1.本发明总体上涉及群体感应依赖性细菌感染的管理，特别地涉及火疫病(fireblight)和其它植物病害的管理。
背景技术：
：：2.由病原体通过群体感应调节系统导致的疾病给临床和农业环境带来巨大挑战。例如，作为影响蔷薇科(familyrosaceae)的苹果、梨、和一些其它成员的、由解淀粉欧文氏菌(erwiniaamylovora)导致的接触传染病的火疫病的有效管理是多方面的并且主要为预防性的，利用环境卫生(sanitation)、培养实践(culturingpractice)、铜杀虫剂、包含利迪链霉菌(streptomyceslydicus)作为活性成分的产品、和抗生素(例如，链霉素或土霉素)的预防性应用的组合(1)。3.可通过群体感应调节系统在各种作物中导致疾病的常见植物病原体的其它实例为胡萝卜软腐坚固杆菌(pectobacteriumcarotovorum)(2)、丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)(3)、和皱纹假单胞菌(pseudomonascorrugate)(4)，其感染马铃薯(solanumtuberosuml.)、菜豆(phaseolusvulgaris)、和番茄(lycopersiconesculentum)。作为依赖于群体感应调节系统的机会病原体的铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)是植物病原体并且是囊性纤维化患者和免疫妥协个体中发病率和死亡率的主要原因。4.然而，调节限制、公共卫生问题、和抗性发展严重限制了抗生素和其它试剂的长期使用前景(5)。5.因此，存在对于火疫病和其它衰弱性植物病害的有效试剂和管理的未满足的需求。技术实现要素：6.在一方面，本发明提供包含突变的磷酸三酯酶样内酯酶的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，其中在具有与seqidno:1为至少30％同一性的氨基酸序列中、对应于seqidno:1的位置59或172的氨基酸残基被置换，其中对应于g59的甘氨酸残基由选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸的氨基酸残基置换，或对应于h172的组氨酸残基由选自酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的氨基酸残基置换，并且所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶具有与野生型磷酸三酯酶样内酯酶为实质上相同的tim桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基。7.在另一方面，本发明提供包含如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的组合物。8.在额外的方面，本发明提供治疗或预防植物或其一部分、器官或植物繁殖材料中的细菌感染的方法，所述植物由分泌选自以下的内酯的细菌感染或易于受到分泌选自以下的内酯的细菌的感染：n-(3-羟基丁酰基)-l-高丝氨酸内酯(c4-hsl)、n-(3-氧代-己酰基)-高丝氨酸内酯(c6-氧代-hsl)、n-[(3s)-四氢-2-氧代-3-呋喃基]辛酰胺(c8-氧代-hsl)、和n-[(3s)-四氢-呋喃基]癸酰胺(c10-hsl)，所述方法包括对所述植物或其所述一部分、器官或植物繁殖材料施用具有与来自结核分枝杆菌(m.tuberclorosis)的野生型推定对硫磷水解酶(putativeparathionhydrolase,pph；seqidno:1)为至少30％同一性、具有与野生型推定对硫磷水解酶为实质上相同的tim桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基的磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，或者如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶或如上定义的组合物的任一种。[0009]还在额外的方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其包括编码如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的核酸序列。[0010]仍在额外的方面，本发明提供一种表达载体，其包括本发明的核酸分子，所述核酸分子可操作地连接至启动子。[0011]仍在另一方面，本发明提供一种细胞，其包括如上定义的分离的核酸分子或表达载体。[0012]还在另一方面，本发明涉及生产如上定义的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段的方法，所述方法包括：(i)培养上述公开的实施方案的任一者的细胞；和(ii)从所述细胞分离所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶，从而获得突变型磷酸三酯酶样内酯酶。[0013]在进一步的方面，本发明提供至少部分地由如上定义的组合物覆盖或涂布的植物或其一部分、器官或植物繁殖材料。附图说明[0014]图1a-b显示了来自结核分枝杆菌(m.tuberclorosis)的推定对硫磷水解酶(pph)的生物化学特征。pph在大肠杆菌-bl21(de3)中重组表达，接着是使用直链淀粉柱的纯化步骤并用c6-氧代-hsl(25℃下e0＝0.01μm)分析pph活性。使用ph指示剂甲酚紫、通过它们的羧酸产物的释放来监测c6-氧代-hsl的水解。(a)发现pph在一定温度范围内为活性的；用硫代丁酰丁内酯(tbbl)(6)(thiobutyrylbutyrolactone)测试活性。其最佳活性为40℃，并且其保持其活性的80％直至50℃。km值为0.056±0.009mm，10.16±0.01s-1，kcat/km为1.81*105s-1/m-1(b)。[0015]图2a-d显示了pph进化变体表现与c6-氧代hsl的增加的活性、增加的热稳定性和改善的保存期限。(a)由tbbl作为底物筛选pph的文库，接着是45℃下的细菌裂解物培养。将热培养后具有最高活性的变体用于大规模生产和纯化。变体携带以下突变：变体pph_r2:p4-d5中g58v和变体pph_r2:p8-d12中h171y，在pph_r2:p4-d5的情况中表现3.70*105s-1m-1的高催化活性kcat/km，其是野生型酶的2倍以上，pph_r2:8-d12的kcat/km为9.67*104s-1/m-1。(b)两种变体都具有增加的热稳定性，表现出它们的50％残余活性(residualactivity)增加了15度，并维持100％直至60℃。(c)自纯化后4天后，变体pph_r2:p4-d5维持其活性的100％，而野生型(wt)pph具有其活性的50％，此外，在37天后，wtpph丧失其活性的95％，而pph_r2:p4-d5丧失其活性的80％。(d)来自结核分枝杆菌的pph的解析结构(solvedstructure)，pdb编号为pdb4if2，显示进化变体的突变g58v(*)和h171y(**)的位置，它们远离活性位点。[0016]图3是显示野生型qq内酯酶(pph)降低解淀粉欧文氏菌中果聚糖(levan)的生产的能力的条形图。