诊断抗肿瘤治疗有效性的方法与流程

诊断抗肿瘤治疗有效性的方法
1.本发明涉及一种用于预测患有肿瘤的对象是否对选自(i)免疫治疗、(ii)化疗、(iii)抗激素治疗和(iv)抗酪氨酸激酶治疗的肿瘤治疗产生应答的方法，其中，所述方法包括：(a)测定从所述对象获得的样品中的至少一种核酸分子和/或至少一种蛋白质或肽的水平，其中所述至少一种核酸分子选自：(a)编码包含或由seq id no:1至6任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)由seq id no:7至12任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列至少85％相同、优选至少90％相同、最优选至少95％相同的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列至少95％相同、优选至少96％相同、最优选至少98％相同的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少150个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少450个核苷酸、最优选至少600个核苷酸，和(g)其中t由u取代的相应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中所述至少一种蛋白质或肽选自由(a)至(g)任一核酸分子编码的蛋白质或肽；以及(b)将(a)的水平与从对(i)至(iii)中的一种或多种治疗有应答的一个或多个对象获得的样品中的所述至少一种核酸分子和/或所述至少一种蛋白质或肽的水平或相应的预定标准进行比较，其中与(b)的水平或预定标准相比，(a)的水平增加表明所述对象对所述肿瘤治疗没有应答，与(b)的水平相比，(a)的水平基本相同或降低表明对象对所述肿瘤治疗有应答；或者(b’)将(a)的水平与从对(i)至(iii)中的一种或多种治疗没有应答的一个或多个对象获得的样品中的所述至少一种核酸分子和/或所述至少一种蛋白质或肽的水平或相应的预定标准进行比较，其中与(b’)的水平或预定标准相比，(a)的水平降低表明所述对象对所述肿瘤治疗有应答，以及与(b’)的水平相比，(a)的水平基本相同或增加表明对象对所述肿瘤治疗没有应答。
2.在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和制造商手册。这些文件的公开虽然被认为与本发明的可专利性无关，但通过引用将其全部内容并入本文。更具体地，所有参考文件均以引用方式并入，其程度与每个单独文件被具体和独自指明以引用方式并入的程度相同。
3.人类白细胞抗原(hla)系统或复合物是编码人类中的主要组织相容性复合物(mhc)蛋白质的基因复合物。这些细胞表面蛋白质负责调节人类的免疫系统。hla基因复合物位于染色体6p21内的3mbp序列段(stretch)上。该复合物中的基因分为三个基本组：i类、ii类和iii类。
4.人类有三种主要的mhc i类基因，即hla-a、hla-b和hla-c。由这些基因产生的蛋白质存在于几乎所有细胞的表面上。在细胞表面上，这些蛋白质与从细胞内部输出的蛋白质片段(肽)结合。mhc i类蛋白质向免疫系统展示这些肽。如果免疫系统将肽识别为外来肽(如病毒或细菌肽)，它通过触发受感染细胞自我毁灭而应答。
5.人类有六种主要的mhc ii类基因：hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dra和hla-drb1。mhc ii类基因为制造几乎只存在于某些免疫系统细胞表面的蛋白质提供指令。与mhc i类蛋白质一样，这些蛋白质向免疫系统展示肽。
6.mhc iii类基因产生的蛋白质具有一些不同的功能；它们参与炎症和其它免疫系
统活性。一些mhc基因的功能尚不清楚。
7.hla基因有许多可能的变异，允许每个人的免疫系统对各种外来入侵者作出反应。一些hla基因有数百个已鉴别的版本(等位基因)，每个版本都有一个特定的编号(如hla-b27)。密切相关的等位基因被分类在一起；例如，至少有40个非常相似的等位基因是hla-b27的亚型。这些亚型被命名为hla-b*2701至hla-b*2743。
8.已有100多种疾病与hla基因的不同等位基因有关。例如，hla-b27等位基因增加了患一种叫做强直性脊柱炎的炎症性关节病的风险。许多其它涉及免疫功能异常的疾病和某些形式的癌症也与特定的hla等位基因有关。然而，经常不清楚hla基因在这些疾病的发病风险中扮演什么角色。
9.在三个主要mhc i类基因邻近，非经典的mhc i类分子hla-e、hla-f和hla-g由hla i类区域编码。hla-g、hla-e和hla-f的过表达是多种恶性肿瘤中常见的发现(kochan等,oncoimmunology.2013nov 1；2(11):e26491.)。据报道，hla-g和hla-e是癌症生物标志物，并且与癌症的不良临床结果呈正相关。
10.据进一步报道，hla i类区域还包括i类假基因(hughes,mol biol evol.1995mar；12(2):247-58)以及基因片段。例如，hla-h、hla-j和hla-l被分类为i类假基因，hla-n、hla-s和hla-x被分类为基因片段。特别是，messer等,j immunol.1992jun 15；148(12):4043-53报道hla-j是一个假基因，这是由于在外显子2或外显子4中产生翻译终止的有害突变所致。因此，人类白细胞抗原(hla)基因作为生物医学、诊断和治疗的重要靶点具有悠久的研究历史。
11.此外，癌症是全球第二大死因，2018年估计有960万人死于癌症。在全球范围内，大约六分之一的死亡是由癌症引起的。癌症的发病率目前还在增加，尤其是由于人们变得越来越老。如果早期发现和治疗病例，可以降低癌症死亡率。在没有早期诊断的情况下，患者在晚期被诊断出来，此时治愈性治疗可能不再是一个选项。然而，即使癌症在早期被诊断出来，肿瘤的异质性仍然常常使得为特定患者找到有效的治疗方法变得困难。这是因为大块肿瘤可能包括多种细胞，这些细胞具有不同的分子特征，对治疗的敏感性不同。这种异质性可能导致遗传学上不同的肿瘤细胞亚群在疾病部位之间和内部分布不均匀(空间异质性)或癌细胞分子构成的时间变化(时间异质性)。异质性为肿瘤抵抗某些治疗方案提供了动力。因此，迫切需要预先预测患有肿瘤的对象是否对特定的肿瘤治疗有应答。也迫切需要新的肿瘤治疗。本发明解决了这些需要。
12.因此，本发明在第一方面涉及一种用于预测患有肿瘤的对象是否对选自(i)免疫治疗、(ii)化疗、(iii)抗激素治疗和(iv)抗酪氨酸激酶治疗的肿瘤治疗产生应答的方法，其中所述方法包括：(a)测定从所述对象获得的样品中的至少一种核酸分子和/或至少一种蛋白质或肽的水平，其中所述至少一种核酸分子选自：(a)编码包含或由seq id no:1至6任一氨基酸序列组成的多肽的核酸分子，(b)由seq id no:7至12任一核苷酸序列组成的核酸分子，(c)编码与(a)的氨基酸序列至少85％相同、优选至少90％相同、最优选至少95％相同的多肽的核酸分子，(d)由与(b)的核苷酸序列至少95％相同、优选至少96％相同、最优选至少98％相同的核苷酸序列组成的核酸分子，(e)由相对于(d)的核酸分子是简并的核苷酸序列组成的核酸分子，(f)由(a)至(e)任一核酸分子的片段组成的核酸分子，所述片段包含至少250个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少450个核苷酸、最优选至少600个核苷
酸，和(g)其中t由u取代的相应于(a)至(f)任一核酸分子的核酸分子，其中所述至少一种蛋白质或肽选自由(a)至(g)任一核酸分子编码的蛋白质或肽；以及(b)将(a)的水平与从对(i)至(iii)中的一种或多种治疗有应答的一个或多个对象获得的样品中的所述至少一种核酸分子和/或所述至少一种蛋白质或肽的水平或相应的预定标准进行比较，其中与(b)的水平或预定标准相比，(a)的水平增加表明所述对象对所述肿瘤治疗没有应答，与(b)的水平相比，(a)的水平基本相同或降低表明对象对所述肿瘤治疗有应答；或者(b’)将(a)的水平与从对(i)至(iii)中的一种或多种治疗没有应答的一个或多个对象获得的样品中的所述至少一种核酸分子和/或所述至少一种蛋白质或肽的水平或相应的预定标准进行比较，其中与(b’)的水平或预定标准相比，(a)的水平降低表明所述对象对所述肿瘤治疗有应答，以及与(b’)的水平相比，(a)的水平基本相同或增加表明对象对所述肿瘤治疗没有应答。
13.根据本发明的术语“对象”是指哺乳动物，优选是家畜或宠物动物例如马、牛、猪、绵羊、山羊、狗或猫，最优选是人类。
14.肿瘤是不具有生理功能的异常的良性或恶性新生长组织，由不受控制的通常快速的细胞增殖引起。肿瘤优选地是癌症。癌症是不具有生理功能的异常的恶性新生长组织，由不受控制的通常快速的细胞增殖引起。癌症优选地选自乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、膀胱癌、唾液腺癌、子宫内膜癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、上消化道相关癌症、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、恶性腹水、淋巴瘤和白血病。优选的癌症将在下文中定义。
15.肿瘤或癌症优选为实体肿瘤或癌症。实体肿瘤或癌症是异常的组织块，与非实体肿瘤(例如白血病)相比，通常不包含囊肿或液体区域。
16.虽然肿瘤治疗通常也可以是例如手术，但本文的肿瘤治疗选自(i)免疫治疗、(ii)化疗、(iii)抗激素治疗和(iv)抗酪氨酸激酶治疗。在这些肿瘤治疗中，优选免疫治疗。
17.免疫治疗是通过激活或抑制免疫系统来治疗疾病。根据本发明，免疫治疗是治疗肿瘤，因此免疫治疗是肿瘤免疫治疗，优选是癌症免疫治疗。肿瘤免疫治疗一般来说是人工刺激免疫系统来治疗肿瘤，改善该系统对抗肿瘤的天然能力。免疫治疗可分类为主动、被动或混合(主动和被动)。主动免疫治疗通过靶向肿瘤抗原来引导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫治疗是增强现有的抗肿瘤应答，包括例如使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。
18.免疫治疗优选地包含应用免疫检查点抑制剂并且免疫治疗因此优选地是免疫检查点抑制剂治疗。免疫检查点抑制剂(也简称为检查点抑制剂)是帮助免疫系统对肿瘤做出更强烈应答的药物。例如，这些药物通过释放“刹车(brakes)”来保持t细胞(一种白细胞，其是免疫系统的一部分)杀死肿瘤细胞。此类药物不直接靶向肿瘤。相反，它们干扰肿瘤细胞避免免疫系统攻击肿瘤细胞的能力。
19.因此，免疫检查点会影响免疫系统功能。免疫检查点可以是刺激性的或抑制性的。肿瘤可以利用这些检查点来保护自己免受免疫系统攻击。刺激性检查点分子是例如肿瘤坏死因子(tnf)受体超家族(cd27、cd40、ox40、gitr和cd137)的成员和属于b7-cd28超家族的分子(cd28本身和icos)。抑制性检查点分子是例如cd20、cd28、cd80、cd86、cd137、ido1、lag3、tim3、tim-4、tigit、btla、ox40、vista、b7-h7、cd27、gitr、ctla4和pd-1和pd-l1。目前批准的检查点治疗主要阻断抑制性检查点受体。因此，阻断对免疫细胞的负反馈信号传导会导致针对肿瘤的免疫应答增强。下文将提供和讨论免疫检查点及其抑制剂的非限制性但
优选的实例。检查点的抑制和/或激活可以通过影响单个靶或其组合来实现。作为说明而非限制，其可以是抗ctla4和/或pd-1和/或pd-l1的组合。此外，检查点抑制剂的功效可以通过使用化疗药和/或激素和/或受体酪氨酸激酶抑制剂和/或dna损伤修复抑制剂的额外治疗来改善。
20.化疗(chemotherapy)是一种癌症疗法，其使用称为细胞抑制剂的药物，旨在阻止肿瘤细胞继续不受控制地分裂。细胞抑制剂通常通过输注进入静脉，但有些也可以作为片剂服用。化疗可能出于治愈目的给予(几乎总是涉及药物组合)，也可能旨在延长生命或减轻症状(姑息性化疗)。细胞抑制剂可以例如通过抑制核酸合成、破坏核酸或改变微管蛋白(纺锤体毒物)或细胞膜破坏来发挥作用。化疗通常与放疗联合-这就是所谓的放化疗。本文所称的化疗可以是辅助化疗或新辅助化疗，优选为新辅助化疗。在新辅助(也称为术前或初级)化疗中，药物治疗发生在手术切除肿瘤之前。这与辅助化疗形成对比，辅助化疗是手术后的药物治疗。化疗药剂的功效可以通过细胞破坏释放肿瘤抗原，肿瘤抗原然后被呈递给免疫系统，这可以最终导致免疫系统的识别增加，从而提高免疫治疗药剂(如免疫检查点抑制剂或激活剂)的有效性。
21.抗激素治疗是一种阻断激素产生或作用的治疗。抗激素治疗在肿瘤治疗中很有用，因为某些激素能够刺激某些类型肿瘤的生长。例如，乳腺癌和前列腺癌的内分泌治疗早已建立。可用于阻断性激素受体介导的肿瘤生长的治疗基于两个原则：(i)配体耗竭，其可以通过手术实现，通过使用促黄体激素释放激素类似物或类固醇生物合成中涉及的酶的抑制剂实现，或通过干扰垂体/下丘脑水平的性激素合成反馈机制实现；(ii)通过使用抗激素阻断性激素受体的功能。例如，他莫昔芬用于治疗乳腺癌并阻断乳腺癌细胞上的雌激素受体。此外，抗激素治疗和/或激素治疗也影响免疫系统和抗原的呈递，这对于免疫调节治疗策略可能很重要。作为本发明的一部分，已经研究了激素活性/依赖性和hla因子的相互作用。
22.抗酪氨酸激酶治疗使用酪氨酸激酶抑制剂(tki)作为抑制酪氨酸激酶的药物。酪氨酸激酶是负责通过信号转导级联激活许多蛋白质的酶。蛋白质是通过向蛋白质添加磷酸基团(磷酸化)来激活，这是tki抑制的步骤。tki被用作抗癌症药物。tki通过四种不同的机制起作用：它们可以与三磷酸腺苷(atp)竞争磷酸化实体、底物或两者，或者可以以变构方式起作用，即与活性位点外的位点结合，通过构象变化影响其活性。作为本发明的一部分，已经研究了受体酪氨酸激酶和hla因子的相互作用。
23.seq id no:7至12的核酸序列分别是人类hla基因膜结合hla-g、hla-l、可溶性hla-g、hla-h、hla-j和hla-l的基因。此外，膜结合同种型可以通过蛋白水解活性释放，从而增加hla-g和hla-l的可溶性部分。优选地，根据本发明的核酸分子是基因组dna或mrna。在mrna的情况下，核酸分子可以另外包含poly-a尾。
24.正如本发明令人惊讶地发现并在下文实施例中所示，hla-g被表达为全长转录物和仅包含hla-g的外显子1至5的剪接形式。虽然全长hla-g包含跨膜结构域并因此与膜结合，但可溶性hla-g缺乏该跨膜结构域。在实施例中进一步表明，编码全长hla-g的mrna的高水平表达(即，例如由所测量的外显子5和8或仅外显子8的高水平表达所示)以及编码可溶形式的mrna的高表达(即，例如由所测量的外显子5的高水平表达和外显子8的低水平，或仅外显子5的高水平所示)与对上文所定义的肿瘤治疗没有应答的肿瘤患者相关。如上所述，
