重组蓑蛾虫丝蛋白质的大量生产系统的制作方法

1.本发明涉及利用基因重组技术制作的增大作为蓑蛾虫丝的纤维主成分的丝心蛋白h链蛋白质的生产量的基因表达增强系统、和使用了该系统的重组蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的生产方法。


背景技术：

2.构成昆虫的茧的丝、哺乳动物的毛自古以来作为动物纤维而在衣物等中被利用。特别作为蚕蛾(bombyx mori)的幼虫的蚕来源的丝(本说明书中经常表述为“蚕丝”)，吸放湿性、保湿性和保温性优异，而且具有独特的光泽和润滑的肌肤触感，因而现在也作为高级天然材料而被重视。
3.但是，自然界存在具有与蚕丝匹敌、或其以上的特性的动物纤维。例如，由蓑蛾虫(bagworm)吐丝的丝(本说明书中经常表述为“蓑蛾虫丝”)就是其中之一。已知蓑蛾虫是属于鳞翅目(lepidoptera)蓑蛾科(psychidae)的蛾的幼虫的总称，通常潜伏在将叶片、枝片用丝捆束而成的纺锤形或圆筒形的巢(bag nest)中，摄食时也连巢一起移动，全幼虫期与巢共同生活。
4.该蓑蛾虫丝具有力学上比蚕丝更优异的特性。例如，关于弹性模量，茶大蓑蛾(eumeta minuscula)的蓑蛾虫丝被夸耀为蚕丝的3.5倍，并且具有非常强的强度(非专利文献1、2)。另外，蓑蛾虫丝的单纤维的截面积仅为蚕丝的单纤维的1/7，能够制作纹理细腻、具有润滑的肌肤触感、薄且轻的布。并且，蓑蛾虫丝具备与蚕丝同等或其以上的光泽和艳丽。因此，蓑蛾虫丝能够成为极有希望作为新的天然材料的动物纤维。
5.但是，蓑蛾虫丝在实用化方面存在几个应解决的课题。其中之一是量产。为了将蓑蛾虫丝作为纤维材料实用化，大量获得蓑蛾虫的巢是不可避免的。但是，蓑蛾虫的巢的野外采集量不足以满足量产，因此蓑蛾虫的大量饲养和从蓑蛾虫有效地采集丝的方法是不可或缺的。
6.蓑蛾虫丝的实用化中另一大问题是蓑蛾虫丝的纯度。在蓑蛾虫的巢的表面必然附着叶片、枝片等夹杂物。从品质这点考虑为了作为纤维材料实用化，必须完全除去这些夹杂物。但是，除去作业需要庞大的工夫和成本，而且现有的技术中从蓑蛾虫的巢完全除去夹杂物是困难的。因此，到目前为止，不仅高成本，而且仅能得到被夹杂物来源的色素染色了的低品质的蓑蛾虫丝。
7.作为上述课题的解决策略，现在开发了像专利文献1、专利文献2所公开那样的从蓑蛾虫有效地采集纯度高的蓑蛾虫丝的方法。但是，蓑蛾虫丝产业刚刚迎来黎明期。用于量产蓑蛾虫丝的设备、体制还正在开发，现状是达到量产化尚需要时间。
8.作为上述课题的解决策略，除了从蓑蛾虫直接采集丝的方法以外，还有使用基因重组技术大量生产重组蓑蛾虫丝的方法。通过将克隆的蓑蛾虫丝的基因导入宿主使其表达，能够在宿主细胞内大量生产重组蓑蛾虫丝。但是，该生产方法也存在重要的蓑蛾虫丝的全长基因序列尚未确定这样的本质问题。这是因为如下原因：由于作为丝的主要纤维成分
的丝心蛋白h链蛋白质(fib h蛋白质)具有甘氨酸残基和丙氨酸残基多个重复的氨基酸序列，因而通过通常的克隆技术确定完全长度的丝心蛋白h链基因(fib h基因)的碱基序列是极难的。为了解决该问题，在专利文献3中，制作了由蓑蛾虫fib h(bagworm fib h：本说明书中经常表述为“bfib h”)基因和蚕fib h(silkworm fib h：本说明书中经常表述为“sfib h”)基因组成的重组嵌合fib h基因。该嵌合fib h基因是通过转录物组分析而鉴定的大蓑蛾(eumeta japonica)中的一部分bfib h基因信息、与现有的sfib h基因信息的一部分融合并全长化而得的人工基因。在专利文献3中公开了将该嵌合fib h基因导入蚕而制作出基因重组蚕，并使蚕吐丝，从而生产对蚕丝赋予了蓑蛾虫丝的物性的嵌合丝的方法。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.专利文献1：日本特开2018-197415
12.专利文献2：日本特开2019-013207
13.专利文献3：日本特开2018-074403
14.非专利文献
15.非专利文献1：大崎茂芳,2002,纤维学会志(纤维与工业),58:74-78
16.非专利文献2：gosline j.m.et al.,1999,202,3295-3303


技术实现要素：

17.发明要解决的课题
18.蛋白质的大量生产体系宿主中除了上述专利文献3即日本特开2018-074403中使用的蚕之外，一般常用大肠杆菌(escherichia coli)、酵母等微生物。于是，本发明者们为了构建以微生物作为大量生产体系宿主的蓑蛾虫fib h基因表达系统，新克隆了大蓑蛾的蓑蛾虫fib h基因，成功地获得了包含到目前为止未被鉴定的区域的蓑蛾虫fibh cdna。将所得的重组蓑蛾虫fib h(recombinant bagworm fib h：本说明书中经常表述为“rbfib h”)基因装入微生物用的基因表达载体，导入大肠杆菌使其生产rbfib h蛋白质，结果判明了表达量显著降低。其具体原因不明，考虑是因为抑制表达的某些控制作用发挥了作用。然而，在蛋白质的大量生产体系中，这样的表达量的降低可以成为致命的问题。
19.于是，本发明的课题是开发在微生物表达体系等中也能够大量生产rbfib h蛋白质的rbfib h基因、和包含该基因的表达载体。
20.用于解决课题的手段
21.为了解决上述课题，本发明者们反复进行了深入研究，结果得到了如下新见解：使编码缺失了rbfib h蛋白质的n末端区域或c末端区域的任一方的单末端缺失型的rbfib h蛋白质的基因表达时，其表达量显著增加。另一方面，在仅残留了有助于fib h蛋白质的物性的中央区域的双末端缺失型的rbfib h蛋白质中，虽然确认了表达量的增加，但同时rbfib h蛋白质的分解量也增加。本发明是基于这些见解的，提供以下发明。
22.(1)改变型rbfib h(modified-rbfib h：m-rbfib h)蛋白质，是将从n末端侧开始依次包含n末端区域、中央区域、和c末端区域的rbfib h蛋白质进行改变而得的，所述m-rbfib h蛋白质是所述rbfib h蛋白质的n末端区域的全部或一部分、或c末端区域的全部或一部分缺失了的蛋白质，所述n末端区域由序列号1所示的氨基酸序列、在序列号1所示的氨
基酸序列中添加、缺失、或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、或与序列号1所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列组成，所述中央区域是由3个以上中央重复单元连接而成的，所述3个以上中央重复单元由相同和/或不同的氨基酸序列组成，所述c末端区域由序列号2所示的氨基酸序列、在序列号2所示的氨基酸序列添加、缺失、或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、或与序列号2所示的氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列组成，其中，所述中央重复单元包含30个单元以上的由甘氨酸和丙氨酸组成的2氨基酸单元，在其n末端侧包含含有15～25个丙氨酸的ala簇，由全长120个～170个氨基酸组成。
23.(2)根据(1)所述的m-rbfib h蛋白质，所述ala簇由序列号3或4所示的氨基酸序列组成。
24.(3)根据(2)所述的m-rbfib h蛋白质，所述中央重复单元从序列号5～13所示的氨基酸序列中选择。
25.(4)编码(1)～(3)的任一项所述的m-rbfib h蛋白质的m-rbfib h基因。
26.(5)根据(4)所述的m-rbfib h基因，由序列号16、18、24或26所示的任一碱基序列组成。
27.(6)以能够在宿主细胞内表达的状态包含(4)或(5)所述的m-rbfib h基因的m-rbfib h基因表达载体。
