慢病毒载体产生方法及构建体与流程

慢病毒载体产生方法及构建体
发明领域
1.本发明涉及慢病毒载体产生细胞的产生方法。具体地说，所述方法利用两种质粒(而非四种)向细胞提供所需包装元件和转移载体，从而产生大量的慢病毒产生细胞(包括悬浮细胞)，并产生大量的慢病毒。这些方法可产生细胞，随后，可诱导这些细胞产生慢病毒，并通过剪裁包含特异性目标基因。


背景技术：

2.在基因和细胞治疗领域，慢病毒载体是最常用的一种输送方法。在慢病毒载体产生过程中，将载体产生所需的序列分为几种不同的质粒或表达盒，以尽量降低产生复制型慢病毒(rcl)的可能性。一般而言，第三代慢病毒产生系统利用四种不同的质粒或表达盒，它们分别表达：
3.1)慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)蛋白；
4.2)包膜蛋白(通常为水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)；
5.3)hiv病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)蛋白；以及
6.4)包含目标基因(goi)的转移载体(tv)。
7.在最常用的方法中，将上述四种质粒瞬时转染到细胞中，以产生慢病毒载体，这非常耗费人力，且成本高昂。此外，瞬时转染在可扩展性方面存在局限性，因为将需要大量的质粒dna，这也会引起安全问题。
8.为了克服与瞬时转染相关的困难，需要制定一种产生细胞系(pcl)制备方法，在这种方法中，将慢病毒载体产生所需的所有或大多数基因或序列稳定整合到哺乳动物细胞的染色体中，以通过简单的诱导方法产生慢病毒载体。本发明则满足这些需求。


技术实现要素：

9.在某些实施例中，本文提供了一种含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞的产生方法，包括：使用以下组分转染哺乳动物细胞：一个包装载体，其包含一个表达盒，能够对以下组分进行编码：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因，其中，所述表达盒在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)；培养转染哺乳动物细胞；以及分离含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞。
10.本文还提供了一种慢病毒载体产生哺乳动物细胞的产生方法，包括：使用以下组分转染哺乳动物细胞：一个包装载体，其包含一个表达盒，能够对以下组分进行编码：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因，其中，所述表达盒在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)；以及一个转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列，
其中，所述核酸序列在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)；培养转染哺乳动物细胞；以及分离慢病毒载体产生哺乳动物细胞。
11.在其他实施例中，本文提供了一种慢病毒载体产生方法，包括：根据本文所述的方法产生含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞；使用转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列)转染哺乳动物细胞；诱导产生表达盒和核酸；培养转染哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
12.本文还提供了一种慢病毒载体产生方法，包括：根据本文所述的方法产生慢病毒载体产生哺乳动物细胞；诱导产生表达盒和核酸；培养转染哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
13.在其他实施例中，本文提供了一种慢病毒载体治疗方法，包括：向哺乳动物受试者施用根据本文所述的方法产生的慢病毒载体。
14.在其他实施例中，本文提供了一种慢病毒载体产生哺乳动物细胞，包含：通过染色体整合到哺乳动物细胞中的核酸分子，所述核酸分子包含：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因，其中，所述核酸序列在5’端和3’端侧接有因转座子特异性反向末端重复序列(itr)重组而产生的序列。
15.本文还提供了一种慢病毒载体产生方法，包括：使用转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列)转染本文所述的哺乳动物细胞；诱导产生表达盒和核酸；培养转染哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