膜结合的hla同种型(isoforms)也可以通过翻译后蛋白水解裂解释放，从而导致可溶性hla片段的释放。
25.编码hla-l的基因也包含编码跨膜结构域的序列。因此认为hla-l也可以全长膜结合形式(seq id no:2)以及可溶形式(seq id no:8)存在于肿瘤中。全长hla-l也可能通过翻译后蛋白水解裂解释放，导致可溶性hla片段的释放。
26.另一方面，编码hla-h和hla-j的基因(seq id no:11和12)不包含编码跨膜结构域的开放阅读框。在下文的实施例中表明hla-h和hla-j是可溶的。下文的实施例还表明，编码此类可溶性hla的mrna的高表达与对上文所定义的肿瘤治疗无应答的肿瘤患者相关。
27.seq id no:1至6分别为人类hla基因hla-g、hla-l、可溶性hla-g、hla-h、hla-j和hla-l蛋白质的氨基酸序列。
28.本发明的术语“核酸序列”或“核酸分子”包括dna，例如cdna或者双链或单链基因组dna和rna。在这方面，“dna”(脱氧核糖核酸)是指在脱氧核糖主链上连接在一起的被称为核苷酸碱基的化学结构单元腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)的任何链或序列。dna可以具有一条核苷酸碱基链，或者可以形成双螺旋结构的两条互补链。“rna”(核糖核酸)是指在核糖主链上连接在一起在被称为核苷酸碱基的化学结构单元腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)的任何链或序列。rna通常具有一条核苷酸碱基链，例如mrna。还包括单链和双链杂交分子，即dna-dna、dna-rna和rna-rna。核酸分子也可以通过本领域已知的许多方法进行修饰。此类修饰的非限制性实例包括甲基化、“帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰。核酸分子，在下文中也称为多核苷酸，可以含有一个或多个额外的共价连接部分，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷基化剂。多核苷酸可通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯键而衍生化。进一步包括本领域已知的核酸模拟分子，例如dna或rna的合成或半合成衍生物和混合聚合物。根据本发明的此类核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、氨基磷酸酯核酸、2
’‑
o-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(hna)、肽核酸(pna)和锁核酸(lna)(参见braasch和corey,chem biol 2001,8:1)。lna是一种rna衍生物，其中核糖环受2
’‑
氧和4
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碳之间的亚甲基键的限制。还包括含有修饰碱基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶。核酸分子典型地携带遗传信息，包括细胞机构用来制造蛋白质和/或多肽的信息。核酸分子可另外包含启动子、增强子、反应元件、信号序列、聚腺苷酸化序列、内含子、5
’‑
非编码区和3
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非编码区等。
29.本文术语“蛋白质”可与术语“多肽”互换使用，其描述氨基酸的线性分子链，包括含有至少50个氨基酸的单链蛋白质或其片段。本文所用术语“肽”描述一组由至多49个氨基酸组成的分子，而本文所用术语“多肽”(也称为“蛋白质”)描述一组由至少50个氨基酸组成的分子。本文所用术语“肽”描述一组优选性增加的由至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸和至少40个氨基酸组成的分子。所述肽组和多肽组通过使用术语“(多)肽”一起指代。(多)肽可进一步形成由至少两个相同或不同分子组成的寡聚物。此类多聚体的相应高级结构相应地称为同源二聚体或异源二聚体、同源三聚体或异源三聚体等。例如，hla蛋白质包含半胱氨酸并因此包含潜在的二聚化位点。此外，其中氨基酸和/或肽键已被功能
类似物替代的此类蛋白质/(多)肽的肽模拟物也包括在本发明中。此类功能类似物包括除20种基因编码氨基酸之外的所有已知氨基酸，例如硒代半胱氨酸。术语“(多)肽”和“蛋白质”也指天然修饰的(多)肽和蛋白质，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域公知的类似修饰实现。
30.根据本发明，术语“序列相同性百分比(％)”描述两个或多个比对的核酸或氨基酸序列的相同核苷酸/氨基酸的匹配数(“hits”)与构成模板核酸或氨基酸序列总长度的核苷酸或氨基酸残基数之比。换言之，使用两个或更多个序列或子序列的比对，可以确定相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如80％、85％、90％或95％相同性)，当使用本领域已知的序列比较算法或者人工比对和目视检查，比较和比对序列在比较窗口上或在指定区域上的最大对应性时。该定义也适用于任何待比对序列的互补序列。
31.与本发明相关的核苷酸和氨基酸序列分析和比对优选使用ncbi blast算法(stephen f.altschul,thomas l.madden,alejandro a.jinghui zhang,zheng zhang,webb miller,和david j.lipman(1997),nucleic acids res.25:3389-3402)。blast可用于核苷酸序列(核苷酸blast)和氨基酸序列(蛋白质blast)。技术人员知道用于比对核酸序列的另外的合适程序。
32.如本文所定义，本发明涉及至少85％相同性、优选至少90％相同性和最优选至少95％相同性的序列相同性。然而，本发明还涉及优选性增加的具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的序列相同性。
33.样品可以是对象的体液或来自对象器官的组织样品。体液的非限制性实例是全血、血浆、血清、尿液、腹膜液和胸膜液、脑脊液、泪液或来自上述溶液中的细胞。组织的非限制性实例是结肠、肝脏、乳房、卵巢和睾丸。组织样品可以通过抽吸或穿刺、切除或任何其它导致活组织检查或切除细胞材料的手术方法获取。样品可以是处理过的样品，例如已被冷冻、固定、包埋等的样品。优选的样品类型是福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样品。ffpe样品的制备是标准的医疗实践，这些样品可以保存很长时间。
34.在本发明方法的背景中获得核酸分子或蛋白质或肽的水平的方法是本领域已知的。
35.例如，核酸分子的水平可以通过实时定量pcr(rt-qpcr)、电泳技术或dna微阵列获得(roth(2002),curr.issues mol.biol.,4:93-100)，其中优选rt-qpcr。在这些方法中，表达水平可以针对样品中一种或多种参考基因的(平均)表达水平进行标准化。如本文所用，术语“参考基因”是指在被检查的系统即肿瘤中，在rna转录物/mrna水平上具有相对不变的表达水平的基因。这种基因可以被称为管家基因。参考基因的非限制性实例是calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh，优选calm2和/或b2m。其它合适的参考基因是本领域技术人员已知的。
36.rt-qpcr在热循环仪中进行，热循环仪能够用至少一个特定波长的光束照射每个样品，并检测激发的荧光团发出的荧光。热循环仪还能够快速加热和冷却样品，从而利用核酸和dna聚合酶的物理化学特性。在实时qpcr中检测pcr产物的两种常用方法是：(1)插入任何双链dna的非特异性荧光染料，以及(2)由用荧光报告分子标记的寡核苷酸组成的序列特异性dna探针，只有在探针与其互补序列杂交后(例如taqman探针)才允许检测。探针通常是荧光标记的探针。优选地，荧光标记的探针由用荧光报告染料和猝灭染料标记的寡核苷酸
组成(＝双标记探针)。合适的荧光报告和猝灭染料/部分是本领域技术人员已知的并且包括但不限于报告染料/部分6-famtm、joetm、和猝灭染料/部分dabcyl、tamratm、bhqtm-1、-2或-3。优选地，用于根据本发明的用途的引物具有15至30个核苷酸的长度，并且特别是脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中，引物被设计为(1)对hla基因或源自其的靶mrna序列具有特异性，(2)提供小于120bp(优选小于100bp)的扩增子大小，(3)是mrna特异性的(考虑外显子/内含子；优选没有基因组dna的扩增)，(4)没有二聚化的趋势和/或(5)具有在58℃至62℃范围内的解链温度tm(优选tm约为60℃)。如上所述，(2)的rt-qpcr需要探针，但是在(1)的rt-qpcr的情况，探针可以用嵌入染料例如sybr绿代替。
37.作为qpcr的一个替代方案，还可以使用电泳技术，或者作为另外的替代方案，可以使用dna微阵列获得本发明第一方面的核酸分子的水平。mrna鉴定和定量的传统方法是通过凝胶电泳的组合，它提供有关大小和序列特异性探测的信息。northern印迹是后一类中最常用的技术。作为northern印迹的一种更灵敏、劳动强度更低的替代方法开发了核糖核酸酶保护测定(rpa)。杂交是在溶液中用标记的核糖核苷酸探针进行的，然后未杂交的样品和探针用选择性地降解单链rna的核糖核酸酶(例如rnase a和rnase t1)的混合物消化。随后的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳提供了一种定量工具，也给出探针杂交区域的大小。对于northern印迹和rpa，定量的准确度和精度取决于检测方法和所用参考或标准。最常见的是，探针用32p或33p进行放射性标记，在这种情况下，最终凝胶曝光于x射线胶片或磷光屏，每个条带的强度分别用密度计或磷光成像仪量化。在这两种情况下，可以调整曝光时间以适应所需的灵敏度，但基于磷光体的技术通常更灵敏并且具有更大的动态范围。作为使用放射性的替代方法，探针可以用抗原或半抗原标记，然后由辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶缀合的抗体结合，在添加底物后通过胶片上的化学发光或荧光成像仪量化。在所有这些成像应用中，都应该减去来自无探针的凝胶的相邻区域的背景。凝胶形式的一大优势是任何参考标准都可以与样品同时成像。同样，管家基因的检测在对所有样品相同条件进行。
38.此外，可以使用下一代测序(ngs)。ngs是一种rna或dna测序技术，它彻底改变了基因组研究。使用ngs可以在一天内对整个人类基因组进行测序。相比之下，以前用于破译人类基因组的sanger测序技术需要十多年才能交付最终草案。鉴于本发明，ngs可用于以开放配置定量(基因组范围外显子组测序)或作为包含本技术中公开的相应hla基因和同种型的重点组进行定量。
39.为构建dna微阵列，出现了两种技术。通常，在每种情况下，设计阵列的起点是相应于要探测的基因或推定基因的一组序列。在第一种方法中，寡核苷酸探针是在玻璃基板上化学合成的。由于寡核苷酸与cdna探针杂交的效率不同，合成多个寡核苷酸探针，与每个感兴趣的基因互补。此外，对于阵列上的每个完全互补的寡核苷酸，构建在单个核苷酸位置具有错配的寡核苷酸并用于标准化。寡核苷酸阵列通常以大约10
4-106个探针/cm2的密度创建。dna微阵列构建的第二种主要技术是将cdna探针直接自动化印刷到玻片或其它合适的基材上。使用通用引物通过pcr从通用载体中获得每个感兴趣基因的dna克隆、纯化和扩增。探针自动化沉积为50-200μm大小的点。以这种间距，可以实现例如大约103个探针/cm2的密度。
40.蛋白质或肽的水平可以例如通过使用“与蛋白质或肽结合的分子”并且优选地“与蛋白质或肽特异性结合的分子”来确定。与蛋白质或肽结合的分子是指在已知条件下主要
与蛋白质或肽结合而发生的分子。“与蛋白质或肽结合的分子”可以是本文下文描述的结合分子之一，优选蛋白质或肽的抑制剂，例如抗体、适体等。蛋白质或肽的水平也可以通过使用western印迹分析、质谱分析、facs分析、elisa和免疫组织化学获得。这些技术是可用于定性、半定量和/或定量检测蛋白质或肽的方法的非限制性实例。
41.western印迹分析是一种广泛使用且公知的分析技术，用于检测给定样品(例如组织匀浆或身体提取物)中的特定蛋白质或肽。它使用凝胶电泳根据(多)肽的长度(变性条件)或蛋白质的3-d结构(天然/非变性条件)分离天然或变性蛋白质或肽。然后将蛋白质或肽转移到膜(通常是硝酸纤维素或pvdf)上，在那里使用对靶蛋白质具有特异性的抗体进行探测(检测)。
42.质谱(ms)分析也是一种广泛使用且公知的分析技术，其中测量带电粒子的质荷比。质谱用于确定粒子的质量，确定样品或分子的元素组成，以及阐明分子的化学结构，例如蛋白质、肽和其它化合物。ms原理包括电离化合物以产生带电分子或分子碎片并测量它们的质荷比。
43.荧光激活细胞分选(facs)分析是一种广泛使用且公知的分析技术，其中生物细胞基于每个细胞的荧光特征的特定光散射进行分选。细胞可以固定在4％的甲醛中，用0.2％的triton-x-100透化，并与荧光团标记的抗体(例如单克隆或多克隆抗hla抗体)一起温育。
44.酶联免疫吸附试验(elisa)是一种广泛使用且公知的灵敏分析技术，其中酶与抗体或抗原连接作为检测特定蛋白质或肽的标志物。
45.免疫组织化学(ihc)是免疫染色最常见的应用。它涉及利用抗体与生物组织中的抗原特异性结合的原理，选择性地识别组织切片细胞中的抗原(蛋白质)的方法。与特定装置组合，ihc可用于蛋白质表达的定量原位评估(综述见cregger等(2006)arch pathol lab med,130:1026-1030)。定量ihc利用染色强度与绝对蛋白质水平相关这一事实。
46.用于确定对象是否对一种或多种肿瘤治疗有应答以及用于确定对象是否对一种或多种肿瘤治疗没有应答的方法是本领域公知的。通常，如果肿瘤缩小(在实体肿瘤的情况下)，如果非实体肿瘤(例如血癌)中的肿瘤细胞数量或肿瘤疾病赋予的症状降低或保持不变(“稳定”)，则肿瘤患者对治疗有应答。通常，如果在治疗期间肿瘤恶化(例如增大其大小、增加其细胞数量或在肿瘤疾病赋予的症状加重的情况下)，则肿瘤患者没有应答。关于应答，优选肿瘤缩小。
47.治疗有效性的确凿证据是临床症状与生存率改善，而治疗无效的确凿证据是临床症状恶化并最终导致对象死亡。作为本发明的一部分，经常使用疾病特异性生存，其定义是从所研究的治疗选项开始直到癌症特异性死亡。成像，尤其是肿瘤病变的成像，通常用于更早地评估治疗效果。当前的应答评估主要基于通过ct(计算机断层扫描)或其它解剖成像方式测量的肿瘤大小的变化，其中肿瘤大小的缩小表明有应答。此外，使用pet(正电子发射断层扫描)和葡萄糖类似物
18