28.(7)由包含(6)所述的m-rbfib h基因表达载体的宿主构成的转化体或其后代。
29.(8)根据(7)所述的转化体或其后代，所述宿主是微生物或昆虫培养细胞。
30.(9)m-rbfib h蛋白质的制造方法，所述制造方法包括：将(7)或(8)所述的转化体或其后代在规定的条件下培养的培养工序、和由培养工序之后的培养液和/或转化体制备m-rbfib h蛋白质的制备工序。
31.本说明书包含成为本技术的优先权基础的日本专利申请号2019-097154号的公开内容。
32.发明的效果
33.根据本发明的m-rbfib h基因表达载体，通过将该表达载体导入宿主进行表达诱导，从而能够大量生产m-rbfib h蛋白质。
附图说明
34.图1显示由本发明中克隆的rbfib h基因所编码的rbfib h蛋白质、和由将其改变而得的m-rbfib h基因所编码的m-rbfib h蛋白质的结构示意图。该图中，作为rbfib h蛋白质显示实施例中构建的bw753蛋白质和bw592蛋白质，另外作为m-rbfib h蛋白质显示实施例中构建的bw592δc蛋白质、bw592δn蛋白质、和bw592δn/c蛋白质。图中的黑条表示在rbfib h基因的克隆中使用的rbfib h基因扩增片段，在m-rbfib h蛋白质上显示相当于由该片段所编码的氨基酸区域的位置。
35.图2是实施例4的各转化体中的rbfib h蛋白质的蛋白质印迹图。道1显示作为rbfib h蛋白质的bw592，道2显示作为m-rbfib h蛋白质的bw592δc，道3显示作为m-rbfib h蛋白质的bw592δn，并且道4显示作为m-rbfib h蛋白质的bw592δn/c。图中的箭头显示目的蛋白质的位置。
具体实施方式
36.1.改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质
37.1-1.概要
38.本发明的第1方案是改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链(modified-recombinant bagworm fib h：本说明书中经常表述为“m-rbfib h”)蛋白质。m-rbfib h蛋白质是由对本发明者们新克隆的rbfib h基因加入了进一步改变的改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链基因(m-rbfib h基因)所编码的蛋白质。
39.根据本发明的m-rbfib h基因，通过使包含该基因的表达载体在微生物等宿主细胞内表达，从而与rbfib h基因相比，能够使15倍以上的重组蛋白质表达。由此，能够使用微生物遗传表达体系实现rbfib h蛋白质的大量生产。
40.1-2.术语的定义
41.本说明书中频繁使用的以下术语如下定义。
[0042]“蓑蛾虫”如前所述，是指属于鳞翅目(lepidoptera)蓑蛾科(psychidae)的蛾的幼虫的总称。因此，本来是指各种蓑蛾科的蛾的幼虫，但在本说明书中仅表述为蓑蛾虫的情况下，原则上是指在rbfib h基因的克隆用于cdna文库的构建的大蓑蛾。
[0043]
本说明书中所谓“丝”，是昆虫来源或蜘蛛目生物来源的丝，是指它们的幼虫、成虫为了结巢、移动、固定、结茧、捕食等而吐丝的蛋白质制的丝。本说明书中，在仅表述为“丝”的情况下，原则上不特定来源生物名，广泛地指一般的丝。在表示特定的生物来源的丝的情况下，像蚕丝、蓑蛾虫丝这样，在丝之前附上其来源生物名。
[0044]“丝心蛋白h链(fib h)蛋白质”是构成作为丝的主要纤维成分的丝心蛋白的蛋白质之一。例如，蚕的丝心蛋白主要由3种蛋白质、即fib h蛋白质、fib l蛋白质、和p25蛋白质构成。其中fib h蛋白质是丝心蛋白中的主要构成蛋白质，丝的特性主要由fib h蛋白质带来。因此，在本说明书中，也有时将作为构成丝的纤维成分的fib h蛋白质表述为丝。
[0045]
此外，本说明书中，在仅表述为“fib h”的情况下，原则上对来源生物名不特别限定。在表示特定的生物来源的fib h蛋白质的情况下，像蚕fib h蛋白质(silkworm fib h蛋白质：sfib h蛋白质)、蓑蛾虫fib h蛋白质(bagworm fib h蛋白质：bfib h蛋白质)这样，fib h之前附上其来源生物名或其首字母。
[0046]
本说明书中“重组丝心蛋白h链蛋白质”(rfib h蛋白质)是指由使用基因克隆技术而克隆的重组丝心蛋白h链基因所编码的fib h蛋白质。rfib h蛋白质只要包含fib h蛋白质的基本构成成分，不必由与野生型的全长fib h蛋白质相同的氨基酸序列构成。所述fib h蛋白质的基本构成成分包含n末端区域、中央区域、和c末端区域。对于这些基本构成成分在“1-3.构成”的章节中详述。另外，rfib h蛋白质可以不是单一生物来源的fib h蛋白质，可以是由来源于二种以上的生物的多肽构成的嵌合fib h蛋白质。可列举例如，由蓑蛾虫与蚕的fib h蛋白质构成的嵌合fib h蛋白质。此外，本说明书中，在构成rfib h蛋白质的全氨基酸序列中超过半数的氨基酸来源于特定的昆虫的情况下，将该特定的昆虫名的首字母附于rfib h蛋白质中的“r”之后。例如，在构成rfib h蛋白质的氨基酸序列90％以上来源于蓑蛾虫fib h蛋白质的氨基酸序列的情况下，表述为“rbfib h蛋白质”。
[0047]
本说明书中“改变型重组丝心蛋白h链蛋白质”(m-rfib h蛋白质)是以所述rfib h蛋白质为基础，将其一部分进行了人工改变的、由与野生型fib h蛋白质不同的氨基酸序列
构成的蛋白质。m-rfib h蛋白质可列举例如，在rfib h蛋白质的氨基酸序列中导入了1个或多个氨基酸的添加、缺失、和/或替换的突变rfib h蛋白质。具体地，例如，是在rfib h蛋白质中缺失了作为fib h蛋白质的基本构成成分的n末端区域和/或c末端区域的rfib h蛋白质等。
[0048]
本说明书中“丝心蛋白h链基因”(fib h基因)是指编码所述fib h蛋白质的基因。本说明书中，与fib h蛋白质同样地，在仅表述为“fib h基因”的情况下，原则上无论来源生物种如何。在表示特定的生物来源的fib h基因的情况下，在fib h之前附上其来源生物名或其首字母。例如，如果是蓑蛾虫来源的fib h基因，则像蓑蛾虫fib h基因、或bfib h基因这样表述。
[0049]
本说明书中“重组丝心蛋白h链基因”(rfib h基因)是使用基因克隆技术克隆而得的fib h基因，是指编码前述的重组fib h蛋白质的基因。
[0050]
本说明书中“改变型重组丝心蛋白h链基因”(m-rfib h基因)是指编码前述的m-rfibh蛋白质的基因。同样地，本说明书中“改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链基因”(m-rbfib h基因)是指编码“m-rbfib h蛋白质”的基因。
[0051]
本说明书中“重组蓑蛾虫丝”是指包含rbfib h蛋白质(包括m-rbfib h蛋白质)的蓑蛾虫丝。
[0052]
本说明书中“表达载体”是指以能够表达基因的状态包含、且能够控制其表达的表达系统。
[0053]
本说明书中所谓“能够表达的状态”是指，以载体所内包的基因能够在宿主细胞内表达的方式整合在表达载体内。具体地，是指所内包的基因被配置在表达载体内的启动子控制下。
[0054]
1-3.构成
[0055]
1-3-1.重组蓑蛾虫丝心蛋白h链(rbfib h)蛋白质的构成
[0056]
本说明书中的rbfib h蛋白质作为基本构成成分从n末端侧起依次包含n末端区域、中央区域、和c末端区域。进而，还可以包含信号序列、标记肽。所述各区域分别可以直接连接，也可以介由任意的连接物序列间接地连接。以下，对于各个区域具体进行说明。
