四唑取代的吡唑并嘧啶类JAK激酶抑制剂及其用途的制作方法

四唑取代的吡唑并嘧啶类jak激酶抑制剂及其用途
1.相关申请的交叉引用
2.本专利申请要求提交于2019年6月18日的国际专利申请序列号pct/cn2019/091709以及提交于2020年6月8日的美国临时专利申请号63/036,046的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及作为詹纳斯激酶(janus kinase)(诸如jak1和jak2)抑制剂的化合物，包含这些化合物的组合物，以及使用方法，该使用方法包括但不限于诊断或治疗患有应答jak激酶的抑制的病症的患者。


背景技术：

4.细胞因子通路介导广泛的生物学功能，包括炎症和免疫的许多方面。詹纳斯激酶(jak)(包括jak1、jak2、jak3和tyk2)是与i型和ii型细胞因子受体缔合并调节细胞因子信号转导的细胞质蛋白激酶。细胞因子与同源受体的结合触发缔合受体的jak的活化，并且这导致信号转导物和转录激活因子(signal transducer and activator of transcription；stat)蛋白的jak介导的酪氨酸磷酸化以及特定基因集的最终转录激活(schindler et al.,2007,j.biol.chem.282：20059-63)。jak1、jak2和tyk2表现出广泛的基因表达模式，而jak3表达仅限于白细胞。细胞因子受体通常作为异二聚体发挥作用，并且因此通常多于一种类型的jak激酶与细胞因子受体复合物缔合。与不同细胞因子受体复合物缔合的特异性jak已在许多情况下通过遗传学研究得以确定，并得到了其他实验证据的证实。抑制jak酶的示例性治疗益处在例如国际专利申请号wo 2013/014567中进行了讨论。
5.jak1最初是在筛选新激酶的过程中被鉴定出的(wilks a.f.,1989,proc.natl.acad.sci.u.s.a.86:1603-1607)。遗传和生物化学研究已表明，jak1与i型干扰素(例如，ifnα)、ii型干扰素(例如，ifnγ)以及il-2和il-6细胞因子受体复合物功能性地及物理性地缔合(kisseleva et al.,2002,gene 285:1-24；levy et al.,2005,nat.rev.mol.cell biol.3:651-662；o'shea et al.,2002,cell,109(suppl.):s121-s131)。敲除jak1的小鼠由于lif受体信号转导缺陷而在围产期死亡(kisseleva et al.,2002,gene 285:1-24；o’shea et al.,2002,cell,109(suppl.):s121-s131)。来源于敲除jak1的小鼠的组织的表征证明了该激酶在ifn、il-10、il-2/il-4和il-6通路中的关键作用。一种靶向il-6通路的人源化单克隆抗体(托珠单抗)被欧洲委员会批准用于治疗中度至重度类风湿性关节炎(scheinecker et al.，2009，nat.rev.drug discov.8:273-274)。
6.cd4 t细胞通过在肺内产生包括il-4、il-9和il-13在内的th2细胞因子而在哮喘发病中发挥重要作用(cohn et al.,2004,annu.rev.immunol.22:789-815)。il-4及il-13的诱导作用使黏液产生增多、嗜酸性粒细胞募集到肺以及ige产生增多(kasaian et al.,2008,biochem.pharmacol.76(2):147-155)。il-9导致肥大细胞活化，这加剧了哮喘症状(kearley et al.,2011,am.j.resp.crit.care med.,183(7):865-875)。当分别与共同γ
链或il-13rα1链组合时，il-4rα链使jak1活化并与il-4或il-13结合(pernis et al.,2002,j.clin.invest.109(10):1279-1283)。共同γ链也可以与il-9rα组合以结合il-9，并且il-9rα也使jak1活化(demoulin et al.,1996,mol.cell biol.16(9):4710-4716)。虽然共同γ链使jak3活化，但据证实jak1优于jak3，并且尽管jak3有活性，但是对jak1的抑制足以使经由共同γ链的信号转导失活(haan et al.,2011,chem.biol.18(3):314-323)。通过阻断jak/stat信号转导通路来抑制il-4、il-13和il-9信号转导可以减轻临床前肺部炎症模型中的哮喘症状(mathew et al.,2001,j.exp.med.193(9):1087-1096；kudlacz et.al.,2008,eur.j.pharmacol.582(1-3):154-161)。
7.生物化学和遗传学研究已表明了jak2与单链(例如，epo)、il-3和干扰素γ细胞因子受体家族之间的关联(kisseleva et al.,2002,gene 285:1-24；levy et al.,2005,nat.rev.mol.cell biol.3:651-662；o’shea et al.,2002,cell,109(suppl.):s121-s131)。与此一致，敲除jak2的小鼠死于贫血(o’shea et al.,2002,cell,109(suppl.):s121-s131)。jak2激酶激活突变(例如，jak2v617f)与人类骨髓增生性疾患相关。另外，jak2与细胞因子诸如il-5及胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)的受体缔合。il-5是负责嗜酸性细胞的分化、生长、活化、存活、及募集至气道的关键细胞因子(pelaia et al.,2019,front.physiol.,10:1514；stirling et al.,2001,am.j.respir.crit.care med.,164:1403
–
9；fulkerson and rothenberg,2013,nat.rev.drug discov.,12:117
–
9.；varricchi and canonica,2016,expert.rev.clin.immunol.,12:903
–
5)。已批准三种靶向il-5(美泊利单抗(mepolizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab))或其受体的α链(benralizumab)的单克隆抗体药物用于治疗具有嗜酸性表型的哮喘。tslp是在调控ii型免疫力方面起重要作用且充当th2细胞因子产生的上游警报蛋白的上皮细胞源性细胞因子(kitajima et al.,2011,eur j immunol.,41:1862-71)。tezepelumab是tslp的拮抗剂抗体。2期试验的结果指示其成功减少具有及不具有2型高标识的患者中的哮喘加重(corren et al.,2017,377:936-46)。
8.jak3仅与γ共同细胞因子受体链缔合，该γ共同细胞因子受体链存在于il-2、il-4、il-7、il-9、il-15和il-21细胞因子受体复合物中。jak3对淋巴样细胞的发育和增殖至关重要，并且jak3突变导致严重的联合免疫缺陷(scid)(o’shea et al.,2002,cell,109(suppl.):s121-s131)。基于其在调节淋巴细胞中的作用，jak3和jak3介导的通路已被靶向用于免疫抑制适应症(例如，移植排斥和类风湿性关节炎)(baslund et al.,2005,arthritis&rheumatism 52:2686-2692；changelian et al.,2003,science 302:875-878)。
9.tyk2与i型干扰素(例如，ifnα)、il-6、il-10、il-12和il-23细胞因子受体复合物缔合(kisseleva et al.,2002,gene 285:1-24；watford,w.t.&o’shea,j.j.,2006,immunity 25:695-697)。与此一致，来源于tyk2缺陷型人的原代细胞在i型干扰素、il-6、il-10、il-12和il-23信号转导方面有缺陷。一种靶向il-12和il-23细胞因子的共有p40亚单位的全人单克隆抗体(优特克单抗)最近被欧洲委员会批准用于治疗中度至重度斑块状银屑病(krueger et al.,2007,n.engl.j.med.356:580-92；reich et al.,2009,nat.rev.drug discov.8:355-356)。此外，对靶向il-12和il-23通路的抗体进行了治疗克罗恩病的临床试验(mannon et al.,2004,n.engl.j.med.351:2069-79)。
10.国际专利申请公开号wo 2010/051549、wo 2011/003065、wo 2015/177326和wo 2017/089390讨论了据报道可用作一种或多种詹纳斯激酶的抑制剂的某些吡唑并嘧啶化合物。其中提供了显示出对jak1、jak2、jak3和/或tyk2激酶的抑制作用的某些特定化合物的数据。
11.目前，仍然需要作为詹纳斯激酶抑制剂的其他化合物。例如，需要具有作为一种或多种詹纳斯激酶(例如，jak1和jak2)的抑制剂的有用效力的化合物与实现有用的治疗益处所必需的其他药理学性质的组合。例如，一般来说，需要表现出相对于其他激酶对一种詹纳斯激酶的选择性更高(例如，相对于其他激酶诸如富含亮氨酸的重复激酶2(lrrk2)对jak1和/或jak2的选择性更高)的有效化合物。还需要表现出相对于其他詹纳斯激酶对一种詹纳斯激酶的选择性更高(例如，相对于jak3和/或tyk2对jak1和/或jak2的选择性更高)的有效化合物。表现出相对于jak3和tyk2对jak1和jak2的选择性更高的化合物可提供响应于jak1抑制的病症的治疗益处。此外，目前需要具有制剂和吸入施用所必需的其他性质(例如，熔点、pk、溶解度等)的有效jak1抑制剂。此类化合物对于治疗例如哮喘的病症特别有用。
12.因此，本领域需要对诸如上述那些的jak激酶介导的病症进行附加的或替代的治疗。特别需要可用于吸入递送以治疗气道炎症适应症诸如哮喘的jak1及jak2激酶抑制剂。


技术实现要素：

13.本文提供了抑制jak激酶的吡唑并嘧啶，诸如选自式(i)化合物、其立体异构体或盐，诸如其药用盐。jak激酶可以是jak1、jak2或二者。
14.一个实施例提供一种式(i)化合物：
[0015][0016]
或其立体异构体或药用盐，
[0017]
其中：
[0018]
r1是：羟基-c
1-c6烷基；-(cr
a1ra2
)
m-het1；-(cr
a1ra2
)
n-nrbrc；或-(cr
a1ra2
)
m-c
3-6
环烷基，其中c
3-6
环烷基部分经rd取代一次；
[0019]
r2是：卤代；卤代c
1-c6烷氧基；c
1-c6烷基硫代；-sf2；或c
3-c6环烷基；
[0020]
r3是：氢；或c
1-c6烷基；
[0021]
r4是：氢；或c
1-c6烷基；
[0022]
r5是：氢；或c
1-c6烷基；
[0023]
r6是：氢；或c
1-c6烷基；
[0024]
或r2及r6连同其所连接的原子一起可形成含有各自独立地选自o、n及s的两个杂原子的六元环；
[0025]
m是0至2；
[0026]
n是0至3；
[0027]
各r
a1
独立地是：氢；或c
1-c6烷基；
[0028]
各r
a2
独立地是：氢；卤代；或c
1-c6烷基；
[0029]
rb是：氢；或c
1-c6烷基；
[0030]
rc是：氢；c
1-c6烷基；氨基保护基团；或氮杂环丁烷基，其可未经取代或经c
1-c6烷基取代一次；
[0031]
het1是选自以下的杂环基：氮杂环丁烷基；吡咯烷基；哌嗪基；哌啶基；吗啉基；及氧杂环丁烷基；其各自可未经取代或经rd取代一次且经rg取代一次或两次；
[0032]
rd是：-(cr
a1ra2
)
p-het2；-(cr
a1ra2
)
q-nrerf；或-(cr
a1ra2
)
p-c
3-6
环烷基，其中c
3-6
环烷基部分经-nrerf取代一次；
[0033]
p是0至2；
[0034]
q是0至4；
[0035]
re是：氢；或c
1-c6烷基；
[0036]
rf是：氢；c
1-c6烷基；或-ch2c2n(ch3)2；
[0037]
各rg是：c
1-c6烷基；或卤代；并且
[0038]
het2是选自以下的杂环：四氢吡喃；氮杂环丁烷基；及吡咯烷基；其各自可未经取代或经c
1-c6烷基或-nrerf烷基取代一次。
[0039]
在某些实施例中，r1是：c
1-c6烷基；羟基-c
1-c6烷基；-(cr
a1ra2
)
m-het1；或(cr
a1ra2
)
n-nrbrc，其中het1可未经取代或经rd取代一次。
[0040]
还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的jak抑制剂或其药用盐，以及药用运载体、稀释剂或赋形剂。
[0041]
还提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐在治疗中的用途，诸如在炎性疾病(例如，哮喘)的治疗中的用途。还提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。还提供了一种在患者中预防、治疗响应于詹纳斯激酶活性抑制的疾病或病症或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的jak抑制剂或其药用盐。
[0042]
哮喘中最有效的细胞因子(il-4、il-5、il-9、il-13和tslp)都通过jak1和/或jak2进行信号转导。本发明的化合物对jak1和jak2具有活性。该化合物中的某些化合物最佳地对于jak1和jak2均具有良好平衡的共活性或对jak1的亲和力稍高于jak2，而非对该激酶中的一种激酶的活性远大于对另一种激酶的活性。主体化合物也针对已与肺毒性相关的脱靶激酶诸如lrrk2具有良好选择性。
[0043]
虽然许多化合物可在简单生物化学测定中对jak1和jak2均表现出高亲和力，但并非所有此类化合物能有效介导与jak1和jak2缔合的相关细胞因子。本发明的某些化合物除了对jak1和jak2均具有活性之外，还在基于细胞的测定中显示出有效介导与jak1和jak2缔合的哮喘相关细胞因子。
[0044]
本发明的化合物也在肺组织中表现出有利的药代动力学(pk)性质且可用于吸入
疗法。当使用诸如干粉吸入(dpi)或鼻内(in)递送的技术经由吸入通路给药时，某些化合物意外地在肺组织内显示持续滞留，在体循环中的浓度低许多。此类经改进pk特性可有利地减小有效疗法的剂量，且降低给药频率要求。某些化合物的溶解性表现出意想不到的提升，再次提高了在肺内的功效。本发明的某些化合物与其他jak抑制剂相比表现出细胞毒性意想不到的降低。
具体实施方式
[0045]
定义
[0046]“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴或碘。另外，术语如“卤代烷基”意指包括单卤代烷基和多卤代烷基，其中一个或多个卤素取代烷基基团的一个或多个氢。
[0047]
术语“烷基”是指饱和的直链或支链单价烃基，其中该烷基可以任选地被取代。在一个实例中，烷基为1至18个碳原子(c
1-c
18
)。在其他实例中，烷基是c
0-c6、c
0-c5、c
0-c3、c
1-c
12
、c
1-c
10
、c
1-c8、c
1-c6、c
1-c5、c
1-c4或c
1-c3。c0烷基是指键。烷基基团的示例包括甲基(me，-ch3)、乙基(et，-ch2ch3)、1-丙基(n-pr，正丙基，-ch2ch2ch3)、2-丙基(i-pr，异丙基，-ch(ch3)2)、1-丁基(n-bu，正丁基，-ch2ch2ch2ch3)、2-甲基-1-丙基(i-bu，异丁基，-ch2ch(ch3)2)、2-丁基(s-bu，仲丁基，-ch(ch3)ch2ch3)、2-甲基-2-丙基(t-bu，叔丁基，-c(ch3)3)、1-戊基(正戊基，-ch2ch2ch2ch2ch3)、2-戊基(-ch(ch3)ch2ch2ch3)、3-戊基(ch(ch2ch3)2)、2-甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch2ch3)、3-甲基-2-丁基(-ch(ch3)ch(ch3)2)、3-甲基-1-丁基(-ch2ch2ch(ch3)2)、2-甲基-1-丁基(-ch2ch(ch3)ch2ch3)、1-己基(-ch2ch2ch2ch2ch2ch3)、2-己基(-ch(ch3)ch2ch2ch2ch3)、3-己基(-ch(ch2ch3)(ch2ch2ch3))、2-甲基-2-戊基(-c(ch3)2ch2ch2ch3)、3-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch(ch3)ch2ch3)、4-甲基-2-戊基(-ch(ch3)ch2ch(ch3)2)、3-甲基-3-戊基(-c(ch3)(ch2ch3)2)、2-甲基-3-戊基((-ch(ch2ch3)ch(ch3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-c(ch3)2ch(ch3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-ch(ch3)c(ch3)3、1-庚基和1-辛基。在一些实施例中，用于“任选取代的烷基”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、苯基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。
[0048]
术语“烯基”是指具有至少一个不饱和位点(即，碳-碳双键)的直链或支链单价烃基，其中烯基可以任选地被取代，并且包括具有“顺式”和“反式”取向，或者替代地“e”和“z”取向的基团。在一个实例中，烯基是2至18个碳原子(c
2-c
18
)。在其他实例中，烯基是c
2-c
12
、c
2-c
10
、c
2-c8、c
2-c6或c
2-c3。示例包括但不限于乙烯基(ethenyl/vinyl)(-ch＝ch2)、丙-1-烯基(-ch＝chch3)、丙-2-烯基(-ch2ch＝ch2)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁间-1,3-二烯基、2-甲基丁间-1,3-二烯、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基和己-1,3-二烯基。在一些实施例中，用于“任选取代的烯基”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、苯基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。
[0049]
术语“炔基”是指具有至少一个不饱和位点(即碳-碳三键)的直链或支链一价烃基，其中炔基可以任选地被取代。在一个实例中，炔基为两个至十八个碳原子(c
2-c
18
)。在其他实例中，炔基是c
2-c
12
、c
2-c
10
、c
2-c8、c
2-c6或c
2-c3。实例包括但不限于乙炔基(-cch)、丙-1-炔基(-c≡cch3)、丙-2-炔基(炔丙基，-ch2c≡ch)、丁-1-炔基、丁-2-炔基和丁-3-炔基。在一些实施例中，用于“任选取代的炔基”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、苯基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。
[0050]“亚烷基”是指饱和支链或直链烃基团，其具有通过从母体烷烃的相同或两个不同碳原子上移去两个氢原子得到的两个单价自由基中心。在一个实例中，二价亚烷基基团为1至18个碳原子(c
1-c
18
)。在其他实例中，二价亚烷基基团是c
0-c6、c
0-c5、c
0-c3、c
1-c
12
、c
1-c
10
、c
1-c8、c
1-c6、c
1-c5、c
1-c4或c
1-c3。基团c0亚烷基是指键。示例性的亚烷基基团包括亚甲基(-ch
2-)、1,1-乙基(-ch(ch3)-)、(1,2-乙基(-ch2ch
2-)、1,1-丙基(-ch(ch2ch3)-)、2,2-丙基(-c(ch3)
2-)、1,2-丙基(-ch(ch3)ch
2-)、1,3-丙基(-ch2ch2ch
2-)、1,1-二甲基-乙-1,2-基(-c(ch3)2ch
2-)、1,4-丁基(-ch2ch2ch2ch
2-)等等。
[0051]
术语“杂烷基”是指由指明数目的碳原子(或者，如果没有指明，则至多18个碳原子)和1至5个选自由o、n、si和s组成的组的杂原子组成的直链或支链一价烃基，并且其中氮原子和硫原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。在一些实施例中，杂原子选自o、n和s，其中氮和硫原子可任选地被氧化并且氮杂原子可任选地被季铵化。一个或多个杂原子可位于杂烷基基团的任何内部位置处，包括烷基基团与分子其余部分的相连处(例如，-o-ch
2-ch3)。实例包括-ch
2-ch
2-o-ch3、-ch
2-ch
2-nh-ch3、-ch
2-ch
2-n(ch3)-ch3、-ch
2-s-ch
2-ch3、-s(o)-ch3、-ch
2-ch
2-s(o)
2-ch3、-si(ch3)3和-ch
2-ch＝n-och3。至多两个杂原子可以是连续的，例如-ch
2-nh-och3和-ch
2-o-si(ch3)3。杂烷基基团可任选地被取代。在一些实施例中，用于“任选取代的杂烷基”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、苯基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。
[0052]“氨基”是指伯胺(即，
–
nh2)、仲胺(即，-nrh)、叔胺(即，-nrr)和季胺(即，-n(+)rrr)，所述氨基任选地被取代，其中每个r是相同或不同的并且选自烷基、环烷基、芳基和杂环基，其中烷基、环烷基、芳基和杂环基基团如本文所定义。特定的仲胺和叔胺是烷基胺、二烷基胺、芳基胺、二芳基胺、芳烷基胺和二芳烷基胺，其中烷基和芳基部分可以任选地被取代。特定的仲胺和叔胺是甲胺、乙胺、丙胺，异丙胺、苯胺、苄胺、二甲胺、二乙胺、二丙胺和二异丙胺。在一些实施例中，季胺的r基团各自独立地是任选取代的烷基基团。
[0053]“芳基”是指无论是否稠合至一个或多个基团，都具有指定的碳原子数，或者如果未指定数目，则至多14个碳原子的碳环芳族基团。一个实例包括具有6-14个碳原子的芳基基团。另一个实例包括具有6-10个碳原子的芳基基团。芳基基团的实例包括苯基、萘基、联苯基、菲基、并四苯基、1,2,3,4-四氢萘基、1h-茚基、2,3-二氢-1h-茚基等(参见例如《兰氏
化学手册》(dean,j.a.主编)第13版表7-2[1985])。一种特定的芳基为苯基。取代的苯基或取代的芳基是指被一个、两个、三个、四个或五个取代基(例如，1-2个、1-3个或1-4个取代基)取代的苯基基团或芳基基团，所述取代基诸如选自本文指定的基团(参见“任选取代的”定义)，诸如f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、苯基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。术语“取代的苯基”的实例包括单或二(卤代)苯基基团，诸如2-氯苯基、2-溴苯基、4-氯苯基、2,6-二氯苯基、2,5-二氯苯基、3,4-二氯苯基、3-氯苯基、3-溴苯基、4-溴苯基、3,4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2-氟苯基、2,4-二氟苯基等；单或二(羟基)苯基基团，诸如4-羟基苯基、3-羟基苯基、2,4-二羟基苯基，它们的羟基受保护的衍生物等；硝基苯基基团，诸如3-硝基苯基或4-硝基苯基；氰基苯基基团，例如4-氰基苯基；单或二(烷基)苯基基团，诸如4-甲基苯基、2,4-二甲基苯基、2-甲基苯基、4-(异丙基)苯基、4-乙基苯基、3-(正丙基)苯基等；单或二(烷氧基)苯基基团，例如3,4-二甲氧基苯基、3-甲氧基-4-苄氧基苯基、3-乙氧基苯基、4-(异丙氧基)苯基、4-(叔丁氧基)苯基、3-乙氧基-4-甲氧基苯基等；3-三氟甲基苯基或4-三氟甲基苯基；单或二羧基苯基或(羧基受保护的)苯基基团，诸如4-羧基苯基，单或二(羟甲基)苯基或(羟甲基受保护的)苯基，诸如3-(羟甲基受保护的)苯基或3,4-二(羟甲基)苯基；单或二(氨基甲基)苯基或(氨基甲基受保护的)苯基，诸如2-(氨基甲基)苯基或2,4-(氨基甲基受保护的)苯基；或单或二(n-(甲基磺酰氨基))苯基，例如3-(n-(甲基磺酰氨基))苯基。另外，术语“取代的苯基”表示取代基不同的二取代苯基基团，例如3-甲基-4-羟基苯基、3-氯-4-羟基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羟基苯基、3-羟基-4-硝基苯基、2-羟基-4-氯苯基、2-氯-5-二氟甲氧基等；以及取代基不同的三取代苯基基团，例如3-甲氧基-4-苄氧基-6-甲基磺酰氨基、3-甲氧基-4-苄氧基-6-苯基磺酰氨基；以及取代基不同的四取代苯基基团，诸如3-甲氧基-4-苄氧基-5-甲基-6-苯基磺酰氨基。在一些实施例中，芳基的取代基诸如苯基，包含酰胺。例如，芳基(例如，苯基)取代基可以是-(ch2)
0-4
conr'r”，其中r'和r”各自独立地指包括例如以下的基团：氢；未取代的c
1-c6烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
1-c6烷基；未取代的c
1-c6杂烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
1-c6杂烷基；未取代的c
6-c
10
芳基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r”取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；以及被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；或者r'和r”可以与氮原子结合以形成3元环、4元环、5元环、6元环或7元环，其中环原子任选地被n、o或s取代，并且其中环任选地被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代。
[0054]“环烷基”是指非芳族的饱和或部分不饱和的烃环基团，其中环烷基基团可任选地独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。在一个实例中，环烷基基团为3至12个碳原子(c
3-c
12
)。在其他实例中，环烷基为c
3-c8、c
3-c
10
或c
5-c
10
。在其他实例中，作为单环的环烷基
基团是c
3-c8、c
3-c6或c
5-c6。在另一个实例中，作为双环的环烷基基团是c
7-c
12
。在另一个实例中，作为螺环系的环烷基基团是c
5-c
12
。单环环烷基的示例包括环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、全氘代环己基、1-环己-1-烯基、1-环己基-2-烯基，1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基和环十二烷基。具有7至12个环原子的双环环烷基的示例性排列包括但不限于[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]环系。示例性桥联双环环烷基包括但不限于双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷和双环[3.2.2]壬烷。螺环烷基的示例包括螺[2.2]戊烷、螺[2.3]己烷、螺[2.4]庚烷，螺[2.5]辛烷和螺[4.5]癸烷。在一些实施例中，用于“任选取代的环烷基”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、芳基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、芳基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。在一些实施例中，环烷基的取代基包含酰胺。例如，环烷基取代基可以是-(ch2)
0-4
conr'r”，其中r'和r”各自独立地指包括例如以下的基团：氢；未取代的c
1-c6烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
1-c6烷基；未取代的c
1-c6杂烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
1-c6杂烷基；未取代的c
6-c
10
芳基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r”取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；以及被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；或者r'和r”可以与氮原子结合以形成3元环、4元环、5元环、6元环或7元环，其中环原子任选地被n、o或s取代，并且其中环任选地被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代。
[0055]“杂环基团”、“杂环的”、“杂环(heterocycle)”、“杂环基”或“杂环(heterocyclo)”可互换使用，并且是指具有3至20个环原子(例如，3-10个环原子)的任何单环系、双环系、三环系或螺环系，饱和或不饱和的环系、芳族(杂芳基)或非芳族(例如杂环烷基)环系，其中环原子是碳，并且该环或环系中的至少一个原子是选自氮、硫或氧的杂原子。如果环系统中的任何环原子为杂原子，则无论该环系统与分子其余部分的连接点如何，该系统均为杂环。在一个实例中，杂环基包括3-11个环原子(“元”)并且包括单环系、双环系，三环系和螺环系，其中环原子是碳，其中该环或环系中的至少一个原子是选自氮、硫或氧的杂原子。在一个实例中，杂环基包含1至4个杂原子。在一个实例中，杂环基包含1至3个杂原子。在另一个实例中，杂环基包含具有1-2、1-3或1-4个选自氮、硫或氧的杂原子的3至7元单环。在另一个实例中，杂环基包含具有1-2、1-3或1-4个选自氮、硫或氧的杂原子的4至6元单环。在另一个实例中，杂环基包含3元单环。在另一个实例中，杂环基包含4元单环。在另一个实例中，杂环基包括5-6元单环，例如5-6元杂芳基。在另一个实例中，杂环基包括3-11元杂环烷基，例如4-11元杂环烷基。在一些实施例中，杂环烷基包括至少一个氮。在一个实例中，杂环基基团包含0至3个双键。任何氮或硫杂原子都可任选地被氧化(例如，no、so、so2)，并且任何氮杂原子都可任选地被季铵化(例如，[nr4]
+
cl-、[nr4]
+
oh-)。示例性的杂环是环氧乙烷基、吖丙啶基、硫
杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、1,2-二硫杂环丁烷基、1,3-二硫杂环丁烷基、吡咯烷基、二氢-1h-吡咯基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、二氢噻吩基、四氢噻吩基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基、二氢吡喃基、四氢吡喃基、六氢噻喃基、六氢嘧啶基、噁嗪烷基、噻嗪烷基、噻烷基、高哌嗪基、高哌啶基、氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂卓基、氧杂氮杂环庚基、二氮杂环庚烷基、1,4-二氮杂环庚烷基、二氮杂卓基、硫氮杂卓基、硫氮杂环庚烷基、四氢噻喃基、噁唑烷基、噻唑烷基、异噻唑烷基、1,1-二氧代异噻唑烷酮基、噁唑烷酮基、咪唑啉酮基、4,5,6,7-四氢[2h]吲唑基、四氢苯并咪唑基、4,5,6,7-四氢苯并[d]咪唑基、1,6-二氢咪唑[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶基、噻嗪基、噁嗪基、噻二嗪基、氧杂二嗪基、二噻嗪基、二噁嗪基、噁噻嗪基、噻三嗪基、噁三嗪基、二噻二嗪基、咪唑啉基、二氢嘧啶基、四氢嘧啶基、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、噻喃基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、二烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、吡唑烷基、二噻烷基、二硫戊烷基、嘧啶酮基、嘧啶二酮基、嘧啶-2,4-二酮基、哌嗪酮基、哌嗪二酮基、吡唑烷基咪唑啉基、3-氮杂双环[3.1.0]-己基、3,6-二氮杂双环[3.1.1]庚基、6-氮杂双环[3.1.1]庚基、3-氮杂双环-[3.1.1]庚基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、氮杂双环[2.2.2]己基、2-氮杂双环-[3.2.1]辛烷基、8-氮杂双环[3.2.1]辛烷基、2-氮杂双环[2.2.2]辛烷基、8-氮杂双环-[2.2.2]辛烷基、7-氧杂二环[2.2.1]庚烷、氮杂螺[3.5]壬基、氮杂螺[2.5]-辛烷基、氮杂螺[4.5]癸基、1-氮杂螺[4.5]癸-2-酮基、氮杂螺[5.5]十一烷基、四氢吲哚基、八氢吲哚基、四氢异吲哚基、四氢吲唑基、1,1-二氧代六氢噻喃基。含有硫或氧原子和一至三个氮原子的5元杂环的示例是噻唑基，包括噻唑-2-基和噻唑-2-基氮氧化物；噻二唑基，包括1,3,4-噻二唑-5-基和1,2,4-噻二唑-5-基；噁唑基，例如噁唑-2-基；以及噁二唑基，诸如1,3,4-噁二唑-5-基和1,2,4-噁二唑-5-基。含有2至4个氮原子的示例性5元环杂环包括咪唑基，例如咪唑-2-基；三唑基，例如1,3,4-三唑-5-基；1,2,3-三唑-5-基、1,2,4-三唑-5-基；以及四唑基，例如1h-四唑-5-基。示例性苯并稠合的5元杂环是苯并噁唑-2-基、苯并噻唑-2-基和苯并咪唑-2-基。示例性6元杂环含有一个至三个氮原子和任选的硫或氧原子，例如吡啶基，诸如吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；嘧啶基，诸如嘧啶-2-基和嘧啶-4-基；三嗪基，诸如1,3,4-三嗪-2-基和1,3,5-三嗪-4-基；哒嗪基，尤其是哒嗪-3-基和吡嗪基。吡啶n-氧化物和哒嗪n-氧化物以及吡啶基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、哒嗪基和1,3,4-三嗪-2-基基团是其他示例性杂环基团。杂环可任选地被取代。例如，用于“任选取代的杂环”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、氧代基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、芳基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、芳基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。在一些实施例中，杂环基团的取代基(诸如杂芳基或杂环烷基)包括酰胺。例如，杂环(例如，杂芳基或杂环烷基)取代基取代基可以是(ch2)
