用于厌氧细菌发酵的方法和组合物与流程

用于厌氧细菌发酵的方法和组合物
1.相关申请的引用
2.本技术要求于2019年5月21日提交的美国临时专利申请号62/850,726和于2019年12月23日提交的美国临时专利申请号62/952,798的权益，其每一个的内容通过引用以其整体并入本文。


背景技术：

3.厌氧细菌是在氧气存在下生长不良(或不生长)的细菌。在人类的胃肠道中发现了许多类型的厌氧细菌。由于微生物培养方法通常发生在大气(有氧环境)中，因此厌氧细菌的培养可能具有挑战性，并且通常需要专门的设备和技术。例如，厌氧细菌可以在厌氧手套箱或其他特殊密封的充满氮气的容器中培养。然而，目前可用的技术不适用于治疗性微生物的商业生产所需的大规模培养。因此，厌氧细菌发酵的替代方法对于培养厌氧细菌是有用的，尤其是大规模培养。


技术实现要素：

4.厌氧细菌受益于在滞后期培养开始时存在的二氧化碳(co2)，但某些厌氧细菌菌株不需要co2来维持对数期的强劲生长。某些厌氧细菌株，例如本文所述的菌株，当在整个生长过程中提供co2时生长得更好(例如，与在对数期不提供co2时的生长速率相比)。例如，某些此类细菌在整个发酵过程中消耗co2。
5.在某些方面，与常规方法相比，本文所述的培养方法允许厌氧细菌菌株例如本文所述的菌株更好地生长。例如，在一些实施例中，本文所述的方法允许细菌生长至od超过4，例如超过10或超过20。例如，在一些实施例中，将约25％(例如，和约75％n2)而不是约5％(例如，和约95％n2)的co2喷射到生物反应器中允许将生物质产率增加约5倍。可以将co2引入气体混合物中；气体混合物还可以包括n2。
6.本文所述方法的某些实施例的关键特征是它们特别适用于大规模生产，例如在生物反应器中，例如在体积超过1l的容器中。随着培养体积的增加，仅仅向容器的顶部空间提供co2可能不足以在整个培养过程中提供足够的co2以实现最佳生长。在一些实施例中，通过在整个培养物中提供co2(例如，不只在顶部空间中提供co2)，细菌生长得到改善。在一些实施例中，可以在整个培养物中提供co2，例如通过将co2喷射/鼓泡到培养物中；通过每隔一段时间(例如，每隔30分钟或一小时)向培养物中注入大剂量co2；和/或通过向培养物中加入碳酸盐或碳酸氢盐。可用于本文提供的实施例中的碳酸盐包括例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钡、碳酸、菱镁矿(碳酸镁)、过碳酸钠(与过氧化氢的加合物)和碳酸钙。可用于本文提供的实施例中的碳酸氢盐包括例如碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、碳酸氢镁和碳酸氢铵。碳酸盐或碳酸氢盐可以以例如0.5g/l至10g/l，例如0.5至1g/l、1至5g/l、2至8g/l、约0.5g/l、约1g/l、约5g/l、约10g/l的浓度使用。在某些实施例中，碳酸盐或碳酸氢盐可用作co2的替代或另外来源(例如，通过添加盐，可使用较低百分比的co2但仍实现与使用较高百分比的co2时相同的生长益处)。例如，在一些实施例中，细菌可以在生物反应器中生长，其中约25％的
co2(例如，约75％的n2)被喷射到培养物中；可以获得相似的产率，例如，在生物反应器中培养细菌，在该生物反应器中加入碳酸氢钠(例如，0.5-1g/l)，向其中喷射约5％co2(例如，约95％n2)。
7.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括在包含碳酸盐的生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，是碳酸钠、碳酸钾、碳酸钡、碳酸、菱镁矿(碳酸镁)、过碳酸钠(与过氧化氢的加合物)或碳酸钙。在一些实施例中，碳酸盐的浓度为0.5g/l至10g/l。在一些实施例中，碳酸盐的浓度为0.5至1g/l、1至5g/l或2至8g/l。在一些实施例中，碳酸盐的浓度为约0.5g/l、约1g/l、约5g/l或约10g/l。
8.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括在包含碳酸氢盐的生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，碳酸氢盐是碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、碳酸氢镁或碳酸氢铵。在一些实施例中，碳酸氢盐的浓度为0.5g/l至10g/l。在一些实施例中，碳酸氢盐的浓度为0.5至1g/l、1至5g/l或2至8g/l。在一些实施例中，碳酸氢盐的浓度为约0.5g/l、约1g/l、约5g/l或约10g/l。
9.在某些方面，本文提供了用于培养厌氧细菌的改进的组合物和方法。例如，在一些实施例中，与常规厌氧培养条件(例如，在大于1％co2水平下，例如，在大于5％co2水平下，例如在约25％co2水平下)相比，本文提供了在包含较大水平co2的厌氧条件下培养厌氧细菌的方法。在某些实施例中，与常规厌氧培养条件(例如，在大于1％co2水平下，例如在约25％co2水平下)相比，本文提供了包含在包含较大水平co2的条件下培养的厌氧细菌的生物反应器。在一些实施例中，与常规培养条件相比，本文提供的方法和组合物导致细菌产量增加。
10.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在包含co2的厌氧气氛下在生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧气氛包含大于1％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、或至少25％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少10％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从10％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、或约40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约25％co2。
11.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在生物反应器中培养厌氧细菌，气体混合物中的co2被引入到该生物反应器的培养物中。在一些实施例中，气体混合物包含大于1％co2。在一些实施例中，气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，气体混合物包含至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、或至少25％co2。在一
些实施例中，气体混合物包含至少8％co2。在一些实施例中，气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，气体混合物包含8％至40％co2。在一些实施例中，气体混合物包含至少10％co2。在一些实施例中，气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，气体混合物包含10％至40％co2。在一些实施例中，气体混合物包含20％至30％co2。在一些实施例中，气体混合物包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％co2。在一些实施例中，气体混合物包含约25％co2。
12.在某些方面，与常规厌氧培养条件(例如，在小于95％n2水平下，例如，在小于90％n2水平下，例如在约75％n2水平下)相比，本文提供了在包含较低水平n2的厌氧条件下培养厌氧细菌的方法。在某些实施例中，与常规厌氧培养条件(例如，在低于95％n2水平下，例如在约75％n2水平下)相比，本文提供了包含在包含较低水平n2的条件下培养的厌氧细菌的生物反应器。在一些实施例中，与常规培养条件相比，本文提供的方法和组合物导致细菌产量增加。
13.在某些方面，本文提供了在厌氧条件下培养厌氧细菌的方法，这些方法包括引入包含与常规厌氧培养条件相比更低水平的n2的气体混合物(例如，小于95％n2的气体混合物，例如小于90％n2，约75％n2)。在某些实施例中，本文提供了包含在以下条件下培养的厌氧细菌的生物反应器，这些条件包括引入包含与常规厌氧培养条件相比较低水平的n2的气体混合物(例如，小于95％n2如约75％n2的气体混合物)。在一些实施例中，与常规培养条件相比，本文提供的方法和组合物导致细菌产量增加。在一些实施例中，气体混合物包含不超过75％、不超过76％、不超过77％、不超过78％、不超过79％、不超过80％、不超过81％、不超过82％、不超过83％、不超过84％、不超过85％、不超过86％、不超过87％、不超过88％、不超过89％、不超过90％、不超过91％、不超过92％、不超过93％或不超过94％n2。在一些实施例中，气体混合物包含75％至94％n2。在一些实施例中，气体混合物包含约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％或约94％n2。
14.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在包含n2的厌氧气氛下在生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于95％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于90％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从65％至85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从70％至80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约75％n2。
15.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在生物反应器中培养厌氧细菌，该生物反应器中引入了包含n2的厌氧气体混合物。在一些实施例中，气体混合物包含小于95％n2。在一些实施例中，气体混合物包含小于90％n2。在一些实施例中，气体混合
物包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，气体混合物包含小于85％n2。在一些实施例中，气体混合物包含小于80％n2。在一些实施例中，气体混合物包含65％至85％n2。在一些实施例中，气体混合物包含70％至80％n2。在一些实施例中，气体混合物包含约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，气体混合物包含约75％n2。
16.在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约30％co2和约70％n2。