[0057]
(n末端区域)
[0058]“n末端区域”是在构成rbfib h蛋白质的氨基酸序列中，如图1所示，位于下述的中央区域的n末端侧的氨基酸区域。具体地，是序列号1所示的氨基酸序列；在序列号1所示的氨基酸序列中添加、缺失、或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列；或与序列号1所示的氨基酸序列有90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、或99％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。另外，本说明书中，氨基酸的替换优选为保守的氨基酸替换。这是因为，如果是保守的氨基酸替换，则可以具有与野生型蛋白质实质上同等的结构或性质。保守的氨基酸是指被分类于相同氨基酸组的氨基酸彼此的关系。所述氨基酸组已知非极性氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸)、极性氨基酸组(非极性氨基酸以外的氨基酸)、带电氨基酸组(酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和碱性氨基酸组(精氨酸、组氨酸、赖氨酸))、非带电氨基酸组(带电氨基酸以外的氨基酸)、芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)、支链氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)、以及脂肪族氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮
氨酸、缬氨酸)等。本说明书中“多个”是指例如，2～20个、2～15个、2～10个、2～7个、2～5个、2～4个或2～3个。“氨基酸同一性”是指将两条多肽的氨基酸序列排列(对齐)，根据需要在任一氨基酸序列中导入间隙并且使两者的氨基酸一致度最高时，相对于序列号1的氨基酸残基数，相同的氨基酸残基的比例(％)。氨基酸同一性可以使用利用blast、fasta的蛋白质的检索系统计算出(karlin，s.et al.,1993,proc.natl.acad.sci.usa,90:5873-5877；altschul，s.f.et al.,1990,j.mol.biol.,215:403-410；pearson，w.r.et al.,1988,proc.natl.acad.sci.usa,85:2444-2448)。
[0059]
此外，fib h蛋白质通常在n末端侧包含信号序列，但n末端区域不包括信号序列。
[0060]
(中央区域)
[0061]“中央区域”是显示bfib h蛋白质的物性的区域，由中央重复单元多个连接而构成，所述中央重复单元由相同和/或不同的氨基酸序列组成。中央重复单元的个数只要为3个以上就不限定。没有特别上限，例如，可以包含10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、或500个以上的中央重复单元。
[0062]“中央重复单元”(本说明书中经常表述为“cru：central repeat unit”)的1单元由全长120个～170个氨基酸组成，包含1个丙氨酸簇和多个甘氨酸/丙氨酸单元。
[0063]“丙氨酸簇”(本说明书中经常表述为“ala簇”)是由连续的丙氨酸(ala)组成的亚单元，包含于cru内的n末端侧。1个ala簇中包含15～25个丙氨酸，除了丙氨酸以外在ala簇中央部(例如ala簇的从n末端侧开始10位的位置)包含1个谷氨酸或谷氨酰胺。虽然不限定，但作为bfib h蛋白质中的ala簇的具体例，可列举序列号3或4所示的氨基酸序列。
[0064]“甘氨酸/丙氨酸单元(g/a单元)”是由甘氨酸(gly：g)和丙氨酸(ala：a)构成的由2个氨基酸组成的单元，由甘氨酸-丙氨酸(ag)或丙氨酸-甘氨酸(ga)组成。大部分cru由g/a单元构成，每1单元包含g/a单元30个单元以上、35个单元以上、或40个单元以上、或60个单元以下、55个单元以下、或50个单元以下。
[0065]
进而，cru可以包含由5～7氨基酸组成的非g/a部分，该非g/a部分由除甘氨酸和丙氨酸以外的氨基酸序列组成。非g/a部分的氨基酸序列不限定。例如，由丝氨酸、缬氨酸、和酪氨酸组成的序列号44或45、序列号46所示的氨基酸序列所组成的非g/a部分是适合的。
[0066]
构成bfib h蛋白质的cru的氨基酸序列只要满足上述各构成要素的条件就不特别限定。作为具体例，虽然不限定，但可列举序列号5～13所示的氨基酸序列。
[0067]
构成bfib h蛋白质的中央区域的各cr彼此直接地连接，或介由其他由1～30个氨基酸、1～20个氨基酸、或1～10个氨基酸组成的任意连接物序列连接。
[0068]
如前述那样，中央区域是显示bfib h蛋白质的物性的区域。rbfib h蛋白质的中央区域具有与野生型bfib h蛋白质中的中央区域相同或类似的物性。这里，本发明的m-rbfib h蛋白质的中央区域仅其数量变动，氨基酸序列与rbfib h蛋白质的中央区域相比不变。因此，m-rbfib h蛋白质作为原则与rbfib h蛋白质具有相同或类似的物性。
[0069]
(c末端区域)
[0070]“c末端区域”是指在构成rbfib h蛋白质的氨基酸序列中，如图1所示，位于下述的中央区域的c末端侧的氨基酸区域。具体地，是序列号2所示的氨基酸序列、在序列号2所示的氨基酸序列中添加、缺失、或替换了1个或多个氨基酸的氨基酸序列、或与序列号2所示的
氨基酸序列有90％以上的氨基酸同一性的氨基酸序列。
[0071]
(信号肽)
[0072]
本发明的rbfib h蛋白质可以根据需要在n末端区域的n末端侧包含信号肽。
[0073]“信号肽”(信号序列)是使通过基因表达而生物合成的蛋白质分泌到细胞外时所需的细胞外转移信号。信号肽在翻译之后在分泌到细胞外之前被信号肽酶切割除去。信号肽在n末端侧配置有赖氨酸、精氨酸这样的具有正电荷的氨基酸，接着它们配置有丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、和苯丙氨酸这样的疏水性高的氨基酸序列。
[0074]
fib h蛋白质通常在其n末端侧具有内源性的信号肽。bfib h蛋白质也在n末端侧具有内源性的信号肽。因此，在本方案的本发明的rbfib h蛋白质包含信号肽的情况下，可以是内源性信号肽和外源性信号肽的任一种。在使所合成的rbfib h蛋白质有效地转移到细胞外的情况下，对信号肽不限定，但优选使用表达细胞外转移目的的蛋白质的宿主细胞来源的信号肽。例如，如果将第3方案所记载的m-rbfib h基因表达载体导入宿主细胞内，则其基因表达载体所包含的m-rbfib h基因优选编码有来源于所述宿主的信号肽。更具体地，如果宿主是大肠杆菌，则编码大肠杆菌来源的信号肽的基因序列包含在m-rbfib h基因中即可。关于信号肽的氨基酸序列、或编码其的碱基序列利用公知的信息即可，不限定。例如，大肠杆菌的信号肽可列举序列号47所示的氨基酸序列。另外，编码大肠杆菌的信号肽的碱基序列可列举编码所述序列号47所示的氨基酸序列的碱基序列，具体为序列号48所示的碱基序列。
[0075]
信号肽的c末端侧也可以具有包含促进信号肽的切割和分泌的信号序列后插入序列和/或从融合蛋白质切割信号肽的信号肽酶识别部位的氨基酸序列。对信号肽的氨基酸序列不特别限定。通常可以在3～60个氨基酸的范围内。
[0076]
(标记肽)
[0077]