在生长于补充有蔗糖(缓冲液)的lb培养基中的解淀粉欧文氏菌(分离株(isolate)ea2tp0)培养物中光谱学地观察果聚糖生产，所述lb培养基在添加蔗糖3小时后添加或不添加1um的qq内酯酶。[0017]图4a-c描述了植物中解淀粉欧文氏菌感染的致病性检验。用由活性缓冲液(a)培养的、或用由纯化自结核分枝杆菌(7)的2μmpph培养的解淀粉欧文氏菌细胞悬液(b)培养的解淀粉欧文氏菌细胞悬液(108cfu/ml)接种梨果实。在28℃下培养7天后，非接种的对照在整个实验中保持无症状，在由纯化的pph培养后的接种的梨表现比对照(仅解淀粉欧文氏菌培养物和缓冲液)较少的症状。第一行中的十个梨用细菌和酶的活性缓冲液处理，第二行–用野生型pph的细菌，和第三行–用pph_r2:p4-d5(对应于g59v-pph)的细菌(c)。[0018]图5a-c描述了在用(107cfu/ml)解淀粉欧文氏菌感染后、在生长室中的健康(a；上图)和感染的(a；下图)梨花(pearflower)中的解淀粉欧文氏菌感染的致病性检验。简言之，将具有西洋梨(p.communis)‘spadona’的开放花朵的开花枝条(bloomingbranch)置于22℃的生长室中(白天12小时，夜晚12小时)。将含有4μm的wtpph及其进化突变体pph_r2:p4-d5(对应于g59v)的酶溶液喷涂在花上，2小时后，喷涂解淀粉欧文氏菌的细胞悬液(107cfu/ml)，或酶和培养物二者以1:1比混合30分钟然后喷涂。单独的解淀粉欧文氏菌培养物用作对照(阳性对照)。作为标准，我们使用4ppm恶喹酸，其为常规使用的抗生素。以三次重复、每次重复10个花簇(blossom)进行实验。感染后关闭室中的空调和灯光过夜，以保持湿度。在感染后3、7和12天评价火疫病症状，显示12天后的结果(lsd，p《0.05，n＝30)5b。图5c中，进化突变体pph_r2:p4-d5降低田间的火疫病症状，表现70％抑制。该抑制度与当今使用的抗生素恶喹酸(70％)类似。简言之，在不同的施用时间中、用进化突变体pph-g58v(4μm)喷涂西洋梨‘spadona’梨树的花簇；感染前30-45分钟、或与感染同时(通过在喷涂前将酶溶液与培养物混合物半小时)。在所有情况中，使用109cfu/ml解淀粉欧文氏菌细菌培养物。感染后，用塑料袋覆盖花簇过夜以确保高湿度。以5次重复、每次重复包括10枝花簇、树的每一侧5枝花簇进行实验。一棵树上不超过4次处理。根据通过计数各花簇中病花的13天接种后的评价来评价病害症状。在北部的胡拉谷果园实验农场(hulavalleyorchardsexperimentalfarm)(33°8'58.10"n35°37'16.93"e)中进行田间试验。[0019]图6显示了部分序列seqid编号1、2、3、10和50的比对。显示保守活性位点催化残基(白色字母)和pph中置换的两个残基(g59v和h172y)。[0020]图7a-b显示了梨果实中解淀粉欧文氏菌感染的致病性检验的结果。(a)感染的果实为未处理的(左)或仅由0.25mmcuso4处理(中间)、或由0.25mmcuso4和4μmpph-r2:p4-d5的组合处理(右)。(b)显示对照和处理的果实中感染直径测量值的概要的条形图。具体实施方式[0021]群体感应(qs)是存在于各种细菌中以感应它自己的群体密度并通过分泌例如n-酰基-高丝氨酸内酯(ahl)等小的、扩散性信号分子来同步毒力基因的表达的信号系统(8)。这些分子在qs依赖性病原体中、在引发毒力基因表达中起到重要作用，例如在腐败酶(rottingenzyme)(例如，聚半乳糖醛酸酶)或例如amylovoran等生物膜组分的生产中(9)。已提出通过群体感应淬灭(qq)酶干扰微生物qs系统用于病害控制的潜在策略，这是因为qq的目的在于停止病原细菌中的毒力表达而不是限制细胞生长，并且显示克服抗生素耐性的潜力(10)。[0022]来自结核分枝杆菌的磷酸三酯酶样内酯酶(本文中还称为来自结核分枝杆菌的推定对硫磷水解酶，pph)是群体感应淬灭酶(7)，其属于如上定义的具有tim桶状折叠和保守催化位点的磷酸三酯酶(pte)样内酯酶(7)。[0023]根据本发明发现，pph的序列中的某些突变使突变酶与对应的野生型酶相比具有增加的热稳定性。用作实例的特定变体是缺少融合至用作用于纯化酶的标签的麦芽糖结合蛋白(mbp)的第一n末端甲硫氨酸的野生型或突变蛋白(seqidnos:10-12)，并且发现与野生型结核分枝杆菌磷酸三酯酶样内酯酶相比，g58至缬氨酸的置换导致酶具有62℃下50％残余活性，和h171至酪氨酸的置换导致酶具有65℃下50％残余活性，同时保留或改善催化活性(图2a-b)。此外，g58至缬氨酸的置换导致酶具有与野生型酶相比为两倍以上的kcat/km。应注意，由于突变酶的非常高的本征催化活性(intrinsiccatalyticactivity)(参见表3)，它们保持高度活跃，即使在62-65℃的相对非常高的温度下具有50％残余活性(具有约1-2*105s-1m-1的kcat/km)。[0024]本文中公开的蛋白质或其片段中的某些氨基酸残基的位置是根据seqidno:1中描述的野生型结核分枝杆菌磷酸三酯酶样内酯酶的编号，并且参照氨基酸残基的单字母代码和其在野生型结核分枝杆菌磷酸三酯酶样内酯酶中的位置来表示。因此，例如，在对应于野生型结核分枝杆菌磷酸三酯酶样内酯酶的位置59的位置处的甘氨酸，本文中也称为g59，其在磷酸三酯酶样内酯酶片段或在不同大小的同源磷酸三酯酶样内酯酶中也称为g59，根据蛋白质化学领域公知的比对算法，例如(muscle(multiplesequencecomparisonbylog-expectation)或mafft(multiplealignmentusingfastfouriertransform)(参见，例如，图6)。[0025]为清楚起见，用于本文实施例2至4的融合蛋白的序列中的氨基酸残基的位置，g58和h171分别对应于分离的野生型全长蛋白质中的g59和h172。类似地，用于解析来自结核分枝杆菌的磷酸三酯酶样内酯酶的三维结构的功能性活性缺失突变体的序列缺少前四个n末端氨基酸残基(11)。因此，根据用于识别本发明的酶中氨基酸残基位置的系统，本文中表征的酶中位置55处的甘氨酸对应于g59。[0026]参照氨基酸残基的单字母代码来表示特定位置处的氨基酸残基由另一氨基酸残基的置换，其位置如上定义并且氨基酸残基的单字母代码代替原始氨基酸残基。因此，例如，g59由缬氨酸的置换表示为g59v。[0027]综上所述，在一方面，本发明提供包含突变的野生型磷酸三酯酶样内酯酶的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，其中，在具有与seqidno:1为至少30％同一性的氨基酸序列中、对应于seqidno:1的位置59或172的氨基酸残基被置换，其中，对应于g59的甘氨酸残基由选自缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、和异亮氨酸的氨基酸残基置换，或对应于h172的组氨酸残基由选自酪氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸的氨基酸残基置换，并且所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶具有与野生型磷酸三酯酶样内酯酶为实质上相同的tim桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基，即，所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶的活性位点与野生型磷酸三酯酶样内酯酶的催化残基为相同的。