16.在其他实施例中，本发明提供了一种慢病毒载体产生方法，包括：诱导产生染色体整合核酸序列以及对本发明所述哺乳动物细胞目标基因进行编码的染色体整合核酸序列；培养哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
附图说明
17.图1显示了本发明实施例所述的一种包装质粒。
18.图2显示了本发明实施例所述的一种转移载体。
19.图3a-3d显示了本发明实施例所述的hek293t细胞(使用包装载体和转移载体转染)。
20.图4显示了使用本文所述的示例性细胞系产生慢病毒载体的情况。
21.图5显示了使用或不使用转座酶时pei和lipofectamine转染的慢病毒滴度。
22.图6显示了单细胞克隆体dh4的慢病毒生产力和稳定性。
23.图7显示了单细胞克隆体ed8的慢病毒生产力和稳定性。
24.图8显示了拷贝数分析结果。
25.图9显示了利用瞬时转染和产生细胞系产生的慢病毒的效力比较情况。
26.图10显示了在部分种系培养期间不使用抗生素的示例性慢病毒pcl生产流程。
具体实施方式
27.当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包括(comprising)”使用时，单词“一个(a)”或“一个(an)”是指“一个(one)”，但是，也与“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或不
止一个”的含义一致。
28.在本技术中，术语“约”用于表示一个数值包括为确定此数值而使用的方法/装置的固有误差变化。此术语通常是指可变性近似或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(取决于具体情况)。
29.除非明确表示仅指替代选择或所述替代选择互斥，否则，在权利要求书中使用术语“或”是指“和/或”，但本发明支持仅指替代选择以及“和/或”的定义。
30.在本说明书和权利要求书中，单词“包括(comprising)”(及其任何形式，如“包括(comprise)”和“包括(comprises)”)、“具有”(及其任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包含(including)”(及其任何形式，如“包含(includes)”和“包含(include)”)或“包含(containing)”(及其任何形式，如“包含(contains)”和“包含(contain)”)具有包含性或开放性，且不排除其他未列举的元素或方法步骤。对于本发明所述的任何方法、系统、宿主细胞、表达载体和/或合成物，预计可实现本说明书中所讨论的任何实施例。此外，本发明所述的合成物、系统、细胞和/或核酸可用于实现本文所述的任何方法。
31.在本文中，“核酸”、“核酸分子”或“寡核苷酸”是指一种包含共价连接核苷酸的聚合化合物。术语“核酸”包括多聚核糖核酸(rna)和多聚脱氧核糖核酸(dna)，两者均可采用单链或双链形式。dna包括但不限于互补dna(cdna)、基因组dna、质粒或载体dna以及合成dna。rna包括但不限于mrna、trna、rrna、snrna、microrna、mirna或mirna。
32.在本文中，“基因”是指对多肽进行编码的核苷酸组合体，包括cdna和基因组dna核酸分子。“基因”也指核酸片段，可用作编码序列前(5’非编码序列)后(3’非编码序列)的调控序列。在某些实施例中，将基因与多个拷贝整合。在某些实施例中，按预定义拷贝数整合基因。
33.慢病毒载体及其产生
34.慢病毒载体是一种基于人类免疫缺陷病毒(hiv-1)的载体系统，已得到充分研究。其他慢病毒系统还被开发用作基因转移系统，包括hiv-2猿猴免疫缺陷病毒、非灵长类慢病毒、猫免疫缺陷病毒以及牛免疫缺陷病毒等。考虑到因人类hiv-1的致病性而引起的安全问题，最常用于临床和研发目的的慢病毒系统基于四质粒系统，其表达：
35.1)慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)蛋白；
36.2)包膜蛋白(通常为水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)；
37.3)hiv病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)蛋白；以及
38.4)包含目标基因(goi)的转移载体(tv)。
39.传统上，使用四种质粒中的每一种(作为贴壁细胞培养物)来转染人胚肾细胞(例如，hek293)等哺乳动物细胞，然后产生包含目标基因的所需慢病毒。这些瞬时转染细胞通常能够产生慢病毒。
40.通常使用目标基因来产生慢病毒载体，所述目标基因将被引入所需细胞中，以进行治疗和疾病治疗，包括免疫缺陷和神经退行性疾病。