本发明的rbfib h蛋白质可以根据需要包含标记肽。“标记肽”是指与作为目的的多肽(这里为rbfib h蛋白质)一起表达、不阻碍或抑制目的多肽的活性、成为其检测或提取时的指标的肽。通常，标记肽以融合多肽的形态以与rbfib h蛋白质一起表达的方式构成。配置标记肽的位置不限定，但一般配置于rbfib h蛋白质的n末端侧和/或c末端侧。作为标记肽的例子，不限定，可列举组氨酸(his)标签(例如，(his)6～(his)
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)、flag标签、myc标签、或ha标签这样的肽标签、gfp蛋白质等。
[0078]
作为rbfib h蛋白质的具体的氨基酸序列的例子，可列举后述的构成实施例中构建的bw592蛋白质的序列号15所示的氨基酸序列、或构成bw753蛋白质的序列号23所示的氨基酸序列。此外，bw592蛋白质和bw753蛋白质如图1所示，在n末端包含由序列号47所示的氨基酸序列组成的大肠杆菌的信号肽，另外在c末端包含his标签。
[0079]
1-3-2.改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链(m-rbfib h)蛋白质的构成
[0080]
本方案的m-rbfib h蛋白质具有所述重组蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质的n末端区域的全部或一部分、和/或c末端区域的全部或一部分缺失了的构成。这里所说的“一部分”是指构成n末端区域或c末端区域的氨基酸序列中的1个、或连续或非连续的2个以上的氨基酸、且不到全部的氨基酸。优选为能够丧失n末端区域或c末端区域的功能的氨基酸数。例如为连续的或非连续的5个、8个、10个、12个、15个、18个、20个以上的氨基酸。
[0081]
其中，发挥本发明的效果的m-rbfib h蛋白质仅是具有n末端区域的全部或一部
分、或c末端区域的全部或一部分缺失了的构成的蛋白质，具有n末端区域的全部或一部分、和c末端区域的全部或一部分缺失了的构成的蛋白质虽然包含在m-rbfib h蛋白质中，但不能发挥其效果，因而不是作为本发明的目的的m-rbfib h蛋白质。因此，在没有特别说明的情况下，本说明书表述为m-rbfib h蛋白质的情况下，是指n末端区域的全部或一部分、或c末端区域的全部或一部分缺失了的rbfib h蛋白质。
[0082]
m-rbfib h蛋白质除了上述n末端区域或c末端区域的缺失以外，还可以在不丧失中央区域的功能的范围内包含其他1个或多个氨基酸的添加、缺失、和/或替换的突变。另外，即使在n末端区域的全部或一部分缺失了的情况下，n末端侧也可以具有所述信号序列。
[0083]
作为m-rbfib h蛋白质的具体的氨基酸序列的例子，可列举后述的实构成施例中构建bw592δn蛋白质的序列号16所示的氨基酸序列、构成bw592δc蛋白质的序列号19所示的氨基酸序列、构成bw753δn蛋白质的序列号25所示的氨基酸序列、或构成bw753δc蛋白质的序列号27所示的氨基酸序列。如前所述，构成bw592δn/c蛋白质的序列号21所示的氨基酸序列、构成bw753δn/c蛋白质的序列号29所示的氨基酸序列虽然是m-rbfib h蛋白质，但由于不发挥本技术发明的效果，因此不是本发明的m-rbfib h蛋白质。
[0084]
2.改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链基因(m-rbfib h基因)
[0085]
2-1.概要
[0086]
本发明的第2方案是m-rbfib h基因。本方案的m-rbfib h基因是编码第1方案所记载的m-rbfib h蛋白质的基因。
[0087]
通过在大肠杆菌等宿主细胞内表达本发明的m-rbfib h基因，能够使重组蛋白质表达改变前的rbfib h基因的15倍以上。
[0088]
2-2.构成
[0089]
2-2-1.重组蓑蛾虫丝心蛋白h链(rbfib h)基因的构成
[0090]
本说明书中的rbfib h基因是由本发明者们从大蓑蛾终龄幼虫的丝腺制备的cdna文库新克隆出的rbfib h基因。关于rbfib h基因，日本特开2018-074403中公开了其部分序列，但本次本发明者们成功地克隆了包含日本特开2018-074403中未鉴定的n末端区域和c末端区域的新的rbfib h基因。本说明书中的rbfib h基因是基于该克隆所得的rbfib h基因的部分碱基序列信息，以编码包含作为基本构成成分的n末端区域、中央区域、和c末端区域的碱基序列的方式再构成而得的重组基因。
[0091]
在作为分泌蛋白质表达m-rbfib h蛋白质的情况下，如前所述在m-rbfib h蛋白质的n末端侧包含信号肽，因而rbfib h基因也可以在rbfib h基因的5’末端包含编码信号肽的信号dna。
[0092]
本说明书中的rbfib h基因只要编码第1方案所记载的rbfib h蛋白质，就不限定其碱基序列。作为rbfib h基因的具体碱基序列的例子，可列举后述的实施例中构建的作为bw592基因的序列号14所示的碱基序列、或作为bw753基因的序列号22所示的碱基酸序列。
[0093]
2-2-2.改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链(m-rbfib h)基因的构成
[0094]
本方案的m-rbfib h基因是编码所述m-rbfib h蛋白质的基因。本说明书中的m-rbfib h基因只要编码第1方案的m-rbfib h蛋白质，就不限定其碱基序列。作为m-rbfib h基因的具体的碱基序列的例子，可列举后述的实施例中构建的作为bw592δn基因的序列号16所示的碱基序列、作为bw592δc基因的序列号18所示的碱基序列、作为bw753δn基因的
序列号24所示的碱基序列、或作为bw753δc基因的序列号26所示的碱基酸序列。
[0095]
3.改变型蓑蛾虫fib h链基因表达载体(m-rbfib h基因表达载体)
[0096]
3-1.概要
[0097]
本发明的第3方案是m-rbfib h基因表达载体。本发明的表达载体以能够在大肠杆菌等宿主细胞内表达的状态包含第2方案所记载的m-rbfib h基因。
[0098]
通过将本发明的表达载体导入宿主，其转化体与rbfib h基因表达载体的转化相比能够生产15倍以上的m-rbfib h蛋白质。
[0099]
3-2.构成
[0100]
3-2-1.改变型蓑蛾虫fib h基因表达载体的构成要素
[0101]
本发明的m-rbfib h基因表达载体以能够在宿主细胞内表达m-rbfib h基因的方式构成。本方案的m-rbfib h基因表达载体包含核心载体、m-rbfib h基因、和启动子作为必须的构成成分。另外，可以包含终止子、增强子、多克隆位点、筛选标志物、多聚腺苷化信号、核糖体结合位点、复制起点等作为选择性构成成分。以下，对于本方案的m-rbfib h基因表达载体的各构成成分具体进行说明。
[0102]
(1)核心载体
[0103]
核心载体是构成本方案的m-rbfib h基因表达载体的骨架部分的载体。核心载体可以利用各种载体。例如，质粒或杆状病毒穿梭载体(bacmid)这样的能自主复制的载体、病毒载体、或能够在染色体中进行同源重组的载体。通常质粒就足够。作为核心载体，一般选择能够在所导入的宿主生物的细胞内复制的载体。另外，核心载体也可以是能够在大肠杆菌等其他细菌与节肢动物之间复制的穿梭载体。进而，
ライフサイエンスメーカー
等各公司销售像pet系统这样的在核心载体中已经插入有后述的启动子、终止子、多克隆位点、筛选标志物等的蛋白质表达用载体，也可以利用他们作为m-rbfib h基因表达载体。
[0104]
(2)m-rbfib h基因
[0105]
本发明的m-rbfib h基因表达载体所包含的m-rbfib h基因是上述第2方案中记载的m-rbfib h基因。因此，这里的说明省略。
[0106]
m-rbfib h基因在m-rbfib h基因表达载体中配置在下述的启动子控制下。