17.在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用包含大于1％co2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；b)在步骤a)中吹扫的生物反应器中培养厌氧细菌。在某些实施例中，在步骤b)期间将厌氧气体混合物添加到生物反应器中。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、或至少25％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约25％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约100％co2。
18.在某些方面，本文提供了培养厌氧细菌的方法，此方法包括以下步骤：a)用包含小于95％n2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；b)在步骤a)中吹扫的生物反应器中培养厌氧细菌。在某些实施例中，在步骤b)期间将厌氧气体混合物添加到生物反应器中。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于85％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于80％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含65％至85％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含70％至80％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约75％n2。
19.在一些实施例中，厌氧气体混合物基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约30％co2和约70％n2。
20.在一些实施例中，本文提供的方法进一步包括用厌氧细菌接种生长培养基的步
骤，其中根据本文提供的方法在生长培养基中培养细菌。在一些实施例中，接种的厌氧细菌的体积在生长培养基的0.01％和10％v/v之间(例如，生长培养基的约0.1％v/v、生长培养基的约0.5％v/v、生长培养基的约1％v/v、生长培养基约5％v/v)。
21.在一些实施例中，生长培养基是至少约1l体积、至少约5l体积、至少约10l体积、至少约15l体积、至少约20l体积、至少约30l体积、至少约40l体积、至少约50l体积、至少约100l体积、至少约200l体积、至少约250l体积、至少约500l体积、至少约750l体积、至少约1000l体积、至少约1500l体积、至少约2000l体积、至少约2500l体积、至少约3000l体积、至少约3500l体积、至少约4000l体积、至少约5000l体积、至少约7500l体积、至少约10,000l体积、至少约15,000l体积、至少约20,000l体积、至少约50,000l体积、至少约100,000l体积、至少约150,000l体积、至少约200,000l体积、至少约250,000l体积、至少约300,000l体积、至少约350,000l体积、至少约400,000l体积、或至少约500,000l体积。
22.在一些实施例中，厌氧细菌培养至少5小时(例如，至少10小时)。在一些实施例中，厌氧细菌培养10-24小时。在一些实施例中，厌氧细菌培养14至16小时。在一些实施例中，方法进一步包括在生长培养基中接种约5％v/v的经培养的细菌的步骤。在一些实施例中，生长培养基体积为约20l。在一些实施例中，厌氧细菌培养10-24小时。在一些实施例中，厌氧细菌培养12-14小时。在一些实施例中，培养厌氧细菌至少直到达到生长稳定期。
23.在一些实施例中，厌氧细菌在35℃至42℃的温度培养。在一些实施例中，厌氧细菌在35℃至39℃的温度培养。在一些实施例中，厌氧细菌在约37℃的温度培养。在一些实施例中，厌氧细菌在5.5至7.5的ph培养。在一些实施例中，厌氧细菌在约6.5的ph培养。
24.在一些实施例中，厌氧细菌在生物反应器中培养。在一些实施例中，培养厌氧细菌包括以50至1000的rpm搅拌培养物。在一些实施例中，培养厌氧细菌包括以100至700的rpm搅拌培养物。在一些实施例中，培养厌氧细菌包括以50至300的rpm搅拌培养物。在一些实施例中，厌氧细菌以约150的rpm搅拌。
25.在一些实施例中，在培养过程中将厌氧气体混合物连续添加到生物反应器中。在一些实施例中，以0.01至1vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以0.01至0.1vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以0.02vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，在培养期间连续添加co2。在一些实施例中，以0.002vvm至0.1vvm的速率添加co2。在一些实施例中，以约0.002vvm的速率添加co2。在一些实施例中，以约0.02vvm的速率添加co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、或至少25％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含至少8％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从8％至40％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含至少10％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从10％至40％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含20％至30％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、
约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含约25％co2。
26.在一些实施例中，在培养过程中将厌氧气体混合物连续添加到生物反应器中。在一些实施例中，以0.01至0.1vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以约0.02vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，在培养期间连续添加co2。在一些实施例中，以0.002vvm至0.1vvm的速率添加co2。在一些实施例中，以约0.002vvm的速率添加co2。在一些实施例中，以约0.02vvm的速率添加co2。在一些实施例中，以约0.007vvm的速率添加co2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于85％n2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含小于80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从65％至85％n2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含70％至80％n2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含约75％n2。
27.在一些实施例中，厌氧气氛基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，连续添加的厌氧气体混合物包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约30％co2和约70％n2。
28.在本文提供的方法的某些实施例中，本文中厌氧细菌在加压生物反应器中培养。在一些实施例中，生物反应器被加压到至少100,000帕斯卡。在一些实施例中，生物反应器被加压到至少100,000帕斯卡、125,000帕斯卡、150,000帕斯卡、175,000帕斯卡、200,000帕斯卡或225,000帕斯卡。在一些实施例中，生物反应器被加压至最多2,225,000帕斯卡。在一些实施例中，生物反应器被加压至最多2,000,000帕斯卡、2,025,000帕斯卡、2,050,000帕斯卡、2,075,000帕斯卡、2,100,000帕斯卡、2,150,000帕斯卡、2,200,000帕斯卡、或2,225,000帕斯卡。在一些实施例中，生物反应器被加压到约100,000帕斯卡至约2,100,000帕斯卡。在一些实施例中，生物反应器从约101,325帕斯卡加压至约2,026,500帕斯卡。通常，但绝不希望受理论束缚，在增加的压力下操作允许co2从气相转移到液相的速率显著增加。
29.在某些实施例中，本文提供的方法包括将气体引入具有扩散喷射器的生物反应器。在一些实施例中，用热压结喷射器或多孔喷射器引入气体。在其他实施例中，气体通过多孔板或其他设备引入以引入微泡。通常，但决不希望受理论束缚，引入更小且更扩散的气泡允许co2从气相转移到液相的速率显著增加。
30.在一些实施例中，厌氧细菌在生长培养基中培养。在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、麦芽糖糊精(例如葡糖葡聚糖，例如glucidex 21d)、葡萄糖和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨
a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含约1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含约0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含20g/l至30g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含约25g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含约0.02g/l血红蛋白。
31.在一些实施例中，厌氧细菌在生长培养基中培养。在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、葡萄糖和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含约1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含约0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含约0.02g/l血红蛋白。
32.在一些实施例中，厌氧细菌在生长培养基中培养。在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、麦芽糖糊精(例如葡糖葡聚糖，例如glucidex 21d)和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含约1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含约0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨
酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含20g/l至30g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含约25g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含约0.02g/l血红蛋白。
33.在一些实施例中，方法进一步包括收获培养的细菌的步骤(例如，当达到生长稳定期时)。在一些实施例中，方法进一步包括在收获后离心经培养的细菌的步骤(例如，以产生细胞糊)。在一些实施例中，方法进一步包括用稳定剂溶液稀释细胞糊以产生细胞浆液。在一些实施例中，方法进一步包括冻干细胞浆液的步骤以产生粉末的步骤。在一些实施例中，方法进一步包括用γ辐照照射粉末。
34.在某些方面，本文提供在包含至少约1％co2的厌氧气氛下包含厌氧细菌的生物反应器。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、或至少25％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少10％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从10％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约25％co2。
35.在某些方面，本文提供在包含小于95％n2的厌氧气氛下包含厌氧细菌的生物反应器。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于90％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含小于80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从65％至85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从70％至80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约75％n2。
36.在一些实施例中，厌氧气氛基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，厌氧气氛包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约30％co2和约70％n2。
37.在一些实施例中，生物反应器是至少约1l体积、至少约5l体积、至少约10l体积、至少约15l体积、至少约20l体积、至少约30l体积、至少约40l体积、至少约50l体积、至少约100l体积、至少约200l体积、至少约250l体积、至少约500l体积、至少约750l体积、至少约1000l体积、至少约1500l体积、至少约2000l体积、至少约2500l体积、至少约3000l体积、至
少约3500l体积、至少约4000l体积、至少约5000l体积、至少约7500l体积、至少约10,000l体积、至少约15,000l体积、至少约20,000l体积、至少约30,000l体积、至少约50,000l体积、至少约100,000l体积、至少约150,000l体积、至少约200,000l体积、至少约250,000l体积、至少约300,000l体积、至少约350,000l体积、至少约400,000l体积、至少约450,000l体积或至少约500,000l体积。在一些实施例中，生物反应器是约20l生物反应器、约3500l生物反应器、约20,000l生物反应器、约50,000l生物反应器、约100,000l生物反应器、约200,000l生物反应器、约300,000l生物反应器、约400,000l生物反应器或约500,000l生物反应器。在一些实施例中，生物反应器是约20l生物反应器、约3500l生物反应器、约20,000l生物反应器或约400,000l生物反应器。
38.在所有规模上，co2的传质都很重要，并由多种因素决定。例如，co2的传质可以通过其他因素调节，包括但不限于增加气体流量、增加气体中co2的浓度、增加培养基搅拌、搅拌器几何形状、反应器几何形状以及使用闪烁器或其他装置产生更小的co2气泡。可替代地，可以在培养物生长之前或期间添加碳酸氢盐或其他co2来源。在某些实施例中，特定于容器硬件/配置的组合可用于优化生长。
39.在一些实施例中，生物反应器进一步包含生长培养基。在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、麦芽糖糊精(例如葡糖葡聚糖，例如glucidex 21d)、葡萄糖和血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含约1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含约0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含约0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含20g/l至30g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含约25g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含约0.02g/l血红蛋白。
40.在一些实施例中，厌氧细菌在生长培养基中培养。在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、葡萄糖和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含约10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含约12.5g/l大豆蛋白胨
intermedia)、小斑点普雷沃菌(prevotella maculosa)、马斯普雷沃菌(prevotella marshii)、产黑普雷沃菌(prevotella melaninogenica)、彩虹普雷沃菌(prevotella micans)、多形普雷沃菌(prevotella multiformis)、变黑普雷沃菌(prevotella nigrescens)、口腔普雷沃菌(prevotella oralis)、口普雷沃菌(prevotella oris)、龈炎普雷沃菌(prevotella oulorum)、苍白普雷沃菌(prevotella pallens)、唾液普雷沃菌(prevotella salivae)、斯特塞拉普雷沃菌(prevotella stercorea)、坦纳普雷沃菌(prevotella tannerae)、蒂莫普雷沃菌(prevotella timonensis)、空肠普雷沃菌(prevotella jejuni)、橙色普雷沃菌(prevotella aurantiaca)、保氏普雷沃菌(prevotella baroniae)、着色普雷沃菌(prevotella colorans)、人体普雷沃菌(prevotella corporis)、丹塔普雷沃菌(prevotella dentasini)、栖居普雷沃菌(prevotella enoeca)、斐氏普雷沃菌(prevotella falsenii)、深黑色普雷沃菌(prevotella fusca)、解肝素普雷沃菌(prevotella heparinolytica)、洛氏普雷沃菌(prevotella loescheii)、嗜糖普雷沃菌(prevotella multisaccharivorax)、南锡普雷沃菌(prevotella nanceiensis)、稻普雷沃菌(prevotella oryzae)、沼泽普雷沃菌(prevotella paludivivens)、胸膜炎普雷沃菌(prevotella pleuritidis)、栖瘤胃普雷沃菌(prevotella ruminicola)、解糖普雷沃菌(prevotella saccharolytica)、靶心普雷沃菌(prevotella scopos)、赛赫普雷沃菌(prevotella shahii)、动胶普雷沃菌(prevotella zoogleoformans)或真空腔普雷沃菌(prevotella veroralis)。
44.在一些实施例中，普雷沃菌为普雷沃菌菌株b 50329(nrrl登录号b 50329)。在一些实施例中，普雷沃菌菌株为包含与普雷沃菌菌株b 50329的核苷酸序列(例如基因组序列、16s序列、crispr序列)有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
45.在一些实施例中，该普雷沃菌属细菌是包含表1中所列的蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，该普雷沃菌属细菌是不含或基本上不含表2中所列的蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌属细菌的菌株。
46.在一些方面，本文提供稳定细菌组合物的稳定剂以及制备和使用此类稳定剂的方法。在一些实施例中，稳定剂包含蔗糖、葡聚糖40k、半胱氨酸hcl和水中的至少一种。在一些实施例中，稳定剂包含蔗糖(例如，约200g/kg蔗糖)、葡聚糖40k(例如，约200g/kg葡聚糖40k)、半胱氨酸hcl(约4g/kg半胱氨酸hcl)和水(例如，约596g/kg水)。
47.在一些方面，本文提供了包含本文提供的稳定剂和细菌(例如本文公开的普雷沃菌属菌株)的细菌组合物及其制备方法。在一些实施例中，细菌组合物包含蔗糖、葡聚糖40k和半胱氨酸hcl。在一些实施例中，细菌组合物包含1.5％蔗糖、1.5％葡聚糖40k和0.03％半胱氨酸hcl。在某些实施例中，细菌组合物通过将细菌与一定百分比的在液体悬浮液中的稳定剂组合和混合来制备。在一些实施例中，用于与细菌混合的稳定剂溶液的百分比为约10％。在一些实施例中，细菌组合物中的细菌是厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧细菌是栖组织普雷沃菌。在一些这样的实施例中，厌氧细菌是栖组织普雷沃菌菌株b50329。在一些实
施例中，细菌组合物被冻干以形成粉末。
附图说明
48.图1是厌氧细菌(包括例如栖组织普雷沃菌)的示例性制造过程的示意图。
49.图2是本文描述的示例性制造过程的示意图。
50.图3是显示95％n2、5％co2气体(0.1vvm对0.02vvm)的喷射(鼓泡)速率降低导致栖组织普雷沃菌菌株b 50329厌氧细菌生长潜力降低的图。(vvm代表气体体积/体积容器/分钟)。
51.图4是显示co2的存在是启动栖组织普雷沃菌菌株b 50329生长所必需的，以及不同数量的co2(0％、5％、25％、100％)对栖组织普雷沃菌生长潜力的影响。(vvm代表气体体积/体积容器/分钟)。
52.图5是显示栖组织普雷沃菌菌株b 50329消耗co2的图。