f-fdg对肿瘤代谢进行成像代表了一种客观和定量评估治疗效果的有吸引力的方法。
48.关于实体肿瘤的评价，优选使用实体肿瘤中的应答评价标准(recist)。recist是一组规则，用于定义肿瘤患者的肿瘤在治疗期间何时改善、保持不变或恶化。该标准于2000年2月由包括欧洲癌症研究和治疗组织(eortc)、美国国家癌症研究所和加拿大国家癌症研究所临床试验组在内的国际合作机构发布。今天，大多数评估癌症治疗对实体肿瘤客观应
答的临床试验都使用recist。这些标准于2009年更新。关于实体肿瘤的评估，也优选使用实体肿瘤中的pet应答标准(percist)。percist是一组替代规则，其使用正电子发射断层扫描(pet)定义肿瘤患者的肿瘤在治疗期间何时改善、保持不变或恶化。这些标准是在2009年制定的。
49.应答或不应答的一或多名对象分别是优选性增加的至少2名、至少5名、至少10名对象、至少25名对象和至少50名对象。采用一个以上的对象有利于分别对有应答或无应答的患者之间的水平差异进行偏倚(bias)。
50.预定标准是指先前从对一种或多种肿瘤治疗有应答的一或多名对象或对一种或多种肿瘤治疗无应答的一或多名对象获得的值。
51.(b)和(b’)的增加水平是优选性增加的与(a)的水平相比增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍。(b)和(b’)的降低水平是优选性增加的与(a)的水平相比降低至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍。(b)和(b’)的基本相同水平优选与对照或预定标准的差异(即更高或更低)小于10％，更优选小于5％。例如，如果(a)中的水平设置为100％，则基本相同的水平可以在100％对照水平的小于110％和大于90％之间。
52.可以从下文的实施例中看出，令人惊讶地发现在患有膀胱癌并接受免疫检查点治疗(抗pd-1或抗pdl-1)的患者中膜结合hla-g(外显子8探针)、可溶性或膜结合hla-g(外显子3探针)、膜结合hla-l(外显子7探针)、可溶性hla-h(外显子2/3探针)和可溶性hla-j(外显子4/5探针)的高表达水平与这些患者的生存率呈负相关。这些hla基因的表达水平越高，患者在2年内死于癌症的可能性就越大。需要考虑到，转录后事件可能会影响膜结合hla同种型。因此，通过外显子8定量确定的膜结合hla-g mrna同种型可能在翻译成蛋白质结构后蛋白水解切割事件后最终产生生物活性的可溶性片段。然而，在免疫检查点治疗开始之前从膀胱癌患者获得的肿瘤组织样品中测量了hla mrna表达水平。因此，实施例中的数据表明，对象的hla-g、hla-l、hla-h和hla-j基因或蛋白质的表达水平可用于在免疫检查点治疗开始之前预测对象是否可能地受益于治疗。虽然低表达水平与较优的疾病特异性生存率相关，但高表达水平与较差的疾病特异性生存率相关。
53.据信实施例中显示的hla-g、hla-l、hla-h和hla-j表达水平对膀胱癌患者在免疫检查点治疗下的生存率的预测价值也适用于其它肿瘤和抗肿瘤治疗，例如一般免疫治疗、化疗、抗激素治疗和抗酪氨酸治疗。这是因为可以假设高hla-g、hla-l、hla-h和hla-j表达水平有助于肿瘤细胞或肿瘤细胞亚群逃避抗肿瘤治疗，因为任何有效的抗癌治疗都会导致肿瘤细胞的破坏和抗原暴露于免疫系统，从而使肿瘤无法被掩盖。因此，降低由hla-g、hla-l、hla-h和hla-j表达赋予的免疫识别的细胞策略不仅对于免疫治疗而且对于化疗和/或抗激素和/或酪氨酸激酶抑制治疗或其任何治疗组合均是重要的。
54.关于膜结合的人类hla-l和可溶性hla-h、hla-j和hla-l的序列，进一步值得注意的是，本文令人惊讶地发现hla-l、hla-h和hla-j在本领域中被错误地注释为假基因。事实上，这些基因是编码蛋白质的，如所附实施例所示，可以在各种癌症中检测到hla-l、hla-h和hla-j的表达。由于hla-l、hla-h和hla-j在本领域中都被错误地注释，因此hla-l、hla-h和hla-j可以统称为一个新的hla组。此外，下文的实施例表明，患有膀胱癌的患者中hla-l、hla-h和hla-j的高表达水平与这些患者的生存率呈负相关。这些hla基因的表达水平越高，患者在2年内死于癌症的可能性就越大。这一证据表明，hla形式l、h和j的表达很可能被肿
瘤用作逃避肿瘤患者的免疫系统的机制。这些基因和所编码的蛋白质具有功能并且不是不编码任何功能蛋白质的假基因。
55.在本发明第一方面的一个优选实施方案中，seq id no:1至6中的任一个是seq id no至6中的任一个，优选seq id no:4或5，及seq id no:7至12中的任一个是seq id no:9至12中的任一个，优选seq id no:11或12。
56.seq id no:9和10是编码可溶性hla形式的膜结合hla-g和hla-l的核酸序列，而seq id no:11和12是可溶性hla-h和hla-j。seq id no:3至6是相应的氨基酸序列。
57.实施例中的数据基于hla类别g、h、l和j证实hla基因和蛋白质可以预测肿瘤患者对本文定义的肿瘤治疗的应答。
58.在本发明第一方面的一个优选实施方案中，所述方法还包含确定选自erbb2、egfr、cd20、ctla4、ido1、lag3、tim3、tim-4、cxcl9、cxcl13、tigit、btla、cd137、ox40、vista、b7-h7、cd27、gitr、tgf-β信号传导途径、il-15、pd-1和pd-l1中的一个或多个、优选pd-1或pd-l1的mrna表达水平或蛋白质水平。
59.就这一优选实施方案而言，应当理解，要确定的是对象中的mrna表达水平或蛋白质水平，然后将其与相应对照或预定标准进行比较，所述对照或预定标准来自已知应答者或不应答者和/或已知的存活者或未存活者，正如上文结合hla基因所解释的。
60.选自erbb2、egfr、cd20、ctla4、ido1、lag3、tim3、tim-4、cxcl9、cxcl13、tigit、btla、cd137、ox40、vista、b7-h7、cd27、gitr、tgf-β信号传导途径、il-15、pd-1和pd-l1中的一个或多个、优选pd-1或pd-l1的mrna表达水平或蛋白质水平单独没有足够的预测价值来确定对象是否可能对本文定义的肿瘤治疗特别是免疫治疗、更特别是检查点治疗有应答或无应答。它们可以与本发明的方法结合使用。因此，预期对这些水平中的一个或多个的附加分析将进一步改善本发明方法的预测价值。
61.pd-1(程序性细胞死亡蛋白质1，又称cd279)是细胞表面的一种蛋白质，其具有调节免疫系统对人体细胞的应答的作用，这种作用通过抑制t细胞炎性活性而下调免疫系统和促进自身耐受而实现。
62.pd-l1(程序性死亡配体1，也称为cd274或b7-h1)是一种40kda的1型跨膜蛋白质，据推测它在特定事件例如怀孕、组织同种异体移植、自身免疫性疾病和其它疾病状态如肝炎期间抑制免疫系统中起主要作用。pd-l1的上调可以使癌症逃避宿主免疫系统。重要的是，pd-l1可以由肿瘤或非肿瘤细胞如巨噬细胞等表达。
63.erbb2(受体酪氨酸蛋白激酶erbb-2，也称为cd340或原癌基因neu)是人类表皮生长因子受体(her/egfr/erbb)家族成员。这一致癌基因的扩增或过表达已被证明在某些侵袭性乳腺癌的发生和进展中发挥重要作用。
64.egfr(表皮生长因子受体，也称为her1)是一种跨膜蛋白质，是细胞外蛋白配体表皮生长因子家族(egf家族)成员的受体。
65.cd20是一种活化的糖基化磷蛋白，在所有b细胞表面表达，从pro-b期(cd45r+、cd117+)开始，浓度逐渐增加直至成熟。cd20是单克隆抗体利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、替伊莫单抗、托西妥单抗和优利妥昔单抗的靶，这些抗体都是治疗所有b细胞淋巴瘤、白血病和b细胞介导的自身免疫疾病的活性药剂。
66.ctla4(细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4，也称为cd152)是一种蛋白质受体，其作为
免疫检查点(或检查点抑制剂)下调免疫应答。ctla4在调节性t细胞中组成型表达，但在常规t细胞中仅在激活后上调-这一现象在癌症中尤为显著。
67.ido1(吲哚胺-吡咯2,3-双加氧酶)是一种含血红素的酶。ido1通过其限制t细胞功能和参与免疫耐受机制的能力参与免疫调节。ido在肿瘤发展过程中被激活，帮助恶性细胞逃避被免疫系统的消灭。
68.lag3(淋巴细胞激活基因3，也称为cd223)是一种细胞表面分子，具有对t细胞功能的多种生物学效应。它是一种免疫检查点受体，因此是制药公司寻求开发癌症和自身免疫性疾病新疗法的各种药物开发计划的目标。
69.tim-3(含t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3，也称为甲型肝炎病毒细胞受体2(havcr2))介导cd8+t细胞耗竭。tim-3也被证明是一种cd4+th1特异性细胞表面蛋白，调节巨噬细胞激活并增强小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的严重程度。
70.tim-4(含t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4)是一种磷脂酰丝氨酸受体，增强凋亡细胞的吞噬。tim-4参与调节t细胞增殖和淋巴毒素信号传导。
71.cxcl9(趋化因子(c-x-c基序)配体9)是一种小细胞因子，属于cxc趋化因子家族，也称为γ干扰素诱导的monokine(mig)。cxcl9是一种t细胞趋化因子，由ifn-γ诱导。
72.cxcl13(趋化因子(c-x-c基序)配体1，也称为b淋巴细胞趋化因子(blc)或b细胞吸引趋化因子1(bca-1))是一种属于cxc趋化因子家族的小趋化因子。顾名思义，这种趋化因子对属于b-1和b-2亚群的b细胞具有选择性趋化性，并通过与趋化因子受体cxcr5相互作用而引起作用。
73.tigit(也称为具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体)是一种存在于一些t细胞和天然杀伤细胞(nk)上的免疫受体。它也被标识为wucam和vstm3。tigit和pd-1已被证明在黑色素瘤患者的肿瘤抗原特异性(ta特异性)cd8+t细胞和cd8+肿瘤浸润淋巴细胞(til)上过表达。
74.btla(b和t淋巴细胞衰减器，也称为cd272)在t细胞激活过程中被诱导表达，并且btla保持在th1细胞上表达，但不在th2细胞上表达。btla激活抑制人cd8+癌症特异性t细胞的功能。
75.cd137也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)、4-1bb，由淋巴细胞激活诱导(ila)。cd137的最佳特征活性是其对活化t细胞的共刺激活性。cd137的交联增强了t细胞增殖、il-2分泌、存活和细胞溶解活性。此外，它还可以增强免疫活性以消除肿瘤。
76.ox40(也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)和cd134)是次级共刺激免疫检查点分子，在激活后24至72小时后表达；它的配体ox40l也不在静息抗原呈递细胞上表达，但会随着细胞激活而表达。ox40的表达依赖于t细胞的完全激活；在没有cd28的情况下，ox40的表达被延迟并且水平降低了四倍。
77.vista(t细胞激活的v域ig抑制因子)是一种i型跨膜蛋白质，作为免疫检查点起作用。vista可以作为t细胞上的配体和受体来起作用，抑制t细胞效应功能并维持外周耐受。
78.b7-h7(也称为人内源性逆转录病毒-h长末端重复序列相关2(hhla2))是b7家族成员，调节人t细胞功能。b7-h7以前被称为功能不明。b7-h7已被鉴定为人cd28h的特异性配体。b7-h7-cd28h途径在tcr信号传导存在下，通过akt依赖性信号传导级联强烈促进cd4+t细胞增殖和细胞因子产生，提示b7-h7包含一个新的共刺激途径。b7-h7的第一个igv结构域
v.；(2012)methods mol biol.899:103-26)。
89.如本文所用，术语“adnectin”(也称为“monobody”)涉及基于人纤连蛋白iii第10个细胞外结构域(10fn3)的分子，其采用94个残基的ig样β-夹心折叠，具有2至3个暴露的环，但缺少中心二硫键(gebauer和skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255)。具有所需靶特异性(即针对hla蛋白质)的adnectin可以通过在蛋白质的特定环中引入修饰来进行基因工程改造。
90.如本文所用，术语“anticalin”是指衍生自脂质运载蛋白的工程蛋白(beste g,schmidt fs,stibora t,skerra a.(1999)proc natl acad sci us a.96(5):1898-903；gebauer和skerra(2009)curr opinion in chemical biology13:245-255)。anticalins拥有一个八链β-桶，它在脂质运载蛋白中形成一个高度保守的核心单元，并通过开放端的四个结构可变环天然形成配体的结合位点。anticalins尽管与igg超家族不同源，但显示出迄今为止被认为是抗体结合位点的典型特征：(i)由于序列变异而导致的高结构可塑性和(ii)构象灵活性提高，允许被诱导适合于不同形状的靶。
91.如本文所用，术语“darpin”是指设计的锚蛋白重复结构域(166个残基)，其提供由典型三个重复的β-转角产生的刚性界面。darpins通常携带相应于人工共有序列的三个重复，其中每个重复的六个位置是随机化的。因此，darpins缺乏结构灵活性(gebauer和skerra，2009)。
92.如本文所用，术语“avimer”是指一类抗体模拟物，其由两个或多个各自具有30至35个氨基酸的肽序列组成，这些肽序列源自各种膜受体的a结构域并通过接头肽连接。靶分子的结合通过a结构域发生，具有针对hla蛋白质的所需结合特异性的结构域可以例如通过噬菌体展示技术进行选择。avimer中包含的不同a结构域的结合特异性可以相同但不是必须相同(weidle uh,等,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0093]“nanofitin”(也称为affitin)是一种抗体模拟蛋白质，衍生自嗜酸热流化叶菌(sulfolobus acidocaldarius)的dna结合蛋白sac7d。nanofitins通常具有大约7kda的分子量并且通过随机化结合表面上的氨基酸被设计成特异性结合靶分子，例如hla蛋白质(mouratou b,b
é
har g,paillard-laurance l,colinet s,pecorari f.,(2012)methods mol biol.；805:315-31)。
[0094]