[0107]
(3)启动子
[0108]
m-rbfib h基因表达载体所包含的启动子是在本发明的m-rbfib h基因表达载体中控制m-rbfib h基因的表达的必须构成成分。启动子只要是在宿主细胞内具有转录控制功能的启动子就不特别限定。使用该领域公知的启动子即可。一般已知例如，能够在宿主内过表达目的基因的过表达型启动子、能够组成型表达的结构性活性型启动子、以及能够自由表达控制的表达诱导型启动子等。可以使用任意启动子，可以考虑本发明的m-rbfib h基因表达载体的使用用途而适当确定。
[0109]
(4)终止子
[0110]
终止子由在本发明的m-rbfib h基因表达载体中在m-rbfib h基因表达时能够终止其转录的碱基序列构成。只要是能够终止由启动子所转录的m-rbfib h基因的转录的序列就不特别限定。
[0111]
(5)增强子
[0112]
增强子是控制启动子的调节因子，是本发明的m-rbfib h基因表达载体中的选择
性构成成分。增强子在m-rbfib h基因表达载体内可以配置在能够控制启动子的位置。
[0113]
(6)多克隆位点
[0114]
多克隆位点是包含多个克隆用限制性酶位点的簇区域，是本发明的m-rbfib h基因表达载体中的选择构成成分。对于构成多克隆位点的碱基序列、所包含的限制性酶位点的种类和数量没有特别限制。另外，对于m-rbfib h基因表达载体中的多克隆位点的数量、所配置的位置也不限制，但优选以能够表达m-rbfib h基因的状态在m-rbfib h基因表达载体中至少预先配置在启动子的控制区域范围内。
[0115]
(7)选择标志物
[0116]
选择标志物可以作为显示宿主保持有本发明的m-rbfib h基因表达载体的确认用标志物发挥功能。选择标志物一般利用编码酶、荧光蛋白质、色素合成蛋白质或发光蛋白质等的基因。例如，耐药性基因(例如，四环素耐性基因、氨苄青霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、潮霉素耐性基因、壮观霉素耐性基因、氯霉素耐性基因或新霉素耐性基因)、营养素基因(例如，亮氨酸、尿嘧啶、腺嘌呤、组氨酸、赖氨酸或色氨酸的生物合成基因)、荧光或发光报告物基因(例如，萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)、或gfp)、酶基因(新霉素磷酸转移酶ii(npt ii)、二氢叶酸还原酶等)、杀稻瘟素s耐性基因等酶基因。一个m-rbfib h基因表达载体可以包含相同或不同的多个选择标志物。
[0117]“选择标志物”可以作为在第3方案的转化体或其后代中确认宿主具有本方案的m-rbfib h基因表达载体时的标志物发挥功能。
[0118]
3-3.m-rbfib h基因表达的载体构建
[0119]
m-rbfib h基因表达载体可以使用该领域公知的基因重组技术来构建。虽然不限定，但一般是将所得的m-rbfib h基因的双末端用适当的限制性酶进行切割处理之后，进行纯化，插入在核心载体中的启动子控制下、并且能够与其限制位点连接的限制位点的方法。
[0120]
4.转化体或其后代
[0121]
4-1.概要
[0122]
本发明的第4方案是通过导入m-rbfib h基因表达载体而转化了的转化体或其后代。本发明的转化体或其后代的特征在于，在细胞内包含第3方案的m-rbfib h基因表达载体。
[0123]
本发明的转化体或其后代能够大量生产与rbfib h蛋白质具有相同或类似的物性的m-rbfib h蛋白质。因此，能够作为rbfib h蛋白质的大量生产体系利用。
[0124]
4-2.构成
[0125]
本发明的转化体在细胞内包含第3方案的m-rbfib h基因表达载体。即，通过导入第3方案的m-rbfib h基因表达载体而被转化后的宿主成为本方案的转化体。因此，本方案的转化体由宿主和第3方案的m-rbfib h基因表达载体构成。
[0126]
另外，“其后代”是转化体的后代，是指转化体的后代个体。
[0127]
以下，分别进行具体说明。
[0128]
(1)宿主
[0129]
构成本发明的转化体的宿主只要是能够表达包含在m-rbfib h基因表达载体中的m-rbfib h基因的微生物或细胞，就不特别限制。如果宿主是微生物，则可列举例如，大肠杆菌(escherichia coli)、枯草杆菌(bacillus subtilis)这样的原核细胞生物，芽殖酵母
(saccharomyces cerevisiae)或裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)这样的真菌。另外，如果宿主是真核细胞，则可列举昆虫细胞(例如，sf9、sf21、sf
+
、high-five、bmn4)等培养细胞。
[0130]
(2)m-rbfib h基因表达载体
[0131]
本发明的转化体或其后代所包含的m-rbfib h基因表达载体是第3方案所记载的m-rbfib h基因表达载体。m-rbfib h基因表达载体也可以整合到宿主基因组内。
[0132]
(3)后代
[0133]
本说明书中所谓“后代”，是指后代个体。后代个体包含通过分裂个体等而产生的无性繁殖个体、和通过有性繁殖而产生的有性繁殖个体的全部。
[0134]
本方案中的“转化体的后代”，是指在转化体的后代个体中，在其细胞内保持有第3方案的m-rbfib h基因表达载体。后代只要保持有第3方案的m-rbfib h基因表达载体，就不限制其世代数。
[0135]
4-3.转化体的制作方法
[0136]
本发明的转化体的制作通过对宿主导入m-rbfib h基因表达载体而进行。m-rbfib h基因表达载体的导入方法使用适合所导入的宿主的公知的导入方法即可。作为在细菌、酵母中导入该载体的方法，可列举例如，热休克法、钙离子法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法等。这些技术均为该领域公知，在各种文献中记载。例如，参照green&sambrook,molecular cloning:a laboratory manual,4th ed.,(2012),cold spring harbor laboratory press所记载的方法即可。另外，作为在细胞中导入该载体的方法，适合使用例如，脂质体转染法(pnas,1989,86:6077；pnas,1987,84:7413)、电穿孔法、磷酸钙法(virology,1973,52:456-467)、脂质体法、deae-葡聚糖法等。
[0137]
5.改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链蛋白质(m-rbfib h蛋白质)的制造方法
[0138]
5-1.概要
[0139]
本发明的第5方案是m-rbfib h蛋白质的制造方法。本制造方法中获得的m-rbfib h蛋白质是蓑蛾虫丝产业上的目的蛋白质。根据本方案的制造方法，可以在大肠杆菌等的转化体细胞内大量生产m-rbfib h蛋白质。
[0140]
5-2.方法
[0141]
本方案的制造方法包括培养工序和制备工序作为必须的工序。以下对于各工序进行说明。
[0142]
(1)培养工序
[0143]“培养工序”是指将第4方案的转化体或其后代在规定的条件下进行培养的工序。规定的条件是指转化体的宿主的最适培养条件。例如，如果宿主是大肠杆菌，则是指在lb培养基等公知培养基中接菌后，一边在37℃进行通气处理，一边培养6小时～12小时培养的条件。该培养条件可以根据宿主的种类通过公知的方法适当应用最适培养方法。
[0144]