53.图6是显示麦芽糖糊精与葡萄糖的组合比单独的葡萄糖能更好地支持栖组织普雷沃菌菌株b 50329的生长的图。
具体实施方式
54.定义
55.如本文所使用的，“厌氧条件”是与正常大气条件相比具有降低的氧水平的条件。例如，在一些实施例中，厌氧条件是其中氧水平是氧分压(po2)不超过8％的条件。在一些情况下，厌氧条件是其中po2不超过2％的条件。在一些情况下，厌氧条件是其中po2不超过0.5％的条件。在某些实施例中，厌氧条件可以通过用除了氧以外的气体(例如，氮气和/或二氧化碳(co2))吹扫生物反应器和/或培养瓶来实现。
56.术语“降低”或“消耗”意指变化，从而治疗后与治疗前状态相比的差异(视情况而定)为至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1/100、1/1000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或不可检测。
57.如本文中所使用，“工程改造的细菌”是通过人类为干预已在遗传上自天然状态改变的任何细菌及任何这类细菌的继代。工程改造的细菌包括例如靶向遗传修饰的产物、随机诱变筛选的产物及定向演化的产物。
58.术语“基因”在广义上用于指与生物功能有关的任一核酸。术语“基因”适用于特定基因组序列以及由基因组序列编码的cdna或mrna。
59.两种核酸分子的核酸序列间“同一性”可使用已知计算机算法(诸如“fasta”程序)使用(例如)如pearson等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85:2444中的预设参数测定为同一性百分比(其他程序包含gcg程序包(devereux，j.等人，nucleic acids research[核酸研究]12(i):387(1984))、blastp、blastn、fasta atschul，s.f.等人，j molec biol[分子生物学杂志]215:403(1990)；guide to huge computers[巨型计算机指南]，martin j.bishop编辑，academic press[学术出版社]，san diego[圣地亚哥]，1994及carillo等人(1988)siam j applied math[工业和应用数学学会应用数学杂志]48:1073)。例如，可使用国家生物技术信息中心数据库(national center for biotechnology information database)的blast功能来测定同一性。其他可商业或公开获
得的程序包含dnastar“megalign”程序(威斯康星州麦迪逊市(madison，wis.))及威斯康星大学遗传学计算机集团(university of wisconsin genetics computer group)(uwg)“gap”程序(威斯康星州麦迪逊市(madison，wis.))。
[0060]
术语“增加”意指变化，从而治疗后与治疗前状态相比的差异(视情况而定)为至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、4倍、10倍、100倍、10^3倍、10^4倍、10^5倍、10^6倍和/或10^7倍。可增加的性质包含免疫细胞、细菌细胞、基质细胞、髓源性抑制细胞、成纤维细胞、代谢物及细胞因子。
[0061]“运算分类单元”及“otu”是指系统发生树中的末端叶且通过核酸序列(例如整个基因组或特定基因序列及所有与此核酸序列在物种层面共享序列同一性的序列)来定义。在一些实施例中，特定基因序列可为16s序列或16s序列的一部分。在其他实施例中，对两种实体的整个基因组进行测序并进行比较。在另一个实施例中，可以基因方式比较所选区域(例如多基因座序列标签(mlst)、特定基因或基因集)。对于16s而言，整个16s或一些16s可变区中共有≥97％平均核苷酸同一性的otu可视为相同otu。参见，例如，claesson mj、wang q、o’sullivan o、greene-diniz r、cole jr、ross rp及o’toole pw.2010年。comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16s rrna gene regions[使用串联可变16s rrna基因区解析高度复杂的微生物群组成的两种下一代测序技术的比较].nucleic acids res[核酸研究]38:e200.konstantinidis kt，ramette a及tiedje jm.2006年。the bacterial species definition in the genomic era[基因组时代的细菌物种类定义].philos trans r soc lond b biol sci[伦敦皇家学会b辑：生物科学哲学学报]361:1929-1940。对于完整基因组、mlst、特定基因(除16s外)或基因集而言，共有≥95％平均核苷酸同一性的otu可视为相同otu。例如参见achtman m及wagner m.2008.microbial diversity and the genetic nature of microbial species[微生物多样性和微生物物种的遗传性质].nat.rev.microbiol.[微生物自然评论]6:431
–
440.konstantinidis kt，ramette a及tiedje jm.2006年。the bacterial species definition in the genomic era[基因组时代的细菌物种类定义].philos trans r soc lond b biol sci[伦敦皇家学会b辑：生物科学哲学学报]361:1929-1940。通常通过比较生物体之间的序列来定义otu。通常，具有小于95％序列同一性的序列并不视为形成相同otu的一部分。还可通过核苷酸标志或基因、尤其高度保守基因(例如“管家”基因)或其组合的任一组合来表征otu。本文提供可分配(例如)属、物种及系统发育进化枝的运算分类单元(otu)。
[0062]“菌株”是指具有基因签名的细菌物种的成员，从而其可与相同细菌物种的密切相关成员区分开来。基因签名可为不存在至少一种基因的全部或一部分、不存在至少一个调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)的全部或一部分、不存在(“消除”)至少一种天然质粒、存在至少一种重组基因、存在至少一种突变基因、存在至少一种外来基因(衍生自另一物种的基因)、存在至少一种突变调控区(例如启动子、终止子、核糖开关、核糖体结合位点)、存在至少一种非天然质粒、存在至少一种抗生素抗性盒或其组合。可通过pcr扩增且任选地随后进行一个或多个目的基因组区域或全基因组的dna测序来鉴别不同菌株之间的基因签名。如果一种菌株(与相同物种的另一种菌株相比)已获得或失去抗生素抗性或获得或失去生物合成能力(例如营养缺陷型菌株)，则可通过选择或反选择分别使用
抗生素或营养物/代谢物来区分菌株。
[0063]
制造过程
[0064]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在包含co2(例如，大于1％co2(例如，大于5％co2))的厌氧气氛下在生物反应器中培养厌氧细菌。在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在生物反应器中培养厌氧细菌，向该生物反应器中引入包含co2(例如，大于1％co2(例如，大于5％co2))的气体混合物。在一些实施例中，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用包含大于1％co2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；并且b)在步骤a)中吹扫的生物反应器中培养厌氧细菌(例如，当将包含大于1％co2的气体混合物引入生物反应器时)。
[0065]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在包含n2(例如，小于95％n2(例如，小于90％n2))的厌氧气氛下在生物反应器中培养厌氧细菌。在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在生物反应器中培养厌氧细菌，向该生物反应器中引入包含n2(例如，小于95％n2(例如，小于90％n2))的气体混合物。在一些实施例中，本文提供了培养厌氧细菌的方法，此方法包括以下步骤：a)用包含小于95％n2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；并且b)在步骤a)中吹扫的生物反应器中培养厌氧细菌(例如，当将包含小于95％n2的气体混合物引入生物反应器时)。
[0066]
提供根据本文提供的某些实施例的示例性制造方法的示意图示于图1和2中。
[0067]
在某些实施例中，根据本文提供的方法培养厌氧细菌导致厌氧细菌的产率提高。在某些实施例中，产率提高了至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍或3.0倍。在一些实施例中，产率提高了1.5倍至4.0倍之间的倍数。在一些实施例中，产率提高了2倍至3倍之间的倍数。
[0068]
在一些实施例中，本文提供的方法减少厌氧细菌培养物的污染。例如，本文提供的方法可以防止厌氧细菌培养物中污染物的生长或过度生长。污染物可以包括例如存在于气流或气流中的细菌菌株和/或环境菌株，例如存在于制造设施中。
[0069]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在包含co2的厌氧气氛下在生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧气氛包含大于1％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少10％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从10％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含从20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约25％co2。
[0070]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，这些方法包括在生物反应器中培养厌氧细菌，该生物反应器中引入了包含co2的厌氧气体混合物。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于1％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少约2％、约3％、约4％、
约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、或约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约100％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少10％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含10％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约25％co2。