[0028]由本发明的核酸分子编码的蛋白质不限于本文中由特定氨基酸序列所限定的那些，但也可以是这些蛋白质的变体或具有与上述公开的那些为实质上相同的氨基酸序列。如本文所用的“实质上相同的”氨基酸序列是指如下的序列，其与参照序列相差一个以上的idno:2中记载的氨基酸序列组成。[0042]在某些实施方案中，对应于seqidno:1的h172的组氨酸残基由酪氨酸置换。在某些实施方案中，与seqidnos:16-110的任一者相比，这是突变型磷酸三酯酶样内酯酶的序列中的唯一置换，除了其它氨基酸残基的任选地保守置换或者n末端或c末端处的一个以上的氨基酸残基的任选缺失。在某些实施方案中，与seqidno:1相比，这是突变型磷酸三酯酶样内酯酶的序列中的唯一置换，除了其它氨基酸残基的保守置换。在某些实施方案中，与seqidno:1相比，这是突变型磷酸三酯酶样内酯酶的序列中的唯一置换，即不对氨基酸序列进行其它修饰，除了n末端或c末端处的一个以上的氨基酸残基的任选缺失。在某些实施方案中，突变型磷酸三酯酶样内酯酶包括seqidno:3中记载的氨基酸序列或基本上由seqidno:3中记载的氨基酸序列组成。[0043]出于实践目的，本发明的野生型或突变型磷酸三酯酶样内酯酶的任一者可作为融合蛋白提供，所述融合蛋白包含用于通过与含有配体的底物的特异性结合而将其从细胞提取物分离或用于改善溶解性的标签。例如，本发明的改进的磷酸三酯酶样内酯酶的任一者可作为在氨基末端处具有麦芽糖结合蛋白的融合蛋白提供。标签的其它实例包括几丁质结合蛋白(cbp)、链霉素标签(例如，显示对链霉亲和素的固有结合亲和性的选定的九氨基酸肽(awrhpqfgg))、谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、和多(his)标签。还可使用用于改善突变型磷酸三酯酶样内酯酶的溶解性的包括硫氧还蛋白(trx)和多(nanp)的标签。标签通过化学试剂或通过例如蛋白质水解或内含肽剪接等酶方法来任选地移除。[0044]可选地，磷酸三酯酶样内酯酶可作为含有促进其分泌至生长培养基的信号序列的融合蛋白来提供或编码。这是有用的，因为其消除了对破坏细胞的需求并且提供了通过收集生长培养基来简单地收获本发明的蛋白质。信号序列针对用于表达蛋白的宿主细胞类型而定制。freudl(14)教导了，细菌中存在两种主要输出途径，常规分泌或sec途径和双精氨酸转运(twin-argininetranslocation)或tat途径，用于运输蛋白质穿过细胞质膜。进入这些可选地蛋白质输出系统的一者的途径需要sec-或tat-特异性信号肽融合至期望的靶蛋白的氨基末端。[0045]简言之，本发明的磷酸三酯酶样内酯酶可作为含有sec或tat信号肽的融合蛋白提供。这些肽具有由带正电的n区、中央疏水性h区、和包含用于信号肽酶的识别位点(共有：a-x-a)的极性c区组成的类似的三部分整体结构。在tat信号肽中，包括两个高度保守的精氨酸残基的特征氨基酸共有基序存在于通常显著更长的n区和h区之间的边界处。此外，tat信号肽的h区通常比sec信号肽中和tat信号肽的c区中发现的那些的疏水性低，存在防止tat底物错误靶向sec途径的通常带正电的氨基酸(称为sec回避基序(avoidancemotif))。[0046]由于信号肽除了需要用于靶向和通过相应的蛋白移位酶而膜移位以外，还具有对相应的靶向蛋白的生物合成、折叠动力学、和稳定性的附加的影响，迄今为止无法预先预测哪种信号肽将在给定的靶蛋白和给定的细菌表达宿主的情况中表现最好。然而，发现用于期望的蛋白的最佳信号肽的方法是公知的并且描述于freudl(通过引用结合在此，如在本文中完全公开)。信号序列可在分泌过程中移除，或者可通过化学试剂或通过例如蛋白质水解或内含肽剪接等酶方法来任选地移除。[0047]在某些实施方案中，融合至标签的本发明的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的任一者可在其n末端或c末端缺少1至10个氨基酸残基(与野生型pph相比)，例如在n末端处缺少1-436、6-36、8-36、10-36、12-36、14-36、16-36、18-36、20-36、22-36、24-36、26-36、28-36、30-36、32-36、34-36、4-34、6-34、8-34、10-34、12-34、14-34、16-34、18-34、20-34、22-34、24-34、26-34、28-34、30-34、32-34、4-32、6-32、8-32、10-32、12-32、14-32、16-32、18-32、20-32、22-32、24-32、26-32、28-32、30-32、4-30、6-30、8-30、10-30、12-30、14-30、16-30、18-30、20-30、22-30、24-30、26-30、28-30、4-28、6-28、8-28、10-28、12-28、14-28、16-28、18-28、20-28、22-28、24-28、26-28、4-26、6-26、8-26、10-26、12-26、14-26、16-26、18-26、20-26、22-26、24-26、4-24、6-24、8-24、10-24、12-24、14-24、16-24、18-24、20-24、22-24、4-22、6-22、8-22、10-22、12-22、14-22、16-22、18-22、20-22、4-20、6-20、8-20、10-20、12-20、14-20、16-20、18-20、4-18、6-18、8-18、10-18、12-18、14-18、16-18、4-16、6-16、8-16、10-16、12-16、14-16、4-14、6-14、8-14、10-14、12-14、4-12、6-12、8-12、10-12、4-10、6-10、8-10、4-8、6-8、或4-6天。在某些实施方案中，上述实施方案的任一者的突变型磷酸三酯酶样内酯酶具有约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40天的保存期限。[0059]在某些实施方案中，在本发明的突变型磷酸三酯酶样内酯酶中，对应于seqidno:1的g59的甘氨酸残基由缬氨酸置换，或对应于seqidno:1的h172的组氨酸残基由酪氨酸置换；并且所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶与如上定义的非突变的野生型磷酸三酯酶样内酯酶相比，具有增加的热稳定性，或与如上定义的所述非突变型磷酸三酯酶样内酯酶相比，具有由n-(3-氧代-己酰基)-高丝氨酸内酯作为底物提供的实质上类似或更高的内酯酶催化活性。[0060]在某些实施方案中，突变型磷酸三酯酶样内酯酶包括seqidno:2、seqidno:3；seqidno:11或seqidno:12中记载的氨基酸序列或基本上由seqidno:2、seqidno:3；seqidno:11或seqidno:12中记载的氨基酸序列组成，表示为t50的所述增加的热稳定性为约55℃至约80℃，例如约65℃(或如上定义)，或所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶与如上定义的所述非突变型磷酸三酯酶样内酯酶相比具有延长的保存期限。