本工序也可以包含表达诱导步骤。“表达诱导步骤”是诱导插入了m-rbfib h基因表达载体中的m-rbfib h基因的表达的步骤。本步骤根据在m-rbfib h基因表达载体内控制m-rbfib h基因的表达的启动子的种类而确定其是否必要。例如，在启动子是表达诱导型启动子的情况下，需要本步骤。另一方面，在启动子是结构性活性型启动子的情况下，由于在转化体内组成型地表达m-rbfib h基因，因而不需要本步骤。表达诱导方法根据表达诱导型
启动子的性质进行即可。例如，m-rbfib h基因表达载体在使用了t7 rna聚合物和t7启动子的pet系统下配置m-rbfib h基因的情况下，通过在培养基中添加iptg等表达诱导剂，从而pet系统中的lac启动子被激活，强烈地促进在其控制下配置的插入基因(这里为m-rbfib h基因)的转录。这些均是公知的蛋白质表达方法，参照前述的green&sambrook,2012即可。
[0145]
(2)制备工序
[0146]“制备工序”是从培养工序之后的培养液和/或转化体制备m-rbfib h蛋白质的制备工序。在m-rbfib h基因载体所含的m-rbfib h基因包含信号dna的情况下，表达出的m-rbfib h蛋白质被分泌到细胞外，因而生物合成出的m-rbfib h蛋白质的大部分存在于培养液中。另一方面，在m-rbfib h基因不包含信号dna的情况下，生物合成出的m-rbfib h蛋白质积累在宿主细胞内。本工序是回收存在于培养液或转化体细胞内的m-rbfib h蛋白质的工序。
[0147]
从培养液回收目的m-rbfib h蛋白质的方法可以使用该领域公知的蛋白质纯化方法。例如，通过适当选择硫酸铵盐析法、离子交换层析、亲和层析、凝胶层析等方法或将它们组合，从而可以获得纯化的m-rbfib h蛋白质。另外，关于提取积累于宿主细胞内的m-rbfib h蛋白质的方法，可以将宿主细胞通过物理和/或化学处理破坏后，从细胞溶解液的上清使用与上述同样的蛋白质纯化方法进行纯化。这些蛋白质纯化方法也均是公知的，可以参照methods in enzymology,vol.463,:guide to protein purification2nd ed.,(2009)。
[0148]
实施例
[0149]
＜实施例1：重组蓑蛾虫丝心蛋白h基因的构建＞
[0150]
(目的)
[0151]
使用日本特开2018-074403中鉴定的蓑蛾虫fib h基因的碱基信息，新克隆出蓑蛾虫fib h基因，然后构建rbfib h基因。
[0152]
(方法)
[0153]
从大蓑蛾的终龄幼虫摘取丝腺，使用rneasy mini kit(qiagen社)提取总rna。接着，以总rna为模板，以随机六聚体作为引物，使用superscript iii first-strand synthesis supermix(invitrogen社)来制作大蓑蛾的cdna文库。
[0154]
(1)bfib h基因的5'末端区域的克隆
[0155]
为了克隆bfib h基因的5'末端侧的cdna，设计了由序列号30和31构成的pcr引物对。使用该引物对和primestar gxl dna聚合酶(
タカラバイオ
社)通过使用说明书记载的标准方案(98℃、2分钟
→
[98℃、10秒
→
68℃、2分钟]
×
30循环
→
68℃、2分钟
→
4℃)进行pcr。将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离之后，切下约1,600bp的条带，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)，提取和纯化dna片段。将所得的dna片段使用mighty cloning reagent set(blunt end)(
タカラバイオ
社)插入puc118载体的hincii位点，制备包含bfib h基因的5'末端区域的质粒载体“puc118-bw-n”。接着，确定插入片段的碱基序列。其结果弄清楚了由序列号32所示的1,608bp组成的bfib h基因的5'末端区域的碱基序列信息。该5'末端区域从bfib h蛋白质的n末端侧开始依次编码信号序列、n末端区域、和中央重复区域的一部分。
[0156]
接下来，为了除掉信号序列的编码区域，以puc118-bw-n为模板，设计了添加有限制性酶切割序列的由序列号33和34所示的碱基序列构成的pcr引物对。使用该引物对和
primestar gxl dna聚合酶(
タカラバイオ
社)进行pcr。将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，结果获得了约600pb的短条带和约1kb的长条带。切下各个条带之后，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)提取和纯化dna片段。然后，使用dna ligation kit,mighty mix(
タカラバイオ
社)，将约600pb和约1kb的dna片段插入puc118载体的hincii位点。将所得的质粒载体分别称为“puc118-bw-n-s”和“puc118-bw-n-l”。确认了各个质粒载体中的插入片段的碱基序列，结果弄清楚了序列号35所示的585bp的碱基序列信息、和序列号36所示的1,068bp的碱基序列信息。
[0157]
(2)bfib h基因的3'末端区域的克隆
[0158]
为了克隆bfib h基因的3'末端侧的cdna，设计了由序列号37和38构成的pcr引物对。使用该引物对和primestar gxl dna聚合酶(
タカラバイオ
社)通过使用说明书记载的标准方案(98℃、2分钟
→
[98℃、10秒
→
68℃、2分钟]
×
30循环
→
68℃、2分钟
→
4℃)进行pcr。将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离之后，切下约1,200bp的条带，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)，提取和纯化dna片段。将所得的dna片段使用mighty cloning reagent set(blunt end)(
タカラバイオ
社)插入puc118载体的hincii位点，制备包含bfib h基因的3'末端区域的质粒载体“puc118-bw-c”。接着，确定插入片段的碱基序列。其结果搞清楚了由序列号39所示的1,179bp组成的bfib h基因的3'末端区域的碱基序列信息。该3'末端区域从bfib h蛋白质的n末端侧开始依次编码中央重复区域的一部分、和c末端区域。
[0159]
(3)rbfib h基因的构建
[0160]
(i)为了构建rbfib h基因，将(1)中制备的puc118-bw-n-s通过nhei/hindiii进行处理。将切割产物用琼脂糖凝胶电泳分离之后，将puc118-bw-n-s来源的585bp的条带从凝胶切下，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)提取和纯化dna片段。将所得的puc118-bw-n-s来源的dna片段称为“bw-n-s(n/h)”。接下来，将(2)中制备的puc118-bw-c通过nhei/hindiii进行切割处理。将所得的开环状质粒载体称为“puc118-bw-c(n/h)”，使该puc118-bw-c(n/h)与上述bw-n-s(n/h)进行连接反应，获得“puc118-bw592”克隆载体。
[0161]