如本文所用，术语“affilin”是指通过使用γ-b结晶或泛素作为骨架并通过随机诱变修饰这些蛋白质表面上的氨基酸而开发的抗体模拟物。具有所需靶特异性即针对本发明的hla基因的affilins的选择例如通过噬菌体展示或核糖体展示技术实现。根据骨架的不同，affiliins的分子量约为10或20kda。如本文所用，术语affilin还指affiliin的二聚或多聚形式(weidle等,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0095]“kunitz结构域肽”源自kunitz型蛋白酶抑制剂例如牛胰蛋白酶抑制剂(bpti)、淀粉样前体蛋白质(app)或组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域。kunitz结构域的分子量约为6kda，可以通过展示技术例如噬菌体展示选择具有所需靶特异性(即针对hla蛋白质)的结构域(weidle等,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0096]
如本文所用，术语是指源自人fyn sh3结构域的非免疫球蛋白衍生的结合多肽。fyn sh3衍生的多肽是本领域公知的并且描述于grabulovski等(2007)jbc,282,p.3196-3204,wo 2008/022759,bertschinger等(2007)protein eng des sel 20(2):
57-68,gebauer和skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255,或schlatter等(2012),mabs 4:4,1-12)。
[0097]
如本文所用，术语“三特异性结合分子”是指具有三个结合域并因此能够结合、优选特异性结合三个不同表位的多肽分子。这三个表位中的至少一个是本发明的hla蛋白质的表位。两个其它表位也可以是本发明的hla蛋白质的表位或者可以是一种或两种不同抗原的表位。三特异性结合分子优选地是tritac。tritac是一种由三个结合域组成的用于实体肿瘤的t细胞接合剂(engager)，旨在延长血清半衰期，大小约为单克隆抗体的三分之一。
[0098]
如本文所用，术语“前抗体(probody)”是指蛋白酶可激活的抗体前药。前抗体由真正的igg重链和修饰的轻链组成。掩蔽肽(masking peptide)通过可被肿瘤特异性蛋白酶切割的肽接头与轻链融合。掩蔽肽可防止前抗体与健康组织结合，从而最大限度地减少毒副作用。例如，在前抗体中，小分子、抗体或蛋白质药物或适体可与掩蔽肽结合，其限制或阻止与本发明的hla蛋白质的结合并且该掩蔽肽可被蛋白酶切割。蛋白酶是通过切割称为底物的特定氨基酸序列将蛋白质消化成更小的片段的酶。在正常健康组织中，蛋白酶活性受到严格控制。在癌症细胞中，蛋白酶活性上调。在健康组织或细胞中，蛋白酶活性受到调节且是最低的，因此前抗体的靶结合区域仍处于掩蔽状态，因此无法结合。另一方面，在患病组织或细胞中，蛋白酶活性被上调，前抗体的靶结合区域被暴露，因此能够结合和/或抑制。
[0099]
第二方面的结合分子是能够结合本文定义的核酸分子、蛋白质或肽的化合物。结合分子优选特异性结合核酸分子、蛋白质或肽。特异性结合是指结合分子基本上不结合或基本上不结合本文定义的核酸分子、蛋白质或肽以外的其它核酸分子、蛋白质或肽。特别地，优选结合分子不能结合除各自选择的hla蛋白质之外的其它hla蛋白质。本发明的结合分子例如适用于研究或诊断目的。例如，结合本发明的蛋白质的抗体可用于免疫测定，例如elisa或western印迹。免疫测定是可以测量样品(例如溶液)中第二个方面的蛋白质的存在或浓度的生化测试。此外，抗体可用于组织或细胞染色，包括但不限于例如ihc、facs、免疫荧光方法等。第二方面的蛋白质的结合分子优选能够抑制本文所定义的核酸分子、蛋白质或肽。在这种情况下，结合分子被称为抑制剂。
[0100]
抑制本发明的核酸分子和/或蛋白质表达的化合物是根据本发明(i)降低或阻止编码本发明的核酸分子和/或蛋白质的基因转录的化合物，或(ii)是降低或阻止编码本发明蛋白质的mrna翻译的化合物。(i)的化合物包括干扰转录机制和/或其与所述基因的启动子和/或与远离启动子的表达控制元件例如增强子的相互作用的化合物。(ii)的化合物包括干扰翻译机制的化合物。抑制本发明的核酸分子和/或蛋白质的表达的化合物例如通过特异性干扰控制表达的启动子区域而特异性地抑制本发明的核酸分子和/或蛋白质的表达。优选地，本发明的核酸分子和/或蛋白质的转录或本发明的蛋白质的翻译优选性增加地降低至少10％、至少20％、至少30％、至少50％，至少75％，例如至少90％或95％，至少98％及最优选约100％(例如与不存在所述化合物的相同实验设置相比)。
[0101]
根据本发明，抑制本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的活性的化合物导致所述核酸分子、肽和/或蛋白质以降低的效率执行它/它们的功能。抑制本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的活性的化合物特异性地抑制所述核酸分子、肽和/或蛋白质的活性。如下文将进一步详述，抑制本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的活性的化合物可以如下特异性抑制所述核酸分子、肽和/或蛋白质的活性，即与所述核酸分子、肽和/或蛋白质本身相互作用，或
通过特异性抑制(优选杀死)产生所述核酸分子、肽和/或所述蛋白质的细胞和/或与所述肽或蛋白质结合的细胞。优选地，本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的活性降低至少50％，更优选至少75％，例如至少90％或95％，甚至更优选至少98％，及最优选约100％(例如，与不存在化合物的相同实验设置相比)。
[0102]
作为替代选择，抑制本发明所述核酸分子、肽和/或蛋白质活性的化合物还包括用于针对特定hla同种型对患者进行疫苗接种的核酸或其类似物。疫苗接种的方法可基于rna、蛋白质或肽水平，需要额外的修饰以在人体体内情况下的稳定化。这种方法可以从个体化突变组疫苗接种方法中采用(sahin u.personalized rna vaccines mobilizes poly-specific therapeutic immunity against cancer.nature 2017)。
[0103]
作为进一步的选择，抑制本发明所述核酸分子、肽和/或蛋白质的活性的化合物还包括分离针对相应hla基因、同种型和片段的天然存在的自身抗体或者产生天然存在的自身抗体的细胞，它们可以在重新引入相应患者之前进行修饰或繁殖。
[0104]
本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的活性根据本发明优选地是它/它们在癌症患者中诱导对如上文定义的肿瘤治疗的抗性的能力。用于测定这种活性的手段和方法在本领域中已确立并在下文的实施例中说明。根据本发明的医学方面，本发明的核酸分子和/或蛋白质的这种活性因此被抑制。
[0105]
抑制剂的抑制效率可以通过比较抑制剂存在时的活性水平与不存在抑制剂时的活性水平的方法来量化。例如，所形成的本发明的核酸分子和/或蛋白质的量的变化可用于测量。可以以高通量形式同时测定几种抑制剂的效率。独立于生化、细胞或其它测定的高通量测定通常可以在微量滴定板的孔中进行，其中每个板可以包含96、384或1536个孔。平板的处理，包括在环境温度以外的温度下温育以及使测试化合物与测定混合物接触，优选通过一个或多个计算机控制的机器人系统包括移液装置来实现。在筛选大型测试化合物库和/或在短时间内进行筛选的情况下，可以将例如10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物添加到每个孔中。在孔显示预期活性的情况下，可以解卷积(de-convolute)所述测试化合物的混合物以鉴定所述混合物中产生所述活性的一种或多种测试化合物。
[0106]
抑制本发明的核酸分子和/或蛋白质的表达和/或活性的化合物可以配制成囊泡，例如脂质体或外泌体(exososmes)。从药物递送的角度来看，脂质体因其特异性和作用持续时间而引起了极大的兴趣。脂质体细胞型递送系统已被用于有效地将核酸例如sirna体内递送到细胞中(zimmermann等(2006)nature,441:111-114)。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。水性部分含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能够与细胞壁融合的优势。非阳离子脂质体虽然不能与细胞壁有效融合，但在体内被巨噬细胞和其它细胞吞噬。外泌体是脂质包装，可以携带各种不同的分子，包括rna(alexander等(2015),nat commun；6:7321)。包括其中包含的分子的外泌体可以被受体细胞摄取。因此，外泌体是细胞间通讯的重要介质和细胞生态位的调节剂。外泌体可用于诊断和治疗目的，因为它们可以用作递送载体，例如用于造影剂或药物。
[0107]
可将抑制本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的表达和/或活性的化合物以合适的剂量和/或治疗有效量施用于对象。对于给定情况的治疗有效量将通过常规实验容易地确定并且在普通临床医生或医师的技能和判断范围内。通常，作为药物组合物的常规给药方案应该在每天1μg至5g单位的范围内。然而，更优选的剂量可以是每天0.01mg至100mg，甚至
更优选0.01mg至50mg并且最优选0.01mg至10mg的范围内。此外，如果例如所述化合物是irna试剂，例如sirna，则所给予的药物组合物的总药学有效量将通常小于约75mg/kg体重，例如小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重。更优选地，每kg体重的irna试剂的量将小于2000nmol(例如，约4.4
×
10
16
个拷贝)，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmol irna试剂/kg体重。观察变化所需的治疗时间和治疗后发生应答的间隔根据所需的效果而变化。观察变化所需的治疗时间和治疗后发生应答的间隔根据所需的效果而变化。具体的量可以通过本领域技术人员公知的常规测试来确定。合适的测试例如描述于tamhane和logan(2002),“multiple test procedures for identifying the minimum effective和maximum safe doses of a drug”,journal of the american statistical association,97(457):1-9。
[0108]
抑制本发明的核酸分子、肽和/或蛋白质的表达和/或活性的化合物优选与药学上可接受的载体或赋形剂混合以形成药物组合物。根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于向患者、优选人类患者给药的组合物。本发明的药物组合物包含上述化合物。它可以任选地包含能够改变本发明化合物的特性从而例如稳定、调节和/或激活它们的功能的其它分子。组合物可以是固体、液体或气体形式，尤其可以是粉末、片剂、溶液或气雾剂的形式。本发明的药物组合物可以任选地和另外地包含药学上可接受的载体。合适的药物载体的实例是本领域公知的并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液例如油/水乳液、各种类型的润湿剂、无菌溶液、包括dmso在内的有机溶剂等。包含这些载体的组合物可以通过公知的常规方法配制。用于制备药物组合物的手段和方法描述于例如formulation tools for pharmaceutical development(2005),isbn-10:1907568999或者handbook of pharmaceutical manufacturing formulations,isbn-10:9781420081169。
[0109]
药物组合物可以通过任何合适的途径给药。例如，要选择的实际途径取决于药物的物理和化学性质、所需作用的部位、药物从不同途径的吸收程度、药物的代谢以及患者的病情。给药途径的例子是肠内/胃肠道、局部和肠胃外。此外，在膀胱癌或其肿瘤性病变的情况下，药物组合物可以作为滴注疗法应用于膀胱。作为滴注疗法的给药被认为是本发明的一部分，特别是用于免疫学、化疗、抗激素或抗酪氨酸激酶化合物与作为本技术一部分的抗hla剂的组合。
[0110]
这些药物组合物可以以合适的剂量给予对象。给药方案将由主治医师和临床因素决定。正如医学领域公知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况以及其它同时服用的药物。
[0111]
如上所述，实施例中的数据表明这些hla的高表达水平与较差的疾病特异性生存率相关。此外，可以推测高hla-g、hla-l、hla-h和hla-j表达水平有助于肿瘤细胞或肿瘤细胞亚群逃避抗肿瘤治疗。
[0112]
因此还假设联合治疗，其中经典的抗肿瘤治疗(例如(i)免疫治疗；(ii)化疗；(iii)抗激素治疗；和/或(iv)抗酪氨酸激酶治疗)与hla-g、hla-l、hla-h或hla-j抑制剂联合使用，进一步改善抗肿瘤治疗。这种联合抗肿瘤治疗可以作为预防措施进行，尤其应该在开始时通过本发明的方法诊断为表达高水平的hla-g、hla-l、hla-h和/或hla-j的患者中进
行。在这些患者中，治疗失败可能会转化为治疗成功。
[0113]
在本发明第二方面的优选实施方案中，已预测对象对通过本发明第一方面的方法进行的(i)免疫治疗；(ii)化疗；(iii)抗激素治疗；和/或(iv)抗酪氨酸激酶治疗无应答。
[0114]
待治疗对象先前诊断为对(i)免疫治疗；(ii)化疗；(iii)抗激素治疗；和/或(iv)抗酪氨酸激酶治疗无应答表明有必要用结合分子、优选本发明的抑制剂额外治疗对象。
[0115]
这是因为上文讨论的hla基因表达据信可以保护对象中的恶性细胞免于(i)免疫治疗；(ii)化疗；(iii)抗激素治疗；和/或(iv)抗酪氨酸激酶治疗，由此结合分子、优选本发明的抑制剂与(i)免疫治疗；(ii)化疗；(iii)抗激素治疗；和/或(iv)抗酪氨酸激酶治疗联合能够将(预期的)治疗失败转化为治疗成功。
[0116]
在本发明第二方面的优选实施方案中，抑制剂为小分子抑制剂、基于核苷酸的抑制剂或基于氨基酸的抑制剂。
[0117]
本文使用的“小分子”优选为有机分子。有机分子涉及或属于一类具有碳基础即碳原子通过碳-碳键连接在一起的化合物。术语有机的最初定义与化合物的来源有关，有机化合物是指从植物、动物或微生物来源获得的含碳化合物，而无机化合物是从矿物来源获得的。有机化合物可以是天然的，也可以是合成的。有机分子优选为芳族分子，更优选为杂芳族分子。在有机化学中，术语芳香性用于描述具有共振键环的环状(环状)、平面(扁平)分子，其比具有相同原子组的其它几何或连接排列更稳定。芳族分子非常稳定，不易分解与其它物质反应。在杂芳族分子中，芳环中的至少一个原子是碳以外的原子，例如n、s或o。对于所有上述有机分子，分子量优选在200da到1500da的范围内，更优选在300da到1000da的范围内。