[0061]在另一方法，本发明涉及包含上述公开的实施方案的任一者的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的组合物。[0062]在某些实施方案中，上述组合物的任一者还包含农业上可接受的表面活性剂，例如肥皂、高级醇硫酸盐、烷基磺酸盐、烷基芳基磺酸盐、季铵盐、聚亚烷基氧化物(polyalkyleneoxide)；涂布剂，例如黄原胶和滑石、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠和糊精；胶凝剂，例如海藻酸钠；湿润剂，例如x060-脂肪醇聚乙二醇醚和365antifoam-聚二甲基硅氧烷消泡乳液；非离子型表面活性剂消泡剂，例如365antifoam-聚二甲基硅氧烷消泡乳液；和/或稳定剂，例如甘油。组合物可还包含固体运载体(carrier)、液体运载体、乳化剂和分散剂等，其全部为本领域已知的。这些运载体的实例包括阿拉伯胶、酸性白土(terraabla)、膨润土、碳酸钙、二氧化碳、陶土(clay)、硅藻土、氟利昂、高岭土(kaolin)、硝化纤维素、和淀粉。[0063]在某些实施方案中，上述组合物的任一者配制成固体材料(例如粉末)或溶液的形式。[0064]在某些实施方案中，上述组合物的任一者还包含附加的抗微生物剂，例如金属，例如银或铜或其合金(黄铜、青铜、白铜(cupronickel)、铜-镍-锌)，金属离子盐，例如硫酸铜(cuso4)；用于植物农业的抗生素，例如硫酸链霉素、土霉素、恶喹酸和庆大霉素；或杀真菌剂，例如代森锰锌(mancozeb)、三环唑(tricyclazole)、多菌灵(carbendazim)、己唑醇(hexaconazole)、甲霜灵(metalaxyl)、苯菌灵(benomyl)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、丙环唑(propiconazole)、异稻瘟净(kitazin)、戊唑醇(tebuconazole)、氧氯化铜(copperoxychloride)、十三吗啉(tridemorph)、和丙森锌(propineb)。[0065]在某些实施方案中，上述组合物的任一者是还包含一种以上的生理学上可接受的运载体或赋形剂的药物组合物。运载体(一种以上)从与组合物的其它成分相容并且不对其接受者有害的意义上来说必须为“可接受的”。[0066]术语“运载体”是指和其施用活性剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂(vehicle)。药物组合物中的运载体可包括粘结剂，例如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone或povidone))、黄蓍胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，例如海藻酸、和玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，例如硬脂酸镁、或十二烷基硫酸钠；和助流剂，例如胶体二氧化硅。[0067]在其它方面，本发明提供治疗或预防由细菌感染或易于受到细菌感染的宿主中的细菌感染的方法，所述细菌通过群体感应调节系统导致疾病，其中所述细菌分泌选自以下的内酯：n-(3-羟基丁酰基)-l-高丝氨酸内酯(c4-hsl)、n-(3-氧代-己酰基)-高丝氨酸内酯(c6-氧代-hsl)、n-[(3s)-四氢-2-氧代-3-呋喃基]辛酰胺(c8-氧代-hsl)和n-[(3s)-四氢-呋喃基]癸酰胺(c10-hsl)，并且所述方法包括向所述宿主应用或施用具有与来自结核分枝杆菌的野生型推定对硫磷水解酶(pph；seqidno:1)为至少30％同一性、具有与野生型推定对硫磷水解酶为实质上相同的tim桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基的磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，或上述公开的实施方案的任一者的突变型磷酸三酯酶样内酯酶或上述定义的组合物的任一者。从afriat等,2006(7)已知来自结核分枝杆菌的推定对硫磷水解酶的底物特异性。[0068]分泌一种以上的上述提及的内酯的细菌的实例为：[0069]作为依赖于群体感应调节系统的革兰氏阴性机会病原体的铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)是植物病原体并且是囊性纤维化患者和免疫妥协个体中发病率和死亡率的主要原因，分泌c4-hsl和c12-氧代-hsl)(22)。[0070]荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)可发现于土壤和水中，并且是分泌c8-hsl的重要食物腐败菌(23)。其是人中不常见的病因，通常影响具有妥协的免疫系统的患者。[0071]解淀粉欧文氏菌(erwiniaamylovora)对蔷薇科作物导致火疫病并且产生和分泌n-酰基高丝氨酸内酯、n-(3-氧代-己酰基)-高丝氨酸内酯、和n-(3-羟基-己酰基)-高丝氨酸内酯(15)。[0072]胡萝卜软腐坚固杆菌(pectobacteriumcarotovorum)导致番茄中的细菌性茎腐病(stemrot)和果腐病(fruitrot)和马铃薯中的软腐病(softrot)，并且利用qs信号传递以控制致病因子的表达，例如细胞外酶和hrp(iii类分泌)系统，和碳青霉烯抗生素生产(16)(17)(18)(19)，这主要由3-氧代-c6和3-氧代-c8ahl控制(barnarda等,2007)。[0073]皱纹假单胞菌(pseudomonascorrugata)分泌c6-hsl群体感应信号(3-氧代-c6和3-氧代-c8ahl)以调节有助于毒力、抗微生物活性和适应性(fitness)的特征(4)。[0074]丁香假单胞菌(p.syringae)导致细菌性斑点病并且报道利用多重qs回路，对3-氧代-c6、3-氧代-c8和c8-ahl为特异性的(21)。[0075]越南伯克霍尔德氏菌(burkholderiavietnamiensis)产生多种ahl分子，主要的ahl为n-癸酰基高丝氨酸内酯(c10-hsl)，以及c8-hsl和n-己酰基高丝氨酸内酯(c6-hsl)(24)；洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderiacepacia)分泌n-辛酰基高丝氨酸内酯(c8-hsl)(25)；和泰国伯克霍尔德氏菌(burkholderiathailandensis)分泌n-氧代-癸酰基高丝氨酸内酯(c10-氧代-hsl)和n-氧代-辛酰基高丝氨酸内酯(c8-氧代-hsl)(26)。