室温下放置10分钟。
[0251]
[7]以50μl/孔添加1mol/l磷酸水溶液，使反应停止。
[0252]
[8]通过光吸收酶标仪测定了450nm的吸光度。
[0253]
将6种夹心elisa的吸光度的箱形图示于图6～11。将6种夹心elisa中的健康人组和胃癌患者组的吸光度的最小值、25百分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的吸光度的范围、及曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表8。在任意的夹心elisa中，胃癌患者组与健康人组相比也显示出高值倾向，特别是在使用实施例15
‑
1、15
‑
2、15
‑
6所示的固相抗体和生物素标记抗体的组合的情况下，p＜0.05，观察到统计学上的显著差异。
[0254]
[表8]
[0255][0256]
[实施例16]健康人和胃癌患者的血清待检体的azu1测定(2)
[0257]
利用以下所示的夹心elisa测定了与实施例15中使用者相同的血清待检体。
[0258]
[1]在maxisorp 96孔微孔板(thermo fisher scientific制)中以50μl/孔添加用pbs稀释至4μg/ml的磷脂酰丝氨酸受体tim4
‑
hfc(fujifilm wako pure chemical corporation制)，在4℃下放置一夜进行固相化。
[0259]
[2]用pbs进行3次清洗，以300μl/孔添加superblock(pbs)(thermo fisher scientific制)，在室温下放置1小时。
[0260]
[3]用tbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa、2mm cacl2和0.05mg/ml异嗜性封闭试剂hbr1(scantibodies laboratory制)的tbs稀释5倍的血清待检体，在室温下放置2小时。
[0261]
[4]用包含2mm cacl2的tbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa和2mm cacl2的tbs稀释至2μg/ml的生物素标记抗azu1抗体(克隆1
‑
14)，在室温下放置1小时。
[0262]
[5]用包含2mm cacl2的tbs进行3次清洗，以50μl/孔添加用包含1％bsa和2mm cacl2的tbs稀释50000倍的streptavidin
‑
polyhrp40(stereospecific detection technologies制)，在室温下放置1小时。
[0263]
[6]用包含2mm cacl2的tbs进行3次清洗，以50μl/孔添加sureblue reserve tmb(seracare life sciences制)，在室温下放置10分钟。
[0264]
[7]以50μl/孔添加1mol/l磷酸水溶液，使反应停止。
[0265]
[8]通过光吸收酶标仪测定了450nm的吸光度。
[0266]
将吸光度的箱形图示于图12。将健康人组和胃癌患者组的吸光度的最小值、25百分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的吸光度的范围、及曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表9。胃癌患者组与健康人组相比显示出高值倾向，p＜0.05，观察到统计学上的显著差异。
[0267]
[表9]
[0268]
(表9)
[0269]
[比较例1]健康人和胃癌患者血清待检体的cea测定
[0270]
对于与实施例15和16中使用者相同的血清待检体，将全自动辅酶免疫法装置aia
‑
2000(东曹制)作为评价用装置，使用癌胚抗原cea测定试剂(东曹制、批准编号20100ezz00112000)测定了现有的作为代表性的胃癌标志物的cea。
[0271]
将测定值的箱形图示于图13。将健康人组和胃癌患者组的吸光度的最小值、25百
分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的吸光度的范围、及曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表10。
[0272]
[表10]
[0273]
(表10)
[0274][0275]
[实施例17]azu1与cea的胃癌检测性能的比较
[0276]
将基于实施例15～16、比较例1的测定结果的健康人组和胃癌患者组之间的受试者工作特征(roc)曲线解析的结果示于图14～21，将roc曲线下面积(auc)和95％置信区间内的auc的范围示于表11。实施例15
‑
1、15
‑
2、15
‑
5、15
‑
6、和16中，与cea相比auc上升，显示出具有优异的胃癌检测性能。
[0277]
[表11]
[0278]
(表11)
[0279][0280]
对于实施例15和16，将在roc曲线解析中由灵敏度+特异性
‑
1计算出的约登指数(youden index)达到最大的值设定为截止值，对于比较例1，将一般作为cea的基准值的5.0ng/ml设定为截止值，将这种情况下的灵敏度和特异性示于表12。实施例15
‑
1、15
‑
2、15
‑
6、和16中，与cea相比灵敏度上升，且特异性是同等的，显示出具有优异的胃癌检测性能。
[0281]
[表12]
[0282]
(表12)
[0283][0284]
[实施例18]乳腺癌患者血清待检体的测定
[0285]
本实施例中使用的健康人血清待检体与实施例15～16、比较例1中使用者相同。将本实施例中使用的乳腺癌患者血清待检体的详情示于表13。乳腺癌患者血清待检体均从promeddx公司购入，产品随附资料中明确记载了以经伦理委员会批准的方案收集。
[0286]
[表13]
[0287]
(表13)
[0288][0289]
利用表7的条件1～3中记载的夹心elisa测定了上述的待检体。具体的方法与实施例15同样。
[0290]