[0118]
或者，本发明的“小分子”可以是无机化合物。无机化合物衍生自矿物来源，包括所有不含碳原子的化合物(二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐除外)。优选地，小无机分子的分子量小于约2000da，或小于约1000da，例如小于约500da，甚至更优选小于约250da。小分子的大小可通过本领域公知的方法来确定，例如质谱法。小分子可以例如基于靶分子的晶体结构来设计，其中可以在体内测定如体内高通量筛选(hts)测定中鉴别和验证可能负责生物活性的位点。
[0119]
基于核苷酸的抑制剂包含或由核酸序列组成。基于核苷酸的抑制剂可以包含或由rna、dna或两者组成。本发明的基于核苷酸或基于核苷酸类似物的抑制剂是特异性结合seq id no:7至12的hla基因并且还抑制由所述基因编码的hla的活性的分子。如本文所用，特异性结合是指抑制剂特异性靶向hla，并且特别是对其它细胞核酸分子基本上不产生任何脱靶抑制作用。
[0120]
基于氨基酸的抑制剂包含或由氨基酸序列和优选至少25个、更优选至少50个氨基酸的氨基酸序列组成。本发明的基于氨基酸的抑制剂是与seq id no:1至6的hla特异性结合并且还抑制所述hla的活性的分子。基于氨基酸的抑制剂优选包含天然氨基酸，但也可包含非天然氨基酸。优选选择或设计基于氨基酸的抑制剂，以使其特异性结合选自seq id no:1至6的氨基酸序列。
[0121]
对于本发明的第二方面，结合分子、优选抑制剂也可以是细胞如t细胞，其中t细胞优选为car-t细胞。
[0122]
细胞通常在其表面携带结合分子，优选是本发明的至少一种核酸分子或本发明的
至少一种蛋白质或肽的抑制剂。在t细胞的情况下，结合分子、优选抑制剂是特异性靶向本发明的至少一种蛋白质或肽的天然存在的或嵌合的t细胞受体。嵌合抗原受体t细胞(也称为cart细胞)是经过基因改造的t细胞，其产生用于免疫治疗中的用途的人工t细胞受体。
[0123]
嵌合抗原受体(car，也称为嵌合免疫受体、嵌合t细胞受体或人工t细胞受体)因此是受体蛋白，其经过工程改造赋予t细胞特异性靶向本发明的至少一种蛋白质或肽的新能力。所述受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和t细胞激活功能结合到一个受体中。
[0124]
在本发明第二方面的更优选实施方案中，基于核苷酸的抑制剂或基于氨基酸的抑制剂是适体、核酶、sirna、shrna或反义寡核苷酸、基于crispr核酸内切酶的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶或转录激活因子样(tal)效应子(tale)核酸酶，且基于氨基酸的抑制剂是抗体或蛋白质药物。
[0125]
适体是结合特定靶分子的核酸分子或肽分子。适体通常是通过从大型随机序列库中选择它们来创建的，但天然适体也存在于核糖开关中。适体可以作为大分子药物用于基础研究和临床目的。适体可以与核酶结合，在其靶分子存在的情况下进行自身裂解。这些化合物分子还有其它研究、工业和临床应用。
[0126]
核酸适体是通常由(通常是短的)寡核苷酸链组成的核酸种类。典型地，它们已经通过重复多轮体外选择或等效的selex(通过指数富集的配体系统进化)进行工程化，以结合各种分子靶，例如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体。
[0127]
肽适体通常是设计用来干扰细胞内其它蛋白质相互作用的肽或蛋白质。它们由两端均连接到蛋白质支架的可变肽环组成。这种双重结构限制大大增加了肽适体的结合亲和力，使之达到与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变肽环典型包含10至20个氨基酸，并且支架可以是具有良好溶解特性的任何蛋白质。目前，细菌蛋白质硫氧还蛋白-a是最常用的支架蛋白，可变肽环被插入到氧化还原活性位点内，即在野生蛋白质中的-cys-gly-pro-cys-环(seq id no:13)，两个半胱氨酸侧链能够形成二硫键。肽适体选择可以使用不同的系统进行，但目前使用最广泛的是酵母双杂交系统。
[0128]
适体可用于生物技术和治疗应用，因为它们提供的分子识别特性可与常用生物分子特别是抗体的识别特性相媲美。除了它们的区分性识别之外，适体还提供优于抗体的优势，因为它们可以完全在试管中工程化，易于通过化学合成产生，具有理想的储存特性，并且在治疗应用中不引起或几乎不引起免疫原性。未修饰的适体从血流中迅速清除，半衰期为几分钟到几小时，这主要是由于核酸酶降解和经肾脏从体内清除，这是适体固有的低分子量的结果。未修饰的适体应用目前专注于治疗暂时性病症，例如凝血，或治疗可以局部递送的器官(例如眼睛)。这种快速清除在体内诊断成像等应用中可以是一个优势。有多种修饰可供科学家使用，例如2
’‑
氟取代的嘧啶、聚乙二醇(peg)连接、与白蛋白或其它半衰期延长蛋白的融合等，这样适体的半衰期可以增加几天或甚至数周。
[0129]
核酶(来自核糖核酸酶，也称为rna酶或催化rna)是催化化学反应的rna分子。许多天然核酶催化它们自身裂解或其它rna的裂解，但也发现它们催化核糖体的转氨酶活性。充分表征的小自裂解rna的非限制性例子是锤头状、发夹状、丁型肝炎病毒和体外选择的铅依赖性核酶，而i组内含子是较大核酶的一个例子。近年来，催化自裂解的原理已经成熟。在具有核酶活性的rna分子中，锤头状核酶被最好表征。由于已经表明锤头结构可以整合到异源rna序列中，从而可以将核酶活性转移到这些分子上，因此似乎可以创造针对几乎任何靶序
列的催化反义序列，只要靶序列含有潜在的匹配裂解位点。构建锤头状核酶的基本原理如下：选择含有guc(或cuc)三联体的rna感兴趣区域。取两条寡核苷酸链，每条通常具有6至8个核苷酸，并将催化锤头序列插入它们之间。最好的结果通常是用短核酶和靶序列获得的。
[0130]
也可用于本发明的最近发展是识别小化合物的适体与锤头状核酶的组合。结合靶分子后在适体中诱导的构象变化可以调节核酶的催化功能。
[0131]
根据本发明，术语“小干扰rna(sirna)”，也称为短干扰rna或沉默rna，是指一类18至30个、优选19至25个、最优选21至23个或者甚至更优选21个核苷酸长的双链rna分子，它们在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，sirna参与rna干扰(rnai)途径，其中sirna干扰特定基因的表达。除了在rnai途径中的作用外，sirna还可以在rnai相关途径中发挥作用，例如作为抗病毒机制或塑造基因组的染色质结构。
[0132]
在自然界中自然发现的sirna具有明确限定的结构：短双链rna(dsrna)，在任一端有2个核苷酸的3’突出端。每条链都有一个5’磷酸基团和一个3’羟基(-oh)基团。这种结构是dicer(一种将长dsrna或小发夹rna转化为sirna的酶)加工的结果。sirna也可以外源性(人工)导入细胞中，以实现感兴趣基因的特异性敲低。因此，基于与适当定制的sirna的序列互补性，基本上任何已知序列的基因都可以被靶向。双链rna分子或其代谢加工产物能够介导靶特异性核酸修饰，特别是rna干扰和/或dna甲基化。外源引入的sirna可以在其3’和5’末端没有突出端，但是，优选至少一条rna链具有5
’‑
和/或3
’‑
突出端。优选地，双链的一端具有1至5个核苷酸、更优选1至3个核苷酸且最优选2个核苷酸的3
’‑
突出端。另一端可以是平端或具有至多6个核苷酸的3
’‑
突出端。一般而言，本发明涉及适合作为针对本发明的靶的sirna的任何rna分子。迄今为止最有效的沉默是使用由21个核苷酸的有义链和21核苷酸的反义链组成的以具有2个核苷酸的3
’‑
突出端的方式配对的sirna双链体获得的。2个核苷酸的3’突出端的序列对限于与第一碱基对相邻的未配对核苷酸的靶识别的特异性的贡献很小。3’突出端中的2'-脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成成本更低，并且可能更具核酸酶抗性。sirna的递送可以使用本领域已知的任何方法来完成，例如通过将sirna与盐水组合并静脉内或鼻内施用该组合，或通过在葡萄糖(例如5％葡萄糖)配制sirna，或者阳离子脂质和聚合物可以用于通过静脉内(iv)或腹腔内(ip)的系统性途径体内递送sirna (fougerolles等(2008),current opinion in pharmacology,8:280-285；lu等(2008),methods in molecular biology,vol.437:drug delivery systems
–
chapter 3:delivering small interfering rna for novel therapeutics)。
[0133]
短发夹rna(shrna)是产生紧发夹转角(tight hairpin turn)的rna序列，它可以通过rna干扰来使基因表达沉默。shrna使用导入细胞的载体并利用u6启动子确保shrna始终表达。这一载体通常会传递给子代细胞，从而使基因沉默得以遗传。shrna发夹结构被细胞机构裂解成sirna，sirna然后与rna诱导的沉默复合物(risc)结合。这种复合物结合并裂解与其结合的sirna匹配的mrna。本发明中使用的si/shrna优选使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规dna/rna合成仪化学合成。rna合成试剂的供应商有proligo(hamburg,germany)、dharmacon research(lafayette,co,usa)、pierce chemical(perbio science的一部分，rockford,il,usa)、glen research(sterling,va,usa)、chemgenes(ashland,ma,usa)和cruachem(glasgow,uk)。最方便的是，sirna或shrna从商业rna寡核苷酸合成供应商处获得，这些供应商出售不同质量和价格的rna合成产品。一般而言，适用于本发明的
rna是常规合成的并且容易以适合于rnai的质量提供。
[0134]
实现rnai的其它分子包括例如microrna(mirna)。所述rna种类是单链rna分子。内源性存在的mirna分子通过与互补的mrna转录物结合并通过类似于rna干扰的过程触发所述mrna转录物的降解来调节基因表达。因此，外源性mirna在引入相应细胞后可用作本发明的hla基因的抑制剂。
[0135]
如本文所用，术语“反义核酸分子”是指与靶核酸互补的核酸。根据本发明的反义分子能够与靶核酸相互作用，更具体地，它能够与靶核酸杂交。由于杂交体的形成，靶基因的转录和/或靶mrna的翻译被降低或阻断。涉及反义技术的标准方法已有描述(参见例如melani等,cancer res.(1991)51:2897-2901)。
[0136]
crispr/cas9和crispr-cpf1技术适用于几乎所有细胞/模式生物，可用于敲除突变、染色体缺失、dna序列编辑和基因表达调节。基因表达调节可以通过使用催化死亡cas9酶(dcas9)来操作，该酶与转录阻遏因子缀合以阻遏特定基因的转录，这里是根据本发明的hla基因。类似地，催化无活性的“死”cpf1核酸酶(来自prevotella和francisella-1的crispr)可以与合成的转录阻遏因子或激活因子融合，以下调内源性启动子，例如控制hla基因表达的启动子。或者，可以设计锌指核酸酶(zfn)的dna结合结构域或转录激活因子样效应核酸酶(talen)来特异性识别hla基因或其启动子区或其5
’‑
utr，从而抑制hla的表达基因。
[0137]
本文还涉及所提供作为抑制核酸分子的抑制剂，其靶向hla基因或参与hla表达的调节分子。这种降低或消除靶hla或调节分子的表达的分子包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活因子样(tal)效应子(tale)核酸酶。这种方法描述于silva等,curr gene ther.2011；11(1):11-27；miller等,nature biotechnology.2011；29(2):143-148,和klug,annual review of biochemistry.2010；79:213-231。
[0138]
根据本发明使用的术语“抗体”包含例如来自任何物种的多克隆或单克隆抗体及其人源化形式。此外，仍保留对靶例如seq id no:1至6的hla蛋白质的结合特异性的其衍生物或片段也包含在术语“抗体”中。抗体片段或衍生物尤其包含fab或fab’片段、fd、f(ab’)2、fv或scfv片段、单域vh或v-样域例如vhh或v-nar-域，以及多聚体形式，例如微型抗体、diabodies、tribodies或triplebodies、tetrabodies或化学缀合的fab
’‑
多聚体(参见例如harlow和lane
″
antibodies,a laboratory manual
″
,cold spring harbor laboratory press,198；harlow和lane“using antibodies:a laboratory manual”cold spring harbor laboratory press,1999；altshuler ep,serebryanaya dv,katrukha ag.2010,biochemistry(mosc).,vol.75(13),1584；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),1126)。多聚体形式特别包含可以同时结合两种不同类型抗原的双特异性抗体。第一种抗原可以在本发明的hla蛋白质上发现。第二种抗原可以例如是在癌症细胞或某种类型癌症细胞上特异性表达的肿瘤标志物。双特异性抗体形式的非限制性例子是biclonics(双特异性、全长人igg抗体)、dart(双亲和性重靶向抗体)和bite(由不同抗体的两个单链可变片段(scfv)组成)分子(kontermann和brinkmann(2015),drug discovery today,20(7):838-847)。
[0139]
术语“抗体”还包括这样的实施方案，例如嵌合(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化(除了非人cdr的人抗体)抗体。
[0140]