41.本发明提供了一种改进的慢病毒产生方法，包括慢病毒产生细胞系(可悬浮生长)的制备方法，可显著增加慢病毒产生量。
42.慢病毒产生细胞系
43.在实施例中，本文提供了一种含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞的产生方法。在
本文中，“含慢病毒载体的细胞”是指包含产生慢病毒载体所需的元件(整合到其基因组中)但缺少慢病毒载体所携带的所需目标基因的一种细胞。随后，可使用包含所需目标基因的转移载体等转染含慢病毒载体的细胞，然后进行诱导，产生所需慢病毒，以最终输送目标基因。
44.适当地，可使用本文所述的方法产生的细胞为哺乳动物细胞和细胞系或培养物。在本文中，术语“哺乳动物细胞”包括来自哺乳纲任何成员的细胞，如人类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞、仓鼠细胞等。在某些实施例中，所述细胞为小鼠细胞、人类细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、chok1细胞、cho-dxb11细胞、cho-dg44细胞、chok1sv细胞(包括所有变体，例如，(龙沙公司(英国斯劳)))、chok1sv gs-ko(谷氨酰胺合成酶基因敲除)细胞(包括所有变体，例如，xceed
tm
(龙沙公司(英国斯劳)))。示例性人类细胞包括人胚肾(hek)细胞(如hek293)、hela细胞或ht1080细胞。
45.哺乳动物细胞包括哺乳动物细胞培养物，可以是贴壁培养物或悬浮培养物。贴壁培养物是指在底物(例如塑料板、圆盘或其他适当的细胞培养生长平台)表面生长的细胞，可具有锚定依赖性。悬浮培养物是指可保存在培养瓶或大型悬浮桶(表面积较大，便于气体和营养物质交换)中的细胞。悬浮细胞培养物通常利用搅拌机构来实现适当的混合。用于使细胞保持悬浮态的培养基和条件在本领域众所周知。示例性悬浮细胞培养物包括人hek293克隆细胞。
46.在实施例中，本文所述的方法包括使用包装载体(包含表达盒)转染哺乳动物细胞。在本文中，“载体”或“表达载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，本文所述的核酸分子可附着在其上，从而复制和/或表达细胞内的附着核酸分子。“载体”包括游离型(例如，质粒)或非游离型载体。术语“载体”包括在体外、体内或离体将核酸分子引入细胞的病毒和非病毒手段。术语“载体”可包括合成载体。可通过众所周知的方法将载体引入所需宿主细胞中，包括但不限于转染、转导、细胞融合和脂质转染。载体可包含启动子等各种调控元件。
47.在本文中，“转染”是指将外源性核酸分子(包括载体)引入细胞。“转染”细胞内包含外源性核酸分子，“转化”细胞内的外源性核酸分子诱导细胞发生表型变化。可将转染核酸分子整合到宿主细胞的基因组dna中，和/或由细胞临时或长期保存在染色体外。表达外源性核酸分子或片段的宿主细胞或生物体被称为“重组”、“转化”或“转基因”生物体。多项转染技术在本领域众所周知。参见graham等人，《病毒学》，52:456(1973年)；sambrook等人，《分子克隆》(实验室手册)，冷泉港实验室(纽约)(1989年)；davis等人，《分子生物学基本方法》，elsevier(1986年)；以及chu等人，《基因》，13:197(1981年)。适当地，使用本文所述的一种或多种载体转染哺乳动物细胞时，利用聚乙烯亚胺(pei)等转染剂或其他适当的药剂(包括各种脂质和聚合物)，以将核酸整合到宿主细胞的基因组dna中。
48.在本文中，“包装载体”是指包含产生慢病毒载体并将目标基因“包装”在最终慢病毒中所需的各种组分的一种载体。所述包装载体包含表达盒，所述表达盒是指载体的一个独特组分，并包含将插入转染细胞并最终由转染细胞表达的一个或多个基因和调控序列。
49.适当地，包装载体中所用的表达盒一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因。在其他实施例中，单一启动子
可控制rev、env、gag和pol的表达，或一个启动子可控制gag和pol的表达，第二启动子控制rev和env的表达。也可使用其他组合，并将其包含在本文中。
50.慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)为rna结合蛋白，可促进晚期基因表达。这对于从细胞核到细胞质的未剪接或单剪接mrna(对病毒结构蛋白进行编码)运输也很重要。
51.慢病毒包膜(env)基因(适当地，水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因)对多聚蛋白前体进行编码，所述多聚蛋白前体由细胞蛋白酶切割成表面(su)包膜糖蛋白gp120和跨膜(tm)糖蛋白gp41。