将吸光度的箱形图示于图22～24。将健康人组和乳腺癌患者组的吸光度的最小值、25百分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的吸光度的范围、及曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表14。在任意的夹心elisa中，乳腺癌患者组与健康人组相比均显示出高值倾向，p＜0.05，观察到统计学上的显著差异。
[0291]
[表14]
[0292][0293]
[实施例19]大肠癌患者血清待检体的测定
[0294]
本实施例中使用的健康人血清待检体与实施例15～16、比较例1中使用者相同。本
实施例中使用的大肠癌患者血清待检体的详情示于表15。大肠癌患者血清待检体均从promeddx公司购入，产品随附资料中明确记载了以经伦理委员会批准的方案收集。
[0295]
[表15]
[0296]
(表15)
[0297][0298]
利用表7的条件1～3中记载的夹心elisa测定了上述的待检体。具体的方法与实施例15同样。
[0299]
将吸光度的箱形图示于图25～27。将健康人组和大肠癌患者组的吸光度的最小值、25百分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的吸光度的范围、及曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表16。在任意的夹心elisa中，大肠癌患者组与健康人组相比均显示出高值倾向，特别是在使用实施例20
‑
1和20
‑
3所示的固相抗体和生物素标记抗体的组合的情况下p＜0.05，观察到统计学上的显著差异。
[0300]
[表16]
[0301][0302]
[实施例20]肺癌患者血清待检体的测定
[0303]
本实施例中使用的健康人血清待检体与实施例15～16、比较例1中使用者相同。本实施例中使用的肺癌患者血清待检体的详情示于表17。肺癌患者血清待检体均从promeddx
公司购入，产品随附资料中明确记载了以经伦理委员会批准的方案收集。
[0304]
[表17]
[0305]
(表17)
[0306][0307]
利用表7的条件1～3中记载的夹心elisa测定了上述的待检体。具体的方法与实施例15同样。
[0308]
将吸光度的箱形图示于图28～30。将健康人组和肺癌患者组的吸光度的最小值、25百分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的吸光度的范围、及曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表18。在任意的夹心elisa中，肺癌患者组与健康人组相比均显示出高值倾向，特别是在使用实施例20
‑
2所示的固相抗体和生物素标记抗体的组合的情况下p＜0.05，观察到统计学上的显著差异。
[0309]
[表18]
[0310][0311]
[实施例21]健康人和各种癌患者的血清待检体的游离azu1测定
[0312]
将本实施例中使用的血清待检体的详情示于表19。健康人血清待检体均得到东曹株式会社生物科学事业部伦理委员会的批准和待检体提供者的同意，并在东曹株式会社东
京研究中心健康管理中心进行采集。肺癌、大肠癌、乳腺癌和胃癌血清待检体均从promeddx公司和bioivt公司购入，各公司的产品随附资料都明确记载了以经伦理委员会批准的方案收集。
[0313]
[表19]
[0314]
(表19)
[0315][0316]
利用使用市售的azu1 elisa试剂盒(sino biological制、产品编号sek10660)的夹心elisa测定了上述的血清待检体中包含的游离azu1的浓度。需要说明的是，本实施例所测定的azu1是作为可溶性蛋白质存在的azu1和在细胞分泌微粒上存在的azu1这两者。
[0317]
以下示出具体的方法。
[0318]
[1]在maxisorp 96孔微孔板(thermo fisher scientific制)中以100μl/孔添加用pbs稀释至2μg/ml的兔子抗人azu1单克隆抗体，在4℃下放置一夜进行固相化。
[0319]
[2]用包含0.05％tween20的tbs进行3次清洗，以300μl/孔添加包含2％bsa和0.05％tween20的tbs，在室温下放置1小时。
[0320]
[3]用包含0.05％tween20的tbs进行3次清洗，以100μl/孔添加用包含0.1％bsa、0.05％tween20和0.05mg/ml异嗜性封闭试剂hbr1(scantibodies laboratory制)的tbs稀释10倍的血清待检体、或在前述的稀释液中添加重组人azu1而制备的已知浓度的标准试样，在室温下放置2小时。
[0321]
[4]用包含0.05％tween20的tbs进行3次清洗，以100μl/孔添加用包含0.5％bsa和0.05％tween20的tbs稀释至0.5μg/ml的hrp标记兔子抗人azu1多克隆抗体，在室温下放置1小时。
[0322]
[5]用包含0.05％tween20的tbs进行3次清洗，以200μl/孔添加sureblue reserve tmb(seracare life sciences制)，在室温下放置10分钟。
[0323]
[6]以50μl/孔添加1mol/l硫酸水溶液，使反应停止。
[0324]
[7]通过光吸收酶标仪测定了450nm的吸光度。
[0325]
[8]以重组azu1作为标准品制作标准曲线，计算出待检体中的游离azu1浓度。
[0326]
将血清待检体中包含的游离azu1浓度的箱形图示于图31。将健康人组和各种癌患者组的吸光度的最小值、25百分位数、中央值、75百分位数、最大值、95％置信区间内的游离azu1浓度的范围、及各癌种类组与健康人组进行比较时的曼
‑
惠特尼u检验的p值示于表20。任意的癌种类与健康人组相比均显示出高值倾向，p＜0.05，观察到统计学上的显著差异。
[0327]
[表20]
[0328]
(表20)
[0329][0330]
产业上的可利用性
[0331]
根据本发明，提供简便且高精度地检测癌的方法、及能用于前述方法的试剂。这些方法可以适宜地用于各种癌的筛选、治疗效果判定、和术后医学随访的用途，因此在产业上是非常有用的。