用于产生抗体的各种技术是本领域公知的并且被描述于例如harlow和lane(1988)和(1999)和altshuler等,2010,loc.cit.。因此，多克隆抗体可以在用抗原与添加剂和佐剂的混合物免疫后从动物的血液中获得，单克隆抗体可以通过提供由连续细胞系培养物产生的抗体的任何技术来产生。这些技术的实例描述于例如harlow e和lane d,cold spring harbor laboratory press,1988；harlow e和lane d,using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,1999，并且包括最初由和milstein,1975描述的杂交瘤技术，三瘤技术，人b细胞杂交瘤技术(参见例如kozbor d,1983,immunology today,vol.4:7；li j,等2006,pnas,vol.103(10),3557)，以及产生人单克隆抗体的ebv杂交瘤技术(cole等,1985,alan r.liss,inc,77-96)。此外，重组抗体可以从单克隆抗体中获得，或者可以使用各种展示方法如噬菌体、核糖体、mrna或细胞展示从头制备。用于表达重组(人源化)抗体的合适系统可以选自例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞系或转基因动物或植物(参见例如美国专利号6,080,560；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),11265)。此外，描述的用于生产单链抗体的技术(尤其参见美国专利4,946,778)可适用于生产特异于本发明的hla基因的表位的单链抗体。biacore系统中采用的表面等离子体共振可用于提高噬菌体抗体的效率。
[0141]
如本文所用，术语“蛋白质药物”是指当给予对象时表现出治疗(治疗或预防)作用的蛋白质或肽。下文将讨论蛋白质药物类别的实例。
[0142]
如所讨论的，上述小分子、抗体或蛋白质药物和适体可以特异性结合本发明的蛋白质。这种结合可以阻断本发明的蛋白质的免疫抑制特性，并且优选地阻断蛋白质在癌症患者中诱导对本文定义的肿瘤治疗的抗性和/或减少癌症患者的无进展生存期和总生存期的能力。在这种情况下，小分子、抗体或蛋白质药物和适体也称为阻断性小分子、抗体或蛋白质药物和适体。阻断性小分子、抗体或蛋白质药物和适体阻断本发明的hla蛋白质与其它细胞成分的相互作用，所述其它细胞成分例如是通常与根据本发明的hla蛋白质相互作用的配体和受体。
[0143]
小分子、抗体或蛋白质药物和适体也可以以药物缀合物的形式生成。在这种情况下，小分子、抗体或蛋白质药物和适体本身可能没有抑制作用，抑制作用仅由药物赋予。小分子、抗体或蛋白质药物和适体赋予药物与产生和/或结合本发明的hla蛋白质的细胞的位点特异性结合。药物优选能够杀死产生和/或结合本发明的hla蛋白质的细胞。因此，通过将结合本发明的hla蛋白质的分子的靶向能力与药物的细胞杀伤能力组合，药物缀合物变成能区分健康和疾病组织和细胞的抑制剂。用于设计药物缀合物的可裂解和不可裂解接头是本领域已知的。能够杀死细胞的药物的非限制性例子是细胞抑制药物和直接向癌症细胞传递辐射的放射性同位素。
[0144]
此外，还可以将小分子、抗体或蛋白质药物和适体的结合和/或抑制活性限制在某些组织或细胞类型，特别是病变组织或细胞类型。例如，可以设计下文进一步描述的前抗体。
[0145]
在本发明第二方面的更优选实施方案中，蛋白质药物是抗体模拟物，优选地选自affibodies、adnectins、anticalins、darpins、avimers、nanofitins、affilins、kunitz结构域肽、三特异性结合分子和前抗体。
[0146]
在本发明第二方面的另一个优选实施方案中，基于核苷酸的抑制剂包含(a)核酸
序列，其包含或由与选自seq id no:7至12的核酸序列或与其至少80％相同的序列的至少12个连续核苷酸互补的核酸序列组成，(b)核酸序列，其包含或由与选自seq id no:7至12的一个或多个核酸序列的互补链至少80％相同的核酸序列组成，(c)核酸序列，其包含或由(a)或(b)的核酸序列组成，其中该核酸序列是dna或rna，(d)表达(a)至(c)中任一项所定义的核酸序列的表达载体，优选在肿瘤特异性启动子的控制下，或者(e)包含(d)的表达载体的宿主。
[0147]
这一优选实施方案的(a)至(c)项中所定义的核酸序列包含或由与seq id no:7至12中的一个或多个所定义的hla基因的核苷酸互补的序列组成。因此，(a)至(c)项中所定义的核酸序列包含或者是反义核酸序列。
[0148]
根据本发明的该进一步优选实施方案的(a)项的核酸序列包含或由这样的序列组成，该序列优选性增加地与选自seq id no:7至12的一个或多个序列的至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸、至少21个核苷酸互补。这些至少13个核苷酸、至少14个核苷酸、至少15个核苷酸、至少16个核苷酸、至少17个核苷酸、至少18个核苷酸、至少19个核苷酸、至少20个核苷酸或至少21个核苷酸优选是选自seq id no:7至12的一个或多个序列的连续部分，即核苷酸在各自的seq id no中是连续的。(a)项的核酸序列的形式没有特别限制，只要它包含或由与选自seq id no:7至12的核酸序列互补的至少12个连续核苷酸组成即可。(a)项的核酸序列包含或由反义寡核苷酸组成。因此，(a)项的核酸序列反映了上述反义技术的基本原理，即使用寡核苷酸通过基于互补配对的精细特异性来沉默选定的靶rna。因此，应当理解，(a)项的核酸序列优选为反义寡核苷酸的形式或形成如上文定义的sirna或shrna的一部分。反义寡核苷酸优选为lna-gapmers、antagomirs或antimirs。
[0149]
(b)项的核酸序列需要与选自seq id no:7至12的一个或多个核酸序列的互补链具有至少70％相同性，典型地比包含反义寡核苷酸并包含选自seq id no:7至12的核酸序列的至少12个连续核苷酸的(a)项的核酸序列长得多。根据本发明上述优选实施方案的(b)项的核酸序列能够与靶hla基因相互作用，更具体地能够与靶hla基因杂交。通过形成杂交体，hla的功能被降低或阻断。
[0150]
(b)项的分子与选自seq id no:7至12的序列的序列相同性优选性增加地是至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92.5％、至少95％、至少98％、至少99％和100％。可以单独选择与seq id no:7至12中的每一个相关的序列相同性。用于确定序列相同性的手段和方法是本领域已知的。优选地，blast(基本局部比对检索工具)程序用于确定针对seq id no:7至12中的一个或多个序列的序列相同性。
[0151]
在(c)项的核酸序列中，核苷酸序列可以是rna或dna。rna或dna涵盖化学修饰的rna核苷酸或dna核苷酸。众所周知，rna包含核苷酸u，而dna包含核苷酸t。
[0152]
根据上述优选实施方案的(d)和(e)项，抑制剂也可以分别是能够产生(a)至(c)项中任一项所定义的核酸序列的表达载体或宿主。
[0153]
表达载体可以是用于将特定转录物引入靶细胞的质粒。一旦表达载体进入细胞内，由基因编码的蛋白质就会由细胞转录和翻译机构核糖体复合物产生。质粒通常被设计成含有作为增强子和/或启动子区域并导致转录物有效转录的调控序列。
[0154]
表达载体的非限制性例子包括原核质粒载体，如puc系列、pbluescript
(stratagene)、pet系列表达载体(novagen)或者pcrtopo(invitrogen)和与哺乳动物细胞相容的载体，例如prep(invitrogen)、pcdna3(invitrogen)、pcep4(invitrogen)、pmc1neo(stratagene)、pxt1(stratagene)、psg5(stratagene)、ebo-psv2neo、pbpv-1、pdbpvmmtneo、prsvgpt、prsvneo、psv2-dhfr、pizd35、plxin、psir(clontech)、pires-egfp(clontech)、peak-10(edge biosystems)、ptriex-hygro(novagen)和pcineo(promega)。适用于毕赤酵母的质粒载体的例子包含例如质粒pao815、ppic9k和ppic3.5k(均为intvitrogen)。对于药物组合物的配制，根据良好生产规范选择合适的载体。这样的载体是本领域已知的，例如来自ausubel等，hum gene ther.2011apr；22(4):489-97或者allay等,hum gene ther.may 2011；22(5):595
–
604。
[0155]
典型的哺乳动物表达载体含有介导mrna转录的起始的启动子元件、蛋白质编码序列以及转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的信号。此外，还可以包括如复制起点、抗药性基因、调节物(作为诱导型启动子的一部分)等元件。lac启动子是典型的诱导型启动子，用于原核细胞，可使用乳糖类似物异丙基硫醇-b-d-半乳糖苷(“iptg”)诱导。对于重组表达和分泌，感兴趣的多核苷酸可以连接在例如引导重组蛋白到周质中的pelb前导信号和称为phen4的噬菌粒中的基因iii(描述于ghahroudi等，1997,febs letters414:521-526)之间。其它元件可以包括增强子、kozak序列和间插序列，其侧翼是用于rna剪接的供体和受体位点。高效转录可以使用sv40的早期和晚期启动子、逆转录病毒(例如rsv、htlvi、hivi)的长末端重复序列(ltr)和巨细胞病毒(cmv)的早期启动子实现。然而，也可以使用细胞元件(例如人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明中用途的合适表达载体包括，例如载体如psvl和pmsg(pharmacia,uppsala,sweden)、prsvcat(atcc 37152)、psv2dhfr(atcc 37146)和pbc12mi(atcc 67109)。或者，重组(多)肽可以在含有整合到染色体中的基因构建体的稳定细胞系中表达。与选择标志物如dhfr、gpt、新霉素、潮霉素的共转染可以鉴别和分离转染的细胞。还可以扩增转染的核酸以表达大量编码的(多)肽。dhfr(二氢叶酸还原酶)标志物可用于开发携带数百个甚至数千个感兴趣基因拷贝的细胞系。另一个有用的选择标志物是谷氨酰胺合酶(gs)(murphy等1991,biochem j.227:277-279；bebbington等1992,bio/technology 10:169-175)。使用这些标志物，哺乳动物细胞在选择性培养基中生长，选择具有最高抗性的细胞。如上所述，表达载体将优选地包括至少一种选择标志物。此类标志物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、g418或新霉素抗性以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。有关载体修饰技术，请参见sambrook和russel(2001),molecular cloning:alaboratory manual,3vol.。通常载体可以含有一个或多个复制起点(ori)和用于克隆或表达的遗传系统、一个或多个用于在宿主中进行选择的标志物例如抗生素抗性，以及一个或多个表达盒。合适的复制起点(ori)包括例如col e1、sv40病毒复制起点和m13复制起点。
[0156]
要插入载体的序列可以例如通过标准方法合成，或从天然来源中分离。编码序列与转录调控元件和/或其它氨基酸编码序列的连接可以使用已建立的方法进行。确保在原核生物或真核细胞中表达的转录调控元件(表达盒的一部分)是本领域技术人员公知的。这些元件包含确保转录起始的调控序列(例如翻译起始密码子、启动子、增强子和/或绝缘子)、内部核糖体进入位点(ires)(owens,proc.natl.acad.sci.usa 98(2001),1471-1476)和任选的poly-a信号，确保转录的终止和转录物的稳定。额外的调控元件可以包括转录和
翻译增强子，和/或天然相关或异源启动子区域。优选地，本发明的上述优选实施方案的(a)项中所定义的核苷酸序列可操作地连接到允许在原核或真核细胞中表达的这种表达控制序列。
[0157]
宿主可以是原核或真核细胞。合适的真核宿主可以是哺乳动物细胞、两栖动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、真菌细胞或植物细胞。细菌细胞的代表性例子是大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞的代表性例子是酵母细胞；昆虫细胞的代表性例子是果蝇s2和夜蛾sf9细胞。优选地，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。可使用的哺乳动物宿主细胞包括人hela、293、h9和jurkat细胞、小鼠nih3t3和c127细胞、cos 1、cos7和cv1、鹌鹑qc1-3细胞、小鼠l细胞和中国仓鼠卵巢(cho)细胞。细胞可以是细胞系的一部分，优选人细胞系或cho细胞系。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。宿主优选是宿主细胞，更优选是分离的宿主细胞。宿主还优选为非人类宿主。
[0158]
根据本发明第一和第二方面的优选实施方案，免疫治疗包含应用免疫检查点抑制剂，优选是erbb2、egfr、cd20、pd-1、pdl-1、ctla4、ido1、lag3、tim3、tim-4、cxcl9、cxcl13、tigit、btla、cd137、ox40、vista、b7-h7、cd27、gitr、tgf-β信号传导途径、il-15、pd-1或pd-1l的抑制剂，优选是pd-1和/或pd-1l的抑制剂。
[0159]
现有技术中已知选自erbb2、egfr、cd20、ctla4、ido1、lag3、tim3、tim-4、cxcl9、cxcl13、tigit、btla、cd137、ox40、vista、b7-h7、cd27、gitr、tgf-β信号传导途径、il-15、pd-1和pd-1l的一个或多个的mrna表达水平或蛋白质水平参与免疫检查点。因此，erbb2、egfr、cd20、ctla4、ido1、lag3、tim3、tim-4、cxcl9、cxcl13、tigit、btla、cd137、ox40、vista、b7-h7、cd27、gitr、tgf-β信号传导、il-15、pd-1和pd-1l的mrna或蛋白质是免疫检查点抑制剂的靶。下文将提供此类免疫检查点抑制剂的特别优选实例。
[0160]
根据本发明第一和第二方面的更优选实施方案，免疫检查点抑制剂选自下组：曲妥珠单抗、西妥昔单抗、利妥昔单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗、阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、伊匹单抗、瑞拉利单抗、ly3321367、mbf453、tsr-022、乌瑞芦单抗、pfz-05082566、1-7f9(iph2101)、gsk2831781、medi16469、medi16383、moxr0916、伐立鲁单抗、trx518、nkg2d配体-抗肿瘤fv融合体(临床前开发)、galunisertib、alt-803(il-15-il-15alpha-sushi-fc融合体复合物)、艾卡朵司他、imp321和nj-63723283。