[0076]在某些实施方案中，宿主是植物，因此本发明提供治疗或预防植物或其一部分、器官、或植物繁殖材料中的细菌感染的方法，所述植物由分泌选自以下的内酯的细菌感染或易于受到分泌选自以下的内酯的细菌的感染：n-(3-羟基丁酰基)-l-高丝氨酸内酯(c4-hsl)、n-(3-氧代-己酰基)-高丝氨酸内酯(c6-氧代-hsl)、n-[(3s)-四氢-2-氧代-3-呋喃基]辛酰胺(c8-氧代-hsl)、和n-[(3s)-四氢-呋喃基]癸酰胺(c10-hsl)，所述方法包括对所述植物或其所述一部分、器官或植物繁殖材料施用具有与来自结核分枝杆菌的野生型推定对硫磷水解酶(pph；seqidno:1)为至少30％同一性、具有与野生型推定对硫磷水解酶为实质上相同的tim桶状折叠和在其活性位点中保留的催化残基的磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段，或上述公开的实施方案的任一者的突变型磷酸三酯酶样内酯酶或上述定义的组合物的任一者。[0077]因此，在某些实施方案中，细菌选自由以下组成的组：解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐坚固杆菌、丁香假单胞菌、皱纹假单胞菌、越南伯克霍尔德氏菌、洋葱伯克霍尔德氏菌、泰国伯克霍尔德氏菌和铜绿假单胞菌，包括任何致病变种。在某些实施方案中，细菌是选自解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐坚固杆菌和丁香假单胞菌的分泌c6-氧代-hsl的细菌。[0078]在某些实施方案中，细菌是解淀粉欧文氏菌，由其导致的植物病害是对例如仁果树(pomefruittree)如苹果和梨等蔷薇科作物的火疫病。[0079]在某些实施方案中，细菌是胡萝卜软腐坚固杆菌，由其导致的植物病害是对例如胡萝卜、马铃薯、番茄、绿叶蔬菜(leafygreen)、南瓜和其它葫芦科(cucurbits)、洋葱、青椒、和非洲堇(africanviolet)等植物的细菌性软腐病，和特别地甜菜脉管坏死(beetvascularnecrosis)和马铃薯的黑胫病(blackleg)以及对许多不同树种的粘液流溢(slimeflux)。[0080]在某些实施方案中，细菌为丁香假单胞菌并且其导致的植物病害是细菌性斑点病。特别地，丁香假单胞菌可为番茄假单胞菌(pseudomonastomato)(原名为丁香假单胞菌番茄致病变种(pseudomonassyringaepv.tomato))和使番茄有细菌性斑点病。[0081]在某些实施方案中，宿主为哺乳动物，例如囊性纤维化患者和免疫妥协个体，细菌为铜绿假单胞菌或荧光假单胞菌。[0082]在某些实施方案中，如上述实施方案的任一者中所定义的来自结核分枝杆菌的推定对硫磷水解酶或其组合物、和包含例如cuso4等铜盐的另外的组合物可分别地施用至所述植物、所述植物的一部分、器官或植物繁殖材料。两种组合物可伴随地或依次地施用。[0083]在某些实施方案中，治疗或预防上述公开的实施方案的任一者中的细菌感染的方法包括施用上述实施方案的任一者的突变型磷酸三酯酶样内酯酶。[0084]在某些实施方案中，治疗或预防上述公开的实施方案的任一者中的细菌感染的方法包括施用突变型磷酸三酯酶样内酯酶，其中seqidno:1的g59由缬氨酸置换，例如包含seqidno:2或seqidno:11中记载的氨基酸序列或基本上由seqidno:2或seqidno:11中记载的氨基酸序列组成的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或如上述实施方案的任一者中所定义的；或磷酸三酯酶样内酯酶，其中seqidno:1的h172由酪氨酸置换，例如包含seqidno:3或seqidno:12中记载的氨基酸序列或基本上由seqidno:3或seqidno:12中记载的氨基酸序列组成的突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或如上述实施方案的任一者中所定义的。[0085]还在额外的方面，本发明提供包含编码上述公开的实施方案的任一者的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的核酸序列的分离的核酸分子。[0086]在某些实施方案中，分离的核酸分子编码包含标签的融合蛋白，所述标签用于通过与含配体的底物特异性结合而从细胞提取物分离融合蛋白。例如，编码本发明的野生型或改进的突变型磷酸三酯酶样内酯酶的任一者的核酸序列可融合至编码麦芽糖结合蛋白的序列，(例如，如seqidnos:13-15的任一者中记载的或其可编码类似地融合至这样的标签的表2中seqidnos:16-110的任何序列)。可选地，核酸序列编码包含如上所述的促进其分泌至生长介质的信号序列的本发明的磷酸三酯酶样内酯酶的任一者。[0087]在某些实施方案中，核酸序列是编码如seqidnos:4(野生型)、seqidno:5(g59v)、seqidno:6(h172y)、或seqidno:10(与mbp的野生型融合体)中记载的野生型或突变酶的原始未修饰的dna序列。[0088]在某些实施方案中，优化核酸序列用于在大肠杆菌中表达以增加其表达水平。例如，核酸序列可通过改变其密码子以匹配大肠杆菌中最普遍的trna来优化(参见，例如，puigbò等人,nucleicacidsresearch,2007,vol.35)。在某些实施方案中，野生型酶的优化序列记载于seqidno:7。[0089]在某些实施方案中，(密码子优化的)核酸序列为如seqidno:8[g59v]或seqidno:9[h172y]中所记载的、或如seqidnos:14和15中所记载的其mbp-融合蛋白。[0090]仍在额外的方面，本发明提供包含可操作地连接至启动子的上述公开的实施方案的任一者的核酸分子的表达载体。[0091]编码核酸序列“可操作地连接”至调节序列(例如，启动子)，只要调节序列可以对连接至其的编码序列赋予调节效果即可。[0092]如本文所用，术语“启动子”是指位于基因的转录起始位点的上游的dna区域，rna聚合酶结合至其以起始rna的转录。启动子控制基因表达的起始。[0093]根据本发明的一些实施方案，启动子与分离的多核苷酸和/或与宿主细胞为异源的。[0094]任何合适的启动子序列可由本发明的核酸构建体来使用。其可为组成型或诱导型。[0095]在仍另一方面，本发明提供包含和/或表达上述公开的实施方案的任一者的分离的核酸分子或上述定义的表达载体的细胞。[0096]在某些实施方案中，细胞选自细菌、真菌、哺乳动物或植物细胞，优选细菌细胞和特别地大肠杆菌。[0097]在仍另一方面，本发明涉及产生突变型磷酸三酯酶样内酯酶、或其功能性片段的方法，所述方法包括：(i)培养上述公开的实施方案的任一者的细胞；和(ii)从所述细胞分离所述突变型磷酸三酯酶样内酯酶，从而获得突变型磷酸三酯酶样内酯酶。[0098]在某些实施方案中，细胞选自细菌、真菌、哺乳动物或植物细胞，优选细菌细胞和特别地大肠杆菌。[0099]用于生长细菌细胞和用于从细胞收获分泌的蛋白质的方法是本领域已知的(choi,j.h.,和lee,s.y.,2004)。作为非限定性实例，大肠杆菌细胞可在合适的生长培养基中生长，例如含有葡萄糖的溶菌肉汤(lysogenybroth，lb)培养基。然后，收获细菌并在合适的裂解缓冲液中裂解，并例如通过超声波来破坏。可选地，由促进蛋白质分泌至生长培养基的信号序列标记蛋白，这免去了裂解细胞的步骤。然后，从澄清生长培养基或裂解物分离并纯化分泌的或释放的蛋白。在出于促进分离的目的而标记感兴趣的蛋白的情况中，在特异性结合标签的柱上纯化，洗涤并洗脱。例如，将包括含有感兴趣的蛋白和麦芽糖结合蛋白的重组蛋白的澄清裂解物加载至直链淀粉柱。然后，用麦芽糖补充的柱缓冲液洗脱重组蛋白。