52.gag对从未剪接mrna翻译的多聚蛋白进行编码，然后由病毒蛋白酶(pr)切割成基质蛋白、衣壳和核衣壳蛋白。由于gag mrna翻译期间的核糖体移码，慢病毒聚合酶(pol)以gag-pol多聚蛋白的形式表达，并对酶蛋白逆转录酶、蛋白酶和整合酶进行编码。这三种蛋白与病毒颗粒内的病毒基因组有关。适当地，所述gag基因为hiv gag基因，所述pol基因为hiv pol基因。
53.在适当的实施例中，所述表达盒在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)。如本文详述，使用转座子itr(结合相应的转座酶)可将表达盒特异性整合到靶细胞的基因组中。
54.所述含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞的产生方法进一步包括培养转染哺乳动物细胞，从而将所述核酸(即，表达盒)整合到细胞基因组中，然后分离含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞。
55.转染哺乳动物细胞的培养方法在本领域众所周知，包括使用各种细胞培养基、适当的气体浓度/交换和温度控制，以促进细胞生长，并将构建体整合到细胞基因组中。
56.所需细胞的分离方法包括各种过滤技术，包括使用筛网、过滤装置、细胞选择装置和分选、细胞计数等。
57.如本文所述，表达盒的各个组分均在启动子的控制下。在本文中，“在控制下”是指基因受“启动子”、“启动子序列”或“启动子区”(指能够结合rna聚合酶并引发下游编码或非编码基因序列转录起始的dna调控区/序列)调控。换句话说，所述启动子和基因为可操作组合或可连接。在本文中，术语“可操作组合”、“可操作顺序”和“可连接”是指连接核酸序列，以产生能够引导给定基因转录和/或所需蛋白分子合成的启动子。此术语也指连接氨基酸序列，以产生功能性蛋白。
58.在本发明的某些示例中，所述启动子序列包含转录起始位点，并向上游延伸，以包含最少数量的转录起始所需碱基或元件(本底以上可检测水平)。在某些实施例中，所述启动子序列包含一个转录起始位点以及负责结合rna聚合酶的蛋白结合结构域。真核启动子经常但不总是包含“tata”盒和“cat”盒。诱导型启动子等各种启动子均可用于驱动本发明所述宿主细胞或载体中的基因表达。在某些实施例中，所述启动子不是渗漏启动子，即，所述启动子不以组成型表达的形式表达本文所述的任何基因产物。在本文所述的其他实施例中，所述启动子为组成型启动子，可启动mrna合成，不受外部调控的影响。
59.适当地，用于控制表达盒中各个基因转录的启动子为去阻遏型启动子。在本文中，“去阻遏型启动子”是指一种结构，包含一个功能性启动子以及能够与阻遏子元件结合的其他元件或序列，以阻遏功能性启动子。“阻遏”是指由启动子引发的下游编码或非编码基因
序列转录起始减少或受到抑制。“阻遏子元件”是指一种蛋白或多肽，能够与启动子结合(或在启动子附近)，从而降低或抑制启动子活性。阻遏子元件可与阻遏子元件的底物或结合伴侣发生相互作用，使阻遏子元件发生构象变化。阻遏子元件的这种构象变化会消除阻遏子元件减少或抑制启动子的能力，导致启动子受到“阻遏”，从而使启动子继续转录起始。“功能性启动子”是指在不存在阻遏子元件的作用下能够实现起始转录的一种启动子。在本发明实践中可使用的各种功能性启动子在本领域众所周知，包括pcmv、ph1、p19、p5、p40和腺病毒辅助基因(例如，e1a、e1b、e2a、e4orf6和va)的启动子。
60.可用作去阻遏型启动子的示例性阻遏子元件及其相应的结合伴侣在本领域众所周知，包括cumate基因开关系统(cuo操纵子、cymr阻遏子和cumate结合伴侣)(参见mullick等人，“cumate基因开关：哺乳动物细胞中的可调控型表达系统”，《bmc生物技术》，6:43(1-18)(2006年)，所述公开通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分，包括其中所述去阻遏型启动子的公开)以及本文所述的teto/tetr细胞(参见yao等人，“四环素阻遏子(tetr)(而不是tetr-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物)调控哺乳动物细胞中的诱导型基因表达”，《人类基因疗法》，9:1939-1950(1998年)，所述公开通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分)等系统。在示例性实施例中，所述去阻遏型启动子包含一个功能性启动子以及一个或两个四环素操纵子序列(teto或teto2)。适当地，所述表达盒进一步对第一、第二和第三去阻遏型启动子的阻遏子元件进行编码，包括四环素阻遏蛋白。
61.图1提供了去阻遏型启动子系统的示意图，显示了本发明实施例所述的一种包装质粒。图中显示了去阻遏型启动子，包括cmv启动子(包含一个teto序列)(cmv-to)。如图所示，cmv-to去阻遏型启动子可连接至rev、vsv-g和gag-pol基因；即，在适当的实施例中，第一、第二和第三启动子均可以是去阻遏型启动子。图中还显示了受另一个启动子系统控制的tetr阻遏子元件，即hpgk启动子。