[0161]
曲妥珠单抗是一种与her2受体结合从而减缓细胞复制的治疗性抗体。
[0162]
西妥昔单抗是一种抗表皮生长因子受体(egfr)的抗体，用于治疗癌症，如转移性结直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌。
[0163]
利妥昔单抗是一种抗cd20蛋白的嵌合单克隆抗体。其用于治疗自身免疫性疾病和癌症。
[0164]
纳武单抗(市售名为opdivo)是一种抗pd-1单克隆抗体，用于治疗癌症。帕博利珠单抗(之前称为mk-3475和兰博利珠单抗，商品名keytruda)和西米普利单抗是另外的抗pd-1抗体，用于治疗癌症。
[0165]
阿特珠单抗是一种抗蛋白质程序性细胞死亡配体1(pd-l1)的抗体，用于癌症免疫治疗。德瓦鲁单抗和阿维鲁单抗是另外的抗pd-l1抗体，用于治疗癌症。
[0166]
伊匹单抗是一种抗ctla-4的单克隆抗体。它用于治疗癌症，特别是黑色素瘤、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、膀胱癌和转移性激素难治性前列腺癌。
[0167]
瑞拉利单抗(bms-986016)是一种抗lag3抗体，设计用于治疗黑色素瘤。
[0168]
ly3321367、mbf453和tsr-022是抗havcr2单克隆抗体，用于治疗癌症。
[0169]
乌瑞芦单抗(bms-663513或抗4-1bb抗体)和utomimulab(pf-05082566)是抗cd137抗体。更详细地，它们特异性结合并激活表达cd137的免疫细胞，从而刺激免疫应答，尤其是针对肿瘤细胞的细胞毒性t细胞应答。
[0170]
iph2101是一种抗kir(1-7f9)人单克隆抗体，开发用于治疗急性髓系白血病。
[0171]
gsk2831781是一种抗lag3抗体，用于治疗自身免疫疾病。
[0172]
medi16469是一种抗ox40抗体，用于免疫治疗。
[0173]
medi16383是一种人ox40融合蛋白，也用于免疫治疗。
[0174]
moxr0916是一种抗ox40抗体，用于治疗实体肿瘤。
[0175]
伐立鲁单抗特异性结合cd27。它用于治疗癌症，例如晚期乳腺癌或卵巢癌。
[0176]
trx518是一种抗体，阻断糖皮质激素诱导的tnf超家族受体(gitr)的相互作用。该抗体可用于治疗肿瘤。
[0177]
galunisertib是tgf-β的小分子抑制剂，用作抗癌药物。
[0178]
alt-803(il-15-il-15alpha-sushi-fc融合体复合物)是一种il-15超激动剂复合物，包括与il-15受体α/igg1 fc融合蛋白融合的il-15突变体(il-15n72d)。alt-803可以触发抗原特异性抗肿瘤应答。
[0179]
艾卡朵司他(epacadostat)是吲哚胺2,3-双加氧酶-1(ido1)的小分子抑制剂，用于治疗癌症。
[0180]
imp321(eftilagimod alpha)是lag3的可溶性版本，用于增加对肿瘤的免疫应答。
[0181]
jnj-63723283是一种针对负面免疫调节人细胞表面受体程序性细胞死亡1蛋白(pd-1、pcdc-1)的单克隆抗体，具有潜在的免疫检查点抑制活性和抗肿瘤活性。给药后，抗pd-1单克隆抗体jnj-63723283与pd-1结合，并抑制与其配体程序性细胞死亡1配体1(pd-l1、pd-1l1)和pd-1配体2(pd-l2、pd-1l2)的相互作用。配体结合的抑制阻止pd-1介导的信号传导，并导致t细胞激活和t细胞介导的抗肿瘤细胞免疫应答的诱导。
[0182]
根据本发明第一和第二方面的另一个更优选的实施方案，抗激素治疗包含抗雌激素治疗和/或抗孕酮和/或抗雄激素治疗。
[0183]
雌激素(或雌激素)是主要的女性性激素。它通常负责女性生殖系统和第二性征的发育和调节。孕酮(p4)是一种内源性类固醇，参与人类和其它物种的月经周期、妊娠和胚胎发生。雄激素是主要的男性性激素。它通常负责男性生殖系统和第二性征的发育和调节。雌激素、孕酮和雄激素都是参与肿瘤发生的激素。特别是，雌激素、雄激素或孕酮受体阳性的癌症用抑制产生这些激素或干扰这些激素在体内作用的药物进行治疗。
[0184]
根据本发明的第一和第二方面的进一步优选的实施方案，肿瘤是癌症，优选是癌并且最优选是膀胱癌。
[0185]
在下文的实施例中，hla-g、hla-l、hla-h和hla-j基因或蛋白质的表达水平在来自膀胱癌患者的样品中测定。
[0186]
在膀胱癌或其肿瘤性病变的情况下，优选的是使用包含向膀胱内的滴注疗法。作为滴注疗法的给药被认为是本发明的一部分，特别是免疫学、化疗、抗激素或抗酪氨酸激酶化合物与所述的抗hla药剂的组合作为本技术的一部分。
[0187]
本发明在第三方面涉及用于制备试剂盒的方法，所述试剂盒用于预测患有肿瘤的对象是否对选自以下的肿瘤治疗有应答：(i)免疫治疗，(ii)化疗，(iii)抗激素治疗，和(iv)抗酪氨酸激酶治疗，其中，所述方法包含组合用于检测上文所定义的至少一种核酸分子和/或上文所定义的至少一种蛋白质或肽的水平的工具，和如何使用所述试剂盒的说明书。
[0188]
待制备的试剂盒实施以试剂盒形式实施本发明所需的工具。因此，上文结合本发明第一方面提供的定义和优选实施方案同样适用于本发明的试剂盒。
[0189]
作为本发明的一部分举例示出的用于检测和/或量化核酸分子的工具可以是如下表1所示的一个或多个引物和探针。然而，任何能够量化核酸的检测模块例如阵列、ngs或其它分子系统都适合作为本发明的一部分。用于检测蛋白质或肽的工具优选为如上所述的抗体和/或蛋白质结合剂和/或肽结合剂。为了进行检测和/或量化，所述抗体和/或蛋白质结合剂和/或肽结合剂可使用例如荧光染料或放射性标记进行标记。上文还描述了荧光染料和放射性标记的实例。
[0190]
试剂盒的各种组分可以包装在一个或多个容器中，例如一个或多个小瓶中。除了组分之外，小瓶还可以包含用于储存的防腐剂或缓冲剂。试剂盒可以包含如何使用试剂盒的说明书，其优选告知如何使用试剂盒的组分来预测患有肿瘤的对象是否对本文定义的肿瘤治疗有应答。
[0191]
在本发明第三方面的一个优选实施方案中，所述工具包含引物对和任选地包含水解探针或本领域技术人员已知的用于靶序列定量的其它标记的引物或探针检测手段，例如scorpion引物、fret-探针或分子信标，用于序列特异性检测如上文定义的至少一种核酸分子。
[0192]
通常使用引物对和任选地使用水解探针来在上文所述的实时定量pcr中特异性检测上文定义的至少一种核酸分子。优选的引物对和水解探针在下文表1中示出。
[0193]
水解探针是指上述序列特异性dna探针，其由用荧光报告分子标记的寡核苷酸组成，其仅在所述探针与其互补序列杂交后才允许检测(例如taqman探针)。更详细地，水解探针是双标记的寡核苷酸。寡核苷酸的5’端用荧光报告分子标记，而3’端用淬灭剂分子标记。探针的序列特异于扩增的靶分子中的感兴趣区域。水解探针的设计是序列的长度使5’荧光团和3’猝灭剂足够接近以抑制荧光。在pcr循环的延伸阶段，dna聚合酶合成pcr引物下游的互补链。当延伸到达结合的水解探针时，dna聚合酶的5
’‑3’
核酸外切酶活性会降解所述水解探针。水解探针的裂解将荧光报告分子与探针的其余部分分开，使报告分子发出荧光。
[0194]
关于在本说明书中、特别是在权利要求中表征的实施方案，从属权利要求中提及的每个实施方案旨在与所述从属权利要求所从属的每个权利要求(独立或从属)的每个实施方案组合。例如，如果独立权利要求1引用了3个备选方案a、b和c，从属权利要求2引用了3个备选方案d、e和f，以及从属于权利要求1和2的权利要求3引用了3个备选方案g、h和i，应当理解，说明书明确地公开了相应于组合a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i的实施方案，除非另有特别说明。
[0195]
类似地，并且在独立和/或从属权利要求不引用备选方案的情况下，应当理解，如果从属权利要求回溯到多个之前的权利要求，则认为由此涵盖的主题的任何组合均被明确
公开。例如，在独立权利要求1、从属权利要求2引用权利要求1以及从属权利要求3同时引用权利要求2和1的情况下，权利要求3和1的主题的组合清楚且明确地公开，与权利要求3、2和1的主题的组合一样。如果存在涉及权利要求1至3中任一项的进一步从属权利要求4，则权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1，以及权利要求4、3、2和1的主题的组合被清楚和明确地公开。
附图说明
[0196]
图1.晚期或转移性尿路上皮癌队列的consort流程合图。排除具有不足和/或淋巴结组织的福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)块，55名患者的组织可供分析。
[0197]
图2.从肌肉浸润性膀胱癌患者组织中通过rt-qpcr确定的管腔和基底亚型标志物、检查点靶基因和fgfr1至4基因表达的数据分布。
[0198]
图3.通过rt-qpcr检测不同的外显子区域对hla-g、hla-h、hla-j、hla-l、hla-v mrna表达的定量。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。40-dct值越高，基因表达越高。
[0199]
图4.通过rt-qpcr从肌肉浸润性膀胱癌患者组织中确定的管腔和基底亚型标志物、检查点靶基因、fgfr1至4基因和hla-g外显子8mrna表达分析的基因间spearman相关性。
[0200]
图5.通过rt-qpcr从肌肉浸润性膀胱癌患者组织中确定的管腔和基底亚型标志物、检查点靶基因、fgfr1至4基因和hla-g外显子3至6mrna表达分析的基因间spearman相关性(n＝61)。
[0201]
图6.尿路上皮癌患者中hla-h mrna表达与fgfr受体、pd-1、pd-l1以及基底细胞和管腔细胞类型标志物的相关性。
[0202]
图7.hla基因与免疫组织学和分子评估的尿路上皮标志物的聚类分析。红色高亮出高基因表达，而蓝色代表低基因表达。基因描述在聚类分析的左侧。每列代表来自患者的膀胱切除术ubc样本。
[0203]
图8.fgf受体基因与pd-1、pd-l1以及基底和管腔标志物的聚类分析。红色高亮出高基因表达，而蓝色代表低基因表达。基因描述在聚类分析的左侧。每列代表来自患者的膀胱切除术ubc样本。
[0204]
图9.kaplan meier图，显示肌肉浸润性膀胱癌患者的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-g外显子8表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0205]
图10.kaplan meier图，显示具有局部晚期或转移性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝57)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-g外显子8表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0206]
图11.kaplan meier图，显示具有局部晚期或转移性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝57)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-g外显子3表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0207]
图12.kaplan meier图，显示具有局部晚期或转移性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝57)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-j外显子4/5表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0208]
图13.kaplan meier图，显示具有局部晚期或淋巴结阳性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝20)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-g外显子8表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0209]
图14.kaplan meier图，显示具有局部晚期或淋巴结阳性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝20)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-g外显子3表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0210]
图15.kaplan meier图，显示具有局部晚期或淋巴结阳性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝19)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-l外显子7表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0211]
图16.kaplan meier图，显示具有局部晚期或淋巴结阳性ubc的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝17)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-l外显子7表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0212]
图17.kaplan meier图，显示已转移至肺和骨骼或肝脏的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝17)的疾病特异性生存(dss)概率，其基于通过rt-qpcr测定量化的hla-h外显子2/3表达分层。相对mrna表达是通过40-dct方法使用calm2作为参考基因确定的。
[0213]
实施例例证本发明。
[0214]
实施例1
实施例
[0215]
实施例1：在晚期、化疗难治性尿路上皮癌中的hla分析
[0216]