收集含有蛋白的洗脱部分，浓缩并使用尺寸排阻柱任选地分级。产生突变酶的方法的非限定性实例发现于下文的实施例中。[0100]在某些实施方案中，磷酸三酯酶样内酯酶还包含标签，例如麦芽糖结合蛋白(mbp)(例如，如seqidnos:10-12的任一者中记载的，或类似地融合至这样的标签的表2中seqidnos:16-110的任何序列。可选地，本发明的磷酸三酯酶样内酯酶可作为融合蛋白提供或编码，所述融合蛋白包含如上所述的促进其分泌至生长培养基的信号序列。[0101]此外，内酯酶和磷酸三酯酶催化活性可针对它们各自的底物进行试验，例如，根据本发明的实验部分中公开的方法。[0102]在另一方面，本发明提供植物或其一部分、器官或植物繁殖材料至少部分地由上述公开的实施方案的任一者的组合物覆盖或涂布。[0103]在某些实施方案中，植物选自蔷薇科作物，例如苹果和梨树；胡萝卜；马铃薯；番茄；绿叶蔬菜；南瓜和其它葫芦科；洋葱；青椒；苦苣苔科(gesneriacea)，例如非洲堇；甜菜(beet)；和马铃薯。[0104]如本文所用的术语“治疗”是指获得期望的生理学效果的方法。所述效果在部分地或完全地治愈疾病和/或归因于疾病的症状方面可为治疗的。所述术语是指抑制疾病，即阻止其发展；减轻疾病，即导致疾病的退化；或通过防止或限制感染而保护植物或其一部分、器官或植物繁殖材料免于病害。如本文所用的术语进一步是指降低细菌毒力，如例如在降低的胞外多糖(eps)基质或有助于eps的形成的果聚糖中所表现的(参见图3)。[0105]术语“预防”可在本文中与术语“保护”或“预防性处理”交换使用并且是指在可识别的微生物感染前，向易受感染的哺乳动物、植物或其一部分、器官或植物繁殖材料施用本发明的组合物。[0106]与未进行本预防方法的的种子、果实、花簇或花相比，通过施用组合物而预防对例如种子、果实、花簇或花的感染的方法可导致后续减少的感染，并且所述术语不应被理解为必需导致微生物感染或微生物存在的完全缺失，因为所述处理既不杀死细菌也不抑制细胞生长。本发明的预防方法的效果可观察为：例如在可识别的感染前已对种子进行预防微生物感染的方法的情况中，其后续种植产生的植物与源自未进行本方法的种子的植物相比，具有更高的茎长度和枝叶(foliage)质量。与非处理的种子相比，植物生物质产量的差异是后续发展的且尽管进行预防处理的预处理的种子中缺少感染、或降低的感染水平的结果。花、完整的花簇和果实可通过施用本发明的组合物来类似地预处理，这导致保留了花、花簇和果实完整性(参见图4a-c)，由此增加产量。另一实例可为，使用本发明的方法用于预防生长在感染的植物附近(来自相同的田地或来自不同的田地)的植物或籽苗中的微生物的感染的方法。在传染物(infectiveagent)从感染植物或田地传播至初始未感染的植物或田地时，与未进行本方法的植物或籽苗相比，预防性处理将保护植物并由此导致更高产量。[0107]本发明的方法包括将本文所定义的组合物直接施用至植物或其一部分、器官或植物繁殖材料，或组合物可以以例如颗粒、粉剂(dust)、可乳化浓缩剂、可湿性粉末(wettablepowder)、糊剂、水基流动剂、干式流动剂、油剂、气溶胶、雾(fog)或与合适的固体运载体、液体运载体的熏剂(fumigant)、乳化剂或分散剂等的制剂向其施用，如上所述。[0108]在某些实施方案中，上述组合物或制剂的任一者可通过喷涂、浸泡、敷料(dressing)、涂布、造粒、或浸渍施用至植物或其一部分、器官或植物繁殖材料。[0109]在某些实施方案中，本发明的方法用于对例如种子、根、果实、块茎、球茎、地下茎、或植物的一部分等繁殖材料治疗或预防如上定义的细菌的感染，其中所述组合物在检测感染之前或之后通过喷涂、浸泡、敷料、涂布、造粒、或浸渍施用至繁殖材料。[0110]在某些实施方案中，植物繁殖材料是种子或果实。[0111]在某些实施方案中，植物的一部分是叶、枝、花、花簇、花序、或茎。[0112]术语“来自结核分枝杆菌的磷酸三酯酶样内酯酶”在本文中可与术语“来自结核分枝杆菌的推定对硫磷水解酶(pph)”和群体感应淬灭(qq)pph可交换地使用。[0113]当涉及氨基酸或核酸序列时，转折短语“由……基本上组成”或“基本上由……组成”是指包括列出的序列并且对于存在或不存在未列出的序列开放的序列，所述未列出的序列实质上不影响蛋白质其自身或由核酸序列编码的蛋白质的基本的和新的性质。[0114]当关于测定50％残余活性的温度时，术语“实质上高于”是指比参照高至少5℃的差异。[0115]术语“显著高于”是指统计学上显著的差异，如由例如具有α＝0.05的学生t检验所测试的。[0116]如本文所用的术语“约”意味着还包括10％高于或低于所提供的值的值。然而，未由术语“约”前缀的数值在所有情况中应理解为由该术语修饰的。因此，除非另外指出为相反的，本说明书和所附权利要求中所记载的数值参数为近似值，取决于本发明所寻求获得的期望的性质，其可变化多至加或减10％。[0117][0118][0119][0120][0121][0122][0123]0.3mm甲酚紫作为ph指示剂(577nm，1550-2500od/m，1％dmso)。对于不存在酶的自发水解的背景速率校正起始速率(v0)。通过用graphpad将初始速率直接拟合至米氏方程(michaelis-mentenequation)[v0＝kcat[e]0[s]0/([s]0+km)]来获得动力学参数。从至少三个独立测定获得有关数据的标准偏差的误差范围。[0134]文库构建和筛选[0135]使用调整以产生每基因平均2个非同义突变的genemorphii随机突变试剂盒(randommutagenesiskit)(agilent)构建来自pph基因的基因文库。诱变pcr后，将文库克隆回修饰的pmal载体，如对于pmal-c4x所描述的。将克隆的文库转化至bl21细胞并铺板在补充有100μg/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的lb板上。在每轮筛选中，挑选约600个随机选择的单一菌落并在含有500μl的补充有100μg/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的lb的96深孔板中、在37℃、振荡下生长过夜。过夜培养物用于接种(以1:20稀释)96深孔板中新鲜的500μl的补充有200μg/ml氨苄青霉素的lb。在30℃、振荡下生长细胞约4小时，至od600＝0.6-1.0，然后添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)(终浓度0.4mm)以诱导磷酸三酯酶样内酯酶变体的表达。在20℃下过夜培养后，使细胞沉淀并冷冻在-80℃。将细胞悬浮于裂解缓冲液(100mmtrisph8、100μmmncl2、150mmnacl、100μg/ml溶菌酶、0.5单位/mlbenzonase、0.1％tritonx-100、1:500蛋白酶抑制剂混合物(sigmap8849)，在25℃下在960rpm下振荡1小时)。通过离心来澄清裂解物，在45℃下培养，冷却至室温，在活性缓冲液中稀释，并对于tbbl和0.5mm5,5’‑二硫双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)一起作为指示剂的水解进行检验。在每轮中，选择具有顶端活性(topactivity)的变体以作为用于下一轮的亲代，在下一轮中使用genemorphii试剂盒对它们的基因改组并突变。