62.在四环素阻遏蛋白(tetr-teto序列的阻遏子元件)与teto序列结合后，所述cmv启动子受到阻遏。即，这些启动子很少或压根不发生转录。在结合tetr的结合伴侣(适当地，强力霉素(dox))后，tetr蛋白发生构象变化，并从teto序列中释放，功能性启动子很自然地开始其正常转录过程。
63.如图1所示，所述表达盒可在对阻遏子元件(适当地，四环素阻遏蛋白)进行编码的序列之后进一步包含一个kruppel相关盒(krab)序列。krab序列(约包含75个氨基酸)是来自人锌指蛋白10的一个转录阻遏结构域，可增加对阻遏子元件(适当地，tetr阻遏子元件)的调控。当通过dna结合结构域连接至模板dna时，所述krab结构域作为转录阻遏子。图中还显示了5’和3’itr转座子序列的示例性位置。如图所示，所述itr序列处于适当位置，因此可将表达盒全部转座到目标细胞中，从而将所有所需基因插入宿主基因组中。
64.在示例性实施例中，所述表达盒进一步包含一种或多种报告基因，用于确定是否将其适当整合到细胞基因组中。在本文中，“报告基因”是一种基因，其表达会提供细胞表型，易于识别和测量。在某些实施例中，所述报告基因包括荧光蛋白基因。在某些实施例中，所述报告基因包括选择基因。在本文中，术语“选择基因”是指使用对酶活性进行编码的基因，提供在缺乏必要营养物质的培养基中生长的能力；此外，选择基因可为表达选择基因的细胞提供抗生素耐药性或耐药性。选择基因可用于为宿主细胞提供特定表型。当宿主细胞必须表达选择基因才能在选择性培养基中生长时，所述基因被称为阳性选择基因。选择基
因也可用于对包含特定基因的宿主细胞进行选择；以这种方式使用的选择基因被称为阴性选择基因。在示例性实施例中，将所述选择基因置于阻遏蛋白之后的krab序列下游以及内部核糖体进入位点(ires)序列下游。在示例性实施例中，所述选择基因是一种抗生素耐药基因，包括提供庆大霉素、胸苷激酶、氨苄青霉素、嘌呤霉素和/或卡那霉素耐药性的基因。
65.如本文详述，经确定，使用转座子特异性itr，可以更高的特异性、频率和稳定性将表达盒插入靶细胞的基因组中。在示例性实施例中，所述转座子特异性itr为鳞翅目转座子itr。
66.转座元件(转座子)可绕细胞基因组移动，并且可用于插入基因，以产生转基因生物体。鳞翅目转座子能够在各物种的基因组内移动，并且可用于基因转导载体。转座子结构包括一个复杂重复序列配置，由一个内部重复序列(ir)、一个间隔区、两端的一个末端重复序列(tr)以及一个对转座酶进行编码的单一开放读码框架组成。
67.最初，从tn-368粉纹夜蛾细胞培养物中分离鳞翅目转座元件作为自发杆状病毒斑块形态突变体内的基因破坏插入。是一种2475bp短反向重复元件，采用非对称末端重复结构，在5'13-bp tr(末端重复序列)和19-bp ir(内部重复序列)之间包含一个3-bp间隔区，并在3'tr和ir之间包含一个31-bp间隔区。单一2.1kb开放读码框架对功能性转座酶进行编码(cary等人，1989；fraser等人，1983，1995；elick等人，1996a；lobo等人，1999；handler等人，1998)。通过独特的“剪切和粘贴”机制对进行转座，仅在5'ttaa3’靶位点(插入后复制)插入，并进行精确切割，不留任何足迹(elick等人，1996b；fraser等人，1996；wang和fraser，1993)。
68.可用于本文所述质粒和表达盒的示例性鳞翅目转座子itr包括第7,105,343号美国专利所公开的itr，所述公开通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。
69.在适当的实施例中，在存在转座酶(识别转座子特异性itr)的情况下，使用包装载体转染哺乳动物细胞。这种转座酶有助于将表达盒转座到靶哺乳动物细胞的细胞基因组中。可向细胞提供转座酶，作为活性酶或作为对转座酶进行编码的核酸序列，包括mrna或cdna。在实施例中，所述转座酶为鳞翅目转座酶mrna或鳞翅目转座cdna。如本文所述，适当地,利用鳞翅目转座子itr及相应鳞翅目转座酶的转座频率至少约为10-4
。
70.在其他实施例中，本文提供了慢病毒载体产生哺乳动物细胞的产生方法。在本文中，“慢病毒载体产生细胞”是指包含产生慢病毒载体所需的元件(整合到其基因组中)以及慢病毒载体所携带的所需目标基因的一种细胞。随后，可诱导慢病毒载体产生细胞，产生所需慢病毒，以最终输送目标基因。
71.慢病毒载体产生细胞的产生方法(尤其是哺乳动物细胞)包括使用以下组分转染哺乳动物细胞：一个包装载体，其包含一个表达盒，能够对以下组分进行编码：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因。
72.如本文所述，所述表达盒在5’端和3’端适当侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)，有助于高转座到靶细胞中。