0-4
conr'r”，其中r'和r”各自独立地指包括例如以下的基团：氢；未取代的c
1-c6烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
1-c6烷基；未取代的c
1-c6杂烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
1-c6杂烷基；未取代的c
6-c
10
芳基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r”取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个
选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；以及被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；或者r'和r”可以与氮原子结合以形成3元环、4元环、5元环、6元环或7元环，其中环原子任选地被n、o或s取代，并且其中环任选地被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代。
[0056]“杂芳基”是指任何单环、双环或三环系，其中至少一个环是含有1至4个选自氮、氧和硫的杂原子的5元或6元芳族环，并且在一个示例性实施例中，至少一个杂原子是氮。参见例如《兰氏化学手册》(dean,j.a.主编)第13版表7-2[1985]。该定义包括任何双环基团，其中任何上述杂芳环与芳环稠合，其中芳环或杂芳环与分子的其余部分连接。在一个实施例中，杂芳基包括5-6元单环芳族基团，其中一个或多个环原子为氮、硫或氧。示例性杂芳基基团包括噻吩基、呋喃基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、四唑基、噻三唑基、噁三唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、四唑并[1,5-b]哒嗪基、咪唑[1,2-a]嘧啶基和嘌呤基，以及苯并稠合衍生物，例如苯并噁唑基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、苯并咪唑基和吲哚基。杂芳基基团可任选地被取代。在一些实施例中，用于“任选取代的杂芳基”的取代基包括f、cl、br、i、oh、sh、cn、nh2、nhch3、n(ch3)2、no2、n3、c(o)ch3、cooh、co2ch3、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、环丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、三氟甲基、二氟甲基、磺酰氨基、甲磺酰氨基、so、so2、苯基、哌啶基、哌嗪基和嘧啶基中的一个至四个实例，其中它们的烷基、苯基和杂环部分可以任选地被取代，诸如被一至四个选自该相同列表的取代基取代。在一些实施例中，杂芳基的取代基包含酰胺。例如，杂芳基取代基可以是-(ch2)
0-4
conr'r”，其中r'和r”各自独立地指包括例如以下的基团：氢；未取代的c
1-c6烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
1-c6烷基；未取代的c
1-c6杂烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
1-c6杂烷基；未取代的c
6-c
10
芳基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r”取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；以及被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；或者r'和r”可以与氮原子结合以形成3元环、4元环、5元环、6元环或7元环，其中环原子任选地被n、o或s取代，并且其中环任选地被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代。
[0057]
在特定的实施例中，杂环基基团在该杂环基基团的碳原子处连接。举例来说，碳键合的杂环基基团包括以下位置的键排列：吡啶环的2、3、4、5或6位，哒嗪环的3、4、5或6位，嘧啶环的2、4、5或6位，吡嗪环的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、噻呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯环的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑环的2、4或5位，异噁唑、吡唑或异噻唑环的3、4或5位，氮丙啶环的2或3位，氮杂环丁烷环的2、3或4位，喹啉环的2、3、4、5、6、7或8位，或异喹啉环的1、3、4、5、6、7或8位。
[0058]
在某些实施例中，杂环基基团是n-连接的。举例来说，氮键合的杂环基或杂芳基基
团包括以下键合排列：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1h-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉酮的2位；吗啉的4位；和咔唑或β-咔啉的9位。
[0059]
术语“烷氧基”是指由式-or表示的直链或支链一价基团，其中r是如本文所定义的烷基。烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、单氟甲氧基、二氟甲氧基和三氟甲氧基，以及环丙氧基。
[0060]“酰基”是指由式-c(o)-r表示的含羰基的取代基，其中r是氢、烷基、环烷基、芳基或杂环基，其中烷基、环烷基、芳基和杂环基如本文所定义。酰基基团包括烷酰基(例如，乙酰基)、芳酰基(例如，苯甲酰基)和杂芳酰基(例如，吡啶甲酰基)。
[0061]
除非另外指明，否则“任选取代的”是指基团可以是未取代的或被一个或多个(例如，0个、1个、2个、3个、4个或5个或更多个，或其中可推导出的任何范围)针对该基团列出的取代基取代，其中所述取代基可以相同或不同。在一个实施例中，任选取代的基团具有1个取代基。在另一个实施例中，任选取代的基团具有2个取代基。在另一个实施例中，任选取代的基团具有3个取代基。在另一个实施例中，任选取代的基团具有4个取代基。在另一个实施例中，任选取代的基团具有5个取代基。
[0062]
单独或作为另一取代基(例如，烷氧基)的一部分的烷基，以及同样单独或作为另一取代基的一部分的亚烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂环烷基和环烷基的任选取代基可以是如本文所述的各种基团，以及选自由以下项组成的组的基团：卤素；氧代基；cn；no；n3；-or'；全氟-c
1-c4烷氧基；未取代的c
3-c7环烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
3-c7环烷基；未取代的c
6-c
10
芳基(例如，苯基)；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r'’取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；-nr'r”；-sr'；-sir'r”r”'；-oc(o)r'；-c(o)r'；-co2r'；-conr'r”；-oc(o)nr'r”；-nr”c(o)r'；-nr”'c(o)nr'r”；-nr”c(o)2r'；-s(o)2r'；-s(o)2nr'r”；-nr's(o)2r”；-nr”'s(o)2nr'r”；脒基；胍基；-(ch2)
1-4-or'；-(ch2)
1-4-nr'r”；-(ch2)
1-4-sr'；-(ch2)
1-4-sir'r”r”'；-(ch2)
1-4-oc(o)r'；-(ch2)
1-4-c(o)r'；-(ch2)
1-4-co2r'；以及-(ch2)
1-4
conr'r”，或它们的组合，所述任选取代基的量在0至(2m'+1)的范围内，其中m'是此类基团中的碳原子的总数。r'、r'’和r”'各自独立地意指基团，包括例如氢；未取代的c
1-c6烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
1-c6烷基；未取代的c
1-c6杂烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
1-c6杂烷基；未取代的c
6-c
10
芳基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r”取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；以及被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)。当r'和r'’连接在同一氮原子时，其可与氮原子结合形成3元环、4元环、5元环、6元环或7元环，其中环原子任选地被n、o
或s取代，并且其中环可任选地被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代。例如，-nr'r'’意味着包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。
[0063]
类似地，芳基和杂芳基基团的任选取代基种类繁多。在一些实施例中，芳基和杂芳基基团的取代基选自由以下项组成的组：卤素；氧代基；cn；no；n3；-or'；全氟-c
1-c4烷氧基；未取代的c
3-c7环烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
3-c7环烷基；未取代的c
6-c
10
芳基(例如，苯基)；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r'’取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；-nr'r”；-sr'；-sir'r”r”'；-oc(o)r'；-c(o)r'；-co2r'；-conr'r”；-oc(o)nr'r”；-nr”c(o)r'；-nr”'c(o)nr'r”；-nr”c(o)2r'；-s(o)2r'；-s(o)2nr'r”；-nr's(o)2r”；-nr”'s(o)2nr'r”；脒基；胍基；-(ch2)
1-4-or'；-(ch2)
1-4-nr'r”；-(ch2)
1-4-sr'；-(ch2)
1-4-sir'r”r”'；-(ch2)
1-4-oc(o)r'；-(ch2)
1-4-c(o)r'；-(ch2)
1-4-co2r'；以及(ch2)
1-4
conr'r”，或它们的组合，所述任选取代基的量在0至(2m'+1)的范围内，其中m'是此类基团中的碳原子的总数。r'、r'’和r”'各自独立地意指基团，包括例如氢；未取代的c
1-c6烷基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代的c
1-c6烷基；未取代的c
1-c6杂烷基；被卤代、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的c
1-c6杂烷基；未取代的c
6-c
10
芳基；被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基或nr'r”取代的c
6-c
10
芳基；未取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)；以及被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r”取代的3-11元杂环基(例如，含有1至4个选自o、n和s的杂原子的5-6元杂芳基或含有1至4个选自o、n和s的杂原子的4-11元杂环烷基)。当r'和r'’连接在同一氮原子时，其可与氮原子结合形成3元环、4元环、5元环、6元环或7元环，其中环原子任选地被n、o或s取代，并且其中环可任选地被卤素、oh、cn、未取代的c
1-c6烷基、未取代的c
1-c6烷氧基、氧代基或nr'r'’取代。例如，-nr'r'’意味着包括1-吡咯烷基和4-吗啉基。
[0064]
术语“氧代基”是指＝o或(＝o)2。
[0065]
如本文所用，与化学结构中的键相交的波浪线表示在化学结构中与该波浪形键连接的原子与分子的其余部分或与分子片段的其余部分的连接点。在一些实施例中，箭头和星号一起以波浪线的方式用以指示连接点。
[0066]
在某些实施例中，二价基团通常被描述为不含特定的键合构型。应当理解，除非另有说明，否则一般描述旨在包括两种键合构型。例如，除非另外指明，否则在基团r1–
r2–
r3中，如果基团r2被描述为-ch2c(o)-，则应理解为该基团可作为r1–
ch2c(o)
–
r3和r1–
c(o)ch2–
r3键合。
[0067]
除非另外指明，否则术语“本发明的化合物(compound(s)of the invention/compound(s)of the present invention)”等包括本文的式(i)化合物，诸如化合物1-18，有时称为作为jak抑制剂，所述jak抑制剂包括立体异构体(包括阻转异构体)、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢物、同位素、盐(例如，药用盐)以及它们的前药。在一些实施例
中，溶剂化物、代谢物、同位素或前药以及其任意组合被排除在外。
[0068]
术语“药学上可接受的”是指分子实体和组合物当视情况而定施用于动物(例如人)时不产生不利的、过敏的或其他不良反应。
[0069]
本发明的化合物可以是盐的形式，诸如药用盐。“药用盐”包括酸加成盐或碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指用无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸等)和有机酸形成的保留游离碱的生物学有效性和特性并且在生物学上或其他方面并非不可取的盐，所述有机酸可以选自脂肪族类、环脂族类、芳族类、芳脂族类、杂环类、羧酸类和磺酸类有机酸，诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸(maloneic acid)、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、帕莫酸、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
[0070]“药学上可接受的碱加成盐”包括衍生自无机碱的那些碱加成盐，诸如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。特定的碱加成盐为铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺，取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂(诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙氨基乙醇、氨丁三醇、二环己胺，赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、多胺树脂等)的盐。特定的有机无毒碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、氨丁三醇、二环己基胺、胆碱和咖啡因。
[0071]
在一些实施例中，盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、三氟乙酸盐、硫酸盐、磷酸盐、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双硫酸盐、苯磺酸盐、乙烷磺酸盐、丙二酸盐、羟萘甲酸盐(xinafoate)、抗坏血酸盐、油酸盐、烟酸盐、糖精酸盐、己二酸盐、甲酸盐、乙醇酸盐、棕榈酸盐、l-乳酸盐、d-乳酸盐、天冬氨酸盐、苹果酸盐、l-酒石酸盐、d-酒石酸盐、硬脂酸盐、糠酸盐(例如，2-糠酸盐或3-糠酸盐)、萘二磺酸盐(萘-1,5-二磺酸盐或萘-1-(磺酸)-5-磺酸盐)、乙二磺酸盐(乙-1,2-二磺酸盐或乙-1-(磺酸)-2-磺酸盐)、羟乙基磺酸盐(2-羟乙基磺酸盐)、2-均三甲苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、2,5-二氯苯磺酸盐、d-扁桃酸盐、l-扁桃酸盐、肉桂酸盐、苯甲酸盐、己二酸盐、乙磺酸盐、丙二酸盐、三甲基苯磺酸盐(2-均三甲苯磺酸盐)、萘甲酸盐(2-萘磺酸盐)、樟脑酸盐(樟脑-10-磺酸盐，例如(1s)-(+)-10-樟脑磺酸盐)、谷氨酸盐、戊二酸盐、马尿酸盐(2-(苯甲酰胺基)乙酸盐)、乳清酸盐、二甲苯酸盐(对二甲苯-2-磺酸盐)和帕莫酸盐(2,2'-二羟基-1,1'-二萘甲烷-3,3'-二羧酸盐)。
[0072]“无菌”制剂是无菌的或不含所有活微生物及其孢子。
[0073]“立体异构体”是指具有相同化学组成，但原子或基团在空间中的排列不同的化合物。立体异构体包括非对映异构体、对映异构体、构象异构体等。
[0074]“手性”是指分子具有镜像配对物的不可重合性质，而术语“非手性”是指分子可重合到其镜像配对物上。
[0075]“非对映异构体”表示具有两个或更多个手性中心并且其分子并非彼此镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱性质或生物活性。非对映异构体的混合物可通过高分辨率分析程序诸如电泳和色谱法(例如hplc)进行分离。
[0076]“对映异构体”是指化合物的两种立体异构体，所述两种立体异构体是彼此不可重叠的镜像。
[0077]
本文所用的立体化学定义和惯例通常遵循s.p.parker编辑，mcgraw-hill dictionary of chemical terms(1984)mcgraw-hill book company,new york；以及eliel,e.和wilen,s.,“stereochemistry of organic compounds”,john wiley&sons,inc.,new york,1994。许多有机化合物以旋光活性形式存在，即它们具有旋转平面偏振光平面的能力。在描述光学活性化合物时，前缀d和l或r和s用于表示分子围绕其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于表示化合物对平面偏振光的旋转的符号，其中(-)或1表示该化合物是左旋的。带有(+)或d前缀的化合物是右旋的。对于既定化学结构，这些立体异构体除了互为镜像外，是完全相同的。特定的立体异构体也可以被称为对映异构体，并且此类异构体的混合物通常被称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可能在化学反应或过程中没有立体选择或立体特异性的情况下发生。术语“外消旋混合物”和“外消旋物”是指两种无旋光活性的对映体种类的等摩尔混合物。
[0078]
术语“互变异构体”或“互变异构形式”是指通过低能垒相互转化的具有不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称为质子异变的互变异构体)包括经由质子迁移的相互转化，诸如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。价互变异构体包括通过一些键合电子的重组而进行的相互转化。
[0079]
本发明的某些化合物可以非溶剂化的形式以及包括水合形式在内的溶剂化的形式存在。“溶剂化物”是指一种或多种溶剂分子与本发明的化合物的缔合物或络合物。形成溶剂化物的溶剂的示例包括水、异丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。某些本发明的化合物可以多种结晶或无定形形式存在。通常，所有物理形式均旨在包含在本发明的范围内。术语“水合物”是指溶剂分子为水的络合物。
[0080]“代谢物”是指通过指定化合物或其盐在体内代谢而得到的产物。此类产物可由所施用的化合物的例如氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶促裂解等产生。
[0081]
代谢产物通常通过以下方式进行鉴定：制备放射性同位素(例如，14c或3h)标记的本发明的化合物；将该放射性同位素标记的本发明的化合物以可检测剂量(例如，大于约0.5mg/kg)施用于动物，诸如大鼠、小鼠、豚鼠、猴子或人类，从而允许有足够的时间发生代谢(通常约30秒至30小时)；以及从尿液、血液或其他生物样本中分离其转化产物。由于这些产物已被标记，因此很容易分离(通过使用能够结合在代谢物中存活的表位的抗体来分离其他产物)。以常规方式，例如，通过ms、lc/ms或nmr分析，来确定代谢物的结构。通常，代谢物的分析以与本领域技术人员熟知的常规药物代谢研究相同的方式进行。代谢物只要未在体内发现，便可用于对本发明的化合物的治疗剂量进行诊断测定。
[0082]“受试者”、“个体”或“患者”是脊椎动物。在某些实施例中，脊椎动物是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于农场动物(诸如牛)、运动动物、宠物(诸如豚鼠、猫、犬、兔和马)、灵长目动物、小鼠和大鼠。在某些实施例中，哺乳动物是人。在包括向患者施用如本文所述的jak抑制剂或其药用盐的实施例中，患者可以是需要所述jak抑制剂或其药用盐。
[0083]
术语“詹纳斯激酶”是指jak1、jak2、jak3和tyk2蛋白激酶。在一些实施例中，詹纳斯激酶可进一步定义为jak1、jak2、jak3或tyk2中的一者。在任何实施例中，可以将jak1、
jak2、jak3和tyk2中的任一者明确排除为詹纳斯激酶。在一些实施例中，詹纳斯激酶是jak1。在一些实施例中，詹纳斯激酶是jak1和jak2的组合。
[0084]
术语“抑制”和“减少”或这些术语的任何变型，包括任何可测量的降低或完全抑制以实现期望的结果。例如，可以存在与正常相比活性(例如，jak1活性)降低的约、至多约或至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高，或可在其中推导出的任何范围的减少。
[0085]“治疗有效量”是指本发明的化合物或其盐(例如，其药用盐)用于以下的量：(i)治疗或预防特定疾病、病症或疾患，或(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状，以及任选地(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。在一些实施例中，治疗有效量是足以减弱或缓解自身免疫性疾病或炎性疾病(例如，哮喘)的症状的量。在一些实施例中，治疗有效量是本文所述的化学实体足以显著降低b细胞活性或数量的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞数；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓和优选地停止)癌细胞浸润周围器官；抑制(即，在一定程度上减缓和优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；或在一定程度上缓解癌症相关的一种或多种症状。在药物可阻止现有癌细胞的生长或杀死现有癌细胞的程度上，其可能抑制细胞生长或具有细胞毒性。对于癌症疗法，例如，疗效可以通过评估疾病进展时间(ttp)或确定有效率(rr)进行测量。
[0086]“治疗(treatment)”(及其变型诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。预期治疗效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、稳定(即，未恶化)病情、降低疾病进展速率、改善或减轻病情、生存期延长(与如果未接受治疗的预期生存期相比)以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的化合物或其盐(例如其药用盐)用于延缓疾病或疾患的发展或者减慢疾病或疾患的进展。需要治疗的个体包括已经患有病症或疾患的个体以及那些容易患有病症或疾患的个体(例如，通过基因突变)或那些要预防该病症或疾患的个体。
[0087]“炎性疾患”是指其中过量或不受控炎性反应导致过度炎性症状、宿主组织损伤或组织功能丧失的任何疾病、疾患或综合征。“炎性疾患”还指由白细胞内流或中性粒细胞趋化介导的病理状态。
[0088]“炎症”是指由组织损伤或损害引起的局部保护性反应，其具有破坏、稀释或隔离(隔绝)损伤因子和损伤组织的作用。炎症与白细胞内流或中性粒细胞趋化明显相关。炎症可能是由病原生物和病毒感染以及非感染性方式引起，所述非感染性方式诸如心肌梗死或中风后的创伤或再灌注、对外源性抗原的免疫应答和自身免疫性应答。因此，适合用本发明的化合物或其盐(例如，其药用盐)治疗的炎性疾患包括与特异性防御系统反应有关的疾患以及与非特异性防御系统反应有关的疾患。
[0089]“特异性防御系统”是指免疫系统对存在特定抗原产生反应的组分。由特异性防御系统应答引起的炎症的实例包括对外源性抗原的经典应答、自身免疫性疾病和由t细胞介导的迟发性超敏反应。慢性炎性疾病、实体移植组织和器官排斥(例如，肾脏和骨髓移植)以及移植物抗宿主病(gvhd)是特异性防御系统的炎性反应的进一步实例。
[0090]
术语“非特异性防御系统”是指由不具有免疫记忆的白细胞(例如，粒细胞和巨噬
细胞)介导的炎性病症。至少部分由非特异性防御系统的反应引起的炎症的示例包括与以下病症相关的炎症：诸如成人(急性)呼吸窘迫综合征(ards)或多器官损伤综合征；再灌注损伤；急性肾小球肾炎；反应性关节炎；伴有急性炎性组分的皮肤病；急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性病症，诸如中风；热损伤；炎症性肠病；粒细胞输血相关综合征；和细胞因子诱导的毒性。
[0091]“自身免疫性疾病”是指其中组织损伤与体液或细胞介导的与对机体自身成分应答有关的任何一组疾患。自身免疫性疾病的非限制性实例包括类风湿性关节炎、狼疮和多发性硬化症。
[0092]
如本文所用，“过敏性疾病”是指由过敏引起的任何症状、组织损伤或组织功能丧失。如本文所用，“关节炎病”是指其特征在于可归因于多种病因的关节的炎性损伤的疾病。如本文所用，“皮炎”是指皮肤疾病大家族中的任一种，其特征在于归因于多种病因的皮肤炎症。如本文所用，“移植排斥”是指针对移植组织(诸如器官或细胞(例如，骨髓))的任何免疫反应，其特征在于移植组织和周围组织的功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多和血小板减少。本发明的治疗方法包括用于治疗与炎性细胞活化有关的疾患的方法。
[0093]“炎性细胞活化”是指通过以下诱导：增殖细胞反应的刺激(包括但不限于细胞因子、抗原或自身抗体)，可溶性介质的产生(包括但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素或血管活性胺)，或炎性细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、粒细胞(即多形核白细胞，诸如中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)、肥大细胞、树突状细胞、langerhans细胞和内皮细胞)中新生或数量增加的介质(包括但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘附分子)的细胞表面表达。本领域技术人员将理解的是，这些细胞中的一种或多种这些表型的活化可对炎性疾患的引发、持续或加剧产生作用。
[0094]
在一些实施例中，可以根据本发明的方法治疗的炎性病症包括但不限于哮喘、鼻炎(例如，过敏性鼻炎)、过敏性气道综合征、特应性皮炎、支气管炎、类风湿性关节炎、牛皮癣、接触性皮炎、慢性阻塞性肺疾病(copd)和迟发性超敏反应。
[0095]
术语“癌症”和“癌的”、“瘤”和“肿瘤”及相关术语是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长失控为特征的生理状况。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。癌症的实例包括恶性肿瘤、胚细胞瘤、肉瘤、精原细胞瘤、胶质母细胞瘤、黑素瘤、白血病和骨髓或淋巴恶性肿瘤。这种癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)和肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“nsclc”)、肺腺癌和肺鳞状癌。其他癌症包括皮肤癌、角化棘皮瘤、滤泡癌、毛细胞白血病、颊腔癌、咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、食道癌、喉癌、肝细胞癌、胃(gastric)癌、胃(stomach)癌、胃肠癌、小肠癌、大肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌、膀胱癌、肝细胞癌、乳房癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、泌尿生殖道癌、胆道癌、甲状腺癌、乳头状癌、肝癌、子宫内膜癌、子宫癌、唾液腺癌、肾脏或肾癌、前列腺癌、睾丸癌、外阴癌、腹膜癌、肛门癌、阴茎癌、骨癌、多发性骨髓瘤、b细胞淋巴瘤、中枢神经系统癌、脑癌、头癌和颈癌、霍奇金病及相关转移。肿瘤性疾患的实例包括骨髓增生性疾病，诸如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化(诸如原发性骨髓纤维化)和慢性粒细胞性白血病(cml)。
[0096]“化疗剂”是用于治疗给定疾患例如癌症或炎性疾病的药剂。化疗剂的实例是本领域中熟知的，并且包括例如美国专利申请号2010/0048557中公开的那些实例，该专利申请
以引用方式并入本文。此外，化疗剂包括任何化疗剂的药用盐、酸或衍生物及其中两种或更多种的组合。
[0097]“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包括的说明书，其含有涉及此类治疗产品的使用的有关适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和警告的信息。
[0098]
除非另有说明，否则本文描述的结构包括仅在一个或多个同位素富集原子存在下有差异的化合物。可掺入本发明的化合物的示例性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯和碘的同位素，分别诸如2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
32
p、
33
p、
35
s、
18
f、
36
cl、
123
i和
125
i。同位素标记的化合物(例如，用3h和
14
c标记的化合物)可用于化合物和/或底物组织分布测定中。可使用氚化(即3h)和碳-14(即
14
c)，因为它们易于制备和检测。此外，用较重的同位素诸如氘(即2h)取代可能以其更高的代谢稳定性(例如，延长体内半衰期或降低剂量要求)而提供某些治疗优势。在一些实施例中，一个或多个氢原子被2h或3h取代，或者一个或多个碳原子被富含
13
c或
14
c的碳取代。正电子发射同位素诸如
15
o、
13
n、
11
c及
18
f可用于正电子发射断层扫描(pet)研究，以检查底物受体占有率。同位素标记的化合物通常可按照与方案或本文实例中所公开的程序类似的程序进行制备，其中用同位素标记的试剂代替非同位素标记的试剂。
[0099]
具体地设想了关于本发明的一个实施例讨论的任何限制可适用于本发明的任何其他实施例。此外，本发明的任何化合物或其盐(例如，其药用盐)可用于本发明的任何方法，并且本发明的任何方法均可用于生产或利用本发明的任何化合物或其盐(例如，其药用盐)。