(ii)将所述puc118-bw592用ecori/nhei处理，获得仅包含3'末端侧基因的克隆载体“puc118-bw592-c”。将(1)中制备的puc118-bw-n-l用相同的限制性酶切割。将1068bp的条带从凝胶切下，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)提取和纯化dna片段。将所得的来源于puc118-bw-n-l、相当于bfib h基因的5'末端区域的dna片段称为“bw-n-l(e/n)”。使puc118-bw592-c与bw-n-l(e/n)进行连接反应而获得“puc118-bw753”克隆载体。puc118-bw592和puc118-bw753是分别编码大蓑蛾来源的分别由592氨基酸和753氨基酸组成的rbfib h蛋白质的碱基数不同的rbfib h基因。本说明书中，将基因分别表述为“bw592基因”(序列号14)和“bw753基因”(序列号22)。另外，由bw592基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw592蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号15。bw592蛋白质如图1所示，由bfib h蛋白质的n末端区域、3个中央重复区域、和c末端区域组成。另一方面，由bw753基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw753蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号23。bw753蛋白质如图1所示，由bfib h蛋白质的n末端区域、4个中央重复区域、和c末端区域组成。
[0162]
＜实施例2：重组蓑蛾虫丝心蛋白h链基因表达载体的构建和大肠杆菌转化体的制备＞
[0163]
(目的)
[0164]
构建以能够表达的状态包含实施例1中克隆的rbfib h基因的基因表达载体。另外，将该基因表达载体导入作为宿主的大肠杆菌中，制备能够表达rbfib h基因的大肠杆菌转化体。
[0165]
(方法)
[0166]
(1)rbfib h基因表达载体的构建
[0167]
为了在大肠杆菌中表达实施例1的(3)中制备的bw592基因和bw753基因，将puc118-bw592和puc118-bw753的各克隆载体用ncoi/xhoi处理，获得bw592和bw753的dna片段。接着，将表达载体pet-22b(+)(novagen社)同样地用ncoi/xhoi处理之后，在该位点分别插入bw592和bw753。将所得的表达载体分别称为“pet-22b-bw592”和“pet-22b-bw753”。
[0168]
(2)表达rbfib h基因的大肠杆菌转化体的制备
[0169]
将(1)中构建的各rbfib h基因表达载体纯化后，使用常规方法导入大肠杆菌bl21(de3)株、blr(de3)株、和rosetta2(de3)株(均为novagen社)的细胞内，制备能够表达rbfib h基因的大肠杆菌转化体(rbfib h表达大肠杆菌株)。
[0170]
＜实施例3：改变型重组蓑蛾虫丝心蛋白h链基因表达载体的构建和大肠杆菌转化体的制备＞
[0171]
(目的)
[0172]
构建对实施例1中克隆的rbfib h基因加入了各种突变的改变型rbfib h基因(m-rbfib h基因)。另外，将该基因表达载体导入作为宿主的大肠杆菌中，制备能够表达m-rbfib h基因的大肠杆菌转化体。
[0173]
(方法)
[0174]
(1)m-rbfib hδc基因表达载体的构建
[0175]
对于作为rbfib h基因的bw592基因和bw753基因，分别通过pcr法制作在维持与丝的物性相关性高的中央重复区域的同时缺失了编码c末端区域的碱基序列的rbfib h基因的δc末端缺失型改变体(表述为“m-rbfib hδc基因”)。
[0176]
以实施例2中构建的pet-22b-bw592和pet-22b-bw753作为模板，使用在n5'末端侧添加了coi/xhoi切割位点的引物对(序列号40和41)进行pcr。将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所预测的大小的条带，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)提取和纯化dna片段。将所得的dna片段用ncoi/xhoi处理，获得作为bw592和bw753的δc改变体的“bw592δc”(序列号18)和“bw753δc”(序列号26)的ncoi/xhoi-dna片段。将这些dna片段分别插入到用ncoi/xhoi处理后的pet-22b(+)(novagen社)的ncoi/xhoi位点。将所得的表达载体分别称为“pet-22b-bw592δc”和“pet-22b-bw753δc”。此外，由bw592δc基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw592δc蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号19。另外，由bw753δc基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw753δc蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号27。
[0177]
(2)m-rbfib hδn基因表达载体的构建
[0178]
对于作为rbfib h基因的bw592基因和bw753基因，分别通过pcr法分别制作在维持
与丝的物性相关性高的中央重复区域的同时缺失了编码n末端区域的碱基序列的rbfib h基因的δn末端缺失型改变体(表述为“m-rbfib hδn基因”)。
[0179]
以实施例2中构建的pet-22b-bw592和pet-22b-bw753作为模板，使用在5’末端侧添加了ncoi/xhoi切割位点的引物对(序列号42和43)进行pcr。将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后，切下预测的大小的条带，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)提取和纯化dna片段。将所得的dna片段用ncoi/xhoi处理，获得作为bw592和bw753的δn改变体的“bw592δn”(序列号16)和“bw753δn”(序列号24)的ncoi/xhoi-dna片段。将这些dna片段分别插入用ncoi/xhoi处理后的pet-22b(+)(novagen社)的ncoi/xhoi位点。将所得的表达载体分别称为“pet-22b-bw592δn”和“pet-22b-bw753δn”。此外，由bw592δn基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw592δn蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号17。另外，由bw753δn基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw753δn蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号25。
[0180]
(3)m-rbfib hδn/c基因表达载体的构建
[0181]
对于作为rbfib h基因的bw592基因和bw753基因，分别通过pcr法制作在仅维持与丝的物性相关性高的中央重复区域的同时缺失了分别编码n末端区域和c末端区域的碱基序列的rbfib h基因的双末端缺失型改变体(表述为“m-rbfib hδn/c基因”)。
[0182]