73.所述方法进一步包括使用转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列)转染哺乳动物细胞。与表达盒一样，对目标基因进行编码的核酸序列也在5’端和3’端适当侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)，以增加转座。在实施例中，同时转染所述转移载体和包装载体；在其他实施例中，可先后转染所述转移载体或包装载体。
74.转染后，培养哺乳动物细胞，并分离慢病毒载体产生哺乳动物细胞。
75.与含慢病毒包装载体的细胞一样，在可用于产生慢病毒载体的所需时间前，适当储存本文所制备的慢病毒载体产生细胞。适当的储存技术和特性在本领域众所周知，可包括细胞冷藏或冷冻以及在诱导产生载体前使细胞保持悬浮态的其他方法。
76.如本文所述，适当地，所述哺乳动物细胞为哺乳动物细胞培养物，在实施例中，为悬浮培养物。示例性细胞包括hek293t细胞。
77.正如在含慢病毒包装载体的细胞中一样，表达载体基因适当包括gag基因(即hiv gag基因)和pol基因(即hiv pol基因)。适当地，所述慢病毒包膜基因为水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因。
78.用于慢病毒载体产生细胞的示例性启动子在本领域众所周知，包括去阻遏型启动子，适当地，所述表达盒进一步对第一、第二和第三去阻遏型启动子的阻遏子元件进行编码。在实施例中，所述去阻遏型启动子包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白。本文对所述表达盒的其他特性(包括转座子特异性itr)进行了说明。
79.在适当的实施例中，慢病毒载体中包含的目标基因为治疗目标基因。在本文中，术语“目标基因”或“goi”用于描述异源基因。在本文中，术语“异源基因”或“hg”涉及编码序列或控制序列等核酸序列，因此表示未与特定细胞正常连接在一起和/或正常结合的核酸序列(例如，基因)。在一些实施例中，异源基因是一种构建体，其中，编码序列本身不存在于自然界中(例如，密码子与天然基因不同的合成序列)。在本文中，等位基因变异或自然发生的突变事件不会导致产生异源dna。
80.在本文中，术语“治疗目标基因”是指任何功能相关核苷酸序列。因此，本发明所述的治疗目标基因可包括对蛋白(缺陷或缺失治疗靶细胞基因组)或非天然蛋白(具有预期生物或治疗作用)(例如，抗病毒功能)进行编码的任何所需基因，或序列可对应于具有反义或核酶功能的分子。适当治疗目标基因的代表性(非限制性)示例包括用于治疗以下疾病的基因：炎性疾病、自身免疫性疾病、慢性病和传染病(包括aids)、癌症、神经系统疾病、心血管疾病、高胆固醇血症；各种血液疾病(包括各种贫血、地中海贫血和血友病)；遗传缺陷(如囊性纤维化、戈谢病、腺苷脱氨酶(ada)缺乏症、肺气肿等)。用于癌症和病毒性疾病反义治疗的几种反义寡核苷酸(例如，与mrna翻译起始位点(aug密码子)周围的序列互补的短寡核苷酸)已在本领域进行了说明，也是适当治疗目标基因的示例。
81.图2显示了包含目标基因的示例性转移载体(用于说明目的的增强型绿色荧光蛋白)。所述目标基因在启动子的控制下，适当地，所述启动子为组成型启动子，在这种情况下，为cmv启动子。图中还显示了5’和3’itr转座子序列的示例性位置。如图所示，所述itr序
列处于适当位置，因此可将包含目标基因和启动子的核酸全部转座到目标细胞中，从而将所有所需基因插入宿主基因组中。如图所示，示例性转移载体还包含选择基因，在这种情况下，为博来霉素耐药基因。图2显示了转移载体的其他元件。
82.在其他实施例中，本文提供了一种慢病毒载体产生方法，包括产生或提供本文所述含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞，然后使用转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列)转染哺乳动物细胞。将目标基因引入细胞基因组后，诱导产生表达盒以及对目标基因进行编码的核酸。然后，对细胞进行培养，最后收获包含目标基因的慢病毒载体。
83.在其他实施例中，慢病毒载体产生方法适当包括产生或提供本文所述的慢病毒载体产生哺乳动物细胞。诱导产生表达盒以及对目标基因进行编码的核酸。然后，对细胞进行培养，最后收获包含目标基因的慢病毒载体。
84.使用本文所述的细胞(仅包含慢病毒包装载体或也包含目标基因(整合到细胞基因组中))产生慢病毒载体的方法提供了一种产生大量慢病毒载体并控制诱导开始时间和诱导发生条件的机制。诱导适当包括引入与阻遏子元件相互作用的化学物质或药剂，从而对去阻遏型启动子去阻遏，产生慢病毒载体的包装组分。