[0100]
除非明确指出仅指代替代方案或替代方案互斥，否则术语“或”的使用意指“和/或”，尽管本发明支持仅指替代方案和“和/或”的定义。
[0101]
贯穿本技术全文的术语“约”用于表示一个值包括用于测定该值的设备或方法的误差的标准偏差。
[0102]
除非另有明确说明，否则如本文所用，“一”或“一种”意指一种或多种。如本文所用，“另一”意指至少第二或更多。
[0103]
本文所用的标题仅用于组织目的。
[0104]
詹纳斯激酶的抑制剂
[0105]
一个实施例提供一种式(i)化合物：
[0106][0107]
或其立体异构体或药用盐，
[0108]
其中：
[0109]
r1是：羟基-c
1-c6烷基；-(cr
a1ra2
)
m-het1；-(cr
a1ra2
)
n-nrbrc；或-(cr
a1ra2
)
m-c
3-6
环烷基，其中所述c
3-6
环烷基部分经rd取代一次；
[0110]
r2是：卤代；卤代c
1-c6烷氧基；c
1-c6烷基硫代；-sf2；或c
3-c6环烷基；
[0111]
r3是：氢；或c
1-c6烷基；
[0112]
r4是：氢；或c
1-c6烷基；
[0113]
r5是：氢；或c
1-c6烷基；
[0114]
r6是：氢；或c
1-c6烷基；
[0115]
或r2及r6连同其所连接的原子一起可形成含有各自独立地选自o、n及s的两个杂原子的六元环；
[0116]
m是0至2；
[0117]
n是0至3；
[0118]
各r
a1
独立地是：氢；或c
1-c6烷基；
[0119]
各r
a2
独立地是：氢；卤代；或c
1-c6烷基；
[0120]
rb是：氢；或c
1-c6烷基；
[0121]
rc是：氢；c
1-c6烷基；氨基保护基团；或氮杂环丁烷基，其可未经取代或经c
1-c6烷基取代一次；
[0122]
het1是选自以下的杂环基：氮杂环丁烷基；吡咯烷基；哌嗪基；哌啶基；吗啉基；及氧杂环丁烷基；其各自可未经取代或经rd取代一次且经rg取代一次或两次；
[0123]
rd是：-(cr
a1ra2
)
p-het2；-(cr
a1ra2
)
q-nrerf；或-(cr
a1ra2
)
p-c
3-6
环烷基，其中所述c
3-6
环烷基部分经-nrerf取代一次；
[0124]
p是0至2；
[0125]
q是0至4；
[0126]
re是：氢；或c
1-c6烷基；
[0127]
rf是：氢；c
1-c6烷基；或-ch2c2n(ch3)2；
[0128]
各rg是：c
1-c6烷基；或卤代；并且
[0129]
het2是选自以下的杂环：四氢吡喃；氮杂环丁烷基；及吡咯烷基；其各自可未经取代或经c
1-c6烷基或-nrerf烷基取代一次。
[0130]
在某些实施例中，r1是：c
1-c6烷基；羟基-c
1-c6烷基；-(cr
a1ra2
)
m-het1；或(cr
a1ra2
)
n-nrbrc，其中het1可未经取代或经rd取代一次。
[0131]
在某些实施例中，r1是：c
1-c6烷基；-(cr
a1ra2
)
m-het1；或-(chra)
n-nrbrc，其中het1[0132]
在某些实施例中，r1是：-(cr
a1ra2
)
m-het1；或-(cr
a1ra2
)
n-nrbrc，其中het1可未经取代或经rd取代一次。
[0133]
在某些实施例中，r1是-(chra)
m-het1，其中het1可未经取代或经d取代一次。
[0134]
在某些实施例中，r1是-(cr
a1ra2
)
n-nrbrc。
[0135]
在某些实施例中，r2是：卤代；卤代c
1-c6烷氧基；或c
1-c6烷基硫代。
[0136]
在某些实施例中，r2是卤代。
[0137]
在某些实施例中，r2是卤代c
1-c6烷氧基。
[0138]
在某些实施例中，r2是c
1-c6烷基硫代。
[0139]
在某些实施例中，r2是：氯；二氟甲氧基；甲基乙硫(methylethio)；或环丙基。
[0140]
在某些实施例中，r2是氯。
[0141]
在某些实施例中，r2是二氟甲氧基。
[0142]
在某些实施例中，r2是甲基乙硫。
[0143]
在某些实施例中，r3是氢。
[0144]
在某些实施例中，r4是氢。
[0145]
在某些实施例中，r5是氢。
[0146]
在某些实施例中，r6是氢。
[0147]
在某些实施例中，r2及r6与它们所连接的原子一起形成含有两个各自独立地选自o、n及s的杂原子的六元环。
[0148]
在某些实施例中，m是0。在m是0且r1是het1的实施例中，应该理解，将het1连接于四唑环的键是由het1的碳原子而不是杂原子组成的。
[0149]
在某些实施例中，m是0。
[0150]
在某些实施例中，m是1。
[0151]
在某些实施例中，m是2。
[0152]
在某些实施例中，n是0。
[0153]
在某些实施例中，n是1。
[0154]
在某些实施例中，n是2。
[0155]
在某些实施例中，r
a1
是氢。
[0156]
在某些实施例中，r
a2
是氢。
[0157]
在某些实施例中，rb是氢。
[0158]
在某些实施例中，rb是c
1-c6烷基。
[0159]
在某些实施例中，rc是氢。
[0160]
在某些实施例中，rc是c
1-c6烷基。
[0161]
在某些实施例中，rc是1-甲基-氮杂环丁烷-3-基。
[0162]
在某些实施例中，het1是氮杂环丁烷基，其可未经取代或经rd取代一次。
[0163]
在某些实施例中，het1是吡咯烷基，其可未经取代或经rd取代一次。
[0164]
在某些实施例中，het1是哌嗪基，其可未经取代或经rd取代一次。
[0165]
在某些实施例中，het1是哌啶基，其可未经取代或经rd取代一次。
[0166]
在某些实施例中，het1是吗啉基。
[0167]
在某些实施例中，het1是氧杂环丁烷基。
[0168]
在某些实施例中，p是0。
[0169]
在某些实施例中，p是1。
[0170]
在某些实施例中，p是2。
[0171]
在某些实施例中，q是0。
[0172]
在某些实施例中，q是2。
[0173]
在某些实施例中，q是3。
[0174]
在某些实施例中，q是4。
[0175]
在某些实施例中，re是氢。
[0176]
在某些实施例中，re是c
1-c6烷基。
[0177]
在某些实施例中，rf是氢。
[0178]
在某些实施例中，rf是c
1-c6烷基。
[0179]
在某些实施例中，het2是四氢吡喃基。
[0180]
在某些实施例中，het2是氮杂环丁烷基，其可未经取代或经c
1-c6烷基取代一次。
[0181]
在某些实施例中，het2是吡咯烷基，其可未经取代或经c
1-c6烷基取代一次。
[0182]
在某些实施例中，r1选自：
[0183]
以及
[0184]
在某些实施例中，r1选自：
[0185]
以及
[0186]
在某些实施例中，标的化合物为式(ii)化合物
[0187][0188]
或其立体异构体或药用盐，其中r1、r2及r6如本文所定义。
[0189]
在某些实施例中，标的化合物为式(iii)化合物
[0190][0191]
或其立体异构体或药用盐，其中r1、r2及r6如本文所定义。
[0192]
在某些实施例中，标的化合物为式(iv)化合物
[0193][0194]
或其立体异构体或药用盐，
[0195]
其中x为-o-或-s-，rg是氢或c
1-c6烷基，且r1如本文所定义。
[0196]
在某些实施例中，标的化合物为式(v)化合物
[0197][0198]
或其立体异构体或药用盐，
[0199]
其中r2及rd如本文所定义。
[0200]
在某些实施例中，标的化合物为式(vi)化合物
[0201][0202]
或其立体异构体或药用盐，
[0203]
其中r2及rd如本文所定义。
[0204]
还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的jak抑制剂或其药用盐，以及药用运载体、稀释剂或赋形剂。
[0205]
还提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐在治疗中的用途，诸如在炎性疾病(例如，哮喘)的治疗中的用途。还提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐在制备用于治疗炎性疾病的药物中的用途。还提供了一种在患者中预防、治疗响应于詹纳斯激酶活性抑制的疾病或病症或减轻其严重程度的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的如本文所述的jak抑制剂或其药用盐。
[0206]
在一个实施例中，治疗的疾病或病症是癌症、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、慢性髓细胞性白血病(cml)、类风湿性关节炎、炎性肠综合征、克罗恩病、银屑病、接触性皮炎或迟发性超敏反应。
[0207]
在一个实施例中，提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐在治疗癌症、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化、慢性髓细胞性白血病(cml)、类风湿性关节炎、炎性肠综合征、克罗恩病、银屑病、接触性皮炎或迟发性超敏反应的用途。
[0208]
在一个实施例中，提供了一种组合物，所述组合物经配制用于吸入施用。
[0209]
在一个实施例中，提供了一种计量剂量吸入器，所述计量剂量吸入器包含本发明的化合物或其药用盐。
[0210]
在一个实施例中，本文所述的jak抑制剂或其药用盐作为jak1抑制剂的效能比作为lrrk2抑制剂的效能高至少十倍。
[0211]
在一个实施例中，提供了一种治疗哺乳动物脱发的方法，所述方法包括将本文所述的jak抑制剂或其药用盐施用于哺乳动物。
[0212]
在一个实施例中，提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐用于脱发治疗的用途。
[0213]
在一个实施例中，提供了本文所述的jak抑制剂或其药用盐在制备用于治疗哺乳动物脱发的药物中的用途。
[0214]
本发明的化合物可含有一个或多个不对称的碳原子。因此，化合物可以以非对映异构体、对映异构体或其混合物的形式存在。化合物的合成可采用外消旋体、非对映异构体或对映异构体作为起始物质或中间体。特定的非对映异构化合物的混合物可通过色谱法或结晶法分离或富集为一种或多种特定的非对映异构体。相似地，可以使用相同的技术或本领域已知的其他技术分离或以对映体富集对映异构体混合物。每个不对称的碳或氮原子可以为r或s构型，并且这两种构型均在本发明的范围内。
[0215]
在本文所示的结构中，其中未指定任何特定手性原子的立体化学，则所有立体异构体均被考虑并包括为本发明的化合物。在通过表示特定构型的实心楔形或虚线指定立体化学的情况下，则应指定并且定义该立体异构体。除非另有说明，否则如果使用实心楔形或虚线，则表示相对立体化学。
[0216]
另一方面包括本文所述化合物的前药，包括已知的氨基保护基团和羧基保护基团，它们在生理条件下释放(例如，水解)以产生本发明的化合物。
[0217]
术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生形式，与母体药物相比对患者较低效，并且能够被酶解或水解活化或转化为活性更高的母体形式。参见，例如，wilman,"prodrugs in cancer chemotherapy"biochemical society transactions,14，第375-382页，615th meeting belfast(1986)and stella et al.,"prodrugs:a chemical approach to targeted drug delivery,」directed drug delivery,borchardt et al.,第247-267页,humana press(1985)。前药包括但不限于含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫
handbuch der organischen chemie,4,aufl.编辑springer-verlag,berlin，包括增刊(也可以通过beilstein在线数据库获得))，或comprehensive heterocyclic chemistry，编辑katrizky和rees，pergamon press,1984。
[0223]
化合物可以单独制备或作为包括至少2种，例如，5至1,000种化合物或10至100种化合物的化合物文库制备。化合物的文库可以通过组合的“拆分和混合”方法或使用溶液相或固相化学的多种平行合成方法，通过本领域技术人员已知的方法进行制备。因此，根据本发明的另一方面，提供了包括至少两种本发明的化合物的化合物文库。
[0224]
出于示例性目的，下文所述反应方案提供了用于合成本发明的化合物以及关键中间体的路线。有关各个反应步骤的详细说明，请参见下面的实例部分。本领域的技术人员将理解，可使用其他合成路线。尽管方案中示出并且在下文描述了一些具体的原料和试剂，但是可替换为其他原料和试剂以提供各种衍生物或反应条件。此外，根据本发明内容，可使用本领域的技术人员熟知的常规化学方法进一步修饰通过下文所述的方法制得的许多化合物。
[0225]
在制备本发明的化合物时，可能需要保护中间体的远端官能度(例如，伯胺或仲胺)。此类保护的需求将根据远端官能度的性质以及制备方法的条件而有所不同。合适的氨基保护基团包括乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苯磺酰基、叔丁氧羰基(boc)、苄氧羰基(cbz)和9-芴基亚甲基氧羰基(fmoc)。对于是否需要这种保护是本领域技术人员容易确定的。有关保护基团及其用途的常规说明，参见t.w.greene,protective groups in organic synthesis,john wiley&sons,new york,1991。
[0226]
可以使用多种试剂和条件来进行常用于合成本发明的化合物的其他转化，包括以下：
[0227]
(1)羧酸与胺反应形成酰胺。可以使用本领域技术人员已知的各种试剂来实现这种转化，但综述可见于tetrahedron,2005,61,10827-10852。
[0228]
(2)可以使用多种催化剂、配体和碱实现伯胺或仲胺与芳基卤化物或类卤化物(例如，三氟甲磺酸酯)的反应，通常称为“buchwald-hartwig交叉偶联”。这些方法的综述在comprehensive organic name reactions and reagents,2010,575-581中提供。
[0229]
(3)芳基卤化物与乙烯基硼酸或硼酸酯之间的钯交叉偶联反应。这种转化是一类“suzuki-miyaura交叉偶联”，这类反应已在chemical reviews,1995,95(7),2457-2483中详述。
[0230]
(4)酯水解生成相应的羧酸是本领域技术人员公知的，条件包括：对于甲基和乙基酯，使用强碱水溶液，诸如氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，或者强无机酸水溶液，诸如hcl；对于叔丁酯，使用酸(例如，hcl在二噁烷溶液或三氟乙酸(tfa)在二氯甲烷(dcm)溶液)进行水解。
[0231]
反应方案1
[0232][0233]
反应方案1示出本发明的化合物的合成。化合物1可在钯催化条件下进行芳基化，以生成化合物2。化合物2的硝基可在诸如铁及氯化铵的条件下还原以生成氨基苯胺3。在偶合试剂(诸如但不限于pyaop)的存在下以有机溶剂(诸如但不限于dmf)中的有机碱(诸如但不限于dipea及dmap)，酰胺键与可商购获得的吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸的偶合提供化合物4。使用在溶剂(诸如但不限于1,4-二噁烷)中的酸(诸如但不限于hcl)去除化合物4的sem保护基，得到化合物5。然后化合物5可于受保护的四唑化合物进行n烷基化。在某些实施例中，保护基pg可为四氢吡喃基，使得四唑试剂为5-(氯甲基)-2-(四氢-2h-吡喃-2-基)-2h-四唑，以得到化合物6。使用hcl或其他酸去保护，得到四唑化合物7。化合物7继而通过与r
1-x(其中x为卤代，诸如碘代)反应进行n-烷基化，以提供根据本发明的式(i)化合物8及化合物9。
[0234]
反应方案2
[0235][0236]
反应方案2示出其中的式vii化合物的合成。可商购获得的4-(二氟甲氧基)苯酚可使用在溶剂(诸如但不限于乙酸)中的溴化剂(诸如但不限于nbs)处理，以得到12。将12二氟甲基化以形成化合物13可通过用(溴二氟甲基)膦酸二乙酯以在溶剂(诸如但不限于乙腈)中的碱(诸如但不限于含水氢氧化钾)处理化合物12来完成。化合物13可在钯催化的条件下以在溶剂(诸如但不限于dma)中的碱(诸如但不限于碳酸钾)用4-硝基-1-[[2-(三甲基硅烷基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑4-溴-1-(二氟甲氧基)-2-碘苯处理，以生成化合物14。化合物14硝基可在诸如铁及氯化铵的条件下还原以生成氨基吡唑15。在偶合试剂(诸如但不限于pyaop)的存在下以溶剂(诸如但不限于dmf)中发有机碱(诸如但不限于dipea及dmap)，化合物15的酰胺键与可商购获得的吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸的偶合提供化合物16。去除化合物16的sem保护基可用有机溶剂(诸如但不限于1,4-二噁烷)中的酸(诸如但不限于hcl)来完成，以生成中间化合物5，其可用于制备如反应方案1中所示的本发明的化合物。
[0237]
应当理解的是，在存在合适的官能团的情况下，可以通过一种或多种采用缩合、取代、氧化、还原或裂解反应的标准合成方法进一步衍生化用于其制备中的各种式的化合物或任何中间体。具体取代方法包括常规的烷基化、芳基化、杂芳基化、酰化、磺酰化、卤化、硝化、甲酰化和偶联程序。
[0238]
另一实例中，伯胺或仲胺基团可以通过酰化转化为酰胺基团(-nhcor’或
–
nrcor’)。酰化作用可以通过在碱(诸如三乙胺)存在下，在适当的溶剂(诸如二氯甲烷)中与适当的酰氯反应，或在适当的偶联剂(诸如hatu(o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐))存在下与适当的羧酸反应来实现。类似地，可以在合适的碱(诸如三乙胺)存在下，在合适的溶剂(诸如二氯甲烷)中，通过与合适的磺酰氯反应，将胺基团转化为磺酰胺基团(-nhso2r’或
–
nr”so2r’)。在合适的碱(诸如三乙胺)存在下，在合适的溶剂(诸如
二氯甲烷)中，通过与合适的异氰酸酯反应，可以将伯胺基团或仲胺基团转化为脲基团(-nhconr’r”或
–
nrconr’r”)。
[0239]
胺(nh2)可以通过还原硝基(-no2)基团而获得，例如，通过催化加氢，例如，使用氢，在金属催化剂(例如，钯)存在下，在溶剂(诸如乙酸乙酯或醇，例如，甲醇)中于支撑物(诸如碳)上进行。或者，可以在酸(诸如盐酸)存在下通过使用例如金属(例如，锡或铁)的化学还原进行转化。
[0240]
在另一实例中，胺(-ch2nh2)基团可以通过还原腈(-cn)而获得，例如，通过催化加氢，例如，使用氢，在金属催化剂的存在下，于适当的温度例如从约-78℃至溶剂的回流温度下进行，所述金属催化剂例如在支撑物(诸如碳)上的钯，或在溶剂中的raney镍，所述溶剂诸如醚，例如，环醚(诸如四氢呋喃)。
[0241]
在另一实例中，可以通过将羧酸基团(-co2h)转化为相应的酰基叠氮化物(-con3)，curtius重排和所得异氰酸酯(-n＝c＝o)的水解，获得胺(-nh2)基团。
[0242]
醛基团(-cho)可以通过胺和硼氢化物(例如三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠)的还原胺化反应转变为胺基团(-ch2nr’r'’)，在溶剂诸如卤代烃(例如，二氯甲烷)，或醇诸如乙醇中，其中必要时在接近环境温度下在酸(诸如乙酸)存在下进行。
[0243]
在另一实例中，在本领域技术人员已知的标准条件下，通过使用wittig或wadsworth-emmons反应，使用适当的膦烷或膦酸酯，可以将醛基团转化为烯基基团(-ch＝chr’)。
[0244]
可以通过在适当的溶剂(诸如甲苯)中使用氢化二异丁基铝将酯基团(诸如
–
co2et)或腈(-cn)还原获得醛基团。或者，可以使用本领域技术人员已知的任何合适的氧化剂通过醇基团的氧化获得醛基团。
[0245]
取决于r的性质，可以通过酸催化水解或碱催化水解将酯基团(-co2r')转化为相应的酸基团(-co2h)。如果r为叔丁基，则可以例如通过在水性溶剂中用有机酸(诸如三氟乙酸)处理，或通过在水性溶剂中用无机酸(诸如盐酸)处理来实现酸催化水解。
[0246]
可以在合适的偶联剂(诸如hatu)的存在下，在适当的溶剂(诸如二氯甲烷)中，通过与适当的胺反应，将羧酸基团(-co2h)转化为酰胺(conhr’或
–
conr’r”)。
[0247]
在另一实例中，羧酸可通过转化为相应的酰氯(-cocl)，然后通过arndt-eistert合成，经一个碳(即，-co2h至
–
ch2co2h)同系化。
[0248]
在另一实例中，-oh基团可以由相应的酯(例如，-co2r’)或醛(-cho)通过还原而产生，例如，使用复杂的金属氢化物(诸如氢化铝锂)在乙醚或四氢呋喃中，或硼氢化钠在溶剂(如甲醇)中。或者，可以通过在溶剂(诸如四氢呋喃)中使用例如氢化铝锂，或在溶剂(诸如四氢呋喃)中使用硼烷，通过还原相应的酸(-co2h)制备醇。
[0249]
可以使用本领域技术人员已知的条件将醇基团转化为离去基团(诸如卤素原子)或磺酰氧基基团(诸如烷基磺酰氧基)，例如，三氟甲基磺酰氧基或芳基磺酰氧基，例如，对甲苯磺酰氧基基团。例如，将醇与亚硫酰氯在卤代烃(例如，二氯甲烷)中反应以产生相应的氯化物。在反应中也可以使用碱(例如，三乙胺)。
[0250]
在另一实例中，可以通过在膦(例如，三苯基膦)和活化剂(诸如二乙基偶氮二羧酸酯、二异丙基偶氮二羧酸酯或二甲基偶氮二羧酸酯)的存在下，在溶剂(诸如四氢呋喃)中将酚或酰胺与醇偶合，从而使醇、苯酚或酰胺基团烷基化。或者，可以通过使用适当的碱(例
如，氢化钠)进行去质子化，随后添加烷基化剂(诸如卤代烷)来实现烷基化。
[0251]
化合物中的芳香族卤素取代基可以通过碱处理，例如，在锂碱(诸如正丁基锂或叔丁基锂)中进行，任选地在低温下(例如，约-78℃)，在溶剂(诸如四氢呋喃)中进行卤素金属交换，然后用亲电子试剂淬灭以引入所需的取代基。因此，例如，可以通过使用n,n-二甲基甲酰胺作为亲电子试剂引入甲酰基基团。芳族卤素取代基还可以经受金属(例如，钯或铜)催化的反应，以引入例如酸、酯、氰基、酰胺、芳基、杂芳基、烯基、炔基、硫代取代基或氨基取代基。可以采用的适当程序包括如heck、suzuki、stille、buchwald或hartwig所述的那些。
[0252]
与适当的亲核试剂(诸如如胺或醇)反应后，芳族卤素取代基还可以发生亲核取代。有利地，这种反应可以在微波辐射存在下在升高的温度下进行。
[0253]
分离方法
[0254]
在各示例性方案中，可能有利的是使反应产物彼此分开或从原料中分离出来。通过本领域常见的技术将每个步骤或一系列步骤的期望产物分离或纯化(下文为在分离之后)至期望的均一度。通常此类分离涉及多相提取、从溶剂或溶剂混合物结晶或研制、蒸馏、升华或色谱法。色谱法可涉及任意种方法，包括例如：反相和正相色谱法；尺寸排阻色谱法；离子交换色谱法；超临界流体色谱法；高压、中压和低压液相色谱方法和装置；小规模分析性色谱法；模拟移动床(smb)和制备型薄层或厚层色谱法，以及小规模薄层法和快速色谱法技术。
[0255]
另一类分离方法涉及用试剂处理混合物，选择所述试剂以与期望的产物、未反应的起始材料、反应副产物等结合或以其他方式使期望的产物、未反应的起始材料、反应副产物等为可分离的。此类试剂包括吸附剂或吸收剂，诸如活性炭、分子筛、离子交换介质等。可替代地，所述试剂可以是酸(在碱性材料的情况下)；碱(在酸性材料的情况下)；结合试剂诸如抗体、结合蛋白、选择性螯合剂诸如冠醚；液/液离子萃取试剂(lix)等。
[0256]
对适当的分离方法的选择取决于所涉及的材料的性质。示例性分离方法包括沸点和分子量(在蒸馏和升华中)、极性官能团的存在或不存在(在色谱中)、材料在酸性和碱性介质中的稳定性(在多相提取中)等。本领域技术人员将应用最有可能实现所期望分离的技术。
[0257]
可通过本领域技术人员公知的方法，例如通过色谱法和/或分级结晶，基于非对映异构体的物理化学差异，将非对映异构体的混合物分离为其单独的非对映异构体。对映异构体可通过如下方式分离：通过使对映异构体的混合物与适当的光学活性化合物(例如手性助剂，如手性醇或mosher酰氯(mosher's acid chloride))反应，将对映异构体的混合物转化为非对映异构体的混合物，分离非对映异构体，并将单独的非对映异构体转化(例如水解)为相应的纯对映异构体。此外，一些本发明的化合物可以是阻转异构体(例如取代的联芳化合物)并被视为本发明的一部分。对映异构体也可使用手性hplc柱或超临界流体色谱法来分离。
[0258]
单一的立体异构体，例如基本上不含其立体异构体的对映异构体，可通过如下方式获得：通过使用诸如形成非对映异构体的方法，使用光学活性拆分剂来拆分外消旋混合物(eliel,e.和wilen,s.，stereochemistry of organic compounds,john wiley&sons,inc.,new york,1994；lochmuller,c.h.,j.chromatogr.,113(3):283-302(1975))。发明的手性化合物的外消旋混合物可通过任何合适的方法来分离和离析，所述方法包括：(1)与手
性化合物形成离子性非对映异构盐，并通过分级结晶或其他方法来分离；(2)与手性衍生试剂形成非对映异构化合物，分离所述非对映异构体，并转化为纯立体异构体；以及(3)在手性条件下对基本上纯的或富集的立体异构体进行直接分离。参见：drug stereochemistry,analytical methods and pharmacology,irving w.wainer,编辑，marcel dekker,inc.,new york(1993)。
[0259]
非对映异构盐可通过如下方式形成：使对映异构纯的手性碱诸如马钱子碱(brucine)、奎宁、麻黄碱、番木鳖碱(strychnine)、α-甲基-β-苯基乙胺(安非他明)等与带有酸性官能团诸如羧酸和磺酸的不对称化合物反应。可通过分级结晶或离子色谱法来诱导非对映异构盐分离。对于分离氨基化合物的光学异构体而言，手性羧酸或磺酸诸如樟脑磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸的加入可引起非对映异构盐的形成。
[0260]
或者，使待拆分的底物与手性化合物的一种对映异构体反应以形成非对映异构体对(eliel,e.和wilen,s.，stereochemistry of organic compounds,john wiley&sons,inc.,new york,1994，第322页)。非对映异构化合物可通过如下方式形成：使不对称化合物与对映异构纯的手性衍生试剂诸如薄荷基衍生物反应，之后分离非对映异构体并水解，以得到纯的或富集的对映异构体。确定光学纯度的方法涉及制备外消旋混合物的手性酯，诸如薄荷基酯，例如在碱的存在下制备(-)氯甲酸薄荷基酯，或mosher酯、α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯基乙酸酯(jacob,j.org.chem.47:4165(1982))，并就两种阻转异构的对映异构体或非对映异构体的存在对nmr光谱进行分析。阻转异构化合物的稳定非对映异构体可通过正相和反相色谱法，按照用于分离阻转异构的萘基-异喹啉的方法(wo 96/15111，以引用方式并入本文)进行分离和离析。通过方法(3)，两种对映异构体的外消旋混合物可通过使用手性固定相的色谱法进行分离(chiral liquid chromatography w.j.lough,ed.,chapman and hall,new york,(1989)；okamoto,j.of chromatogr.513:375-378(1990))。富集的或纯化的对映异构体可通过用于辨别带有不对称碳原子的其他手性分子的方法(诸如旋光性或圆二色性)进行辨别。手性中心和对映异构体的绝对立体化学可通过x射线晶体学来确定。
[0261]
可通过诸如nmr和分析型hplc的表征方法来观察用于其合成的位置异构体和中间体。对于相互转化的能垒足够高的某些化合物，可例如通过制备型hplc来分离e和z异构体。
[0262]
药物组合物和施用
[0263]
本发明涉及的化合物是jak激酶抑制剂，诸如jak1抑制剂，并且可用于治疗若干种疾病，例如炎性疾病，诸如哮喘。
[0264]
因此，另一实施例提供了含有本发明的化合物或其药用盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本发明的化合物制备此类组合物和药物的方法。
[0265]
在一个实例中，本发明的化合物或其药用盐可通过在环境温度下适当的ph值和期望的纯度下与生理学上可接受的载体(即在所用剂量和浓度下对受者无毒的载体)混合而配制为盖伦(galenical)施用形式。制剂的ph值主要取决于化合物的具体用途和浓度，但通常在约3至约8的范围内。在一个实例中，将本发明的化合物或其药用盐配制在ph 5的乙酸盐缓冲液中。在另一实施例中，本发明的化合物是无菌的。化合物可以例如作为固体或无定形组合物、作为冻干制剂或作为水溶液储存。
[0266]
以与良好医学实践一致的方式配制、计量和施用组合物。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。
[0267]
应当理解，任何特定患者的具体剂量水平均将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、施用通路、排泄速率、药物组合和正在治疗的特定疾病的严重程度。最优化的剂量水平和给药频率将通过临床试验确定，如制药领域中所需要的。通常，口服施用的日剂量范围将在如下范围内：每kg人体重约0.001mg至约100mg，通常为每kg人体重0.01mg至约50mg，例如每kg人体重0.1至10mg，以单次剂量或分份剂量进行。一般来说，吸入施用的日剂量范围将在如下范围内：每kg人体重约0.1μg至约1mg，优选每kg人体重0.1μg至50μg，以单次剂量或分份剂量进行。另一方面，在一些情况下可能需要使用超出这些限制的剂量。
[0268]
本发明的化合物或其药用盐可通过任何适合的方式施用，包括口服、局部(包括颊和舌下)、直肠、阴道、经皮、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、皮内、鞘内、吸入和硬膜外和鼻内，以及(如果需要用于局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施例中，采用吸入施用。
[0269]
本发明的化合物或其药用盐可以以任何方便的施用形式施用，例如片剂、粉剂、胶囊、锭剂、颗粒、溶液、分散剂、混悬剂、糖浆、喷雾剂、气体剂(vapor)、栓剂、凝胶、乳剂、贴剂等。此类组合物可含有药物制剂中常规的组分，例如稀释剂(例如葡萄糖、乳糖或甘露醇)、载体、ph修饰剂、缓冲剂、甜味剂、填充剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、芳香剂、矫味剂、其他已知的添加剂以及其他活性剂。
[0270]
适合的载体和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且在例如ansel,howard c.,et al.,ansel’s pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems.philadelphia:lippincott,williams&wilkins,2004；gennaro,alfonso r.,et al.remington:the science and practice of pharmacy.philadelphia:lippincott,williams&wilkins,2000；and rowe,raymond c.handbook of pharmaceutical excipients.chicago,pharmaceutical press,2005.例如，载体包括溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、类似材料及其组合，如本领域普通技术人员已知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences，第1289-1329页，1990)。除了任何常规载体与活性成分不相容的情况之外，所述载体在治疗或药物组合物中的用途是可预期的。示例性赋形剂包括磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合。药物组合物可以包含不同类型的载体或赋形剂，这取决于其是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及对于这些施用通路其是否需要是无菌的。
[0271]
例如，用于口服施用的片剂和胶囊可以是单位剂量呈递形式，并且可以含有常规赋形剂如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂，例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂，例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅；崩解剂，例如马铃薯淀粉，或可接受的润湿剂如十二烷基硫酸钠。可以根