[0071]
在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含小于95％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含小于85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含小于80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含65％至85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含70％至80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含约75％n2。
[0072]
在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约30％co2和约70％n2。
[0073]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括以下步骤：a)用包含大于1％co2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；b)在步骤a)中吹扫的生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，该方法包括在步骤b)期间将厌氧气体混合物引入生物反应器中。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于1％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含从5％至35％co2、10％至40％co2、10％至30％co2、15％至30％co2、20％至30％co2、22％至28％co2、或24％至26％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少10％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含10％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约25％co2。在一些实施例中，在培养期间连续添加co2气体。
[0074]
在某些方面，本文提供了培养厌氧细菌的方法，此方法包括以下步骤：a)用包含小于95％n2的厌氧气体混合物吹扫生物反应器；b)在步骤a)中吹扫的生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，该方法包括在步骤b)期间将厌氧气体混合物引入生物反应器中。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于95％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于95％、小于92％、小于90％、小于87％、小于85％、小于82％、小于80％、小于77％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于95％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于90％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含65％至85％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含从70％至80％n2co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约75％n2。
[0075]
在一些实施例中，厌氧气体混合物基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛包含约30％co2和约70％n2。
[0076]
在一些实施例中，厌氧气体混合物包含co2和n2，co2比n2比率是约1:99、约2:98、约3:97、约4:96、约5:95、约6:94、约7:93、约8:92、约9:91、约10:90、11:89、约12:88、约13:87、约14:86、约15:85、约16:84、约17:83、约18:82、约19:81、约20:80、21:79、约22:78、约23:77、约24:76、约25:75、约26:74、约27:73、约28:72、约29:71、约30:70、31:69、约32:68、约33:67、约34:66、约35:65、约36:64、约37:63、约38:62、约39:61、或约40:50。
[0077]
在一些实施例中，在培养过程中将厌氧气体混合物连续添加到生物反应器中。在一些实施例中，以0.001至0.1vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以约0.001、约0.002、约0.003、约0.004、约0.005、约0.006、约0.007、约0.008、约0.009、约0.01、约0.011、约0.012、约0.013、约0.014、约0.015、约0.016、约0.017、约0.018、约0.019、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以0.02vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，以约0.002vvm的速率添加连续添加的厌氧气体混合物。在一些实施例中，在培养过程中将co2气体连续添加到生物反应器中。在一些实施例中，以0.001至0.1vvm的速率添加连续添加co2气体。在一些实施例中，以约0.001、约0.002、约0.003、约0.004、约0.005、约0.006、约0.007、约0.008、约0.009、约0.01、约0.011、约0.012、约0.013、约0.014、约0.015、约0.016、约0.017、约0.018、约0.019、约0.02、约0.03、约0.04、约0.05、约0.06、约0.07、约0.08、约0.09或约0.1vvm的速率添加连续添加的co2气体。在一些实施例
中，以约0.02vvm的速率添加连续添加的co2气体。在一些实施例中，以约0.007vvm的速率添加连续添加的co2。在一些实施例中，以约0.1vvm的速率添加co2。
[0078]
在某些方面，本文提供生物反应器，该生物反应器在包含至少约1％co2的厌氧气氛下包含厌氧细菌和/或向其中添加包含至少约1％co2的厌氧气体混合物。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含大于5％co2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含至少8％co2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含至少20％co2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含8％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含10％至40％co2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含20％至30％co2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约25％co2。
[0079]
在某些方面，本文提供生物反应器，该生物反应器在包含小于95％n2的厌氧气氛下包含厌氧细菌和/或向其中添加包含小于约95％n2的厌氧气体混合物。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含小于90％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含小于85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含65％至85％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含70％至80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或厌氧气体混合物包含约75％n2。
[0080]
在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物基本上由co2和n2组成。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约25％co2和约75％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约20％co2和约80％n2。在一些实施例中，厌氧气氛和/或气体混合物包含约30％co2和约70％n2。在一些实施例中，生物反应器是至少1l、20l、3500l、20,000l、50,000l、100,000l、200,000l、300,000l、400,000l或500,000l。
[0081]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括在包含碳酸盐的生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，是碳酸钠、碳酸钾、碳酸钡、碳酸、菱镁矿(碳酸镁)、过碳酸钠(与过氧化氢的加合物)或碳酸钙。在一些实施例中，碳酸盐的浓度为0.5g/l至10g/l。在一些实施例中，碳酸盐的浓度为0.5至1g/l、1至5g/l或2至8g/l。在一些实施例中，碳酸盐的浓度为约0.5g/l、约1g/l、约5g/l或约10g/l。在一些实施例中，生物反应器是至少1l、20l、3500l、20,000l、50,000l、100,000l、200,000l、300,000l、400,000l或500,000l。
[0082]
在某些方面，本文提供培养厌氧细菌的方法，该方法包括在包含碳酸氢盐的生物反应器中培养厌氧细菌。在一些实施例中，碳酸氢盐是碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、碳酸氢镁或碳酸氢铵。在一些实施例中，碳酸氢盐的浓度为0.5g/l至10g/l。在一些实施例中，碳酸氢盐的浓度为0.5至1g/l、1至5g/l或2至8g/l。在一些实施例中，碳酸氢盐的浓度为约0.5g/l、约1g/l、约5g/l或约10g/l。在一些实施例中，生物反应器是至少1l、20l、3500l、20,000l、50,000l、100,000l、200,000l、300,000l、400,000l或500,000l。
[0083]