85.如本文所述，适当地，所述表达盒中的各启动子为去阻遏型启动子，包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白。在此类实施例中，包装组分诱导包括向哺乳动物细胞中加入强力霉素。
86.由于向细胞基因组中插入的所需核酸序列数量增加，并且悬浮细胞培养物可提供高产生量，因此本文所述的方法可产生更多的慢病毒载体。在实施例中，在1-5天内，适当地，在约细胞诱导后两天，慢病毒载体的产生量至少为约104，更适当地，约105或约106个转导单位/ml。
87.使用本文所述细胞的产生方法可利用任何适当的反应器，包括但不限于搅拌釜式、气升式、纤维、超细纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器在本文中，“反应器”可包括发酵罐、发酵装置或任何其他反应容器，术语“反应器”可与“发酵罐”互换使用。术语“发酵罐”或“发酵”是指微生物和哺乳动物培养。例如，在某些方面，示例生物反应器装置可执行以下一种、多种或所有功能：供给营养物质和/或碳源、注入适当气体(例如，氧气)、流入和排出发酵或细胞培养基、分离气相和液相、保持温度、保持氧气和co2水平、保持ph水平、搅拌和/或清洗/灭菌。示例反应器装置(如发酵装置)可包含多个反应器，例如，每个装置可包含1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多生物反应器，和/或一个设施可包含多个装置(包含一个或多个反应器)。在各个实施例中，所述生物反应器适用于分批、半流加、流加、灌流和/或连续发酵工艺。可使用任何适当的反应器直径。在实施例中，所述生物反应器的体积可在约100ml到约50000l之间。非限制性示例包括以下体积：100ml、250ml、500ml、750ml、1升、2升、3升、4升、5升、6升、7升、8升、9升、10升、15升、20升、25升、30升、40升、50升、60升、70升、80升、90升、100升、150升、200升、250升、300升、350升、400升、450升、500升、550升、600升、650升、700升、750升、800升、850升、900升、950升、1000升、1500升、2000升、2500升、3000升、3500升、4000升、4500升、5000升、6000升、7000升、8000升、9000升、10000升、15000升、20000升和/或50000升。此外，适当的反应器可以是多用途、一次性或非一次性反应器，可由任何适当的材料制成，包括不
锈钢(例如，316l或任何其他适当的不锈钢)和inconel等金属合金、塑料和/或玻璃。
88.如本文所述，令人惊奇的是，经确定，在不存在抗生素的情况下，可至少部分执行使用产生细胞系的慢病毒产生方法，包括种子培养生产、细胞传代、大体积细胞培养和/或主要生产阶段。由此产生的方法在至少部分慢病毒产生过程中不使用抗生素，因此减少或消除了与在细胞工艺和产品(最终用于人类)中使用抗生素有关的问题。
89.图10显示了使用本文所述的产生细胞系制备慢病毒的示例性生产工艺。如图所示，首先产生pcl克隆体，然后选择用于大规模生产工艺。在生产工艺的初始阶段，将pcl传代至多约3次(例如，体积约为2l)，此时，可从工艺中去除嘌呤霉素和/或吉欧霉素等抗生素。然后，在不存在抗生素的情况下继续传代，例如，从第3次传代、第4次传代、第5次传代等，直至达到所需细胞体积。例如，如图10所示，在不存在抗生素的情况下，生物反应器中的体积适当达到50l。然后，适当诱导所述pcl(例如，使用本文所述的强力霉素)，以开始产生慢病毒载体。因此，在实施例中，在不存在抗生素的情况下至少部分培养哺乳动物细胞(pcl)，适当地，这段时间为从第3次传代到诱导阶段。诱导后，可进行下游处理，包括收获(包括核酸酶处理和澄清步骤)和纯化慢病毒载体(包括切向流过滤和无菌过滤)。令人吃惊且出乎意料的结果是能够执行使用本文所述pcl的慢病毒载体产生过程的重要部分，这为大规模生产工艺提供了显著优势。
90.本文还提供了使用根据本文所述的各种方法产生的慢病毒载体治疗哺乳动物受试者(适当地，人类受试者)的方法。适当地，所述方法用于使用目标基因(包括治疗目标基因)来治疗人类受试者。向人类受试者施用可包括吸入、注射或静脉内施用以及本领域已知的其他施用方法。
91.本文还提供了慢病毒载体产生哺乳动物细胞。使用本文所述的方法或其变体，,很容易产生哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含通过染色体整合到哺乳动物细胞中的核酸分子，所述核酸分子包含：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因。在其他实施例中，包含包装组分(整合到基因组中)的哺乳动物细胞可进一步包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的染色体整合核酸序列。
92.如本文所述，使用基于转座酶(包括转座酶)的方法会导致宿主细胞基因组中的核酸序列在5’和3’端侧接有因转座子特异性反向末端重复序列(itr)重组而产生的序列。