据正常药物实践中熟知的方法将片剂包衣。口服液体制剂可以是例如水性或油性混悬剂、溶液、乳剂、糖浆或酏剂的形式，或者可以作为用于在使用前用水或其他适合的媒介物重构的干燥产品呈递。此类液体制剂可以含有常规的添加剂，如助悬剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆、明胶氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水性媒介物(其可以包括食用油)，例如杏仁油、分级的椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，以及如果需要常规的矫味剂或着色剂。
[0272]
对于局部施用于皮肤，可以将化合物制成乳膏、洗剂或软膏。可用于药物的乳膏或软膏制剂是本领域熟知的常规制剂，例如在如british pharmacopoeia的标准药学教科书中所描述的。
[0273]
本发明的化合物或其药用盐也可以配制用于吸入，例如作为鼻喷雾剂，或用于干粉或气雾剂吸入器。对于通过吸入递送，化合物通常是微粒的形式，其可以通过多种技术包括喷雾干燥、冷冻干燥和微粉化来制备。可以使用例如压力驱动的喷射雾化器或超声雾化器进行气雾产生，例如通过使用抛射剂驱动的计量气雾剂或来自例如吸入胶囊或其他“干粉”递送系统的微粉化化合物的无抛射剂施用。
[0274]
作为实例，本发明的组合物可以制备为用于从喷雾器递送的混悬剂或作为液体抛射剂中的气雾剂，例如在加压计量剂量吸入器(pmdi)中使用。适用于pmdi的抛射剂是本领域技术人员已知的，并且包括cfc-12、hfa-134a、hfa-227、hcfc-22(ccl2f2)和hfa-152(ch4f2和异丁烷)。
[0275]
在一些实施例中，本发明的组合物为干粉形式，用于使用干粉吸入器(dpi)递送。许多类型的dpi是已知的。
[0276]
通过施用递送的微粒可以使用有助于递送和释放的赋形剂配制。例如，在干粉制剂中，微粒可以使用有助于从dpi流入肺的大载体颗粒配制。适合的载体颗粒是已知的，并且包括乳糖颗粒；它们可以具有例如大于90μm的质量中值空气动力学直径。
[0277]
在基于气雾剂的制剂的情况下，实例为：
[0278]
本发明的化合物*24mg/罐
[0279]
卵磷脂，nf液体浓度 1.2mg/罐
[0280]
三氯氟甲烷，nf 4.025g/罐
[0281]
二氯二氟甲烷，nf 12.15g/罐。
[0282]
*或其药用盐
[0283]
取决于所用的吸入器系统，可以如所述施用本发明的化合物或其药用盐。除了化合物之外，施用形式还可以含有如上所述的赋形剂，或者例如抛射剂(例如在计量气雾剂的情况下为frigen)、表面活性物质、乳化剂、稳定剂、防腐剂、矫味剂、填充剂(例如在粉末吸入器的情况下是乳糖)或(如果适合)另外的活性化合物。
[0284]
对于吸入的目的，可以使用很多系统，这些系统利用适合于患者的吸入技术，可以产生和施用最优化的粒径的气雾剂。除了使用适配器(垫片、膨胀器)和梨形容器(例如)以及发射吹气喷雾的自动装置外，对于计量喷雾剂，特别是在粉末吸入器的情况下，还可以使用多种技术解决方案(例如
或例如，如美国专利no.5,263,475中所述的吸入器，该美国专利以引用方式并入本文)。另外，本发明的化合物或其药用盐可以在多室装置中递送，从而允许递送组合剂。
[0285]
该化合物或其药用盐也可以在无菌介质中肠胃外施用。取决于所用的媒介物和浓度，可以将化合物悬浮或溶解在媒介物中。有利地，可以将佐剂诸如局部麻醉剂、防腐剂或缓冲剂溶解在媒介物中。
[0286]
靶向吸入式药物递送
[0287]
本发明的化合物可以预期用于靶向吸入递送。最近已经综述了通过局部(吸入)施用递送至肺部的药物的优化(cooper,a.e.et al.curr.drug metab.2012,13,457-473)。
[0288]
由于递送装置的限制，吸入式药物的剂量可能为有限人体剂量，其需要具有良好肺药代动力学特性的高效分子。由于诸如从吸入器中一次抽吸可递送的药物量有限，以及与肺高喷雾剂负荷有关的安全性问题(例如，咳嗽或刺激)等因素，针对目标靶标的高效力对于吸入式药物尤为重要。例如，在一些实施例中，对于吸入式jak1抑制剂，可以期望如本文所述的jak1生化测定中的ki为约0.5nm或更小，以及如本文所述的基于jak1依赖性细胞的测定中的ic50为约20nm或更小。在其他实施例中，本发明的化合物或其药用盐的预计人体剂量至少比本领域已知的化合物的预计人体剂量小两倍。因此，在一些实施例中，本文所述的化合物(或其药用盐)表现出此类效力值。以下程序用于评价标的化合物用作吸入式药物的潜能。
[0289]
il13信号转导。il13信号转导与哮喘发病密切相关。il13是一种需要活性jak1才能进行信号转导的细胞因子。因此，抑制jak1也会抑制il13信号转导，这会为哮喘患者带来益处。在动物模型(例如，小鼠模型)中对il13信号转导的抑制可预测未来对人类哮喘患者的益处。因此，吸入式jak1抑制剂在动物模型中显示il13信号转导抑制可能是有益的。测量这种抑制的方法在本领域中是已知的。例如，如本文所讨论并且在本领域中已知的，已知jak1依赖性stat6磷酸化为il13刺激的下游结果。因此，在一些实施例中，本文所述的化合物(或其药用盐)表现出对肺pstat6诱导的抑制。为了检查对pstat6水平的药效动力学效应，将本发明的化合物与1μg il13共同鼻内给药至雌性balb/c小鼠。将化合物配制在含0.2％(v:v)tween 80的盐溶液中，并在施用前与il13以1:1(v:v)混合。通过用移液管将固定体积(50μl)直接分配到鼻孔中以达到目标剂量水平(3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg、0.1mg/kg)，来将鼻内剂量施用于轻度麻醉(异氟醚)的小鼠。给药后0.25h，通过心脏穿刺收集血液样本(约0.5ml)，并通过离心(1500g，10min，+4℃)产生血浆。用冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs)灌注肺，称重并在液氮中速冻。将所有样本储存在约-80℃下直至用于分析。每克组织加入2ml hplc级水后，在4℃下使用omni-prep球磨机(omni-prep bead ruptor)将除霜的肺样本称重并匀浆。血浆和肺样本通过蛋白质沉淀法提取，其中使用三体积的含甲苯磺丁脲(50ng/ml)和拉贝洛尔(25ng/ml)的乙腈作为分析内标。涡旋混合并在3200g和4℃下离心30分钟后，将上清液用hplc级水在96孔板中适当稀释(例如1:1v:v)。通过lc-ms/ms，参照一系列基质匹配校准和质量控制标准，对血浆和肺样本的代表性等分试样进行母体化合物测定。通过向对照balb/c小鼠血浆或肺匀浆(2:1，在hplc级水中)的等分试样中掺加测试化合物，并如针对实验样本所述的方法进行提取来制备标准物。肺:血浆比率测定为在采样时间(0.25h)的平均肺浓度(μm)与平均血浆浓度(μm)之比。
[0290]
为了测量pstat6水平，将小鼠肺在-80℃下冷冻储存直至测定，并在0.6ml冰冷细胞裂解缓冲液(cell signaling technologies，目录号9803s)中匀浆，所述缓冲液中补充有1mm pmsf以及蛋白酶(sigma aldrich，目录号p8340)和磷酸酶(sigma aldrich，目录号p5726和p0044)抑制剂混合物。将样本在4℃下以16060x g离心4分钟以除去组织碎片，并使用pierce bca蛋白测定试剂盒(目录号23225)测定匀浆的蛋白浓度。在冰冷的蒸馏水中将样本稀释至蛋白浓度为5mg/ml，并通过meso scale discovery电化学发光免疫测定来测定pstat6水平。简而言之，将5μl/孔的150μg/ml stat6捕获抗体(r&d systems，目录号mab 2169)包被在96孔meso scale discovery高结合板(目录号l15xb-3)上，并在室温下风干5小时。通过加入150μl/孔的30mg/ml meso scale discovery封闭剂a(目录号r93ba-4)来封闭板，并在室温下在微孔板振荡器上温育2小时。封闭的板用meso scale discovery tris洗涤缓冲液(目录号r61tx-1)洗涤4次，之后转移50μl/孔的肺匀浆以达到250μg/孔的蛋白负荷。将测定板在4℃下温育过夜，并用tris洗涤缓冲液洗涤4次，然后在室温下在微孔板振荡器上加入25μl/孔2.5μg/ml硫标签标记的pstat6检测抗体(bd pharmingen，目录号558241)达2小时。用tris洗涤缓冲液洗涤板4次，并加入150μl/孔的1x meso scale discovery读数缓冲液t(目录号r92tc-1)。通过在meso scale discovery sector s 600仪器上检测电化学发光来定量肺匀浆pstat6水平。
[0291]
jak及jak2抑制抑制jak1及jak2二者的化合物潜在地可用于治疗不同类型的哮喘。jak1与jak2之间的选择性对于吸入式jak1抑制剂也可是重要的。例如，gmcsf(粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子)是专门通过jak2进行信号转导的细胞因子。gmcsf活性的中和与肺中的肺泡蛋白沉着症(pap)相关联。但是，亚极量的jak2抑制似乎与pap无关。因此，即使适度的jak1与jak2选择性或对jak1和jak2近似等效的抑制也可以有益于避免完全抑制gmcsf通路以及避免pap。例如，在某些实施例中，对jak1及jak2的效能均等的化合物是期望的。在其他实施例中，对jak1的选择性是对jak2的选择性的约2倍-5倍的化合物可以对吸入式jak1抑制剂有益。因此，在一些实施例中，本文所述的化合物(或其药用盐)表现出此类选择性。测量jak1和jak2选择性的方法在本领域中是已知的，并且信息也可以在本文的实例中找到。
[0292]
激酶剖析。另外，可以期望吸入式jak1或jak1/jak2抑制剂对一种或多种其他激酶具有选择性，以减少由于脱靶激酶通路抑制而产生潜在毒性的可能性。因此，吸入式jak1抑制剂对多种非jak激酶具有选择性也可以是有益的，例如在可得自thermofisher scientific的selectscreen
tm
生化激酶谱分析服务的使用adapta
tm
筛选方案测定条件(2016年7月29日修订)、lanthascreen
tm eu激酶结合测定筛选方案和测定条件(2016年6月7日修订)和/或z’lyte
tm
筛选方案和测定条件(2016年9月16日修订)的方案中。例如，本发明的化合物或其药用盐对jak1比一组非jak激酶表现出至少50倍的选择性。因此，在一些实施例中，本文所述的化合物(或其药用盐)表现出此类选择性。
[0293]
细胞毒性测定。肝细胞毒性(一般细胞毒性或未知机制的细胞毒性)是潜在药物(包括吸入式药物)的不期望的特征。可以有益的是吸入式jak1或jak1/jak2抑制剂对各种细胞类型的固有细胞毒性较低。用于评定细胞毒性的典型细胞类型包括原代细胞(诸如人肝细胞)和确立的增殖细胞系(诸如jurkat和hek-293)。因此，在一些实施例中，本文所述的化合物(或其药用盐)表现出此类值。测量细胞毒性的方法在本领域中是已知的。在一些实
allegra x 12r)，以去除血浆蛋白。随后，收集上清液且然后用等体积水稀释，之后进行lc-ms/ms分析。
[0302]
(b)在交替程序中，测试化合物与小鼠肺均质物的肺组织结合程度也可通过使用pierce red(快速平衡透析)装置(fisher scientific 89811&89809)进行平衡透析来确定。在dmso中制备10mm的化合物溶液并用dmso稀释至1mm。将此1mm的等分试样(4μl)添加至肺均质物(稀释系数为1:9，肺组织:磷酸钾缓冲液为(0.05m,ph 7.4))，以得到5μm的最终化合物孵育浓度，其中溶剂占最终孵育体积的0.5％(v/v)。
[0303]
对于每次测定，重复三次确定经结合的肺组织的百分比。重复三次将肺均质物(200μl)装载到red装置插件的一侧，并将350μl磷酸钾缓冲液装载到另一侧。密封red装置并将其在约37℃下在定轨振荡器(约150rpm)上孵育4小时。
[0304]
在孵育后，在分析之前，将肺均质物等分试样(8μl)及透析液等分试样(72μl)进行基质匹配(具有72μl磷酸盐缓冲液的肺均质物、具有8μl肺均质物的透析液)。通过添加160μl含内标的乙腈，从样本中沉淀蛋白。对实验开始时采集的肺均质物等分试样(t＝0min样本)进行相同的基质匹配及蛋白沉淀程序，以用于评估质量平衡。将经淬灭的样本离心(4000rpm，30min，4℃)且用水稀释所得上清液(3:1(v/v)，上清液:水)，并通过液相层析质谱检定法分析样本的亲本化合物。
[0305]
由透析液与均质物峰面积比率确定肺均质物中的未结合分数(fu)，经校正以考虑肺均质物稀释(d)，使得能够使用以下等式评估全肺组织结合：
[0306]
未经稀释的fu＝(1/d)/[((1/表面fu)-1)+(1/d)]
[0307]
经校正的结合分数(％)＝(1-未经稀释的fu)*100
[0308]
动力学溶解度。用于吸入递送的jak1/jak2抑制剂的良好水溶解度是期望的。在量测动力学溶解度的一个程序中，将4μl测试化合物的10mm dmso储备溶液添加至millipore96孔过滤板中的196μl ph 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液，以得到200μm测试浓度及2％的残余dmso。用铝密封膜密封过滤板且在室温下震荡24小时，然后使该等混合物真空过滤至干净96孔板中。使用ph 7.4磷酸盐缓冲盐水溶液以2的系数稀释滤液样本，然后通过超高效液相层析(uhplc)使用化学发光氮侦检测(clnd)及254nm波长下的紫外光(uv)检测来分析5μl所得溶液。通常通过clnd强度定量样本浓度，该强度与化合物中氮的数量相关。主要使用uv检测来确认样本纯度，除了测试样本不含氮的少数情况。在彼等情况下，基于uv吸光度来收集化合物特异性校准曲线。然后使用该曲线确定样本浓度。
[0309]
亲油性。亲油性通常与潜在药物的溶解度、吸收度、组织渗透性、蛋白结合、分布、及adme和pk特性相关。经计算logp(clogp)是化合物在正辛醇与水之间的分配系数的对数(也即log(正辛醇中化合物的浓度/水中化合物的浓度))，因此可作为用于吸入递送的jak1/jak抑制剂的重要考虑因素。
[0310]
肝微粒体稳定性。为了最小化吸入式jak1/jak2抑制剂的全身暴露，优化肝内的快速代谢可以是有益的。在biocel 1200液体处理工作台(agilent technologies,santa clara,ca)上执行肝微粒体稳定性测定。将化合物(1.0μm)在37℃下在100μl含有100mm磷酸盐缓冲液(ph 7.4)及0.5mg/ml肝微粒体及1mm nadph的反应混合物中孵育5min。在不同时间间隔(0、20、40及60min)下，取出20μl反应混合物的等分试样并将其与4个体积的含有0.1μm普萘洛尔作为内部标准的乙腈(acn)混合以终止代谢反应。然后将样本在3250xg下离心
40min以去除沉淀蛋白。随后将上清液转移至新的96孔板并用去离子水稀释2倍，然后使用与agilent 1260hplc(agilent technologies,santa clara,ca)耦接的abi sciex 5500质谱仪(applied biosystems,foster city,ca)进行lc-ms/ms分析。在不同时间点相对于对照(t＝0min)使用测试化合物与内部标准的峰面积比率计算其余部分的百分比。参见b.williamson,c.wilson,g.dagnell,rj riley.harmonised high throughput microsomal stability assay.j.pharmacol.toxicol.methods.2017；84:31-36。
[0311]
固态特性。对于预定通过干粉吸入来递送的化合物，还需要能够产生可以微粉化至1-5μm大小的化合物的结晶形式。粒度是吸入式化合物肺沉积的重要决定因素。直径小于5微米(μm)的颗粒通常被定义为可吸入的。直径大于5μm的颗粒更有可能沉积在口咽中，因此不太可能沉积在肺中。此外，与更大的颗粒相比，直径小于1μm的细颗粒更有可能在空气中保持悬浮，因此更可能从肺中呼出。因此，对于作用部位在肺的吸入式药物，粒径为1-5μm可以是有益的。用于量测粒子大小的典型方法包括雷射绕射及级联冲击。用于定义粒度的典型值包括：
[0312]
·
d10、d50和d90。这些值是粒径的测量值，分别指示10％、50％或90％的样本低于该值。例如，d50为3μm指示50％的样本的大小低于3μm。
[0313]
·
质量平均空气动力学直径(mmad)。mmad是指直径，按质量计50％的颗粒大于该值而50％小于该值。mmad是集中趋势的量度。
[0314]
·
几何标准偏差(gsd)。gsd是根据mmad的分散性量值或空气动力学粒度分布散布的量度。
[0315]
吸入式药物的常用制剂是干粉制剂，所述干粉制剂包含与载体(诸如乳糖)、具有(或不具有)附加添加剂(诸如硬脂酸镁)掺混的活性药物成分(api)。对于这种制剂和其他制剂，api本身具有允许将其研磨成1-5μm的可吸入颗粒大小的特性可以是有益的。应避免颗粒的附聚，所述附聚可以通过本领域中已知的方法进行测量，例如在不同压力条件下检查d90值。因此，在一些实施例中，本发明的化合(或其药用盐)物可以制备成具有这样的可吸入粒度而少有或没有附聚。
[0316]
至于结晶度，对于一些吸入式药物制剂(包括乳糖掺混物)，重要的是使用特定结晶形式的api。结晶度和结晶形式可能会影响与吸入式药物有关的许多参数，包括但不限于：随时间的化学和空气动力学稳定性、与吸入式制剂组分诸如乳糖的相容性、吸湿性、肺积存性和肺刺激性。因此，稳定的、可再现的结晶形式对于吸入式药物可以是有益的。另外，用于将化合物研磨至期望粒度的技术通常是高能的，并且可以使得低熔点的结晶形式转化为其他结晶形式，或者转化为完全或部分无定形的。熔点低于150℃的结晶形式可能不适宜研磨，而熔点低于100℃的结晶形式有可能与研磨不相容。因此，吸入式药物的熔点至少大于100℃，理想地大于150℃可以是有益的。因此，在一些实施例中，本文所述的化合物(或其药用盐)表现出这种特性。
[0317]
另外，将分子量降至最低可有助于降低吸入式jak1抑制剂的有效剂量。分子量越低，每单位质量的活性药物成分(api)的分子数相应地就越高。因此，找到保留吸入式药物的所有其他期望特性的最小分子量的吸入式jak1抑制剂可以是有益的。
[0318]
最后，化合物需要在给定的时间段内在肺中保持足够的浓度，以便能够发挥药理学效应达期望的持续时间，并且对于药理学靶标(在并不期望所述靶标的全身抑制作用的
情况下)而言能够具有较低的全身暴露。肺对大分子(蛋白质、肽)以及伴随短肺半衰期的小分子具有固有的高渗透性，因此可能需要通过改变化合物的一种或多种特征来减弱肺吸收速率：最小化膜渗透性、最优pka、clogp、溶解度、溶解速率、或向化合物中引入一定程度的碱性(例如，引入胺)以增强与富含磷脂的肺组织的结合，或通过在酸性亚细胞区室如溶酶体(ph 5)中捕获。测量此类特性的方法在本领域中是已知的。
[0319]
因此，在一些实施例中，本发明的化合物(或其药用盐)有利地表现出上述特征中的一种或多种。此外，在一些实施例中，相对于本领域中已知的化合物，本发明的化合物有利地表现出这些特征中的一种或多种，对于预期用作口服药物而不是吸入式药物的本领域化合物而言尤其如此。例如，具有快速口服吸收的化合物通常在吸入时很难在肺中保留。
[0320]
使用詹纳斯激酶抑制剂的治疗方法及其用途
[0321]
本发明的化合物或其药用盐抑制詹纳斯激酶诸如jak1激酶的活性。例如，化合物或其药用盐通过jak1激酶以及stat介导的细胞因子产生来抑制信号转导和转录激活因子(stat)的磷酸化。本发明的化合物可用于通过细胞因子通路诸如il-6、il-15、il-7、il-2、il-4、il-9、il-10、il-13、il-21、g-csf、ifnα、ifnβ或ifnγ通路抑制细胞中的jak1激酶活性。因此，在一个实施例中，提供了一种使细胞与本发明的化合物或其药用盐接触以抑制细胞中的詹纳斯激酶活性(例如，jak1活性)的方法。
[0322]
所述化合物可用于治疗由异常的il-6、il-15、il-7、il-2、il-4、il-9、il-10、il-13、il-21、g-csf、ifnα、ifnβ或ifnγ细胞因子信号转导驱动的免疫性疾病。
[0323]
因此，一个实施例包括用于治疗的本发明的化合物或其药用盐。
[0324]
在一些实施例中，提供了本发明的化合物或其药用盐在炎性疾病治疗中的用途。进一步提供了本发明的化合物或其药用盐在制备用于治疗炎性疾病如哮喘的药物中的用途。还提供了用于治疗炎性疾病如哮喘的本发明的化合物或其药用盐。
[0325]
另一实施例包括一种方法，该方法预防、治疗患者的响应于詹纳斯激酶活性如jak1激酶活性的抑制的疾病或病症(如哮喘)或减轻所述疾病或病症的严重性。所述方法可以包括向患者施用治疗有效量的本发明的化合物或其药用盐的步骤。在一个实施例中，响应于詹纳斯激酶如jak1激酶的抑制的疾病或病症是哮喘。
[0326]
在一个实施例中，疾病或病症是癌症、中风、糖尿病、肝肿大、心血管疾病、多发性硬化症、阿尔茨海默病、囊性纤维化、病毒性疾病、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化、再狭窄、银屑病、类风湿性关节炎、炎症性肠病、哮喘、变应性疾病、炎症、神经系统疾病、激素相关疾病、与器官移植相关的病症(例如，移植排斥)、免疫缺陷疾病、破坏性骨病、增生性疾病、感染性疾病、与细胞死亡相关的病症、凝血酶诱导的血小板聚集、肝病、涉及t细胞活化的病理性免疫病症、cns疾病或骨髓增生性疾病。
[0327]
在一个实施例中，炎性疾病是类风湿性关节炎、银屑病、哮喘、炎症性肠病、接触性皮炎或迟发性超敏反应。在一个实施例中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎、狼疮或多发性硬化症。
[0328]
在另一实施例中，本发明的化合物或其药用盐可用于治疗肺病诸如纤维化肺病或间质性肺病(例如，间质性肺炎)。在一些实施例中，本发明的化合物或其药用盐可用于治疗特发性肺纤维化(ipf)、全身性硬化间质性肺病(ssc-ild)、非特异性间质性肺炎(nsip)、类风湿性关节炎相关的间质性肺病(ra-ild)、结节病、过敏性肺炎或硬皮病后继发于结缔组
织病的ild(例如，多肌炎、皮肌炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(sle)或混合性结缔组织病)。
[0329]
在一个实施例中，癌症是乳房癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、泌尿生殖道癌、精原细胞瘤、食道癌、喉癌、胃癌(gastric)、胃癌(stomach)、胃肠癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、滤泡癌、黑素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、肺腺癌、肺鳞癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳头状癌、膀胱癌、肝脏癌、胆道癌、肾癌、骨癌、髓性障碍、淋巴性障碍、毛细胞癌、颊腔和咽(口腔)癌、唇癌、舌癌、口腔癌、唾液腺癌、咽癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肾脏癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、中枢神经系统癌、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈癌、霍奇金病或白血病。
[0330]
在一个实施例中，疾病是骨髓增生性疾病。在一个实施例中，骨髓增生性疾病是真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化或慢性髓细胞性白血病(cml)。
[0331]
另一个实施例包括本发明的化合物或其药用盐在制造用于治疗本文所述疾病(例如炎性病症、免疫性疾病或癌症)的药物中的用途。在一个实施例中，本发明提供了一种通过靶向抑制jak激酶如jak1来治疗如本文所述的疾病或病症(例如炎性病症、免疫性疾病或癌症)的方法。
[0332]
组合疗法
[0333]
所述化合物可以单独使用或与其他药剂组合使用以进行治疗。药物组合物或给药方案的第二化合物或另外(例如，第三)通常具有与本发明的化合物互补的活性，使得它们不会对彼此产生不利影响。此类药剂适当地以对预期目的有效的量组合存在。所述化合物可以在单一药物组合物中一起施用或分开施用，并且当分开施用时，其可以同时或顺序施用。这种顺序施用可以在时间上接近或间隔较远。
[0334]
例如，其他化合物可以与本发明的化合物或其药用盐组合用于预防或治疗炎性疾病，如哮喘。用于联合疗法的适合的治疗剂包括但不限于：腺苷a2a受体拮抗剂；抗感染药；非甾体糖皮质激素受体(gr受体)激动剂；抗氧化剂；β2肾上腺素受体激动剂；ccr1拮抗剂；趋化因子拮抗剂(非ccr1)；皮质类固醇；crth2拮抗剂；dp1拮抗剂；甲酰基肽受体拮抗剂；组蛋白脱乙酰酶激活剂；氯通道hclca1阻断剂；上皮钠通道阻断剂(enac阻断剂；细胞间粘附分子1阻断剂(icam阻断剂)；ikk2抑制剂；jnk抑制剂；瞬时受体电位锚蛋白1(trpa1)抑制剂；布鲁顿(bruton)酪氨酸激酶(btk)抑制剂(例如，芬鲁替尼(fenebrutinib))；脾酪氨酸激酶(syk)抑制剂；类胰蛋白酶-β抗体；st2受体抗体(例如，amg 282)；环加氧酶抑制剂(cox抑制剂)；脂氧合酶抑制剂；白三烯受体拮抗剂；双重β2肾上腺素受体激动剂/m3受体拮抗剂(maba化合物)；mek-1抑制剂；髓过氧化物酶抑制剂(mpo抑制剂)；毒蕈碱拮抗剂；p38 mapk抑制剂；磷酸二酯酶pde4抑制剂；磷脂酰肌醇3-激酶δ抑制剂(pi3-激酶δ抑制剂)；磷脂酰肌醇3-激酶γ抑制剂(pi3-激酶γ抑制剂)；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂(pparγ激动剂)；蛋白酶抑制剂；视黄酸受体调节剂(rarγ调节剂)；他汀类；血栓烷拮抗剂；tlr7受体激动剂；或血管扩张剂。
[0335]
此外，本发明的化合物或其药用盐可以与以下物质组合：(1)皮质类固醇，诸如二丙酸阿氯米松(alclometasone dipropionate)、阿洛米松(amelometasone)、二丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)、布地奈德(budesonide)、丙酸布替可特(butixocort propionate)、环索奈德(biclesonide)、丙酸氯倍他索(clobetasol propionate)、去异丁
基环索奈德(desisobutyrylciclesonide)、地塞米松(dexamethasone)、艾泼诺酯(etiprednol dicloacetate)、乙酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、糠酸氟替卡松(fluticasone furoate)、丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、依碳氯替泼诺(loteprednol etabonate)(局部用)或糠酸莫米松(mometasone furoate)；(2)β2-肾上腺素受体激动剂，诸如舒喘灵(salbutamol)、沙丁胺醇(albuterol)、特布他林(terbutaline)、非诺特罗(fenoterol)、比托特罗(bitolterol)、卡布特罗(carbuterol)、克仑特罗(clenbuterol)、吡布特罗(pirbuterol)、里模特罗(rimoterol)、特布他林、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)，以及长效2-肾上腺素受体激动剂，诸如奥西那林(metaproterenol)、异丙特醇(isoproterenol)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、沙美特罗(salmeterol)、茚达特罗(indacaterol)、福莫特罗(formoterol)(包括富马酸福莫特罗)、阿福特罗(arformoterol)、卡莫特罗(carmoterol)、阿迪特罗(abediterol)、三氟拉酸维兰特罗(vilanterol trifenate)或奥达特罗(olodaterol)；(3)皮质类固醇/长效2激动剂组合产品，诸如沙美特罗/丙酸氟替卡松(也以销售)、福莫特罗/布地奈德福莫特罗/丙酸氟替卡松福莫特罗/环索奈德、福莫特罗/糠酸莫米松、茚达特罗(indacaterol)/糠酸莫米松、三氟拉酸维兰特罗(vilanterol trifenate)/糠酸氟替卡松(breo ellipta)或阿福特罗(arformoterol)/环索奈德；(4)抗胆碱能剂，例如毒蕈碱-3(m3)受体拮抗剂，诸如异丙托溴铵(ipratropium bromide)、噻托溴铵(tiotropium bromide)、阿地溴铵(aclidinium bromide)(las-34273)、格隆溴铵(glycopyrronium bromide)或芜地溴铵(umeclidinium bromide)；(5)m3-抗胆碱能/β2-肾上腺素受体激动剂组合产品，诸如维兰特罗/芜地铵奥托特罗/噻托溴铵、格隆溴铵/茚达特罗(也以销售)、氢溴酸非诺特罗(fenoterol hydrobromide)/异丙托溴铵硫酸沙丁胺醇(albuterol sulfate)/异丙托溴铵富马酸福莫特罗/格隆溴铵(glycopyrrolate)或阿地溴铵/福莫特罗；(6)双重药理学m3-抗胆碱能/β2-肾上腺素受体激动剂，(诸如琥珀酸备芬特洛(batefenterol succinate)、azd-2115或las-190792；(7)白三烯调节剂，例如白三烯拮抗剂，诸如孟鲁司特(montelukast))、扎鲁司特(zafirulast)或普仑司特(pranlukast)，或白三烯生物合成抑制剂，诸如齐留通(zileuton)，或ltb4拮抗剂，诸如阿美卢班(amelubant)，或flap抑制剂，诸如氟非隆(fiboflapon)、gsk-2190915；(8)磷酸二酯酶-iv(pde-iv)抑制剂(口服或吸入)，诸如罗氟司特(roflumilast)、西洛司特(cilomilast)、奥格司特(oglemilast)、咯利普兰(rolipram)、替托司特(tetomilast)、ave-8112、瑞米司特(revamilast)、chf 6001；(9)抗组胺药，例如选择性组胺-1(h1)受体拮抗剂，诸如非索非那定(fexofenadine)、西吡替林(citirizine)、氯雷他定(loratidine)或阿司咪唑(astemizole)，或双重h1/h3受体拮抗剂，诸如gsk 835726或gsk 1004723；(10)镇咳剂，诸如可待因或右美沙芬(dextramorphan)；(11)粘液溶解剂，例如n-乙酰基半胱氨酸或福多斯汀(fudostein)；(12)祛痰剂/粘弹性调节剂，例如氨溴索(ambroxol)、高渗溶液(例如盐水或甘露醇)或表面活性剂；(13)粘液溶解肽，例如重组人脱氧核糖核酸酶i(链道酶-α和rhdnase)或螺杀菌素；(14)抗生素，例如阿奇霉素(azithromycin)、妥布霉素(tobramycin)或氨曲南(aztreonam)；
(15)非选择性cox-1/cox-2抑制剂，诸如布洛芬(ibuprofen)或酮洛芬(ketoprofen)；(16)cox-2抑制剂，诸如塞来考昔(celecoxib)和罗非昔布(rofecoxib)；(17)vla-4拮抗剂，诸如在wo 97/03094和wo 97/02289中描述的那些，所述文献各自通过引用合并于本文；(18)tace抑制剂和tnf-α抑制剂，例如抗tnf单克隆抗体，诸如和cdp-870，以及tnf受体免疫球蛋白分子，如(19)基质金属蛋白酶抑制剂，例如mmp-12；(20)人嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，诸如bay-85-8501或在wo2005/026124、wo2003/053930和wo 2006/082412中描述的那些，所述文献各自通过引用合并于本文；(21)a2b拮抗剂，诸如在wo2002/42298中描述的那些，其通过引用合并于本文；(22)趋化因子受体功能调节剂，例如ccr3和ccr8的拮抗剂；(23)调节其他类前列腺素受体的作用的化合物，例如血栓烷a2拮抗剂；dp1拮抗剂，诸如拉罗匹仑(laropiprant)或阿萨匹仑(asapiprant)crth2拮抗剂，诸如oc000459、非韦匹仑(fevipiprant)、adc 3680或arry 502；(24)pparα激动剂，包括pparα激动剂(如非诺贝特)、pparδ激动剂、pparγ激动剂(如吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)和巴格列酮(balaglitazone))；(25)甲基黄嘌呤，诸如茶碱或氨茶碱，以及甲基黄嘌呤/皮质类固醇组合，诸如茶碱/布地奈德(budesonide)、茶碱/丙酸氟替卡松(fluticasone propionate)、茶碱/环索奈德、茶碱/糠酸莫米松和茶碱/二丙酸倍氯米松(beclometasone dipropionate)；(26)a2a激动剂，诸如ep1052264和ep1241176中所述的那些；(27)cxcr2或il-8拮抗剂，如azd-5069、azd-4721、达尼日新(danirixin)；(28)il-r信号转导调节剂，诸如阿那白滞素(kineret)和acz 885；(29)mcp-1拮抗剂，如abn-912；(30)p38 mapk抑制剂，如bct197、jnj49095397、洛沙莫德(losmapimod)或ph-797804；(31)tlr7受体激动剂，如azd 8848；(32)pi3-激酶抑制剂，诸如rv1729或gsk2269557；尼米拉利昔(nemiralisib))；(33)三重组合产品诸如trelegy ellipta(糠酸氟替卡松、芜地溴铵及维兰特罗)；或(34)trpa1、btk或syk的小分子抑制剂。