在一些实施例中，本文提供的方法和组合物包括在生长培养基中培养厌氧细菌。在一些实施例中，生长培养基可以含有糖、酵母提取物、基于植物的蛋白胨、缓冲液、盐、微量元素、表面活性剂、消泡剂和/或维生素。
[0084]
生长培养基中存在的糖源会影响生长。例如，使用麦芽糖糊精(例如，glucidex，例如，glucidex 21d)可以提供比使用葡萄糖更好的生长，例如在每种糖源的相同浓度下，例如约10g/l。可替代地，麦芽糖糊精和葡萄糖两者用于生长培养基，例如，葡萄糖为10g/l，麦芽糖糊精为25g/l。例如，使用麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)和葡萄糖可
以提供比单独使用葡萄糖更好的生长，例如在相同的总浓度下，例如约35g/l总糖。在一些实施例中，生长培养基包含葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含麦芽糖糊精。在一些实施例中，生长培养基包含葡萄糖和麦芽糖糊精。
[0085]
在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、麦芽糖糊精(例如葡糖葡聚糖，例如glucidex 21d)、葡萄糖和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，该生长培养基包含0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含20g/l至30g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含25g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含0.02g/l血红蛋白。
[0086]
在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、葡萄糖和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，该生长培养基包含0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l葡萄糖。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含0.02g/l血红蛋白。
[0087]
在一些实施例中，生长培养基包含酵母提取物、大豆蛋白胨a2sc 19649、大豆蛋白胨e110 19885、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、l-半胱氨酸-hcl、氯化铵、麦芽糖糊精(例如葡糖葡聚糖，例如glucidex 21d)和/或血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含5g/l至15g/l酵母提取物19512。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l酵母提取物19512。在一些实施
例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含12.5g/l大豆蛋白胨a2sc 19649。在一些实施例中，生长培养基包含10g/l至15g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含12.5g/l大豆蛋白胨e110 19885。在一些实施例中，生长培养基包含1g/l至2g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含1.59g/l磷酸氢二钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l至1.5g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.91g/l磷酸二氢钾。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，该生长培养基包含0.5g/l l-半胱氨酸-hcl。在一些实施例中，生长培养基包含0.1g/l至1.0g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含0.5g/l氯化铵。在一些实施例中，生长培养基包含20g/l至30g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含25g/l麦芽糖糊精(例如glucidex，例如glucidex 21d)。在一些实施例中，生长培养基包含0.01g/l至0.05g/l血红蛋白。在一些实施例中，生长培养基包含0.02g/l血红蛋白。
[0088]
在一些实施例中，将培养基灭菌。可以通过超高温(uht)处理、高压灭菌或过滤进行灭菌。在极高温下实施短时间段的uht处理。uht范围可为135℃-180℃。例如，可在135℃下将培养基灭菌10至30秒。
[0089]
在一些实施例中，接种物可以在监测生长的烧瓶或较小生物反应器中制备。例如，接种物大小可以是总生物反应器体积的大约0.1％v/v至5％v/v之间。在一些实施例中，接种物是总生物反应器体积的0.1％-3％v/v、0.1％-1％v/v、0.1％-0.5％v/v、或0.5％-1％v/v。在一些实施例中，接种物是总生物反应器体积的0.1％v/v、0.2％v/v、0.3％v/v、0.4％，v/v、0.5％v/v、0.6％v/v、0.7％v/v、0.8％v/v、0.9％v/v、1％v/v、1.5％v/v、2％v/v、2.5％v/v、3％v/v、4％v/v或5％v/v。
[0090]
根据应用和材料需要，生物反应器体积可以是至少1l、2l、10l、80l、100l、250l、1000l、2500l、3500l、5000l、10,000l、20,000l、50,000l、100,000l、200,000l、300,000l、400,000l或500,000l。
[0091]
在一些实施例中，在接种之前，用生长培养基在所需的ph和温度下制备生物反应器。培养基的初始ph可不同于制程设定点。ph应激在低细胞浓度下可以是不利的；初始ph可以在ph 7.5与处理设定点之间。例如，ph可设定于4.5与8.0之间，优选6.5。在发酵期间，ph可通过使用氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵进行控制。温度可控制于25℃至45℃，例如在37℃下。
[0092]
在某些实施例中，通过用氮气、二氧化碳或气体混合物(n2和co2)引入或吹扫生物反应器以在生物反应器中建立厌氧气氛来降低生物反应器中的氧气水平来产生厌氧条件。
[0093]
在一些实施例中，气氛包含至少约2％至约40％co
2、
约5％至35％co2、约10％至30％co2、约15％至30％co2、约20％至30％co2、约22％至28％co2或约24％至26％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些优选实施例中，气氛包含约25％co2。
[0094]
在一些实施例中，气氛包含至少约1％、2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、或约40％co2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含大于5％co2。在一些优选实施例中，气氛包含至
少约25％co2。
[0095]
在一些实施例中，气氛包含65％至85％n2或70％至80％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于95％n2。在一些优选实施例中，气氛包含约75％n2。
[0096]
在一些实施例中，气氛包含约65％、约66％、约67％、约28％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％n2。在一些实施例中，厌氧气体混合物包含小于95％n2。在一些优选实施例中，气氛包含约75％n2。
[0097]
在一些实施例中，气体混合物(co2和n2)在生物反应器中提供气氛，该气氛包含co2和n2，co2比n2比率是约1:99、约2:98、约3:97、约4:96、约5:95、约6:94、约7:93、约8:92、约9:91、约10:90、11:89、约12:88、约13:87、约14:86、约15:85、约16:84、约17:83、约18:82、约19:81、约20:80、21:79、约22:78、约23:77、约24:76、约25:75、约26:74、约27:73、约28:72、约29:71、约30:70、31:69、约32:68、约33:67、约34:66、约35:65、约36:64、约37:63、约38:62、约39:61或约40:50。在一些实施例中，混合气体组合物提供了以约25:75的比率包含co2和n2的生物反应器中的气氛。
[0098]
在一些实施例中，取决于菌株及接种物大小，生物反应器发酵时间可有所变化。例如，发酵时间可从大约5小时至48小时有所变化。在一些实施例中，发酵时间可以是约5小时至约24小时、约8小时至约24小时、约8小时至约18小时、约8小时至约16小时、约8小时至约14小时、约10小时至约24小时、约10小时至约18小时、约10小时至约16小时、约10小时至约14小时、约10小时至约12小时、约12小时至约24小时、约12小时至约18小时、约12小时至约16小时、或约12小时至约14小时。在一些实施例中，发酵时间可以是约12小时至约96小时、从约12小时至约72小时、从约12小时至约60小时、从约24小时至约96小时、从约24小时至约72小时、从约24小时至约60小时、从约24小时至约48小时、从约36小时至约96小时、从约36小时至约72小时、从约36小时至约60小时、或从约36小时至约48小时。
[0099]
在一些实施例中，发酵培养物与co2和n2的混合气体组合物的添加连续混合。在一些实施例中，混合气体组合物在生物反应器中提供气氛，该气氛包含co2和n2，co2比n2比率是约1:99、约2:98、约3:97、约4:96、约5:95、约6:94、约7:93、约8:92、约9:91、约10:90、11:89、约12:88、约13:87、约14:86、约15:85、约16:84、约17:83、约18:82、约19:81、约20:80、21:79、约22:78、约23:77、约24:76、约25:75、约26:74、约27:73、约28:72、约29:71、约30:70、31:69、约32:68、约33:67、约34:66、约35:65、约36:64、约37:63、约38:62、约39:61或约40:50。在一些实施例中，混合气体组合物提供了以约25:75的比率包含co2和n2的生物反应器中的气氛。
[0100]
在某些实施例中，收获时间可以基于葡萄糖水平低于2g/l或达到生长稳定期时。
[0101]
在一些实施例中，一旦发酵完成，将培养物冷却(例如，至10℃)并离心收集细胞糊。可以将稳定剂添加至细胞糊中并充分混合。可通过连续离心实施收获。产品可用各种赋形剂重新悬浮至所需的最终浓度。可添加赋形剂以用于冷冻保护或用于冻干期间的保护。赋形剂可包括但不限于蔗糖、海藻糖或乳糖，且可替代地这些赋形剂可与缓冲液及抗氧化剂混合。在冻干之前，可以将细胞沉淀物液滴与赋形剂混合并浸没于液氮中。