以实施例2中构建的pet-22b-bw592和pet-22b-bw753作为模板，使用引物对(序列号42和41)进行pcr。将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离后，切下预测的大小的条带，使用wizard(注册商标)sv gel and pcr clean-up system(promega社)提取和纯化dna片段。将所得的dna片段用ncoi/xhoi处理，获得作为bw592和bw753的δn/c改变体的“bw592δn/c”(序列号20)和“bw753δn/c”(序列号28)的ncoi/xhoi-dna片段。将这些dna片段分别插入用ncoi/xhoi处理后的pet-22b(+)(novagen社)的ncoi/xhoi位点。将所得的表达载体分别称为“pet-22b-bw592δn/c”和“pet-22b-bw753δn/c”。此外，由bw592δn/c基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw592δn/c蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号21。另外，由bw753δn/c基因编码的rbfib h蛋白质表述为“bw753δn/c蛋白质”，将其氨基酸序列示于序列号29。
[0183]
(4)表达rbfib h基因的大肠杆菌转化体的制备
[0184]
将(1)～(3)中构建的各m-rbfib h基因表达载体纯化后，使用常规方法导入大肠杆菌bl21(de3)株(novagen社)的细胞内，从而制备能够表达m-rbfib h基因的大肠杆菌转化体(m-rbfib h表达大肠杆菌株)。将导入有bw592基因、bw592δn基因、bw592δc基因、bw592δn/c基因、bw753基因、bw753δn基因、bw753δc基因、和bw753δn/c基因的转化体分别表述为bw592株、bw592δn株、bw592δc株、bw592δn/c株、bw753株、bw753δn株、bw753δc株、和bw753δn/c株。
[0185]
＜实施例4：使用大肠杆菌转化体的bfib h蛋白质的表达量的验证＞
[0186]
(目的)
[0187]
在实施例2和3中制备的各种rbfib h表达大肠杆菌株或m-rbfib h表达大肠杆菌株中表达rbfib h蛋白质或m-rbfib h蛋白质，验证其表达量。
[0188]
(方法)
[0189]
将实施例2和3中制备的各种rbfib h表达大肠杆菌株(bw592株、bw753株)或m-rbfib h表达大肠杆菌株(bw592δn株、bw592δc株、bw592δn/c株、bw753δn株、bw753δc
株、和bw753δn/c株)分别接种于lb培养基(thermo fisher scientific社)，在37℃培养后，使用wpa co8000 cell dense meter(biowave社)测定浊度。在浊度达到0.4～0.6的时间点，添加iptg使其终浓度为1mm，进而在25℃培养4小时。培养后，通过离心集菌，悬浮于添加有增溶用缓冲液(lysonase(merck社)和pmsf(sigma-aldrich社)的bugbuster reagent(merck社))中，在室温放置10分钟后，在4℃以20,000
×
g离心15分钟，回收上清。将上清用10％或12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将所分离的肽使用trans-blot turbo转录系统(bio-rad社)以1.3a、25v、7分钟的外施电压条件转印至pvdf膜。
[0190]
在实施例2和3中制备的大肠杆菌株中，由各表达载体表达的rbfib h蛋白质或m-rbfib h蛋白质均在c末端具有his6标签。因此，在将转印处理后的pvdf膜用脱脂乳封闭处理后，使用5,000倍稀释的hrp标记抗his抗体(anti-his-tag mab-hrp-direct；mbl社)，按照附带方案使其反应。接着，使用发光底物western lightning plus-ecl(perkin elmer社)，进行基于hrp活性的发光反应。
[0191]
(结果)
[0192]
将结果示于图2。由该图可见，在表达未加入改变的rbfib h蛋白质的bw592株中，目的rbfib h蛋白质虽然表达，但其量不多(道1)。在大肠杆菌中表达包含fib h蛋白质的基本构成成分的rbfib h蛋白质的情况下，似乎通过某种控制机制发挥表达抑制作用。该未知的控制机制对于在微生物表达体系等中大量生产rbfib h蛋白质这样的本发明的目的极为不适合。
[0193]
另一方面，在表达从fib h蛋白质除去了n末端区域的m-rbfib h-bw592δn蛋白质的bw592δn株中，m-rbfib h-bw592δn蛋白质的表达量显著增加，也没有发现m-rbfib h-bw592δn蛋白质的分解(道3)。因此表明了，为了大量生产具有蛋白酶耐性的rbfib h蛋白质，使用编码除去了n末区域的全部或一部分的m-rbfib h-bw592δn蛋白质的基因即可。
[0194]
与此相对，在表达从fib h蛋白质除去了c末端区域的m-rbfib h-bw592δc蛋白质的bw592δc株中，与bw592δn株不同，确认了多个m-rbfib h-bw592δc蛋白质的分解产物(道2)。该结果提示，c末区域有助于rbfib h蛋白质的蛋白酶分解耐性。然而，在bw592δc株中，确认了高于其分解量的压倒性的量的m-rbfib h-bw592δc蛋白质的表达。因此搞清楚了，为了大量生产rbfib h蛋白质，使用编码除去了c末区域的全部或一部分的m-rbfib h-bw592δc蛋白质的基因，在表达之后提取非分解产物即可。
[0195]
进而，在表达除去了fib h蛋白质的n末端和c末端的两区域、实质上仅为中央区域的m-rbfib h-bw592δn/c蛋白质的bw592δn/c株中，也验证了m-rbfib h蛋白质的表达量。其结果是，虽然比表达rbfib h蛋白质的bw592株表达量提高，但同时分解产物量也增加。另一方面，没有确认到像bw592δc株那样剧烈的m-rbfib h-bw592δn/c蛋白质的表达量提高(道4)。
[0196]
上述倾向在bw753株、bw753δn株、bw753δc株、和bw753δn/c株中也同样(未图示)。
[0197]
因此，将bw592株与bw592δc株、和bw753株与bw753δc株中的发光强度使用
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社)进行定量化，通过仪器附带的专用软件(v.1.2)进行计算之后，求出各自的rbfib h蛋白质量和m-rbfib h蛋白质量的表达量。结果示于表1。
[0198]
表1
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转化体表达量(相对值)bw5921.0bw592δc20.4bw7531.0bw592δc16.2
[0200]
(n＝4)
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表1中，显示将大肠杆菌中表达的bw592株和bw753株的表达量设为1时的、bw592δc株、bw753δc株各自的相对表达量。在bw592δc株中确认了bw592株的约20倍的表达量增大，在bw753δc株中确认了bw753的约16倍的表达量增大。bw592δc株与bw753δc株的差异仅为cru的数。
[0202]
由以上的结果显示，在大肠杆菌等微生物细胞内表达rbfib h蛋白质的情况下，通过与cru的数无关地使用编码除去了n末端区域、或c末端区域的任意一方的全部、或一部分的m-rbfib h蛋白质的基因，能够增强该m-rbfib h蛋白质的表达量。另一方面弄清楚了，在除去了双末端的情况下，虽然表达量比rbfib h蛋白质增加，但分解量也增加，造成相对表达量减少。
[0203]
本说明书中引用的全部出版物、专利和专利申请均直接通过引用而纳入本说明书中。