[0336]
在一些实施例中，本发明的化合物或其药用盐可以与一种或多种其他药物组合使用，例如抗过度增殖药、抗癌药、细胞抑制剂、细胞毒性剂、抗炎剂或化疗剂，诸如美国公开申请no.2010/0048557中公开的，该申请通过引用方式并入本文。如本领域中已知的，本发明的化合物或其药用盐也可以与放疗或外科手术组合使用。
[0337]
前述任何一项与本发明的化合物或其药用盐的组合是特别设想的。
[0338]
制品
[0339]
另一实施例包括用于治疗应答詹纳斯激酶如jak1激酶的抑制的疾病或疾患的制品(例如药盒)。该药盒可以包含：
[0340]
(a)第一药物组合物，其包含本发明的化合物或其药用盐；和
[0341]
(b)使用说明。
[0342]
在另一实施例中，药盒进一步包含：
[0343]
(c)第二药物组合物，如包含如上所述的用于治疗的药剂的药物组合物，该药剂为诸如用于治疗炎性疾患的药剂，或化疗剂。
[0344]
在一个实施例中，说明书描述了将第一药物组合物和第二药物组合物同时、顺序或分开施用于有需要的患者。
[0345]
在一个实施例中，第一组合物和第二组合物包含在独立的容器中。在另一实施例中，第一组合物和第二组合物包含在同一个容器中。
[0346]
使用的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。所述容器可以由诸如玻璃或塑料等多种材料形成。容器中包含用于有效治疗病症的本发明的化合物或其药用盐，并且所述容器可具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内输液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或包装插页标明该化合物用于治疗所选择的病症，诸如哮喘或癌症。在一个实施例中，标签或包装插页标明该化合物可以用于治疗某种疾患。此外，标签或包装插页可标明待治疗的患者是具有特征为活性过强或不规律的詹纳斯激酶活性(诸如活性过强或不规律jak1活性)的疾患的患者。标签或包装插页也可以标明该化合物可以用于治疗其他疾患。
[0347]
替代地或另外地，药盒可进一步包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。制品还可以包括从商业和用户角度所需的其他物质，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
[0348]
为了说明本发明，纳入了以下实例。然而，应当理解，这些实例不限制本发明，而是仅意在建议实施本发明的方法。本领域技术人员将认识到，所述的化学反应可以容易地进行调整以制备其他的本发明的化合物，并且制备化合物的替代方法也在本发明的范围内。例如，通过对本领域的技术人员显而易见的修改，例如，通过适当地保护干扰基团、利用本领域中已知的其他合适的试剂或通过对反应条件进行常规修改，可成功地实现根据本发明所述的非示例性化合物的合成。另选地，本文所公开的或本领域已知的其他反应将被视为适用于制备本发明的其他化合物。
[0349]
实例
[0350]
使用类似于本文方案和实例中所述的流程制备表1的以下代表性化合物。可能尚未描绘以下各化合物的绝对立体化学：因此，结构可出现不止一次，各自表示单一立体异构体。表1也示出lc-ms方法、滞留时间及m/z。
[0351]
表1：示例性jak抑制剂
[0352]
[0353]
[0354]
[0355]
[0356]
[0357]
[0358]
[0359]
[0360]
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[0362]
[0363]
[0364]
[0365]
[0366]
[0367]
[0368][0369]
表1
[0370]
一般实验详情
[0371]
除非另有说明，否则所有溶剂和商购试剂均按原样使用。在通过硅胶色谱法纯化产物的情况下，使用手动填充硅胶(kieselgel 60,220-440目，35-75μm)的玻璃柱或spe si ii管柱进行该操作。“isolute spe si管柱”是指包含具有50μm平均粒径和标称孔隙率的不规则颗粒的未键合活性二氧化硅的预填充聚丙烯柱。在使用scx-2管柱的情况下，“scx-2管柱”是指包含非封端丙基磺酸官能化的二氧化硅强阳离子交换吸附剂的预填充聚丙烯柱。
[0372]
lcms条件
[0373]
方法a
[0374]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0375]
[0376]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0377]
方法b
[0378]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0379][0380]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0381]
方法c
[0382]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0383][0384]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0385]
方法d
[0386]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0387][0388][0389]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0390]
方法e
[0391]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0392][0393]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0394]
方法f
[0395]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0396][0397]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0398]
方法g
[0399]
实验在shimadzu 20a hplc上进行，采用c18反相柱(50x2.1mm ascentis express c18，2.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0400][0401]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0402]
方法h
[0403]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0404][0405]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0406]
方法i
[0407]
实验在shimadzu 20a hplc上进行，采用poroshell hph-c
18
管柱(50x3mm，2.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水/5mm nh4hco3；溶剂b：乙腈。梯度：
[0408][0409]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0410]
方法j
[0411]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm kinetex xb-c
18
，2.6μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0412][0413][0414]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0415]
方法k
[0416]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0417][0418]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0419]
方法l
[0420]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x2.1mm kinetex xb-c
18 100a，2.6μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0421][0422]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0423]
方法m
[0424]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(30x2.1mm kinetex c18-100a，1.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0425][0426][0427]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0428]
方法n
[0429]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3.0mm poroshell hph-c18，2.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+5mm碳酸氢铵；溶剂b：乙腈。梯度：
[0430][0431]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0432]
方法o
[0433]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3.0mm titank c18，3.0μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+5mm碳酸氢铵；溶剂b：乙腈。梯度：
[0434][0435]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0436]
方法p
[0437]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(30x2.1mm halo c18，2.0μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0438][0439]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0440]
方法q
[0441]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3.0mm ymc-triart c18，2.5μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.1％甲酸；溶剂b：乙腈+0.1％甲酸。梯度：
[0442][0443]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0444]
方法r
[0445]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0446][0447]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0448]
方法s
[0449]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3.0mm poroshell hph-c18，2.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+5mm碳酸氢铵；溶剂b：乙腈。梯度：
[0450][0451]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0452]
方法t
[0453]
实验在shimadzu 20a hplc上进行，采用c18反相柱(50x2.1mm ascentis express c18，2.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0454][0455]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0456]
方法u
[0457]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3mm shim-pack xr-ods，2.2μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.05％三氟乙酸；溶剂b：乙腈+0.05％三氟乙酸。梯度：
[0458][0459]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0460]
方法v
[0461]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x3.0mm poroshell hph-c18，2.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+5mm碳酸氢铵；溶剂b：乙腈。梯度：
[0462][0463]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0464]
方法w
[0465]
实验在shimadzu lcms-2020上进行，采用c18反相柱(50x2.1mm waters acquity beh，1.7μm粒径)，洗脱液为：溶剂a：水+0.1％甲酸；溶剂b：乙腈+0.1％甲酸。梯度：
[0466][0467]
检测-uv(220和254nm)和elsd
[0468]
方法x
[0469]
实验采用agilent 1290uhplc与agilent msd(6140)质谱仪联用系统，该仪器系统使用esi作为离子源。使用phenomenex xb-c18,1.7m,50
×
2.1mm管柱在0.4ml/min流速下进行lc分离。流动相a为具有0.1％甲酸的水，且流动相b为具有0.1％甲酸的乙腈。梯度以2％b开始并且以98％b结束，历时7min，并在平衡1.5min后保持98％b 1.5min。lc柱温为40℃。在220nm和254nm下采集uv吸光度，且所有实验均采用质谱全扫描。
[0470]
常用缩写列表
[0471]
acn
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙腈
[0472]
盐水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
饱和氯化钠水溶液
[0473]
ch-3
od
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
氘代甲醇
[0474]
cdcl3ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
氘代氯仿
[0475]
dcm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二氯甲烷
[0476]
diea或dipea
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二异丙基乙胺
[0477]
dma
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基乙酰胺
[0478]
dmap
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4-二甲基氨基吡啶
[0479]
dmf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基甲酰胺
[0480]
dmso
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基亚砜
[0481]
dmso-d6
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
二甲基亚砜
[0482]
dtad
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
偶氮二甲酸二叔丁酯
[0483]
edc或edci
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
[0484]
esi
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
电喷雾电离
[0485]
etoac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙酸乙酯
[0486]
etoh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙醇
[0487]
fa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
甲酸
[0488]
hoac
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙酸
[0489]gꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
克
[0490]hꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
小时
[0491]
hatu
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯
[0492]
hcl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
盐酸
[0493]
hobt
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
羟基苯并三唑
[0494]
hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
高效液相层析
[0495]
ims
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
工业甲基化酒精
[0496]
l
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
公升
[0497]
lcms
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
液相色谱-质谱法
[0498]
lihmds或lhmds
ꢀꢀꢀꢀꢀ
六甲基二硅基胺基锂
[0499]
mdap
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
质谱引导自动纯化
[0500]
mecn
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
乙腈
[0501]
meoh
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
甲醇
[0502]
μm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
微米
[0503]
min
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
分钟
[0504]
mg
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫克
[0505]
ml
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫升
[0506]
mm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
毫米
[0507]mꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
摩尔
[0508]
nm
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
纳米
[0509]
nmr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核磁共振谱
[0510]
pd2(dba)3.chcl3ꢀꢀꢀꢀ
氯仿加合物三(二亚苄基丙酮)二钯(0)-氯仿加合物
[0511]
pe
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
石油醚
[0512]
制备型-hplc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
制备型高效液相色谱
[0513]
pyaop
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷磷六氟磷酸盐
[0514]
scx-2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
强阳离子交换
[0515]
tbaf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四正丁基氟化铵
[0516]
thf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
四氢呋喃
[0517]
tfa
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
三氟乙酸
[0518]
xantphos
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基黄嘌呤
[0519]
zncl2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
氯化锌
[0520]
中间体1
[0521][0522]
n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0523]
步骤1：1-(苄氧基)-4-(二氟甲氧基)苯的合成
[0524][0525]
将n,n-二甲基甲酰胺(1500ml)、4-(苄氧基)苯酚(200g，999mmol)、碳酸铯(651g，1.99mol)放入3000ml的圆底烧瓶中，所述烧瓶用氮气惰性气氛吹扫并维持。反应容器装配有用于co2释放的出口。随后，在120℃下分若干次添加2-氯-2,2-二氟乙酸钠(228g，1.50mol，1.50当量)。将反应物在120℃下在油浴中搅拌，直至气体停止逸出(约1h)，然后将其冷却至室温。在搅拌下将反应混合物缓慢添加至3000ml水/冰中。将所得混合物用乙酸乙酯(3x4000ml)萃取。将有机层合并，且经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/19)洗脱。合并适当的馏分并在减压下浓缩。将此反应重复四次。产生总计450g(36％)白色固体1-(苄氧基)-4-(二氟甲氧基)苯。
[0526]
步骤2：4-(二氟甲氧基)苯酚的合成
[0527][0528]
将甲醇(1500ml)、1-(苄氧基)-4-(二氟甲氧基)苯(140g，559mmol)、10％钯碳(15g，141mmol)放入3000ml的圆底烧瓶中。室温下将所得混合物在氢气(约45psi)下搅拌过夜。滤出催化剂。在减压条件下浓缩滤液。将此反应重复三次。得到300g(78％)黄色油状4-(二氟甲氧基)苯酚。
[0529]
步骤3：2-溴-4-(二氟甲氧基)苯酚的合成
[0530][0531]
将乙酸(500ml)、4-(二氟甲氧基)苯酚(50g，312mmol)和nbs(55.6g，312mmol)放入1000ml的圆底烧瓶中。将反应混合物在15℃下搅拌1h。然后在搅拌下将所得混合物缓慢添
加至1000ml水/冰中。将所得溶液用乙酸乙酯(3x1000ml)萃取。将有机层合并，经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用二氯甲烷/石油醚(30/70)洗脱。收集适当的馏分并在减压下浓缩。得到50g(67％)浅黄色油状2-溴-4-(二氟甲氧基)苯酚。
[0532]
步骤4：2-溴-1,4-双(二氟甲氧基)苯的合成
[0533][0534]
将ch3cn(500ml)、水(500ml)、2-溴-4-(二氟甲氧基)苯酚(54g，226mmol)和氢氧化钾(94g，1.68mol)放入2000ml的圆底烧瓶中。将烧瓶置于冰浴中并将反应混合物在冰浴中搅拌30min。然后在0℃下将(溴二氟甲基)膦酸二乙酯(120g，449mmol)逐滴添加至反应混合物中。在完成(溴二氟甲基)膦酸二乙酯添加后，将反应混合物在水/冰浴中搅拌1h。将所得溶液用乙酸乙酯(3x300ml)萃取。将有机层合并，且经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/19)洗脱，收集适当的馏分并在减压下浓缩。得到54g(83％)浅黄色油状2-溴-1,4-双(二氟甲氧基)苯。
[0535]
步骤5：5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑的合成
[0536][0537]
将dma(500ml)、碳酸钾(112g，810mmol)、4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(66g，271mmol)、2-溴-1,4-双(二氟甲氧基)苯(79g，273mmol)、2,2-二甲基丙酸(8.3g，81.3mmol)、pd(oac)2(6.0g，26.7mmol)和双(金刚烷-1-基)(丁基)膦(19g，52.9mmol，0.195当量)放入1000ml的圆底烧瓶中，所述烧瓶用氮气惰性气氛吹扫并维持。将反应混合物在120℃下在油浴中搅拌过夜，然后将其冷却至室温。然后在搅拌下将反应混合物添加至1000ml水/冰。将所得溶液用乙酸乙酯(3x1000ml)萃取。将有机层合并，且经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)洗脱。收集适当的馏分并在减压下浓缩。得到100g(82％)5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑固体。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]
+
＝452.1,r
t
＝1.49min
[0538]
步骤6：5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-胺的合成
[0539][0540]
将乙醇(1500ml)、水(150ml)、5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2]-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(100g，221mmol)、铁粉(124g，2.22mol)和nh4cl(59.2g，1.11mol)放入3000ml的3颈圆底烧瓶中。将所得混合物在回流温度下在油浴中搅拌2h，然后将其冷却至室温。滤出固体并用乙醇洗涤。在减压条件下浓缩滤液。将残余物溶解在3000ml乙酸乙酯中。将乙酸乙酯溶液用1x1000ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并在减压条件下浓缩。得到100g浅黄色油状粗制5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-胺，其无需纯化直接使用。lc/ms(方法h,esi)：[m+h]
+
＝422.1,r
t
＝1.25min。
[0541]
步骤7：n-[5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0542][0543]
将dma(1000ml)、5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-胺、吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(58.1g，356mmol)、7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷磷六氟磷酸盐(pyaop)(186g,356mmol)、4-二甲基氨基吡啶(2.90g，23.7mmol)和dipea(92.0g，712mmol)放入2000ml的圆底烧瓶中。将所得溶液在65℃下在油浴中搅拌过夜。然后在搅拌下将反应混合物缓慢添加至2000ml水中。将所得溶液用乙酸乙酯(3x2000ml)萃取。将合并的有机相用1000ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并在减压条件下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(40/60)洗脱。合并适当的馏分并在减压条件下浓缩，得到120g白色固体状n-[5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法g，esi)：[m+h]
+
＝567.2,r
t
＝1.05min。
[0544]
步骤8：n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0545][0546]
将甲醇(800ml)、浓盐酸(400ml，12n)和n-[5-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(80g，141mmol)放入2000ml的圆底烧瓶中。将所得溶液在25℃下搅拌4h。通过过滤收集固体。将固体添加至1l烧瓶中并添加h2o(200ml)。在搅拌下逐滴添加饱和nahco3水溶液直至溶液的ph值约为8。通过过滤收集固体，将其用水洗涤，并进行干燥，以得到55g(89％)浅黄色固体状n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。1h nmr(300mhz,cd3od)δ9.08(dd,j＝7.2,1.5hz,1h),8.65
–
8.61(m,2h),8.28(s,1h),7.46(d,j＝9.0hz,1h),7.40(d,j＝3.0hz,1h),7.34(dd,j＝8.9,2.9hz,1h),7.19(dd,j＝6.7,4.4hz,1h),6.87(t,j＝73.7hz,1h),6.73(t,j＝73.7hz,1h)。lc/ms(方法h,esi)：[m+h]
+
＝437.1,r
t
＝1.12min。
[0547]
中间体2
[0548][0549]
n-(5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0550]
步骤1：4-溴-1-(二氟甲氧基)-2-碘苯的合成
[0551][0552]
向4-溴-2-碘苯酚(282g，943mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(2000ml)和水(500ml)中的溶液中加入2-氯-2,2-二氟乙酸钠(216g，1.42mol)和碳酸铯(617g，1.89mol)。反应容器
装备有用于co2释放的气体出口。将所得混合物在120℃下搅拌隔夜，使其冷却至室温并倒入冰水(3000ml)中。用乙酸乙酯(3x1500ml)萃取所得溶液并合并有机层。将乙酸乙酯萃取物用盐水(1000ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在减压条件下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/10)洗脱，以得到300g(91％)黄色油状物4-溴-1-(二氟甲氧基)-2-碘苯。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ7.96(dd,j＝5.7hz,2.4hz,1h),7.45(dd,j＝8.7hz,2.4hz,1h),7.03(d,j＝8.7hz,1h),6.39(t,j＝72.9hz,1h)。
[0553]
步骤2：5-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基甲硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑的合成
[0554][0555]
在搅拌、-70℃、氮气下向4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(100g，411mmol)在无水thf(1000ml)中的溶液中逐滴加入lihmds(490ml，1.0mol/l thf)溶液。将所得溶液在-50℃下搅拌1h，然后使其冷却至-70℃。在-70℃下逐滴加入zncl2(500ml，0.7mol/l thf溶液)。将所得溶液升温至室温并将其在室温下搅拌1h。向该混合物中添加4-溴-1-(二氟甲氧基)-2-碘苯(150g，860mmol)、pd(pph3)4(24.0g，20.8mmol)。将所得溶液在回流温度下加热隔夜，使其冷却至室温，且在减压条件下浓缩。将该规模的反应再重复一次，然后将两次运行的粗产物结合起来进行提纯。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/20)洗脱。合并适当的馏分并在减压下浓缩。得到总计300g(79％)浅黄色固体状5-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ8.27(s,1h),7.68(dd,j＝8.7,2.4hz,1h),7.62(d,j＝2.4hz,1h),7.19(d,j＝8.4hz,1h),6.39(t,j＝72.5hz,1h),5.44