对来自对化疗难治、随后接受pd-1和pd-l1检查点抑制剂药物(即阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗)的一线或二线免疫肿瘤学(“io”)治疗的原发性肿瘤的尿道切除术(tur)活检和膀胱切除术样品分析了hla表达，并与组织病理学和分子参数以及对io治疗的应答和io后疾病特异性生存率相关联。
[0217]
2016年至2018年间，72名经组织学确诊的尿路上皮癌(包括膀胱癌和上尿路上皮癌)新诊断的患者纳入研究。根据批准的说明书给予纳武单抗、帕博利珠单抗和阿特珠单抗作为1、2和3线单药治疗。来自队列样本的所有苏木精-伊红(he)染色的肿瘤组织切片均由两名泌尿病理学家根据uicc的tnm分类(2017)进行评估和分类。罕见的组织学变体根据世界卫生组织(who 2016)泌尿生殖系统肿瘤分类进行了分类。在中心组织病理学审查后，18个组织因没有足够的肿瘤材料或不是尿路上皮癌而被排除在外。有5名患者只有淋巴结组织可用，因此被排除在hla基因表达的预后和/或预测作用的主要分析之外(见图1；consort流程图)。临床数据的数据库关闭于2018年10月16日与fda的平行提交一起完成。
[0218]
对于mrna检测，使用商业试剂盒(xtract,stratifyer)从来自tur活检、膀胱切除术和相应的膀胱组织映射的ffpe组织中提取rna。对于每个反应，从ffpe切片中提取的2.5μl总rna与2.5μl分析混合物、2.5μl酶混合物和2.5μl水在96孔光学反应板的一个孔中混合。pcr反应的测量根据制造商的说明使用versant kpcr cycler(siemens)或light cycler 480(roche)在适当条件下进行(5分钟50℃，1个循环；20秒95℃，1个循环；15秒95℃；1分钟60℃，40个循环)。相对mrna表达与在各个位点评估的基于recist(实体肿瘤应答评估标准)标准确定的io治疗应答相关联，并与从io治疗开始到癌症特异性死亡确定的疾病特异性生
存率相关联。使用生物统计jmp sas 9.0.0(sas,cary,north carolina,usa)进行分区测试，以评估对io治疗应答的可能差异。
[0219]
为了通过rt-qpcr方法对基因表达进行详细分析，使用了感兴趣区域侧翼的引物和在其间杂交的荧光标记探针。使用ncbi引物设计工具(www.ncbi.nlm.nih.go)选择靶特异性引物和探针。rna特异性引物/探针序列用于通过跨外显子/外显子边界定位引物/探针序列来实现rna特异性测量。此外，选择不与具有已知多态性(snp)的序列区域结合的引物/探针。如果存在相同基因的多个同种型，则选择引物以适当地扩增所有相关或选定的剪接变体。通过常规pcr反应检查所有引物对的特异性。进一步优化引物/探针后，表1中列出的引物和探针给出了最好的结果。这些引物/探针优于现有技术中已知的引物/探针，例如，在特异性和扩增效率方面。为了对样品rna的量进行标准化，选择calm2作为参考基因，因为它们在分析的样品中没有被差异性地调节。进行验证实验，显示靶扩增和对照扩增的效率大致相等，这是通过比较αct方法对基因表达进行相对定量的先决条件。
[0220]
表1：hla mrna定量所使用的引物和探针
[0221][0222][0223]
通过rt-qpcr确定uc队列中的管腔和基底亚型显示krt5和krt20mrna的宽的动态范围，范围在40-dct值为19至48的相似范围内。pd-1和pd-l1的mrna表达范围为19至41。fgfr基因的动态范围在fgfr家族内显著不同。相对fgfr1 mrna范围为29至37，fgfr2 mrna
范围为19至39，fgfr3 mrna范围为19至43，fgfr4 mrna范围为19至36(图2)。
[0224]
除了管腔和基底标志物、pd-1、pd-l1和fgfr家族的mrna表达分析外，还进行了经典hla的表达谱以及hla基因和假基因的外显子表达(图3)。
[0225]
fgfr基因1-4、pd-1、pd-l1、基底和管腔标志物以及外显子8hla引物组的非参数spearman相关性揭示了pd-1在表达hla-g外显子8的尿路上皮肿瘤中的强显著相关性(spearman rho 0.2904，p＝0,0232)。除了pd-1，高fgfr1(spearman rho 0.2724,p＝0.0337)表达也与hla-g外显子8表达相关。然而，对于管腔样尿路上皮癌，没有观察到与任何hla的显著相关性(图4)。
[0226]
令人惊讶的是，管腔和基底亚型标志物、检查点靶基因、fgfr1至4基因与剩余hla-g外显子的spearman相关性揭示了hla-g与检查点标志物pd-1的强显著相关性，如与所有hla-g外显子的相似的高共表达所示(pd-1在外显子3 3’末端：spearman rho 0.2768，p＝0.0308；pd-1在外显子4中：spearman rho 0.2768，p＝0.0308；pd-1在外显子5中：spearman rho 0.3220，p＝0.0114；pd-1在外显子6中：spearman rho 0.3805，p＝0.0025)(图5)。这些令人感兴趣的发现对于pd-l1只能在hla-g外显子5中得到证实(spearman rho 0.2695，p＝0.0357)。对于外显子3 3’末端，还可以观察到对于fgf受体3(spearman rho 0.2990，p＝0.0193)和fgf受体4(spearman rho0.2703，p＝0.0352)的高显著相关性。无法确定外显子4的这种相关性，尽管外显子4表达与基底细胞标志物krt5的高mrna表达相关(spearman rho0.2931，p＝0.0219)。基底标志物krt5(spearman rho 0.3526,p＝0.0053)也显示与hla-g外显子6显著相关。此外，fgf受体3(spearman rho 0.2972,p＝0.0200)和fgf受体4(spearman rho 0.3552,p＝0.0050)也显示与hla-g外显子6的mrna表达显著相关。
[0227]
此外，还对hla-h进行了管腔和基底亚型标志物、pd1、pd-l1和fgfr1至4基因的非参数spearman相关性分析(图6)。然而，没有观察到hla-h表达与管腔或基底标志物或检查点抑制剂之间的相关性。
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此外，还进行了fgf受体基因与pd-1、pd-l1以及基底和管腔标志物的聚类分析。分析表明，pd-1和pd-l1表达发生在相当基底尿路上皮癌亚型中。此外，fgfr1 mrna也在细胞角蛋白5阳性肿瘤中更高表达，而fgf受体2至4在相当管腔尿路上皮癌亚型中表现出更高的表达。
[0229]
用免疫组织学评估的尿路上皮癌标志物对hla基因进行的聚类分析揭示hla-g表达主要发生在基底尿路上皮癌亚型(ihc_st_ck5)中，基底尿路上皮癌亚型可以通过hla mrna表达进一步划分。一些基底肿瘤亚型显示出高hla-g表达(图7a)。最后，使用免疫组织学细胞和亚分类标志物(ck5、cd44、ck20、foxa1、gata3)、pd-1、pd-l1以及hla-h表达对hla外显子8表达进行聚类分析。分析表明，hla-g外显子5和外显子8表达和hla-h表达以及pd-1、pd-l1更可归为基底亚型。然而，在管腔尿路上皮肿瘤中也可以观察到hla-g、hla-h和pd-1和pd-l1表达(图7b)。此外，计算机模拟的启动子分析(silico promoter analysis)揭示了hla-g基因中的几种雌激素反应元件(ere)以及孕酮反应元件(pre)。这表明hla-g表达不仅在基底癌亚型中而且在管腔癌亚型中的重要潜力。由于mrna外显子和外显子/外显子连接表达在管腔和基底癌亚型内变化，因此单一外显子表达和外显子/外显子连接分析作为分层工具应该被应用于基底和管腔尿路上皮癌亚型。令人惊讶的是，hla-h启动子区域的计算机模拟分析也揭示了几种雌激素反应元件。与聚类分析一起，这强调了假基因hla-h作为
尿路上皮癌进一步分层工具的重要作用。如图8所示，fgf受体基因已与pd-1、pd-l1以及基底和管腔标志物进行了进一步的聚类分析。分析证明，pd-1和pd-l1表达发生在相当基底尿路上皮癌亚型中。此外，fgfr1 mrna在细胞角蛋白5阳性肿瘤中的表达也更高，而fgf受体2至4在相当管腔尿路上皮癌亚型中表现出更高的表达。这证明了分析hla基因相互作用的队列的代表性。
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实施例2：尿路上皮癌中不同hla基因的外显子表达作为疾病特异性存活(dss)的标志物
[0231]
为了确定接受免疫肿瘤检查点治疗(io治疗)(即阿特珠单抗、纳武单抗或帕博利珠单抗)的晚期或转移性尿路上皮癌患者膀胱癌组织中hla基因表达的预测价值，根据详细的临床随访数据进行评估，其包含who分级，主要转移部位、io治疗开始、癌症特异性死亡时间点或最后接触日期。免疫肿瘤疾病特异性生存率是从io治疗开始到癌症特异性死亡或最后接触计算，并分别删失(censored)。
[0232]
如图9所示，分析了hla-g mrna表达的变化与尿路上皮癌患者的疾病特异性生存率(dss)的相关性。当考虑到包括转移性淋巴结在内的所有可用组织时(n＝60)，kaplan meier分析显示hla-g外显子8mrna表达高于28.43的40-dct值表明疾病特异性生存率较差(p＝0.0102).
[0233]
然而，为了排除淋巴结中非肿瘤相关淋巴细胞的hla表达的非癌症相关效应，在后续分析中将转移性淋巴结组织排除在外，留下57个样品进行如图1所示生存率分析。如图10所示，高hla-g外显子8mrna表达(》＝28.43)与较差的疾病特异性生存率显著相关，hla-g外显子8阳性患者2年后生存概率为35％，而hla-g外显子8阴性患者2年后生存概率为65％(p＝0.0298)。
[0234]
由于所检查的hla-g特异性外显子8区域未翻译成蛋白质，因此通过确定hla-g的外显子3区域(该区域是靠近hla-g信号肽的翻译区的一部分)进行了进一步的确认分析。如图11所示，高hla-g外显子3mrna表达(》＝28.23)与较差的疾病特异性生存率显著相关，hla-g外显子3阳性患者2年后生存概率为30％，而hla-g外显子8阴性患者2年后生存概率为70％(p＝0.0156)。
[0235]
接下来分析了总队列中其它hla基因的预后价值。特别关注当前分类的“假基因”，例如hla-j、h、v或l。如图12所示，高hla-j外显子4/5mrna表达(》＝25.08)与较差的疾病特异性生存率相关，36名hla-j外显子4/5阳性患者2年后生存概率为35％，而19名hla-j外显子4/5阴性患者2年后生存概率为70％。
[0236]
为了进一步阐明hla-g表达与io治疗后生存率的相关性，通过仅分析原发性肿瘤组织以及同时考虑原发性转移部位，进一步明确了该分析。这是基于最初的发现，即io治疗根据转移部位具有不同的效果，例如内脏转移到肝脏的效果较差，可能是因为pd1阳性t细胞被排除在转移性尿路上皮癌患者的肝脏之外，独立于经典的检查点机制(eckstein m,sikic d,strissel pl,erlmeier f.evolution of pd-1和pd-l1 gene和protein expression in primary tumors和corresponding liver metastases of metastatic bladder cancer.eur urology 2018.)。因此，患者根据转移的首发表现进行分组，局部进展、局部区域淋巴结或区域外腹膜后淋巴结分别分类为0或0.5，而扩散到骨、肝、肺、肺和骨或者肺和肝脏分类为增加的指数(分别为1、2、3、4、5)。对于此分析，来自具有足够临床日期
和原发肿瘤组织材料的原发肿瘤组织的54个数据集可用，其中19名患者有局部进展或淋巴结转移，而17名患者最初转移到骨或肝，18名患者转移到肺部受累，单一部位或合并骨或肝脏受累，而所有患者均已接受io药物治疗且主要》1线治疗(74％)。
[0237]
在患有晚期或淋巴结阳性疾病的尿路上皮性膀胱癌患者中，hla-g的高mrna表达与较差的从io治疗起始到癌症特异性死亡的疾病特异性生存率相关。如图13所示，高hla-g外显子8mrna表达(》＝28.545)的患者预后显著较差，11名hla-g外显子8阳性患者2年后生存概率仅为25％，而9名hla-g外显子8阴性患者2年后生存概率为100％(p＝0.0068)。
[0238]
由于所检测的hla-g特异性外显子8区域不翻译成蛋白质，因此通过确定hla-g外显子3区域进行了进一步的验证性分析，该外显子3区域是靠近hla-g信号肽的翻译区的一部分。
[0239]
如图14所示，高hla-g外显子3mrna表达(》＝26.535)与较差的疾病特异性生存率显著相关，10名hla-g外显子3阳性患者2年后生存概率仅为15％，而10名hla-g外显子3阴性患者2年后生存概率为100％(p＝0,0013)。这类似于hla-g外显子8mrna表达的预测价值，并进一步证明，hla-g表达与更差的结果相关，尽管在晚期和淋巴结阳性疾病情况下使用检查点抑制io药物治疗。
[0240]
接下来，研究了其它hla基因，即经典或非经典基因、已知基因或伪基因，是否可以预测尿路上皮性膀胱癌的io结果。
[0241]
作为一个例子，开发了用于量化在“假基因”的3’端的类似于hla-g外显子8区域的相似区域的“假基因”hla-l mrna的分析。如图15所示，高hla-l外显子7mrna表达(》＝29.89)与较差的疾病特异性生存率相关，其中10名hla-l外显子7阳性患者在2年后的生存概率仅为30％，而10名hla-l外显子7阴性患者在2年后的生存概率为80％。然而，由于生存曲线的交叉，这种相关性没有达到通过对数秩检验的统计学显著性。可以争辩的是，一方面样本量仍然很低，另一方面对数秩检验在这种情况可能无效，因为1个月后的非常早期情况确实对p值产生夸大的影响，因此可能不是评估风险的最佳选择。
[0242]
这表明，不仅hla-g而且其它hla基因和/或假基因都与较差的结果相关，尽管使用检查点抑制io药物进行治疗。从治疗的角度来看，这表明不仅应该靶向hla-g还应同时靶向其它hla基因和/或假基因，以克服或破坏对io药物的耐药性。
[0243]
接下来，从肿瘤生物学的角度检查了hla基因在最具侵袭性情况下是否也具有预测性，当多个器官特别是肺在io治疗前的诊断中通过ct扫描确定已经被转移时。如图16所示，高hla-l外显子7mrna表达(》＝30.195)与较差的疾病特异性生存率相关，16名hla-l外显子7阳性患者在1年后的生存概率仅为0％，而11名hla-l外显子7阴性患者在1年后的生存概率为70％(p＝0.0418)。
[0244]
在这种高度转移的情况下，其它“假基因”也很重要，例如hla-h。如图17所示，高hla-h外显子2/3mrna表达(》＝29.95)与较差的疾病特异性生存率相关，hla-h外显子2/3mrna阳性患者在1年后的生存概率仅为30％，而hla-h外显子2/3mrna阴性患者在1年后的生存概率为80％。