[0136]wtpph及其进化变体的热稳定性和保存期限[0137]通过在范围在4-70℃之间的温度下预培养酶变体1小时来测试热稳定性，设定为0.5μm，和tbbl(6)为0.2mm。然后，根据室温下的内酯酶活性来测定残余活性。对于保存期限测定，在纯化并在室温下保存酶溶液18天后，由0.1mmtbbl测定wtpph和进化变体(0.5μm酶浓度下)二者的内酯酶活性。[0138]实施例1.利用c6-氧代-hsl的酶的重组表达、纯化和生物化学特征[0139]将来自结核分枝杆菌的pph及其进化变体的编码基因克隆至表达载体pmal-c4x，并作为与高结合突变体(a313v)麦芽糖结合蛋白的融合蛋白在大肠杆菌-bl21(de3)中过表达(seqidno:10)。然后，裂解细胞并使用直链淀粉柱(neb)纯化蛋白。纯化后，我们用显色底物(tbbl，硫代丁酰丁内酯)测试了酶的最佳温度、它们的热稳定性和保存期限。如前所述(7)，使用ph指示剂检验，它们的与作为由植物病原体解淀粉欧文氏菌分泌的内酯的c6-氧代-hsl(又称为n-己酰基-l-高丝氨酸内酯，n-[(3s)-四氢-2-氧代-3-呋喃基]己酰胺，hhl)的活性，参见图1b和2a；pph表现与c6-氧代-hsl的高活性，kcat/km值为1.24*105s-1/m-1(参见表3)。其最佳温度为40℃(图1a)并且在热稳定性方面，其表现55℃下的50％残余活性，参见图2b。[0140]实施例2.构建随机基因文库和分离具有更高活性、热稳定性和保存期限的改进的变体[0141]使用genemorph随机突变试剂盒(agilent)，将pph编码基因用于构建基因文库。pcr扩增后，将所得pcr产物用作用于具有外引物的巢式pcr的模板，接着用ecori和psti消化并连接至pmal-c2x，文库质粒经电穿孔至大肠杆菌dh5α，估计文库大小为5000，并分离质粒dna。对未选择的文库的单个克隆进行测序并识别每基因平均2-3个点突变。使用几轮的产生随机突变(3-4*105个变体的文库大小)和筛选(600个变体每轮)用于增加的热稳定性，我们分离了具有独特序列的两个变体，参见图2：变体具有以下突变：变体pph_r2:p4-d5中的g58v[g59v；seqidno:11]和变体pph_r2:p8-d12中的h171y[h172y；seqidno:12]，表现与野生型酶处于相同数量级105s-1m-1的高催化活性kcat/km，表3，对于pph_r2:p4-d5，kcat/km增加2倍，参见表3和图2a。此外，它们具有增加的热稳定性，表现出在它们50％残余活性中约15度的增加，并且维持100％的它们的活性直至60℃(图2b)。我们进一步分析了进化变体与wtpph相比的保存期限，如图2c中可以看到的，在纯化后13天后，变体pph_r2:p4-d5具有约50％残余活性，而wtpph具有其活性的20％。这使得它们更合适在农业中用作抗细菌处理。[0142][0143]实施例3.野生型qqpph内酯酶在培养中抑制胞外多糖形成[0144]根据先前描述的方案(molina等人,2005)，作为在胞外多糖(eps)基质的形成中表现的细菌毒力的量度，在补充500mm蔗糖后、在400nm下光谱学地观察果聚糖生产。[0145]在将纯化的野生型pph蛋白施加至解淀粉欧文氏菌的细胞培养物时，观察到eps生产中30％的降低(图3)。预期g59v和h172y突变体至少在降低eps生产中为有效的。[0146]实施例4.用pph突变体的火疫病的治疗[0147]为了评价qq内酯酶在梨中抑制火疫病的能力，我们根据先前描述的方案(28)(29)、用野生型pph酶在植物中进行致病性检验。用解淀粉欧文氏菌接种受伤的未成熟的梨果实，然后监测症状发展。对梨进行三种处理；单独的细菌培养物，细菌培养物和纯化的野生型或突变pph酶，1:1比的细菌培养物和酶活性缓冲液，接着在20℃、300rpm下培养1小时。为此，用70％乙醇对未成熟的梨(西洋梨，‘safadona’)进行表面杀菌，通过单独的细菌培养物、细菌培养物和内酯酶缓冲液作为对照和用酶培养的细菌，用无菌针刺破，在28℃的湿润室中培养。接种后2、4、6和7天记录症状。在28℃下培养7天后，测定病害症状。非接种对照在整个实验中保持无症状。各处理由10个梨组成，随着时间推移，在三个独立试验中重复实验。如图4a-c中可以看到的，由细菌-酶(来自结核分枝杆菌的pph)溶液刺破的梨中的火疫病病灶不如对照黑和扩散，并且pph_r2:p4-d5突变体(seqidno:11)(图4c，从顶部起第3行)在控制感染方面比野生型酶(seqidno:10)(图4c从顶部起第2行)更有效。[0148]与上述对于野生型pph和g59vpph所描述的类似地试验携带例如h172y等h172处的突变的突变型磷酸三酯酶样内酯酶(由seqidno:3或12中记载的氨基酸序列组成)、或具有对应于seqidno:1中g59v或h172y的氨基酸残基的置换的、任选地作为mbp-融合蛋白表达的seqidnos:16-110的pll的任一者在治疗或预防火疫病中的功效。预期这些突变在降低和抑制火疫病方面比野生型突变体具有更高的功效。[0149]实施例5.生长室和田地中用pph及其突变体对花簇的火疫病的治疗[0150]方法.将具有西洋梨，‘spadona’的开花的花簇条置于22℃的生长室中(白天12h，夜晚12h)。将含有4μm的wtpph和其进化突变体的酶溶液喷涂在花上，2小时后，将解淀粉欧文氏菌的细胞悬液(107cfu/ml)喷涂在花上(预感染)，或将酶和培养物以1:1比混合半小时然后喷涂(混合)。单独的解淀粉欧文氏菌培养物用作对照。以三次重复、各重复使用10枝花簇进行实验。感染后关闭室中的空调和灯光2h，以避免室中的干燥和温度升高。[0151]对于田间实验，用不同酶溶液；wtpph和进化突变体pph-g58v(4μm)喷涂西洋梨‘spadona’梨树的花簇。试验了不同的施用时间；感染前30-45分钟或与感染同时(通过在喷涂前将酶溶液与培养物混合半小时)。在所有情况中，使用109cfu/ml的解淀粉欧文氏菌细菌培养物。感染后，用塑料袋覆盖花簇过夜以确保高湿度。以五次重复、各重复包括10枝花簇、树的每一侧上5枝花簇来进行实验。一棵树上不超过4次处理。根据通过计数各花簇中的病花的接种后13天的评价和通过计数感染花簇的接种后24天的评价来评价病害症状。在西洋梨costia梨中进行类似的实验；以相同方法在感染后12和35天进行病害评价。2019、2020连续两年在北部的胡拉谷果园实验农场(33°8'58.10"n35°37'16.93"e)中进行田间试验。显示通过计数感染花簇的西洋梨‘spadona’梨树接种后24天的数据。[0152]结果.我们试验了pph野生型和进化突变体在生长室中抑制花簇致病性的能力。如图5a-b所示，感染后6天，当在由病原体感染前施用时，4μm的wtpph和pph-g58v二者相对于未处理的对照，抑制花感染30％；恶喹酸抑制45％。当酶和细菌混合在一起然后喷涂在花簇上时，处理仍为有效的(20％抑制)，但感染迹象增加。[0153]在田间，观察到突变体的预培养物比混合处理具有明显优势，pph-g58v的接近70％的抑制，具有当今使用的抗生素恶喹酸的类似的抑制范围，图5c。[0154]与上述对于野生型pph和g59vpph所描述的类似地试验携带例如h172y等h172处的突变的突变型磷酸三酯酶样内酯酶(由seqidno:3或12中记载的氨基酸序列组成)、或具有对应于seqidno:1中g59v或h172y的氨基酸残基的置换的、任选地作为mbp-融合蛋白表达的seqidnos:16-110的pll的任一者在治疗或预防火疫病中的功效。