–
5.19(m,2h),3.72
–
3.54(m,2h),0.94
–
0.89(m,2h),0.02(s,9h)。
[0556]
步骤3：5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺的合成
[0557][0558]
向5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(50.1g，108mmol)在乙醇(2000ml)和水(200ml)中的溶液中加入铁粉60.1g，1.07mol)和nh4cl(28.0g，0.523mol)。将反应混合物在回流温度下在氮气下搅拌3h。滤出固体，并用乙醇(100ml)洗涤。在减压条件下浓缩滤液。将残余物溶解在3000ml乙酸乙酯中。将乙酸乙酯溶液用1x500ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压条件下浓缩，以得到50.1g黄色油状粗5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺。粗产物无需进一步纯化即可用于下一步。lc/ms(方法g,esi)：[m+h]
+
＝434.2,r
t
＝
0.93min。
[0559]
步骤4：n-(5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0560][0561]
向5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺(50.1g，115mmol)在dma(1500ml)中的溶液中添加吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸(32.1g，196.0mmol)、pyaop(102g，196mmol)、dmap(1.41g，11.0mmol)和dipea(44.1g，0.341mol)。将所得溶液在60℃下在油浴中搅拌3h，然后将其冷却至室温。将反应混合物在水/冰(2000ml)与乙酸乙酯(2000ml)之间进行分配。将水相用乙酸乙酯(2x)萃取。将有机层合并，用盐水(1000ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在减压条件下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(4/1)洗脱。合并适当的馏分并在减压下浓缩。将水(150ml)添加至残余物中并将混合物在室温下在水中搅拌1h。固体经过滤后风干进行收集，以得到60.1g(91％)淡黄色固体状n-(5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法g，esi)：[m+h]
+
＝579.1&581.1,r
t
＝1.10min.1h nmr(300mhz,cdcl3)δ9.62(s,1h),8.80(dd,j＝6.9,1.7hz,1h),8.73(s,1h),8.53(dd,j＝4.2,1.7hz,1h),8.38(s,1h),7.79(d,j＝2.4hz,1h),7.67(dd,j＝8.8,2.5hz,1h),7.29(d,j＝1.4hz,1h),7.00(dd,j＝6.9,4.2hz,1h),6.43(t,j＝72.6hz,1h),5.53
–
5.27(m,2h),3.73
–
3.50(m,2h),0.88(ddd,j＝9.5,6.4,4.4hz,2h),0.00(s,9h)。
[0562]
中间体3
[0563][0564]
n-[3-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0565]
在室温下将n-[5-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体2，5.00g，8.63mmol)用hcl/二噁
烷(150ml，4m)处理过夜。将所得混合物在减压条件下浓缩。得到3.80g黄色固体状n-[3-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。中间体的纯度足以用于下一步骤而无需进一步纯化。lc/ms(方法i，esi)：[m+h]
+
＝449.0,r
t
＝1.02min。1hnmr(400mhz,cd3od)δ9.11(dd,j＝6.8,1.6hz,1h),8.67
–
8.64(m,2h),8.32(s,1h),7.80(d,j＝2.4hz,1h),7.72(dd,j＝8.8,2.4hz,1h),7.37(d,j＝8.8hz,1h),7.23(dd,j＝7.0,4.2hz,1h),6.81(t,j＝73.2hz,1h)。
[0566]
中间体4
[0567][0568]
n-[3-[2-(二氟甲氧基)-5-碘苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0569]
步骤1：n-[5-[2-(二氟甲氧基)-5-碘苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0570][0571]
在氮气下向n-[5-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(100mg，0.173mmol)在t-buoh(2ml)中的溶液中添加n,n-二甲基乙烷-1,2-二胺(2.28mg，0.0259mmol)、nai(155mg，1.04mmol)、cui(4.93mg，0.026mmol)。将所得溶液在120℃下在氮气下在油浴中搅拌14h，然后将其冷却至室温。将所得混合物在减压条件下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/1)洗脱，以得到80mg(74％)黄色固体状n-[5-[2-(二氟甲氧基)-5-碘苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法j，esi):[m+h]
+
＝627.1,r
t
＝1.31min。
[0572]
步骤2：n-[3-[2-(二氟甲氧基)-5-碘苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0573][0574]
在室温下将n-[5-[2-(二氟甲氧基)-5-碘苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5a]嘧啶-3-甲酰胺(80.0mg，0.128mmol)用cf3co2h(3.0ml)处理30min。将所得混合物在减压条件下浓缩。将残余物溶解在水中。缓慢添加饱和碳酸氢钠，直至溶液ph调整至约8。通过过滤收集固体。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(2/1)洗脱，以得到23.0mg(36％)淡黄色固体状n-[3-[2-(二氟甲氧基)-5-碘苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法k，esi)：[m+h]
+
＝497.1,r
t
＝1.74min.1h nmr(300mhz,cd3od)δ9.08(dd,j＝6.9,1.5hz,1h),8.65
–
8.61(m,2h),8.27(s,1h),7.94(s,1h),7.87(d,j＝8.7hz,1h),7.21
–
7.18(m,2h),6.78(t,j＝73.2hz,1h)。
[0575]
中间体5
[0576][0577]
n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0578]
步骤1：n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0579][0580]
在氮气下向n-(5-(5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体2，1.40g，2.41mmol)在二噁烷
(15ml)和水(3.0ml)中的溶液中添加环丙基硼酸(314mg，3.66mmol)、pd(dppf)cl
2-ch2cl2(200mg，0.245mmol)和碳酸铯(1.56g，4.79mmol)。将反应混合物在80℃在氮气下搅拌过夜。将所得混合物在减压条件下浓缩。使残余物穿过短硅胶垫，用二氯甲烷/甲醇(94/6)洗脱。将适当馏分合并并在减压条件下浓缩，以得到1.40g(在254nm下纯度＝约85％)深红色固体状n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]
‑‑
1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法g,esi)：[m+h]
+
＝541.2,r
t
＝1.12min。中间体无需进一步纯化即可使用。
[0581]
步骤2：n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0582][0583]
在25℃下将来自前一步骤的n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(145mg)用hcl/二噁烷(5.0ml，4m)处理2h。在减压条件下浓缩溶液。通过prep-hplc在以下条件纯化残余物：管柱：xbridge c18,19*150mm,5um；流动相a：水/0.05％nh4hco3，流动相b：acn；流速：30ml/min；梯度：在10min内20％b至85％b；254nm，以获得44.9mg(41％)黄色固体状n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]
+
＝411.2,r
t
＝1.14min.1h nmr(300mhz,cd3od)δ9.09(dd,j＝6.9,1.5hz,1h),8.63
–
8.61(m,2h),8.27(s,1h),7.28
–
7.25(m,3h),7.20(dd,j＝7.2,4.2hz,1h),6.68(t,j＝73.8hz,1h),2.04
–
1.95(m,1h),1.03
–
0.97(m,2h),0.79
–
0.71(m,2h)。
[0584]
中间体6
[0585][0586]
吡唑并[l,5-a]嘧啶-3-羧酸[3-(5-氯-2-二氟甲氧基苯基)-1h-吡唑-4-基]酰胺
[0587]
步骤1：2-溴-4-氯-1-(二氟甲氧基)苯的合成
[0588][0589]
向2-溴-4-氯苯酚(4.98g，24.0mmol)在dmf(25ml)中的溶液中添加氯二氟乙酸钠(8.42g，55.2mmol)、碳酸铯(10.97g，33.67mmol)和水(2.5ml)。在100℃下搅拌反应物16小时。使反应混合物在乙酸乙酯和水之间分液，将有机部分用盐水稀释，干燥(mgso4)，并蒸发。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用庚烷中的0-20％etoac洗脱，以得到呈透明无色油状2-溴-4-氯-1-(二氟甲氧基)苯(2.98g，48％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:(ppm)7.90(d,1h),7.54(dd,1h),7.38(d,1h),7.28(t,1h)。
[0590]
步骤2：5-(5-氯-2-二氟甲氧基苯基)-4-硝基-1-(2-三甲基硅烷基乙氧基甲基)-1h-吡唑的合成
[0591][0592]
向4-硝基-1-(2-三甲基硅烷基乙氧基甲基)-1h-吡唑(wo2011003065中所述的制备)(46.5g，191mmol)在dma(350ml)中的溶液中添加2-溴-4-氯-1-二氟甲氧基苯(64.0g，248mmol)、乙酸钯(ii)(2.15g，9.6mmol)、二-(金刚烷基)-正丁基膦(5.0g，13.4mmol)、碳酸钾(79.2g，573mmol)和三甲基乙酸(5.27g，51.6mmol)。将混合物用氮气脱气10min，然后在130℃下加热8h。使反应混合物冷却至室温，用乙酸乙酯稀释，并用水及盐水洗涤，干燥(mgso4)，过滤并蒸发。将所得粗材料通过硅胶快速色谱法纯化，用环己烷中的0-10％etoac洗脱，以得到5-(5-氯-2-二氟甲氧基苯基)-4-硝基-1-(2-三甲基硅烷基乙氧基甲基)-1h-吡唑(62.4g，78％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:(ppm)8.24(s,1h),7.52-7.53(m,2h),6.39(t,1h),5.29-5.30(m,2h),3.63-3.64(m,2h),0.90(s,9h)。
[0593]
步骤3：5-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺的合成
[0594][0595]
向5-(5-氯-2-二氟甲氧基苯基)-4-硝基-1-(2-三甲基硅烷基乙氧基甲基)-1h-吡唑(62g，148mmol)在乙醇(600ml)中的溶液中添加水(200ml)、氯化铵(32g，590mmol)和铁粉(41g，740mmol)。将混合物在80℃下加热2小时，然后使其冷却至室温。残余固体通过使用过滤去除。在减压条件下蒸发滤液，用水稀释并用dcm萃取两次。将合并的有机萃
取物用水和盐水洗涤，干燥(mgso4)并蒸发，以得到黑色油状物。将该油状物通过硅胶快速色谱法纯化，用dcm中的0-25％etoac洗脱。收集适当馏分并在真空下去除溶剂，以得到棕色油状5-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺(30.8g，54％)。1h nmr(400mhz,cdc13)δ:(ppm)7.56(d,1h),7.44(dd,1h),7.34(s,1h),7.30-7.25(m,1h),6.37(t,1h),5.29(s,2h),3.56(t,2h),0.88(dd,2h),0.00(s,9h)。
[0596]
步骤4：n-(5-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0597][0598]
在30分钟内将5-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺(60.0g，154mmol)在thf(100ml)中的溶液逐滴加入至吡唑并[l,5-a]嘧啶-3-碳酰氯(27.8g，153mmol)和dipea(49.5g，383mmol)于thf(300ml)中的经冰/水冷却的混合物中。添加完成后，将混合物在室温下搅拌1h。蒸发溶剂并用0.5n hcl水溶液稀释残余物并用乙酸乙酯萃取。将合并的有机萃取物穿过以去除残余固体并用1m碳酸钾水溶液、水和盐水洗涤滤液，干燥(硫酸钠)并蒸发，以得到红色固体。将固体用环己烷中的10％乙醚研磨。固体通过过滤进行收集，用环己烷中的1:1乙醚洗涤，并晾干，以得到灰白色固体状n-(5-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(59.2g，73％)。1h nmr(300mhz,cdcl3):δ(ppm)9.61(s,1h),8.77-8.78(m,1h),8.51(dd,1h),8.36(s,1h),7.65(d,1h),7.52(dd,1h),7.36(d,1h),7.29(s,1h),7.01(dd,1h),6.42(t,1h),5.39-5.41(m,2h),3.60-3.64(m,2h),0.87-0.89(m,2h),0.09(s,9h)。
[0599]
步骤5：n-(3-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0600][0601]
将n-(5-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(59.0g，110mmol)于甲醇(420ml)中的悬浮液用6n hcl(80ml)处理并将混合物在60℃下加热4h。蒸发溶剂并用水研磨残余物。固体通过过滤进
行收集，用水洗涤并晾干。将固体用最小体积的乙腈研磨，通过过滤收集固体，用乙醚洗涤，并在60℃下在高真空下干燥，以得到黄色固体状标题化合物(42.9g，96％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:(ppm)9.71(s,1h),9.34(dd,1h),8.68-8.69(m,1h),8.66(s,1h),8.25(s,1h),7.62(dd,2h),7.43-7.46(m,1h),7.29(dd,1h),7.23(d,1h)。
[0602]
中间体7
[0603][0604]
n-(3-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0605]
步骤1：5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-4-硝基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑的合成
[0606][0607]
将甲苯(500ml)、5-[5-溴-2-(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(60g,129mmol)、nasme(26g，371mmol)、pd2(dba)3.chcl3(6.7g，6.47mmol)、xantphos(7.5g，12.96mmol)放入1000ml的圆底烧瓶中，所述烧瓶用氮气惰性气氛吹扫并维持。将所得混合物在85℃下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将此反应重复三次。将残余物施加在硅胶柱上，用乙酸乙酯/石油醚(1:20)洗脱。将适当馏分合并且在真空下浓缩。得到总计171g黄色固体状5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-4-硝基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑。lc/ms(方法f，esi)：[m+h]+＝432.1,rt＝1.23min；1h
nmr
(300mhz,cdc13)δ:(ppm)8.25(s,1h),7.42(dd,j＝8.7,2.4hz,1h),7.34(d,j＝2.1hz,1h),7.23(d,j＝8.7hz,1h),6.39(t,j＝72.9hz,1h),5.36
–
5.22(m,2h),3.74
–
3.55(m,2h),2.51(s,3h),0.94
–
0.90(m,2h),0.02(s,9h)。
[0608]
步骤2：5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺的合成
[0609][0610]
向5-[2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫烷基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(171g，408mmol)、乙醇(2000ml)、水(200ml)的混合物中添加铁粉(228g，4.08mol)、nh4cl(120g，2.24mol)。将反应混合物在氮气下搅拌回流3h，并将其冷却至室温。滤出固体。将滤液在真空下浓缩。将残余物溶解在3000ml乙酸乙酯中并用1x500ml盐水洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。得到148g黄色油状5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺。lc/ms(方法f，esi)：[m+h]+＝402.1,r
t
＝0.93min。
[0611]
步骤3：n-(5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0612][0613]
将dma(1500ml)、5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-胺(148g)、吡唑并[l,5-a]嘧啶-3-羧酸(102g)、hatu(325g)、4-二甲基氨基吡啶(4.5g)、dipea(142g)放入3000ml的3颈圆底烧瓶中。将所得溶液在60℃下搅拌3h，倒入冰水(2000ml)中，用3x2000ml乙酸乙酯萃取并将有机层合并。将所得混合物用1x1000ml盐水洗涤。将混合物经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物施加在硅胶柱上，用乙酸乙酯/石油醚(4:1)洗脱，以得到200g淡黄色固体状n-(5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法a，esi)：[m+h]+＝547.2,rt＝1.10min；1h nmr(300mhz,cdc13)δ：(ppm)9.63(s,1h),8.77(dd,j＝7.0,1.7hz,1h),8.73(s,1h),8.51(dd,j＝4.2,1.8hz,1h),8.38(s,1h),7.50(d,j＝2.4hz,1h),7.39(dd,j＝8.7,2.4hz,1h),7.30(d,j＝8.7hz,1h),6.98(dd,j＝6.9,4.2hz,1h),6.39(t,j＝73.2hz,1h),5.46
–
5.38(m,2h),3.70
–
3.59(m,2h),2.52(s,3h),0.92-0.85(m,2h),0.03(s,9h)。
[0614]
步骤4：n-(3-(2-二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0615][0616]
向n-(5-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(60g)在甲醇(600ml)的溶液中添加浓hcl溶液(300ml)。将所得溶液在35℃下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩。通过过滤收集固体。将固体悬浮于200ml水中。将该溶液的ph值用饱和碳酸氢钠调节至8。产物通过过滤收集，干燥以得到30g(66％)淡黄色固体状n-(3-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法g,esi)：[m+h]+＝417.0,r
t
＝0.80min；1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ：(ppm)13.02(s,1h),9.71(s,1h),9.33(dd,j＝6.9,1.5hz,1h),8.68(dd,j＝4.1,1.4hz,1h),8.66(s,1h),8.24(s,1h),7.47
–
7.36(m,3h),7.27(dd,j＝6.9,4.2hz,1h),7.17(t,j＝73.8hz,1h),2.51(s,3h)。
[0617]
中间体8
[0618][0619]
n-(5-(5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0620]
步骤1：4-溴-5-氯-2-碘苯酚的合成
[0621][0622]
在搅拌、70℃下向5-氯-2-碘苯酚(100g，393mmol)在乙腈(1000ml)中的溶液中分若干次添加cubr2(264g，1.18mol)。将所得混合物在70℃下搅拌4h，使其冷却至室温并在真空下浓缩。然后通过添加3000ml水/冰来淬灭残余物，并用3x2000ml乙酸乙酯萃取并将有机层合并。将萃取物用1x1000ml盐水洗涤，经硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:30)洗脱。收集适当的馏分并在真空下浓缩。将反应重复一次以上。得到140g(53％)白色固体状4-溴-5-氯-2-碘苯酚。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)7.89(s,1h),7.14(s,1h),5.32(s,1h)。
[0623]
步骤2：l-溴-2-氯-4-(二氟甲氧基)-5-碘苯的合成
[0624][0625]
向4-溴-5-氯-2-碘苯酚(140g，420mmol)在dmf(1200ml)中的溶液中添加2-氯-2,2-二氟乙酸钠(95.8g，628mmol)、碳酸铯(274g，840mmol)。将反应混合物在120℃下在油浴中搅拌2h，将其冷却至室温，然后通过添加2500ml水/冰来淬灭。将所得溶液用3x2000ml乙酸乙酯萃取，并将有机层合并。将萃取物用1x1000ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1/30)洗脱。将适当馏分合并并在真空下浓缩，以得到130g(81％)淡黄色固体状l-溴-2-氯-4-(二氟甲氧基)-5-碘苯。
[0626]
步骤3：5-(5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-4-硝基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑的合成
[0627][0628]
在搅拌、-70℃、氮气下向4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑(67.0g，275mmol)在四氢呋喃(1000ml)中的溶液中逐滴加入lihmds(340ml，1m thf)。将所得溶液在-70℃下搅拌1h。在-70℃下，一边搅拌一边向该溶液中逐滴加入zncl2(400ml，0.7m thf溶液)在-70℃下，将所得溶液在氮气下搅拌1h。在氮气下向该混合物中添加1-溴-2-氯-4-(二氟甲氧基)-5-碘苯(105g，274mmol)、pd(pph3)4(16.0g，13.9mmol)。将所得溶液在90℃下搅拌过夜，使其冷却至室温并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:20)洗脱。收集适当的馏分并在真空下浓缩。得到115g(84％)淡黄色固体状5-[5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-4-硝基-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑。lc/ms(方法b，esi)：[m+h]+＝498.0&500.0,rt＝1.27min。
[0629]
步骤4：5-[5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-胺的合成
[0630][0631]
向5-(5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-4-硝基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑(102g，205mmol)在乙醇(1000ml)和水(100ml)中的溶液中添加铁粉(102g，1.82mol)和氯化铵(53g，1.00mol)。在100℃下，将反应混合物在油浴中搅拌3h。滤出固体。将滤液在真空下浓缩。将残余物溶解在2000ml乙酸乙酯中。将有机溶液用1x500ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。得到102g(粗制)淡黄色油状5-[5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-胺。lc/ms(方法e，esi)：[m+h]+＝467.9&469.9,r
t
＝1.29min。
[0632]
步骤5：n-(5-(5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0633][0634]
向5-[5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基]-1h-吡唑-4-胺(100g，213mmol)在dma(800ml)中的溶液中添加吡唑并[l,5-a]嘧啶-3-羧酸(52.0g，319mmol)、pyaop(166g，319mmol)、dipea(82.3g，638mmol)和4-二甲基氨基吡啶(2.59g，21.2mmol)。在60℃下，将所得溶液在油浴中搅拌过夜。然后通过添加2000ml水/冰来淬灭反应物。将所得溶液用3x1500ml乙酸乙酯萃取，并将有机层合并。将合并的有机层用500ml盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用乙酸乙酯/石油醚(2/1)洗脱。将适当馏分合并且在真空下浓缩。将残余物悬浮在水(800ml)中并搅拌1h。通过过滤收集固体。得到113g(86％)灰白色固体状n-(5-(5-溴-4-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法a，esi)：[m+h]+＝613.2&615.2,rt＝2.29min.1h nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)9.56(s,1h),8.81(dd,j＝6.8,1.5hz,1h),8.73(s,1h),8.53(d,j＝4.0hz,1h),8.33(s,1h),7.92(s,1h),7.54(s,1h),7.03(dd,j＝6.8hz,4.0hz,1h),6.45(t,j＝72.2hz,1h),5.43(d,j＝11.2hz,1h),5.35(d,j＝11.2hz,1h),3.68-3.56(m,2h),0.94-0.84(m,2h),0.00(s,9h)。
[0635]
中间体9
[0636][0637]
n-(3-(6-(二氟甲氧基)-3,4-二氢-2h-苯并[b][1,4]噁嗪-7-基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0638]
步骤1：(2-(2-氯-4-(二氟甲氧基)-5-(4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-5-基)苯氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0645][0646]
向6-(二氟甲氧基)-7-(4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1h-吡唑-5-基)-2,3-二氢-4h-苯并[b][1,4]噁嗪-4-羧酸叔丁酯(80.0mg，0.122mmol)在甲醇(8.0ml)中的溶液中添加hcl水溶液(6mol/l水溶液)(4.0ml)。将所得溶液在25℃下搅拌4h，并在真空下浓缩。通过prep-hplc在以下条件纯化粗产物(50.0mg)：管柱，xbridge shield rp18obd管柱，19*150mm,5um；流动相，10mm nh4hco3水溶液和乙腈(在10min内10.0％乙腈高达38.0％)；探测器，uv 254nm，以获得16.1mg(24％)黄色固体状n-(3-(6-(二氟甲氧基)-3,4-二氢-2h-苯并[[b][1,4]噁嗪-7-基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法d，esi)：[m+h]+＝428.0,rt＝2.05min；1h nmr(400mhz,cd3od):δ(ppm)8.98(d,j＝6.8hz,1h),8.57-8.51(m,2h),8.12(s,1h),7.10(dd,j＝7.0,4.2hz,1h),6.79(s,1h),6.51(s,1h),6.40(t,j＝75.2hz,1h),4.13-4.11(m,2h),3.39-3.32(m,2h)。
[0647]
中间体10
[0648][0649]
n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0650]
步骤1：红色油状n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(四氢-2h-吡喃-2-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺和n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成。(位置异构体的混合物)
[0651][0652]
在室温下向n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体1，10.0g，22.9mmol)、碳酸铯(22.3g，68.6mmol)和tbai(423mg，1.15mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(100ml)中的悬浮液中添加5-(氯甲基)-2-四氢吡喃-2-基-四唑(11.6g，57.3mmol)。将反应混合物搅拌1.5h，之后将其用盐水(300ml)洗涤，并用乙酸乙酯(3x300ml)萃取。将有机层合并，用盐水(300ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用dcm(1％tea)/ea(1/2)洗脱，以得到红色油状n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(四氢-2h-吡喃-2-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺和n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法i，esi)：[m+h]+＝603.25,rt＝1.02min