[0102]
在某些实施例中，可以将细胞浆液冻干。可以自一级干燥开始来冻干材料(包括活细菌)。在一级干燥期期间，去除冰。在此处，生成真空且将适当量的热量供应至材料以使冰
升华。在二级干燥期期间，可以去除结合产物的水分子。在此处，将温度升至高于一级干燥期以裂解已在水分子与产物材料之间形成的任何物理-化学相互作用物。还可进一步降低压力以增强此阶段期间的解吸。在冷冻干燥处理完成之后，可使用惰性气体(例如氮)填充室。可将产物在干燥条件下密封于冷冻干燥器内，从而防止暴露于大气水及污染物。可以将冻干材料进行γ照射(例如，17.5kgy)。
[0103]
厌氧细菌
[0104]
在一些方面，本文提供了用于培养厌氧细菌的方法和组合物。在某些方面，本文提供的方法和组合物中使用的厌氧细菌选自放线菌属、拟杆菌属、梭菌属、梭杆菌属、消化链球菌属、卟啉单胞菌属、普雷沃菌属、丙酸杆菌属或韦永氏球菌属的细菌。
[0105]
在一些实施例中，厌氧细菌是雷沃菌属细菌的以下物种：阿尔伯普雷沃菌(prevotella albensis)、羊水普雷沃菌(prevotella amnii)、卑尔根普雷沃菌(prevotella bergensis)、二路普雷沃菌(prevotella bivia)、短普雷沃菌(prevotella brevis)、布氏普雷沃菌(prevotella bryantii)、颊普雷沃菌(prevotella buccae)、口颊普雷沃菌(prevotella buccalis)、粪便普雷沃菌(prevotella copri)、牙普雷沃菌(prevotella dentalis)、栖牙普雷沃菌(prevotella denticola)、解糖胨普雷沃菌(prevotella disiens)、栖组织普雷沃菌(prevotella histicola)、产黑色素普雷沃菌(prevotella melanogenica)、中间普雷沃菌(prevotella intermedia)、小斑点普雷沃菌(prevotella maculosa)、马斯普雷沃菌(prevotella marshii)、产黑普雷沃菌(prevotella melaninogenica)、彩虹普雷沃菌(prevotella micans)、多形普雷沃菌(prevotella multiformis)、变黑普雷沃菌(prevotella nigrescens)、口腔普雷沃菌(prevotella oralis)、口普雷沃菌(prevotella oris)、龈炎普雷沃菌(prevotella oulorum)、苍白普雷沃菌(prevotella pallens)、唾液普雷沃菌(prevotella salivae)、斯特塞拉普雷沃菌(prevotella stercorea)、坦纳普雷沃菌(prevotella tannerae)、蒂莫普雷沃菌(prevotella timonensis)、空肠普雷沃菌(prevotella jejuni)、橙色普雷沃菌(prevotella aurantiaca)、保氏普雷沃菌(prevotella baroniae)、着色普雷沃菌(prevotella colorans)、人体普雷沃菌(prevotella corporis)、丹塔普雷沃菌(prevotella dentasini)、栖居普雷沃菌(prevotella enoeca)、斐氏普雷沃菌(prevotella falsenii)、深黑色普雷沃菌(prevotella fusca)、解肝素普雷沃菌(prevotella heparinolytica)、洛氏普雷沃菌(prevotella loescheii)、嗜糖普雷沃菌(prevotella multisaccharivorax)、南锡普雷沃菌(prevotella nanceiensis)、稻普雷沃菌(prevotella oryzae)、沼泽普雷沃菌(prevotella paludivivens)、胸膜炎普雷沃菌(prevotella pleuritidis)、栖瘤胃普雷沃菌(prevotella ruminicola)、解糖普雷沃菌(prevotella saccharolytica)、靶心普雷沃菌(prevotella scopos)、赛赫普雷沃菌(prevotella shahii)、动胶普雷沃菌(prevotella zoogleoformans)或真空腔普雷沃菌(prevotella veroralis.)。
[0106]
在一些实施例中，普雷沃菌为普雷沃菌菌株b 50329(nrrl登录号b 50329)。在一些实施例中，普雷沃菌菌株为包含与普雷沃菌菌株b 50329的核苷酸序列(例如基因组序列、16s序列、crispr序列)有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性(例如至少99.5％序列同一性、
至少99.6％序列同一性、至少99.7％序列同一性、至少99.8％序列同一性、至少99.9％序列同一性)的菌株。
[0107]
在一些实施例中，普雷沃菌为包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多种)表1中所列的蛋白质和/或一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多种)编码表1中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌的菌株。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌包含表1中所列的所有蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的所有基因。
[0108]
表1：示例性普雷沃菌蛋白
[0109]
[0110]
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122][0123]
在一些实施例中，普雷沃菌是不含或基本上不含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种)表2中所列的蛋白质和/或一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多种)编码表2中所列的蛋白质的基因的普雷沃菌的菌株。在一些实施例中，普雷沃菌属细菌不含表2中所列的所有蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的所有基因。
[0124]
表2：其他普雷沃菌蛋白
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135][0136]
在一些实施例中，这些普雷沃菌属细菌来自包含表1中所列的蛋白质中的一种或多种且不含或基本上不含表2中所列的一种或多种蛋白质的普雷沃菌属细菌的菌株。在一些实施例中，这些普雷沃菌属细菌来自包含表1中所列的所有蛋白质和/或编码表1中所列的蛋白质的所有基因，且不含表2中所列的所有蛋白质和/或编码表2中所列的蛋白质的所有基因的普雷沃菌属细菌的菌株。
[0137]
稳定剂和细菌组合物
[0138]
在一些方面，本文提供的是稳定细菌组合物的稳定剂，其包含蔗糖。在一些实施例中，稳定剂包含约100g/kg、约110g/kg、约120g/kg、约130g/kg、约140g/kg、约150g/kg、约160g/kg、约170g/kg、约180g/kg、约190g/kg、约200g/kg、约210g/kg、约220g/kg、约230g/kg、约240g/kg、约250g/kg、约260g/kg、约270g/kg、约280g/kg、约290g/kg或约300g/kg蔗糖。在一些实施例中，稳定剂包含至少100g/kg、至少110g/kg、至少120g/kg、至少130g/kg、至少140g/kg、至少150g/kg、至少160g/kg、至少170g/kg、至少180g/kg、至少190g/kg、至少200g/kg、至少210g/kg、至少220g/kg、至少230g/kg、至少240g/kg、至少250g/kg、至少260g/kg、至少270g/kg、至少280g/kg、至少290g/kg或至少300g/kg蔗糖。
[0139]
在一些实施例中，稳定剂包含葡聚糖40k。在一些实施例中，稳定剂包含约100g/kg、约110g/kg、约120g/kg、约130g/kg、约140g/kg、约150g/kg、约160g/kg、约170g/kg、约180g/kg、约190g/kg、约200g/kg、约210g/kg、约220g/kg、约230g/kg、约240g/kg、约250g/kg、约260g/kg、约270g/kg、约280g/kg、约290g/kg或约300g/kg葡聚糖40k。在一些实施例中，稳定剂包含至少100g/kg、至少110g/kg、至少120g/kg、至少130g/kg、至少140g/kg、至少150g/kg、至少160g/kg、至少170g/kg、至少180g/kg、至少190g/kg、至少200g/kg、至少210g/kg、至少220g/kg、至少230g/kg、至少240g/kg、至少250g/kg、至少260g/kg、至少270g/kg、至少280g/kg、至少290g/kg或至少300g/kg葡聚糖40k。
[0140]
在一些实施例中，稳定剂包含半胱氨酸hcl。在一些实施例中，稳定剂包含约1.0g/kg、约1.1g/kg、约1.2g/kg、约1.3g/kg、约1.4g/kg、约1.5g/kg、约1.6g/kg、约1.7g/kg、约1.8g/kg、约1.9g/kg、约2.0g/kg、约2.1g/kg、约2.2g/kg、约2.3g/kg、约2.4g/kg、约2.5g/kg、约2.6g/kg、约2.7g/kg、约2.8g/kg、约2.9g/kg、约3.0g/kg、约3.1g/kg、约3.2g/kg、约3.3g/kg、约3.4g/kg、约3.5g/kg、约3.6g/kg、约3.7g/kg、约3.8g/kg、约3.9g/kg、约4.0g/kg、约4.1g/kg、约4.2g/kg、约4.3g/kg、约4.4g/kg、约4.5g/kg、约4.6g/kg、约4.7g/kg、约4.8g/kg、约4.9g/kg或约5.0g/kg半胱氨酸hcl。在一些实施例中，稳定剂包含至少1.0g/kg、至少1.1g/kg、至少1.2g/kg、至少1.3g/kg、至少1.4g/kg、至少1.5g/kg、至少1.6g/kg、至少1.7g/kg、至少1.8g/kg、至少1.9g/kg、至少2.0g/kg、至少2.1g/kg、至少2.2g/kg、至少2.3g/kg、至少2.4g/kg、至少2.5g/kg、至少2.6g/kg、至少2.7g/kg、至少2.8g/kg、至少2.9g/kg、至少3.0g/kg、至少3.1g/kg、至少3.2g/kg、至少3.3g/kg、至少3.4g/kg、至少3.5g/kg、至少3.6g/kg、至少3.7g/kg、至少3.8g/kg、至少3.9g/kg、至少4.0g/kg、至少4.1g/kg、至少4.2g/kg、至少4.3g/kg、至少4.4g/kg、至少4.5g/kg、至少4.6g/kg、至少4.7g/kg、至少4.8g/kg、至少4.9g/kg或至少5.0g/kg半胱氨酸hcl。
[0141]