预期这些突变在降低和抑制火疫病方面比野生型突变体具有更高的功效。[0155]实施例6.由pph突变体和铜盐的组合的火疫病的治疗[0156]铜已知作为用于抑制解淀粉欧文氏菌感染的保护剂(以0.19g/l的浓度。[0157]进行本初步实验以检查使用较低剂量的cu2+和pph_r2:p4-d5(pph-g58v)以实现叠加效果的可能性。将来自两个分离株(称为511和576)的解淀粉欧文氏菌的单一菌落的混合物在lb培养基(10ml)中培养过夜，隔4小时更换，并且将各分离株归一化为od6000.5。在室温下将培养物悬浮液与以下混合30分钟：(i)0.25μmcuso4，(ii)4μmpph_r2:p4-d5和0.25μmcuso4。未处理的培养物悬浮液用作对照。[0158]用1％hcl对未成熟的梨进行灭菌几秒，接着用h2o洗涤，并用浸泡在不同混合物中的无菌针刺破。将处理的果实在25℃的湿润室中培养。9天后测定病害症状直径。以3次重复、各重复包含3-6个未成熟的梨进行各处理。[0159]初始数据表明，使用0.25mmcuso4在未成熟的梨中显著抑制解淀粉欧文氏菌的感染程度，并且将4μmpph_r2:p4-d5添加至0.25mmcuso4溶液产生比仅cuso4更好的效果。thephosphotriesterasefromm.tuberculosis,anothermemberofphosphotriesterase-likelactonasefamily.biochem.biophys.res.commun.[0174]12.wierengark.2001.thetim-barrelfold:aversatileframeworkforefficientenzymes[0175]13.pieperu,webbbm,barkandt,schneidman-duhovnyd,schlessingera,etal.2011.modbase,adatabaseofannotatedcomparativeproteinstructuremodels,andassociatedresources.nucleicacidsres.[0176]14.freudlr.2018.signalpeptidesforrecombinantproteinsecretioninbacterialexpressionsystems[0177]15.venturiv,venutic,devescovig,lucchesec,friscinaa,etal.2004.theplantpathogenerwiniaamylovoraproducesacyl-homoserinelactonesignalmoleculesinvitroandinplanta.femsmicrobiol.lett.241(2):179–83[0178]16.crépina,barbeyc,beury-ciroua,héliasv,taupinl,etal.2012.quorumsensingsignalingmoleculesproducedbyreferenceandemergingsoft-rotbacteria(dickeyaandpectobacteriumspp.).plosone[0179]17.crépina,beury-ciroua,barbeyc,farmerc,héliasv,etal.2012.n-acylhomoserinelactonesindiversepectobacteriumanddickeyaplantpathogens:diversity,abundance,andinvolvementinvirulence.sensors[0180]18.bhatka,masoodsd,bhatna,bhatma,razvism,etal.2010.currentstatusofpostharvestsoftrotinvegetables:areview.asianj.plantsci.[0181]19.lohj,piersonea,piersonls,staceyg,chatterjeea.2002.quorumsensinginplant-associatedbacteria[0182]20.barnardaml,salmondgpc.2007.quorumsensinginerwiniaspecies.anal.bioanal.chem.387(2):415–23[0183]21.ladeh,pauld,kweonjh.2014.n-acylhomoserinelactone-mediatedquorumsensingwithspecialreferencetouseofquorumquenchingbacteriainmembranebiofoulingcontrol.biomedres.int.[0184]22.schusterm,greenbergep.2006.anetworkofnetworks:quorum-sensinggeneregulationinpseudomonasaeruginosa[0185]23.lit,wangd,liun,may,dingt,etal.2018.inhibitionofquorumsensing-controlledvirulencefactorsandbiofilmformationinpseudomonasfluorescensbycinnamaldehyde.int.j.foodmicrobiol.[0186]24.conwayba,greenbergep.2002.quorum-sensingsignalsandquorum-sensinggenesinburkholderiavietnamiensis.j.bacteriol.[0187]25.venturiv,friscinaa,bertanii,devescovig,aguilarc.2004.quorumsensingintheburkholderiacepaciacomplex[0188]26.duerkopba,vargaj,chandlerjr,petersonsb,hermanjp,etal.2009.quorum-sensingcontrolofantibioticsynthesisinburkholderiathailandensis.j.bacteriol.[0189]27.choijh,leesy.2004.secretoryandextracellularproductionofrecombinantproteinsusingescherichiacoli[0190]28.molinal,rezzonicof,défagog,duffyb.2005.autoinductioninerwiniaamylovora:evidenceofanacyl-homoserinelactonesignalinthefireblightpathogen.j.bacteriol.187(9):3206–13[0191]29.zhaoy,blumerse,sundingw.2005.identificationoferwiniaamylovoragenesinducedduringinfectionofimmaturepeartissue.j.bacteriol.当前第1页12当前第1页12