[0653]
步骤2：n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0654][0655]
在室温下，将n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(区域异构体的混合物，4.21g，6.98mmol)在hcl/meoh(60.0ml，240mmol)中的溶液搅拌过夜。将残余物通过c18管柱快速色谱法纯化，用38.7％acn/水洗脱，以得到白色固体状n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(2.50g，4.83mmol，产率：69.2％)。lc/ms(方法i，esi)：[m+h]+＝519.3,rt＝0.71min。
[0656]
中间体11
[0657][0658]
n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0659]
步骤1：n-(3-(2-二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1-((2-(四氢-2h-吡喃-2-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(连同四唑烷基化异构体)的合成
[0660][0661]
在室温下，搅拌n-[3-[2-(二氟甲氧基)-5-甲基硫烷基-苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体7，2.02g，4.85mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液。然后添加5-(氯甲基)-2-四氢吡喃-2-基-四唑(2.81g，13.9mmol)、碳酸铯(4.71g，14.5mmol)、tbai(88.7mg，0.24mmol)，并在室温下搅拌1.5h。过滤后，用水(50ml)稀释滤液。用ea(50*3ml)萃取所得溶液并合并有机层。将有机层用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用ea/dcm(1％tea)(46％)洗脱，以得到白色固体状n-[3-[2-(二氟甲氧基)-5-甲基硫烷基-苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺连同四唑烷基化区域异构体的混合物(3.51g，6.02mmol)。lc/ms(方法m，esi)：[m+h]+＝583.1,rt＝0.66min。
[0662]
步骤2：n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2-(二氟甲氧基)-5-(甲基硫基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0663][0664]
在室温下，搅拌n-[3-[2
‑‑
(二氟甲氧基)-5-甲基硫烷基-苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(区域异构体的混合物，8.34g，14.3mmol)在甲醇(30ml)中的溶液。然后添加1,4-二噁烷(80ml)(4m hcl)并将混合物在室温下搅拌2h。在真空下浓缩溶剂，并且粗产物无需进一步纯化即可使用。lc/ms(方法m，esi)：[m+h]+＝499.1,rt＝0.61min
[0665]
中间体12
[0666][0667]
n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0668]
步骤1：n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(连同四唑烷基化异构体)的合成
[0669][0670]
在室温下向n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(3.2g，7.92mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(30ml)中的溶液中添加碳酸铯(5.2g，15.99mmol)和tbai(178mg，0.480mmol)和5-(氯甲基)-2-四氢吡喃-2-基-四唑(4.05g，20.0mmol)。将所得溶液在室温下搅拌2小时。用水(150ml)稀释反应混合物。用ea(300*3ml)萃取所得溶液并合并有机层。将有机层在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，
用ea/dcm(24％)洗脱，以得到黄色油状n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(3.20g，5.33mmol，产率：67.3％)连同四唑烷基化区域异构体的混合物。lc/ms(方法m，esi)：[m+h]+＝471.1,rt＝0.66min
[0671]
步骤2：n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0672][0673]
在室温下，将n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(区域异构体的混合物，3.21g，4.5mmol)在4m hcl/meoh(40ml，4.5mmol)中的溶液搅拌2h。将有机层在真空下浓缩。将残余物通过c18胶快速色谱法纯化，用acn/h2o(tfa)(35％)洗脱，以得到黄色固体状n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-(2h-四唑-5-基甲基)吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(1.81g，3.35mmol，产率：74.4％)。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]+＝487.1,rt＝1.12min。
[0674]
中间体13
[0675][0676]
n-(1-((2h-四唑-5-基)甲基)-3-(5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0677]
步骤1：n-(3-(5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(四氢-2h-吡喃-2-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0678][0679]
步骤1：n-[n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0680]
在室温下向n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体5，3.02g，7.35mmol)、tbai(271mg,0.740mmol)和碳酸铯(7.18g,22.1mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(40ml)中的溶液中添加5-(氯甲基)-2-四氢吡喃-2-基-四唑(3.75g,18.5mmol)。将所得溶液在室温下搅拌1.5小时。通过过滤残余物，并用水(80ml)稀释滤液。用ea(80*3ml)萃取所得混合物。将有机层用盐水(100*3ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，且在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用ea/pe(0.1％tea)＝4/1洗脱，以得到呈黄色油状n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺及四唑烷基化区域异构体(3.26g，5.65mmol，产率：76.8％)的混合物。lc/ms(方法g，esi)：[m+h]+＝577.2,rt＝0.98min。
[0681]
步骤2：n-[n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0682][0683]
在室温下，将n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[(2-四氢吡喃-2-基四唑-5-基)甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(区域异构体的混合物，3.26g，5.65mmol)在4m hcl/甲醇(20ml)中的溶液搅拌2h。在真空下浓缩所得溶液。将残余物通过反相色谱法(乙腈0-45/水0.1％tfa水溶液)进行纯化，以得到淡黄色固体n-[3-[5-环丙基-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-(2h-四唑-5-基甲基)吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(1.85g，3.8mmol，产率：66.5％)。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]+＝493.2,rt＝1.16min。
[0684]
实例
[0685]
实例1
[0686][0687]
n-(3-(5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(2-羟基乙基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0688]
将n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-(2h-1,2,3,4-四唑-5-基甲基)-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体12，200mg，0.412mmol)、1,3-二氧戊环-2-酮(122mg，1.38mmol，3.35当量)、氢氧化钠(44mg，1.10mmol，2.67当量)、n,n-二甲基甲酰胺(30ml)放入100ml圆底烧瓶中。在120℃下，将所得溶液在油浴中搅拌4h。在真空下浓缩所得混合物。将残余物施加在使用二氯甲烷/石油醚(11.5:1)的硅胶管柱上。粗产物通过掌性prep-hplc(prep-hplc-009)在以下条件纯化：管柱，phenomenex lux 5u cellulose-4xia packed,2.12*25cm,5um；流动相，hex和乙醇(在32min内保持60.0％乙醇)；探测器，uv 220/254nm。得到19.6mg(9％)白色固体状n-[3-[5-氯-2-(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(2-羟基乙基)-2h-1,2,3,4-四唑-5-基]甲基]-1h-吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺。lc/ms(方法n，esi)：[m+h]+＝531.2,rt＝1.33min。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.76(s,1h),9.35(dd,j＝6.9,1.5hz,1h),8.68
–
8.66(m,2h),8.52(s,1h),7.64(dd,j＝8.9,2.9hz,1h),7.57
–
6.99(m,4h),5.78(s,2h),5.07(t,j＝5.6hz,1h),4.72(t,j＝5.1hz,2h),3.94
–
3.88(m,2h)。
[0689]
实例21
[0690]
n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(2-(二甲基氨基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0691][0692]
步骤1：3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯的合成
[0693][0694]
将1-boc-3-碘氮杂环丁烷(2.42g，8.55mmol)添加至n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-(2h-四唑-5-基甲基)吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体1，1.87g，3.61mmol)和碳酸钾(2.43g，17.6mmol)在n,n-二甲基甲酰胺(20ml)中的混合物中。将所得溶液在60℃下搅拌3h并在75℃下搅拌过夜。将混合物冷却至室温并经过滤。用盐水(120ml)稀释滤液。用ea(3x50ml)萃取所得混合物并合并有机层。用盐水(2*50ml)洗涤有机层。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用dcm(1％tea)/ea(1％tea)(1/2)洗脱，以得到黄色油状3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(1.4g，92％)和330mg黄色油状3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(非对映异构体的混合物)。
[0695]
通过反相色谱法(乙腈0-60/0.1％nh4hco3水溶液)来纯化1.4g 3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯，以得到白色固体状3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(1.00g，1.5mmol，产率：41.2％)。lc/ms(方法c，esi)：[m+h]+＝674.2rt＝2.63min。
[0696]
将330mg非对映异构体的混合物通过硅胶快速色谱法纯化，用dcm(1％tea)/ea(1％tea)(1/2)洗脱，以得到黄色固体状3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-1-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(140mg，0.208mmol，产率：5.8％)。lc/ms(方法g，esi)：[m+h]+＝674.2rt＝0.97min。
[0697]
步骤2：n-(1-((2-(氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0698]
[0699]
在室温下，将3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰氨基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(1.05g，1.56mmol)在2,2,2-三氟乙酸(3ml)/二氯甲烷(12ml)中的溶液搅拌2h。在真空下浓缩反应混合器，并且所得产物无需进一步纯化即可使用。lc/ms(方法r，esi)：[m+h]+＝574.2rt＝1.58min。
[0700]
步骤3：(2-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0701][0702]
在室温下向n-(1-((2-(氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(821mg，1.43mmol)在1,4-二噁烷(30ml)中的溶液中添加碳酸钾(593mg，4.29mmol)。将所得溶液搅拌10min，此后添加2-溴乙基氨基甲酸叔丁酯(1.29g，5.73mmol)。将所得反应混合物在70℃下搅拌过夜。在真空下浓缩混合物，并将残余物通过c18管柱快速色谱法纯化，用42％acn/nh4hco3(0.05％)洗脱，以得到黄色油状(2-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(715mg，0.998mmol，产率：69.8％)。lc/ms(方法m,esi)：[m+h]+＝717.4,rt＝0.67min。
[0703]
步骤4：n-(1-((2-(1-(2-氨基乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0704][0705]
在室温下，将(2-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(720mg，1mmol)在二氯甲烷(4ml)和三氟乙酸(1ml)中的溶液搅拌2h。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物通过c18管柱快速色谱法纯化，用45％acn/水(0.05％hcl)洗脱，以
得到黄色油状n-(1-((2-(1-(2-氨基乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(615mg，0.10mmol，产率：99.3％)。lc/ms(方法m，esi)：[m+h]+＝617.4,rt＝0.54min。
[0706]
步骤5：n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(2-(二甲基氨基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0707][0708]
在室温下向n-[1-[[2-[1-(2-氨基乙基)氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(615mg，1mmol)在甲醇(10ml)中的溶液中添加hcho/h2o(256mg，3.15mmol)。将所得溶液在25℃下搅拌2h。添加nabh(aco)3(846mg，3.99mmol)，并将反应物混合物在25℃下搅拌3h，之后将其在真空下浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用(0.05％nh4hco3)洗脱。在室温下，将560mg产物在乙醇(4ml)中的浆料缓慢搅拌2日，以得到白色固体状n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-[1-[2-(二甲氨基)乙基]氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(433mg，0.663mmol，产率：66.4％)。lc/ms(方法x，esi)：[m+h]+＝645.3,rt＝3.38min。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.76(s,1h),9.34(dd,j＝7.2,1.6hz,1h),8.67
–
8.65(m,2h),8.52(s,1h),7.49
–
7.46(m,1h),7.40
–
6.99(m,5h),5.80(s,2h),5.58
–
5.54(m,1h),3.83
–
3.79(m,2h),3.57
–
3.53(m,2h),2.60
–
2.56(m,2h),2.22
–
2.20(m,2h),2.12(s,6h)。
[0709]
实例10
[0710][0711]
n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0712]
将n-[1-[[2-(氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(670.5mg,1.17mmol)和hcho/h2o(113mg，1.4mmol)在甲醇(10ml)中的溶液在25℃下搅拌2h。然后添加nabh(ch3coo)3(301mg，
1.42mmol)并在25℃下搅拌过夜。在真空下浓缩溶剂，并用水(20ml)稀释所得残余物。用ea(50*3ml)萃取所得溶液并合并有机层。将有机层用无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。通过prep-hplc在以下条件下纯化产物：管柱：xbridge prep obd c18管柱30倍；150mm 5um；流动相a：水(10mmol/l nh4hco3)，流动相b：acn；流速：60ml/min；梯度：在10min内27％b至37％b；254/220nm；rt：13min，以得到白色固体状n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(507mg，0.858mmol，产率：73.4％)。lc/ms(方法e，esi)：[m+h]+＝588.2,rt＝2.28min。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.77(s,1h),9.35(dd,j＝7.2,1.2hz,1h),8.68
–
8.64(m,2h),8.52(s,1h),7.50
–
7.00(m,6h),5.80(s,2h),5.58
–
5.52(m,1h),3.84
–
3.80(m,2h),3.59
–
3.52(m,2h),2.33(s,3h)。
[0713]
实例12
[0714][0715]
n-(1-((1-(氮杂环丁烷-3-基)-1h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0716]
在室温下，搅拌3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-1-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(200mg，0.30mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。然后添加tfa(1ml，0.30mmol)并在室温下搅拌2h。在真空下浓缩溶剂。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用h2o(0.1％tfa)/acn(69％)洗脱，以得到黄色油状n-[1-[[1-(氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(184mg)。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]+＝574.2,rt＝0.97min。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.78(s,1h),9.36(dd,j＝6.9,1.5hz,1h),8.70
–
8.64(m,2h),8.59(s,1h),7.61
–
6.97(m,6h),6.10(s,2h),5.94
–
5.88(m,1h),4.47
–
4.16(m,4h)。
[0717]
实例78
[0718]
[0719]
n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1'-甲基-[1,3'-双氮杂环丁烷]-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0720]
步骤1：3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)-[1,3'-联氮杂环丁烷]-1'-羧酸叔丁酯的合成
[0721][0722]
在25℃下，将n-[1-[[2-(氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(1.0g，1.74mmol)和1-boc-3-氮杂环丁酮(896mg，5.23mmol)在甲醇(20ml)和乙酸(1ml)的混合物中的溶液搅拌2h。然后添加nabh(oac)3(1.1g,5.19mmol)并且在室温下将混合物搅拌3h。在反应完成后，在真空下去除溶剂。将残余物通过反相分离管柱流动相a：水(0.1％nh4hco3)，流动相b：乙腈；梯度：在35min内10％b至70％b]进行纯化，以得到淡黄色固体状3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)-[1,3'-联氮杂环丁烷]-1'-羧酸叔丁酯(650mg，0.890mmol，产率：50.1％)。lc/ms(方法p，esi)：[m+h]+＝729.15,rt＝0.85min。
[0723]
步骤2：n-(1-((2-([1,3'-联氮杂环丁烷]-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0724][0725]
在室温下，将3-[3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-基]氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(650mg，0.890mmol)在二氯甲烷(6ml)和2,2,2-三氟乙酸(2ml)中的溶液搅拌3h。在反应完成后，在真空下去除溶剂，以得到600mg黄色固体状粗产物。lc/ms(方法g，esi)：[m+h]+＝629.2,rt＝0.92min。
[0726]
步骤3：n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1'-甲基-[1,3'-联氮杂环丁烷]-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0727][0728]
在室温下，将n-(1-((2-([1,3'-联氮杂环丁烷]-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(600mg，0.950mmol)及甲醛/水(2ml)在乙酸(1ml)和甲醇(10ml)的混合物中的溶液搅拌1h。然后添加nabh(oac)3(1.0g，4.72mmol)并将混合物搅拌3h。在反应完成后，在真空下去除溶剂。将残余物通过反相分离管柱[流动相a：水(0.1％nh4hco3)，流动相b：乙腈；梯度：在30min内10％b至70％b]进行纯化，以得到淡黄色固体状n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1'-甲基-[1,3'-联氮杂环丁烷]-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(400mg，0.603mmol，产率：63.3％)。lc/ms(方法o，esi)：[m+h]+＝643.3,rt＝1.42min。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.78(s,1h),9.35(dd,j＝7.2,1.7hz,1h),8.67
–
8.64(m,2h),8.53(s,1h),7.53
–
6.96(m,6h),5.82(s,2h),5.64
–
5.59(m,1h),3.87
–
3.82(m,2h),3.71
–
3.35(m,10h)。
[0729]
实例51
[0730][0731]
n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-[1-[3-(二甲基氨基)丙基]氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0732]
步骤1：(3-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0733][0734]
在室温下n-[1-[[2-(氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(500mg，0.870mmol)、乙酸(104mg，1.74mmol)和n-(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(302mg，1.74mmol)在甲醇(8ml)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌2小时。然后添加nabh(aco)3(555mg，2.62mmol)并在室温下搅拌3h。在真空下浓缩反应混合物。将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用acn/水(0.05％nh4hco3)(35％)洗脱，以得到黄色油状n-[3-[3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-基]丙基]氨基甲酸叔丁酯(470mg,0.643mmol，产率：73.8％)。lc/ms(方法q，esi)：[m+h]+＝731.3,rt＝1.35min。
[0735]
步骤2：n-(1-((2-(1-(3-氨基丙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0736][0737]
在室温下n-[3-[3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-基]丙基]氨基甲酸叔丁酯(152mg，0.210mmol)在二氯甲烷(4ml)和2,2,2-三氟乙酸(1ml)中的溶液。将所得溶液在室温下搅拌2小时。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物通过c18管柱凝胶快速色谱法纯化，用acn/水(0.05％hcl)(45％)洗脱，以得到黄色油状n-[1-[[2-[1-(3-氨基丙基)氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(80.2mg,0.127mmol，产率：61.1％)。lc/ms(方法m，esi)：[m+h]+＝631.4,rt＝0.55min。
[0738]
步骤3：n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-[1-[3-(二甲基氨基)丙基]氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0739][0740]
在室温下hcho/h2o(39.4mg，0.490mmol)和n-[1-[[2-[1-(3-氨基丙基)氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(85.1mg，0.130mmol)在甲醇(5ml)中的溶液。将所得溶液在25℃下搅拌2h。然后添加nabh(aco)3(114mg，0.540mmol)并将其在25℃下搅拌3h。然后，添加nabh3cn(14mg，0.23mmol)并将混合物搅拌1h。在真空下浓缩反应混合物。通过hplc在以下条件下纯化残余物：管柱：xbridge prep obd c18管柱，19*250mm，5um；流动相a：水(10mmol/l h4hco3)，流动相b：acn；流速：25ml/min；梯度：在7min内20b至50b；254nm；rt1：5.88；以得到黄色固体状n-[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-1-[[2-[1-[3-(二甲基氨基)丙基]氮杂环丁烷-3-基]四唑-5-基]甲基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(25.4mg，0.038mmol，产率：27.9％)。lc/ms(方法a，esi)：[m+h]+＝659.3,rt＝1.17min，1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.78(s,1h),9.36(dd,j＝9.4,2.2hz,1h),8.68
–
8.64(m,2h),8.53(s,1h),7.54
–
6.95(m,6h),5.81(s,2h),5.57(m,1h),3.82
–
3.77(m,2h),3.52
–
3.48(m,2h),2.21
–
2.16(m,2h),2.08(s,6h),1.49
–
1.32(m,2h)。
[0741]
实例80
[0742][0743]
n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(2-(1-(二甲基氨基)环丙基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺步骤1：(1-(2-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)乙基)环丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0744][0745]