在某些实施例中，稳定剂处于液体悬浮液中。在一些实施例中，稳定剂的组分溶解在水中以制备液体悬浮液。在一些此类实施例中，稳定剂包含约500g/kg、约510g/kg、约520g/kg、约530g/kg、约540g/kg、约550g/kg、约560g/kg、约570g/kg、约580g/kg、约590g/kg、约600g/kg、约610g/kg、约620g/kg、约630g/kg、约640g/kg、约650g/kg、约660g/kg、约670g/kg、约680g/kg、约690g/kg或约700g/kg水。在一些此类实施例中，稳定剂包含至少500g/kg、至少510g/kg、至少520g/kg、至少530g/kg、至少540g/kg、至少550g/kg、至少560g/kg、至少570g/kg、至少580g/kg、至少590g/kg、至少600g/kg、至少610g/kg、至少620g/kg、至少630g/kg、至少640g/kg、至少650g/kg、至少660g/kg、至少670g/kg、至少680g/kg、至少690g/kg或至少700g/kg水。
[0142]
在一些实施例中，稳定剂包含蔗糖、葡聚糖40k、半胱氨酸hcl和水。在一些此类实施例中，稳定剂包含150g/kg至250g/kg蔗糖。
[0143]
在一些实施例中，稳定剂包含200g/kg蔗糖。在一些实施例中，稳定剂包含150g/kg至250g/kg葡聚糖40k。在一些实施例中，稳定剂包含200g/kg葡聚糖40k。在一些实施例中，稳定剂包含2g/kg至6g/kg半胱氨酸hcl。在一些实施例中，稳定剂包含4g/kg半胱氨酸hcl。
[0144]
在一些实施例中，稳定剂包含500g/kg至700g/kg水。在一些实施例中，稳定剂包含596g/kg水。在一些实施例中，稳定剂包含200g/kg蔗糖、200g/kg葡聚糖40k、4g/kg半胱氨酸hcl和596g/kg水。
[0145]
在一些方面，本文提供包含稳定剂和细菌的细菌组合物及其制备方法。在某些实施例中，细菌组合物通过将细菌与一定百分比的在液体悬浮液中的稳定剂组合来制备。在一些实施例中，与细菌组合的稳定剂溶液的百分比为约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％或约50％。在一些实施例中，与细菌组合的稳定剂溶液的百分比为至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至
少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％或至少50％。
[0146]
在某些方面，本文提供的细菌组合物包含稳定剂。在一些实施例中，细菌组合物包含蔗糖。在一些实施例中，细菌组合物中蔗糖的浓度为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％或约3.0％。在一些实施例中，细菌组合物中蔗糖的浓度为至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％、至少1.1％、至少1.2％、至少1.3％、至少1.4％、至少1.5％、至少1.6％、至少1.7％、至少1.8％、至少1.9％、至少2.0％、至少2.1％、至少2.2％、至少2.3％、至少2.4％、至少2.5％、至少2.6％、至少2.7％、至少2.8％、至少2.9％或至少3.0％。
[0147]
在一些实施例中，细菌组合物包含葡聚糖40k。在一些实施例中，细菌组合物中葡聚糖40k的浓度为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％或约3.0％。在一些实施例中，细菌组合物中葡聚糖40k的浓度为至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1.0％、至少1.1％、至少1.2％、至少1.3％、至少1.4％、至少1.5％、至少1.6％、至少1.7％、至少1.8％、至少1.9％、至少2.0％、至少2.1％、至少2.2％、至少2.3％、至少2.4％、至少2.5％、至少2.6％、至少2.7％、至少2.8％、至少2.9％或至少3.0％。
[0148]
在一些实施例中，细菌组合物包含半胱氨酸hcl。在一些实施例中，细菌组合物中半胱氨酸hcl的浓度为约0.001％、约0.005％、约0.01％、约0.011％、约0.012％、约0.013％、约0.014％、约0.015％、约0.016％、约0.017％、约0.018％、约0.019％、约0.02％、约0.021％、约0.022％、约0.023％、约0.024％、约0.025％、约0.026％、约0.027％、约0.028％、约0.029％、约0.03％、约0.031％、约0.032％、约0.033％、约0.034％、约0.035％、约0.036％、约0.037％、约0.038％、约0.039％、约0.04％、约0.041％、约0.042％、约0.042％、约0.043％、约0.044％、约0.045％、约0.046％、约0.047％、约0.048％、约0.049％或约0.05％。在一些实施例中，细菌组合物中半胱氨酸hcl的浓度为至少0.001％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.011％、至少0.012％、至少0.013％、至少0.014％、至少0.015％、至少0.016％、至少0.017％、至少0.018％、至少0.019％、至少0.02％、至少0.021％、至少0.022％、至少0.023％、至少0.024％、至少0.025％、至少0.026％、至少0.027％、至少0.028％、至少0.029％、至少0.03％、至少0.031％、至少0.032％、至少0.033％、至少0.034％、至少0.035％、至少0.036％、至少0.037％、至少0.038％、至少0.039％、至少0.04％、至少0.041％、至少0.042％、至少0.042％、至少0.043％、至少
0.044％、至少0.045％、至少0.046％、至少0.047％、至少0.048％、至少0.049％或至少0.05％。
[0149]
在一些实施例中，细菌组合物包含蔗糖、葡聚糖40k和半胱氨酸hcl。在一些此类实施例中，细菌组合物包含1％至2％蔗糖。在一些实施例中，细菌组合物包含1.5％蔗糖。在一些实施例中，细菌组合物包含1％至2％葡聚糖40k。在一些实施例中，细菌组合物包含1.5％葡聚糖40k。在一些实施例中，细菌组合物包含0.01％至0.05％半胱氨酸hcl。在一些实施例中，细菌组合物包含0.03％半胱氨酸hcl。在一些实施例中，细菌组合物包含1.5％蔗糖、1.5％葡聚糖40k和0.03％半胱氨酸hcl。
[0150]
在某些方面，细菌组合物包含细菌。在一些实施例中，细菌是厌氧细菌。在一些实施例中，厌氧细菌是栖组织普雷沃菌。在一些此类实施例中，厌氧细菌是栖组织普雷沃菌菌株b 50329。
[0151]
在一些实施例中，细菌组合物被冻干以形成粉末。
[0152]
实例
[0153]
实例1：栖组织普雷沃菌和栖组织普雷沃菌与稳定剂的冻干粉的示例性制造过程
[0154]
栖组织普雷沃菌的示例性制造过程如图1和图2所示。在此示例性方法中，厌氧细菌在包含表3中所列的组分的生长培养基中生长。在使用之前将培养基进行过滤灭菌。
[0155]
表3：生长培养基
[0156][0157][0158]
简而言之，用1ml已储存在-80℃下的细胞库样品接种1l的瓶子。由于此菌株对有氧条件的敏感性，所以将这种接种的培养物在37℃、ph＝6.5下的厌氧室中进行孵育。当瓶子达到对数生长期(生长大约14至16小时后)时，在5％v/v下使用培养物接种20l生物反应器。对数生长期(生长大约10至12小时后)期间，在0.5％v/v下使用培养物接种3500l生物反应器。
[0159]
将发酵培养物与以0.02vvm添加的混合气体(25％co2和75％n2的组合物)连续混
合。用氢氧化铵将ph保持在6.5，并将温度控制在37℃。收获时间取决于何时达到生长稳定期(生长大约12至14小时后)。
[0160]
可替代地，发酵培养物与以0.002vvm添加的100％co2气体连续混合。用氢氧化铵将ph保持在6.5，并将温度控制在37℃。收获时间取决于何时达到生长稳定期(生长大约12至14小时后)。
[0161]
一旦发酵完成，将培养物冷却至10℃，离心并收集所得的细胞糊。
[0162]
通过组合和混合表4中描述的组分来制备稳定剂。为了制备栖组织普雷沃菌和稳定剂的冻干粉，在细胞糊中添加10％稳定剂并充分混合(稳定剂浓度(浆液中)：1.5％蔗糖、1.5％葡聚糖、0.03％半胱氨酸)。细胞浆液被冻干。
[0163]
表4：稳定剂配制品
[0164][0165][0166]
实例2：co2可用性对栖组织普雷沃菌生长的影响
[0167]
测试了co2可用性对栖组织普雷沃菌b50329生长的影响。栖组织普雷沃菌在厌氧条件下培养，喷射95％n2和5％co2，速率为0.1体积气体/容器体积/分钟(vvm)或0.02vvm。如图3所示，增加的气体喷射量增加了栖组织普雷沃菌的生长潜力。
[0168]
然后以0.02vvm的速率喷射纯n2(0％co2)、95％n2和5％co2或75％n2和25％co2对栖组织普雷沃菌菌株进行培养。从图4中可以看出，co2的存在对于栖组织普雷沃菌生长的开始是必要的。喷射增加浓度的co2增加了栖组织普雷沃菌的生长潜力。以较低的速率(0.005vvm)喷射100％co2导致栖组织普雷沃菌的中等增长潜力。
[0169]
在所有规模上，co2的传质都很重要，并由多种因素决定。在这里，我们展示了规模、搅拌、气体浓度和气体流速的影响(表5)。
[0170]
表5：不同条件下栖组织普雷沃菌的生长
[0171][0172]
栖组织普雷沃菌在生长过程中消耗co2。如图5所示，当向新接种的栖组织普雷沃菌培养物中加入co2时，co2浓度增加，浓度接近平衡。随着栖组织普雷沃菌培养物的生长，co2浓度的增加减慢，然后随着培养物进入对数增长，co2水平下降。当培养物停止对数增长时，这种下降停止，因为传质抵消了消耗。当co2喷射关闭时，培养物中的co2浓度立即开始迅速下降，表明栖组织普雷沃菌消耗了co2。如果不发生消耗，例如在无菌介质中，则在该时间范围内几乎不会观察到co2浓度的变化。
[0173]
实例3：麦芽糖糊精与葡萄糖组合比单独使用葡萄糖作为糖源能更好地支持栖组织普雷沃菌b50329的生长
[0174]
图6中的结果表明，在总糖量相同的情况下，麦芽糖糊精(25g/l)与葡萄糖(10g/l)的组合与单独的葡萄糖(35g/l)相比导致在增加的工艺产率。除了使用的糖之外，培养条件是相同的。结果表明，对于等量的葡萄糖和麦芽糖糊精，栖组织普雷沃菌b50329菌株在麦芽糖糊精加葡萄糖上比在单独葡萄糖上生长得更好。因为麦芽糖糊精只是葡萄糖单体的链，结果表明细胞的生长可能从链结构的某些方面受益。
[0175]
通过引用并入
[0176]
在本文中提及的所有出版物、专利申请都通过引用以其全文特此并入，如同各个单独的出版物或专利申请被确切地并且单独地指明为通过引用并入。如果出现冲突，则以本技术(包含本文的任何定义)为准。
[0177]
等效形式
[0178]
本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能确定本文所述本发明的具体实施例的许多等效形式。此类等效形式旨在被下列权利要求所涵盖。