在室温下，将n-[1-(2-氧代乙基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(69.4mg，0.350mmol),n-[1-[[2-(氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体1，200mg，0.350mmol)和乙酸(62.6mg，1.04mmol)在甲醇(10ml)中的溶液搅拌1h。然后添加nabh(oac)3(148mg，0.700mmol)并将混合物在室温下再搅拌1h。然后添加nabh3cn(21.9mg，0.350mmol)并将混合物在室温下再搅拌1h。反应完成后，在真空中去除溶剂。将残余物通过反相分离管柱[流动相a：水(0.1％tfa)，流动相b：乙腈；梯度：在30min内30％b至70％b]进行纯化，以得到淡黄色固体状(1-(2-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)乙基)环丙基)氨基甲酸叔丁酯(136mg，0.18mmol，产率：51.5％)。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]+＝757.3,rt＝1.10min。
[0746]
步骤2：n-(1-((2-(1-(2-(1-氨基环丙基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0747][0748]
在室温下，将n-[1-[2-[3-[5-[[3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羰基氨基)吡唑-1-基]甲基]四唑-2-基]氮杂环丁烷-1-基]乙基]环丙基]氨基甲酸叔丁酯(126mg，0.170mmol)]在二氯甲烷(4ml)和2,2,2-三氟乙酸(1ml)中的溶液搅拌2h。在真空下浓缩溶剂。产物无需进一步纯化即可使用。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]+＝657.3,rt＝0.94min。
[0749]
步骤3：n-(1-((2-(1-(2-(1-氨基环丙基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0750][0751]
在室温下，将n-(1-((2-(1-(2-(1-氨基环丙基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(120mg，0.180mmol)和甲醛(43.1mg，0.570mmol)在甲醇(4ml)中的溶液搅拌2h。然后添加nabh(oac)3(154mg，0.730mmol)并将其在35℃下搅拌3h。最后，添加nabh3cn(9.3mg，0.150mmol)并将其在35℃下搅拌1h。用水及盐水洗涤萃取物，经无水硫酸钠干燥，然后在真空中浓缩。以相同规模重复该反应，并通过hplc纯化合并的粗产物：ymc-actus triart c18，30*250，5um；流动相a：水(10mmol/l nh4hco3)，流动相b：acn；流速：60ml/min；梯度：在7min内38b至44b；220nm，以得到n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(2-(1-(二甲基氨基)环丙基)乙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(15mg，0.022mmol，产率：6％)。lc/ms(方法h，esi)：[m+h]+＝685.3,rt＝0.94min。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ(ppm)9.78(s,1h),9.38
–
9.38(m,1h),8.67
–
8.64(m,2h),8.52(s,1h),7.47
–
7.01(m,6h),5.80(s,2h),5.60
–
5.55(m,1h),3.78
–
3.74(m,2h),3.49
–
3.46(m,2h),2.50
–
2.44(m,2h),2.21(s,6h),1.50-1.23(m,3h)。
[0752]
实例83
[0753][0754]
n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(3-(二甲基氨基)-2-氟丙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
[0755]
步骤1：(3-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-2-氟丙基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0756][0757]
在室温下，将n-[1-[[2-(氮杂环丁烷-3-基)四唑-5-基]甲基]-3-[2,5-双(二氟甲氧基)苯基]吡唑-4-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(中间体1，300mg，0.520mmol)和n-(2-氟-3-氧代-丙基)氨基甲酸叔丁酯(220mg，1.15mmol)在乙酸(0.50ml)和甲醇(5ml)的混合物中的溶液搅拌1h。然后添加nabh(oac)3(333mg，1.57mmol)并将该混合物再搅拌2h。反应完成后，在真空下去除有机溶剂。将残余物通过反相分离管柱[流动相a：水(0.1％nh4hco3)，流动相b：乙腈；梯度：在30min内20％b至70％b]纯化，以得到淡黄色固体状(3-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-2-氟丙基)氨基甲酸叔丁酯(290mg，0.387mmol，产率：74％)。lc/ms(方法q，esi)：[m+h]+＝749.25,rt＝1.98min。
[0758]
步骤2：n-(1-((2-(1-(3-氨基-2-氟丙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0759][0760]
在室温下，将(3-(3-(5-((3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-4-(吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)-1h-吡唑-1-基)甲基)-2h-四唑-2-基)氮杂环丁烷-1-基)-2-氟丙基)氨基甲酸叔丁酯(290mg，0.390mmol)在2,2,2-三氟乙酸(1ml)及二氯甲烷(3ml)的混合物中的溶液搅拌3h。反应完成后，在真空下浓缩溶剂。残余物通过prep chiral hplc[管柱：hiralpak id-2,2*25cm,5um；流动相a：mtbe(0.3％ipa)，流动相b：meoh；流速：20ml/min；梯度：在26min内10b至10b；220/254nm；rt1：18.047：rt2：22.229；注入体积：0.6ml；运行次数：12]进行纯化，以得到两种立体异构体(65mg(峰1)和52mg(峰2))。lc/ms(方法i，esi)：[m+h]+＝649.3,rt＝0.96min。
[0761]
步骤3：n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(3-(二甲基氨基)-2-氟丙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺的合成
[0762][0763]
在室温下，将第二洗脱对映异构体(峰2)n-(1-((2-(1-(3-氨基-2-氟丙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(52mg，0.080mmol)和hcho(60mg，0.80mmol)在甲醇(2ml)和乙酸(0.20ml)中的溶液搅拌1h。添加nabh(oac)3(51mg，0.24mmol)并将混合物在室温下搅拌1h。添加nabh3cn(5.0mg，0.08mmol)并将混合物在室温下再搅拌1h。在真空下去除溶剂。通过prep-hplc[管柱：xselect csh obd管柱30*150mm 5um；流动相a：水(10mmol/l nh4hco3)，流动相b：acn:meoh＝4:1；流速：60ml/min；梯度：在11min内27b至49b；220nm；rt1：10.08，以得到淡黄色固体状n-(3-(2,5-双(二氟甲氧基)苯基)-1-((2-(1-(3-(二甲基胺基)-2-氟丙基)氮杂环丁烷-3-基)-2h-四唑-5-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(10.6mg,0.016mmol，产率：19.3％)。lc/ms(方法a，esi)：[m+h]+＝677.2,rt＝1.24min。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ(ppm)9.87(s,1h),8.80(dd,j＝7.2,1.6hz,1h),
–
9.38(m,1h),8.72(s,1h),8.54
–
8.52(m,2h),7.47(d,j＝2.8hz,1h),7.36
–
7.33(m,1h),7.25
–
7.22(m,1h),7.03
–
7.00(m,1h),6.73
–
6.29(m,2h),5.67(s,2h),5.56
–
5.25(m,1h),4.80
–
4.60(m,1h),4.04
–
4.02(m,2h),3.82
–
3.78(m,2h),2.92-2.82(m,2h),2.62
–
2.58(m,1h),2.52
–
2.44(m,1h),2.30(s,6h)。
[0764]
测定
[0765]
测试药剂
[0766]
测试药剂样本以浓度为10mm的二甲基亚砜(dmso)溶液提供并在使用前储存于黑暗、室温条件下。
[0767]
jak1及jak2生化测定
[0768]
体外生化测定定量合成肽的经jak催化的磷酸化，如使用ez reader ii微流体流动性转移仪器(perkinelmer；waltham,ma)所检测的。底物肽y-1b具有序列5-fam-valvdgyfrltt-nh2。y-1b在n端被5-fam(5-羧基萤光素)萤光标记并含有可通过jak活性磷酸化的单酪胺酸残基(y)。将底物肽储备液用dmso制备5mm。将经纯化的重组人jak1激酶域蛋白(残基854-1154)在昆虫细胞中表达并获自proteros biostructures gmbh(martinsried,germany)。使重组人jak2激酶域蛋白(残基812-1132)在昆虫细胞中表达并在genentech,inc.(south san francisco,ca)处纯化。
[0769]
激酶反应混合物含有100mm 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液(ph 7.2)、10mm氯化镁、0.015％35、4mm二硫苏糖醇、1.5μm y-1b肽底物、25μm三磷酸腺苷(atp)、1nm总jak1或0.2nm总jak2和在最终浓度为2％的(体积比体积[v/v])dmso中的多达
1000nm的测试化合物。在各滴定实验中，在十二个浓度的各浓度下对测试化合物重复测试两次。空白反应物含有atp、肽和dmso，但不含jak或测试化合物，而未控制对照反应物含有atp、肽、jak和dmso，但不含测试化合物。
[0770]
将肽和atp混合物(24μl)添加至1μldmso中的测试化合物(或单独dmso)中。通过将25μljak酶添加至抑制剂/肽/atp混合物，然后完全混合所得溶液进而启动反应。在室温(22℃-23℃)下，将反应物在384孔板的每孔50μl的最终体积中孵育。孵育30分钟后，通过将25μl在含有0.015％brij 35的100mm hepes缓冲液(ph 7.2)中的150mm乙二胺四乙酸添加至各孔中来终止反应。
[0771]
在各反应中，使用ez reader ii仪器分离残余y-1b底物和所生成的磷酸-肽产物。分别使用-500v和-2600v的下游和上游电压在-1.3psi操作压力下实现产物分子与基底分子的电泳分离。在488nm处激发存在于底物和产物肽上的5-fam基团，并在530nm处检测萤光，并报告峰高。
[0772]
数据分析
[0773]
底物转化为产物的程度(或百分比)通过使用hts well analyzer软件5.2版(perkinelmer)得到的电泳图中的相应峰高及以下等式(等式1)计算得出：
[0774]
等式1
[0775]
％转化＝[p
÷
(s+p)]
×
100
[0776]
其中s和p分别表示底物和产物的峰高度。从所有测试孔的信号减去不含jak的空白孔的任何基准信号后，将％转化资料转换为如等式2所示的分数活性，其中vi及vo分别为存在和不存在测试化合物时的％转化。含有jak和dmso媒介物但不含测试化合物的未受抑制的对照反应物中观测到的％转化定义为具有分数活性＝1(其中不存在抑制剂，vi＝vo，而不具有jak的空白孔定义为具有分数活性＝0。将分数活性相对于测试化合物的浓度绘制，并使用xlfit软件(idbs；guildford,united kingdom)将该数据拟合至紧密结合表观抑制常数(k
i表观
)二次方程式(参见等式2)(williams jw,morrison jf.the kinetics of reversible tight-binding inhibition.methods enzymol 1979；63:437-67.)，该二次方程式用于计算分数活性及k
i表观
[0777]
等式2
[0778][0779]
其中[e]
t
和[i]
t
分别为活性酶(初始估值对于jak1为0.15nm，且对于jak2为0.048nm)和抑制剂(可变参数)的总浓度。最后，ki通过应用竞争性抑制关系(等式3)由k
i表观
计算得出。
[0780]
等式3
[0781]ki
＝k
i表观
/(1+[atp]/k
m表观
)
[0782]
其中[atp]为atp＝25μm的浓度，k
m表观
是atp michaelis常数，对于jak1，该常数＝32.1μm，且对于jak2，k
m表观
＝11.7μm。通过应用考虑抑制剂的任何消耗的紧密结合等式2以
及竞争性抑制关系等式3，测定的敏感性可至少延长至对jak1计算的k
i 0.008nm和对jak2的0.0015nm。
[0783]
激酶选择性
[0784]
在一组重组人激酶活性和结合测定中评估测试药剂在1μm浓度下的体外激酶选择性，包括细胞质及受体酪胺酸激酶、丝胺酸/苏胺酸激酶及脂质激酶(kinase profiling services,thermofisher scientific,madison,wi)。激酶活性检定测量肽磷酸化(z
’‑
)或adp产生而结合检定监测atp位点结合探针的置换活性测定中所用的atp浓度通常为根据实验确定的各激酶的表观michaelis常数(k
m表观
)值的2倍内，而结合测定中所用的竞争性结合痕量浓度通常为根据实验确定的解离常数(kd)值的3倍。针对各激酶重复两次测试抑制剂并报告％抑制值平均值。对于在初始1-μm测试浓度下受到抑制接近或大于50％的激酶，使用相同测定进行10点抑制剂滴定，以便确定引起50％抑制(ic
50
)的抑制剂浓度。此测定组中所用的总jak1浓度为75nm。若100％75nm jak1蛋白具有催化活性，则来自供体jak1测定的jak1抑制剂灵敏度限度在理论上将为37.5nm的ic
50
值(总酶浓度的一半)。然而，jak1测定生成若干抑制剂的jak1ic
50
值，该等值远低于37.5nm且与内部确定值一致。因此，测定中的活性jak1酶浓度必须远低于该测定中所用的总标称jak1蛋白浓度75nm，并且此测定所观测到的灵敏度远高于理论灵敏度ic
50
限度37.5nm。
[0785]
数据分析
[0786]
对于浓度-激酶抑制曲线图中的资料拟合，激酶分析服务使用xlfit软件(idbs)，模型编号205(反曲浓度-反应模型)，其为由等式4所述的四参数逻辑拟合模型
[0787]
等式4
[0788]
[001]y＝a+{(b－a)
÷
[1+(c
÷
x)d]}
[0789]
其中x为抑制剂浓度，y为所观测到的％抑制，a为最小y-值，b为最大y-值，c为ic
50
值，且d为hill斜率。在某些情况下，使用三参数逻辑拟合。例如，若在无限低抑制剂浓度下曲线的平台期未在-20％与20％抑制之间拟合，则该平台期下限设置为0％抑制，而若在无限抑制剂浓度下曲线的平台期未在70％与130％抑制之间拟合，则平台期上限设置为100％抑制。
[0790]
tf-1细胞系磷酸-stat jak1和jak2通路选择性测定
[0791]
使tf-1人红白血病细胞(manassas,va；目录号crl-2003
tm
)在roswell park memorial institute(rpmi)培养基中生长，该培养基补充有10％热灭活胎牛血清(fbs)、2ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、1
×
非必需氨基酸(neaa)和1mm丙酮酸钠。测定前一日，将培养物转移至opti-mem
tm
、1
×
neaa、1mm丙酮酸钠以及0.5％经木炭剥离的fbs(饥饿培养基)。将抑制剂储备溶液(5mm dmso溶液)以dmso连续1:2稀释，以生成10点浓度滴定(在500
×
测试浓度下)，其通过50倍稀释以检定培养基(含有1
×
neaa和1mm丙酮酸钠的rpmi)进一步稀释，以生成10
×
浓度滴定(2％dmso)。将细胞(在35μl测定培养基中为300,
000个细胞/孔)接种在384-孔greiner板。将以10
×
浓度稀释的抑制剂(5μl)添加至细胞并将板在37℃下在湿润孵育器中孵育30分钟。按照之前对每个批次的检测结果，用对应ec
90
浓度的人类重组细胞因子刺激细胞。对于磷酸化信号传递及转录活化子6(p-stat6)tf-1+介白素-13(il-13)的测定，将10μl 250ng/ml il-13(r&d systems；minneapolis,mn)添加至细胞中，然后将其在37℃下孵育10分钟。对于p-stat5 tf-1+促红血球生成素(epo)的测定，将10μl 110iu/ml epo(gibco life technologies，目录号phc2054)添加至细胞中，然后将其在37℃下孵育30min。对于两种测定，在孵育之后，在细胞中加入5μl含有1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)的冰冷10
×
细胞裂解缓冲液(cell signaling technologies；danvers,ma；目录号9803s)。将测定板在-80℃下冷冻至少1小时。在il-13测定中，p-stat6通过以下方法测量：用兔抗人总stat6抗体(cell signaling technologies；目录号9362s)涂覆山羊抗兔(gar)板(meso scale discovery[msd]；rockville,md；目录号msd l21ra-1)、将涂覆板中的细胞裂解物在4℃下孵育过夜、然后使用标准msd板处理、洗涤及检测方案检测小鼠抗-p-stat6(tyr641)纯系16e12抗体((milliporesigma；burlington,ma；目录号05-590，由具有sulfo-标签的msd自定义标记)。在epo测定中，使用磷酸-stat5a,b全细胞裂解物试剂盒(msd；目录号k150igd-1)来检测p-stat5。在meso sector s600(msd)读取器上读取孔的电化学发光(ecl)信号。
[0792]
数据分析
[0793]
数据分析通过以下方法进行：从所有孔的ecl值减去阴性对照(细胞因子刺激及20μm对照抑制剂处理细胞)平均ecl值、确定测试化合物孔ecl值相对于阳性对照(细胞因子刺激并经dmso处理的细胞)平均ecl值的对照百分比、并使用如等式4所示的四参数逻辑拟合模型确定测试化合物的ic
50
。
[0794]
p-stat6 beas-2b+il-13细胞测定
[0795]
为了研究细胞系中与人哮喘细胞生物学相关的jak1抑制剂的作用，开发了人肺支气管上皮beas-2b细胞系的il-13-刺激的stat6磷酸化测定。
[0796]
将beas-2b细胞(crl-9609
tm
)在支气管上皮生长培养基(begm)(lonza目录号cc-3170；walkersville，md；或promocell目录号c-21060；heidelberg,germany)上生长。将测试化合物储备溶液(0.5mm dmso溶液)以dmso连续1:2稀释，以生成10点浓度曲线(在500
×
测试浓度下)，其通过50倍稀释步骤begm进一步稀释，以生成10
×
浓度曲线(2％dmso溶液)。将细胞以100,000个细胞/孔铺板在96孔板中的200μlbegm中，并将其在37℃下在湿润孵育器中孵育48小时。将培养基从细胞取出并用70μl新鲜begm置换。将经稀释的测试化合物(10μl；或测定培养基中的2％dmso)添加至细胞，且将板在37℃下在湿润孵育器中孵育1小时。然后将二十μl250 ng/ml人重组il-13(bio techne目录号213-ilb)添加至细胞并在37℃下孵育15分钟。从细胞抽出培养基并将60μl含有1mm pmsf的冰冷1
×
细胞裂解缓冲液(cell signaling technologies；目录号9803s)添加至细胞。将测定板在-80℃下孵育至少1小时。p-stat通过以下方法测量：用兔抗人总stat6抗体(cell signaling technologies；目录号9362s)涂覆gar板(msd；目录号l45ra-1)、将涂覆板中的细胞裂解物在4℃下孵育过夜、然后使用标准msd板处理、洗涤及检测方案检测小鼠抗-磷酸-stat6(tyr641)纯系16e12抗体(millipore；目录号05-590，由具有sulfo-标签的msd自定义标记)。在meso sector s600上读取板。
[0797]
数据分析
[0798]
数据分析通过以下方式进行：从所有孔减去阴性对照值并使用阳性对照值确定对照百分比；使用如等式4所示的四参数逻辑拟合模型来确定ic
50
。
[0799]
使用抑制剂冲洗(wo)的p-stat6 beas-2b+il-13细胞测定
[0800]
为了评定jak1抑制剂在细胞洗涤以去除游离未结合抑制剂之后保留其抑制il-13-刺激的stat6磷酸化的能力，开发了人肺支气管上皮beas-2b细胞系的抑制剂冲洗(wo)测定。在抑制剂廓清后抑制活性的保留与抑制剂与jak1蛋白的持久结合和/或在冲洗后细胞内抑制剂分子的保留一致。
[0801]
正如标准beas-2b细胞测定(参见前文)，在支气管上皮生长培养基(begm)上生长beas-2b细胞。将测试化合物储备溶液(0.5mm dmso溶液)以dmso连续1:2稀释，以生成10点浓度曲线(在500
×
测试浓度下)，其通过50倍稀释步骤begm进一步稀释，以生成10
×
浓度曲线(2％dmso溶液)。将细胞以100,000个细胞/孔铺板在96孔板中的200μlbegm中，并将其在37℃下在湿润孵育器中孵育48小时。将培养基从细胞抽出并用70μl新鲜begm置换。将经稀释的测试化合物(10μl；或测定培养基中的2％dmso)添加至细胞，且将板在37℃下在湿润孵育器中孵育1小时。将培养基从细胞取出并用80μl新鲜begm置换从而从细胞中冲掉抑制剂，然后将细胞板在37℃下在湿润孵育器中孵育10分钟。将此冲洗程序再重复两次。第三次洗涤步骤结束后，将细胞板返回至37℃湿润孵育器并将其孵育1小时。然后将二十μl 250 ng/ml il-13添加至细胞并将其在37℃下孵育15分钟。从细胞抽出培养基并将60μl含有1mm pmsf的冰冷1
×
细胞裂解缓冲液(cell signaling technologies；目录号9803s)添加至细胞。将测定板在-80℃下孵育至少1小时。p-stat通过以下方法测量：用兔抗人总stat6抗体(cell signaling technologies；目录号9362s)涂覆gar板(msd；目录号l45ra-1)、将涂覆板中的细胞裂解物在4℃下孵育过夜、然后使用标准msd板处理、洗涤及检测方案检测小鼠抗-磷酸-stat6(tyr641)纯系16e12抗体(millipore；目录号05-590，由具有sulfo-标签的msd自定义标记)。在meso sector s600上读取板。
[0802]
数据分析
[0803]
数据分析通过以下方式进行：从所有孔减去阴性对照值并使用阳性对照值确定对照百分比；使用如等式4所示的四参数逻辑拟合模型来确定ic
50
。
[0804]
细胞毒性测定
[0805]
使用t175烧瓶中以融合密度维持的a549(ccl-185
tm
)、jurkat纯系e6-1(tib-152
tm
)及hek-293t(crl-1573
tm
)细胞。将指数生长期的细胞铺板(45μl培养基中的450个细胞)在greiner 384孔黑色/透明组织培养物处理板(greiner目录号781091)中。在分配细胞后，使板在室温下平衡30分钟，然后在37℃和co2的条件下将板置于湿度控制的孵育器中过夜。次日，在10点滴定及最高浓度50μm下，用以100％dmso(在细胞上为0.5％的最终dmso浓度)稀释的测试药剂处理细胞。然后在37℃和co2的条件下，将细胞和化合物在湿度控制的孵育器中孵育72小时，然后通过将celltiter-(promega g7572)试剂添加至所有孔来测量细胞活力。将板在室温下孵育20分钟，然后在envision板读取器(perkin elmer life sciences)上读取孔发光读数。
[0806]
表1中化合物的上述jak1和jak2测定数据如下表2所示。
[0807]
表2：
[0808]
[0809]
[0810][0811]
正如表2所示，本发明的化合物对jak1和jak2二者都具有良好平衡的亲和力，并且许多化合物在基于细胞的测定中具有活性。
[0812]
动物模型
[0813]
小鼠屋尘螨(hdm)模型
[0814]
七至八周龄雌性c57bl/6j小鼠，购自jackson west。在第0&14日通过腹膜注射屋尘螨(hdm,d.pteronyssinus，购自greer laboratories，正规化至含量为每只小鼠0.918ug derp1)与用无菌pbs稀释的2mg明矾(thermo scientific)的混合物来免疫接种小鼠。在第21&24日，用pbs中的hdm(再对0.918ug derp1含量正规化)刺激小鼠，通过气管内吸入进行给药。在每次吸入hdm刺激前(在组子集中，在第22&23日)，动物经由仅鼻吸入接受测试化合物(使用来自电子医疗量测系统(electro-medical measurement systems，emms)的干粉吸入装置，包括wright粉剂进给装置和4-层/24-口或2-层/12-口，定向流，仅经鼻吸入塔)，在刺激前1小时结束。对照动物仅接受经鼻空气吸入。在最终治疗后24小时，从小鼠眼眶后抽血以进行血浆pk，然后通过co2吸入进行安乐死。在安乐死后，收集bal流体以进行总(通过facs，使用已知量的所添加参考珠粒)及分化(通过wright giemsa-染色细胞离心涂片器)细胞计数。收集肺及脾，称重，冷冻以进行pk。每组有5或6只动物。
[0815]
另外，为验证经肺递送剂量，在单日或连续四日经由仅鼻吸入分别向3只纯动物的pk卫星组给予测试化合物。在最终吸入给药后，从pk卫星动物眼眶后抽血以进行血浆pk，然后通过co2进行安乐死。收集肺及脾，称重以进行pk分析。
[0816]
大鼠ova模型
[0817]
六周龄雄性brown norway大鼠来自charles river-kingston。在第0日通过腹腔注射150ug ova(sigma)与以无菌pbs稀释的40mg明矾(thermo scientific)的混合物来免疫接种大鼠。在敏化后28日，用经由喷雾器气雾化的pbs中的2％ova刺激大鼠30分钟，连续三日。在每次ova刺激前，动物经由仅鼻吸入接受jak1/jak2测试化合物(使用来自电子医疗量测系统(emms)的干粉吸入装置，包括wright粉剂进给装置及4-层、24-口，定向流，仅经鼻吸入塔)，在刺激前1小时结束。对照动物接受口服mct缓冲液或仅接收经鼻空气吸入。在最终治疗后24小时，将动物通过co2吸入进行安乐死。从动物腹主动脉抽血以进行血浆pk和全血facs分析。在安乐死后，收集bal流体以进行总(通过facs，使用已知量的所添加参考珠粒)及分化(通过wright giemsa-染色细胞离心涂片器)细胞计数。收集肺，称重，冷冻以进行pk。称量脾并切下一半以进行pk和facs分析。通过facs分析血液和脾样本以进行总细胞计数和％nk细胞(cd161a阳性)。除纯对照组含有5只动物之外，每组有6只动物。
[0818]
另外，为验证经肺递送剂量，在单日或三日经由仅鼻吸入分别向3只纯动物的pk卫星组给予jak1/jak2测试化合物。在最终吸入给药后，pk卫星动物通过co2吸入进行安乐死。从动物腹主动脉抽血以进行血浆pk。收集肺及脾，称重以进行pk分析。
[0819]
通过以下方式确定测试化合物的血浆及肺水平及其比率。在该测定中使用来自charles river laboratories的balb/c小鼠。将测试化合物用0.2％tween 80盐水溶液单独调配，并将给药溶液通过经口吸入引入小鼠气管中。在给药后的不同时间点(通常为0.167、2、6、24h)，经由心脏穿刺去除血液样本并从小鼠切下完整肺。将血液样本在大约12,000rpm、4℃下离心4分钟(eppendorf centrifuge，5804r)，以收集血浆。将肺垫干，称重并以无菌水以1:3稀释而实现均质化。通过针对构造成测试基质的标准曲线的分析标准进行lc-ms分析来确定测试化合物的血浆及肺水平。肺与血浆比率确定为以μg h/g计的肺auc与以μg h/ml计的血浆auc的比率，其中auc通常定义为测试化合物浓度相对时间的曲线的面积。
[0820]
小鼠血浆及肺中的药代动力学
[0821]
通过以下方式确定测试化合物的血浆及肺水平及其比率。在该测定中使用来自charles river laboratories的balb/c小鼠。将测试化合物以ph为4的柠檬酸盐缓冲液中的20％丙二醇单独调配为0.2mg/ml的浓度并将50ul给药溶液通过经口吸入引入小鼠气管中。在给药后的不同时间点(通常为0.167、2、6、24h)，经由心脏穿刺去除血液样本并从小鼠切下完整肺。将血液样本在大约12,000rpm、4℃下离心4分钟(eppendorf centrifuge，5804r)，以收集血浆。将肺垫干，称重并以无菌水以1:3稀释而实现均质化。通过针对构造成测试基质的标准曲线的分析标准进行lc-ms分析来确定测试化合物的血浆及肺水平。肺与血浆比率确定为以μg h/g计的肺auc与以μg h/ml计的血浆auc的比率，其中auc通常定义为测试化合物浓度相对时间的曲线的面积。
[0822]
小鼠血浆及肺中的药代动力学
[0823]
在通过单次鼻内(in)推注溶液/悬浮液注射来注射0.2％tween 80盐水溶液调配的0.3mg/kg目标剂量后，确定雌性balb/c小鼠中化合物的药物动力学。7-8周龄雌性balb/c小鼠可购自charles river。小鼠在特定无病原体的条件下饲养，直至用于研究。
[0824]
动物在给药前不禁食。在给药后0.083、2、7及24小时的每个时间点在麻醉(腹膜内
注射戊巴比妥)下经由心脏穿刺从3只动物获得血液样本，并置入经edta涂覆的微容器中。将血液样本离心(1500g，在4℃下10min)，以分离血浆。在大约-80℃下冷冻血浆样本。鼻内给药后，在肺灌注前，将脾移出，称重，并进行速冻。在确认死亡后，用冷冻pbs灌注经给药动物的肺，以从肺血管移出残余血液。然后切下肺并称重(记录全部重量)。所有组织样本都浸泡在液氮中冷冻。将组织样本冷冻储存(约-80℃)直至用于分析。
[0825]
在pk分析前，将解冻的组织样本(脾和肺)称重并在为每公克组织添加4ml hplc级水后使用omni-prep球磨机(omni inc.,kennesaw,ga)在4℃下均质化。以四体积含有吐鲁必他胺(200ng/ml)及拉贝他乐(100ng/ml)的乙腈作为内标准，使用蛋白沉淀提取血浆和组织均质物样本。将样本在3200g及4℃下混合并离心30分钟以去除沉淀蛋白，并在96孔盘中将上清液以hplc级水适当稀释(例如，1:1，v:v)。通过阳离子模式的lc-ms/ms使用waters xevo tq-s(waters,elstree,uk)针对基质匹配的校准曲线及品质对照标准测定血浆、脾及肺的代表性等分试样的化合物浓度。通过以化合物掺加对照血浆、脾及肺组织均质物来制备标准物并针对实验样本进行提取。在所有基质中测定的检测限度为0.168mg/ml-4000ng/ml。
[0826]
低于定量下限(lloq)的浓度作为零以用于计算平均值和sd。使用样本中所测量的平均浓度来构建半对数浓度-时间曲线特征。使用biobook(e-workbookidbs)中的非房室方法进行药代动力学(pk)分析。
[0827]
肺经互生链隔孢菌诱导的嗜酸性粒细胞炎症的鼠类模型
[0828]
气道嗜酸性粒细胞增多症是人类哮喘的标志。互生链隔孢菌为可加重人哮喘并诱导小鼠肺中的嗜酸性粒细胞炎症的真菌气源性致敏原(havaux et al.clin exp immunol.2005,139(2):179-88。在小鼠中，已证实链隔孢菌间接活化肺中的2型组织驻留型先天性淋巴细胞，其对(例如il-2及il-7)有应答并释放jak依赖性细胞因子(例如il-5和il-13)并调节嗜酸性粒细胞炎症(bartemes et al.j immunol.2012,188(3):1503-13)。
[0829]
该研究使用来自taconic的七至九周龄雄性c57小鼠。在研究当日，用异氟烷轻微麻醉动物并经由口咽抽吸注射媒介物或测试化合物。给药后将动物置于侧躺状态，并在监测到动物从麻醉中完全恢复后将其放回其居住笼。一小时后，再次简单麻醉动物并经由口咽抽吸用媒介物或互生链隔孢菌进行刺激，并在监测到动物从麻醉中恢复后将其放回其居住笼。在注射链隔孢菌四十八小时后，收集支气管肺泡灌洗液(balf)并使用advia 120hematology system(siemens)计数balf中的嗜酸性粒细胞。
[0830]
通过与经媒介物处理、经链隔孢菌攻击的对照动物相比，四十八小时后存在于经处理动物的balf中的嗜酸性粒细胞的水平降低，则证明了模型中的化合物活性。数据表示为经媒介物处理、经链隔孢菌攻击的balf嗜酸性粒细胞反应的抑制百分比。为计算抑制百分比，将各条件的balf嗜酸性粒细胞数目转换为平均经媒介物处理、经链隔孢菌攻击的balf嗜酸性粒细胞的百分比并将其从100％中减去。