93.本文对示例性哺乳动物细胞、表达盒的基因组分以及对目标基因进行编码的核酸进行了说明。
94.本文对利用这些细胞的慢病毒产生方法进行了说明，适当地，所述方法包括诱导产生表达盒和对目标基因进行编码的核酸、培养转染哺乳动物细胞以及收获慢病毒载体。
95.其他示例性实施例
96.实施例1是一种含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞的产生方法，包括：使用以下组分转染哺乳动物细胞：一个包装载体，其包含一个表达盒，能够对以下组分进行编码：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合
酶(pol)基因，其中，所述表达盒在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)；培养转染哺乳动物细胞；以及分离含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞。
97.实施例2包括实施例1所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为哺乳动物细胞培养物。
98.实施例3包括实施例2所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养物为悬浮培养物。
99.实施例4包括实施例3所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为hek293t细胞。
100.实施例5包括实施例1-4中任一项所述的方法，其中，所述gag基因为hiv gag基因，所述pol基因为hiv pol基因。
101.实施例6包括实施例1-5中任一项所述的方法，其中，所述慢病毒包膜基因为水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因。
102.实施例7包括实施例1-6中任一项所述的方法，其中，所述第一、第二和第三启动子为去阻遏型启动子。
103.实施例8包括实施例7所述的方法，其中，所述表达盒进一步对第一、第二和第三去阻遏型启动子的阻遏子元件进行编码。
104.实施例9包括实施例8所述的方法，其中，所述去阻遏型启动子各包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白。
105.实施例10包括实施例9所述的方法，其中，所述表达盒在对四环素阻遏蛋白进行编码的序列之后进一步包含一个kruppel相关盒序列。
106.实施例11包括实施例1-10中任一项所述的方法，其中，所述转座子特异性itr为鳞翅目转座子itr。
107.实施例12包括实施例1-11中任一项所述的方法，其中，在存在转座酶(识别转座子特异性itr)的情况下进行所述转染。
108.实施例13包括实施例12所述的方法，其中，所述转座酶为鳞翅目转座酶mrna或鳞翅目转座cdna。
109.实施例14是一种慢病毒载体产生哺乳动物细胞的产生方法，包括：使用以下组分转染哺乳动物细胞：一个包装载体，其包含一个表达盒，能够对以下组分进行编码：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因，其中，所述表达盒在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)；以及一个转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列，其中，所述核酸序列在5’端和3’端侧接有转座子特异性反向末端重复序列(itr)；培养转染哺乳动物细胞；以及分离慢病毒载体产生哺乳动物细胞。
110.实施例15包括实施例14所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为哺乳动物细胞培养物。
111.实施例16包括实施例15所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞培养物为悬浮培养物。
112.实施例17包括实施例16所述的方法，其中，所述哺乳动物细胞为hek293t细胞。
113.实施例18包括实施例14-17中任一项所述的方法，其中，所述gag基因为hiv gag基
因，所述pol基因为hiv pol基因。
114.实施例19包括实施例14-18中任一项所述的方法，其中，所述慢病毒包膜基因为水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因。
115.实施例20包括实施例14-19中任一项所述的方法，其中，所述第一、第二和第三启动子为去阻遏型启动子。
116.实施例21包括实施例20所述的方法，其中，所述表达盒进一步对第一、第二和第三去阻遏型启动子的阻遏子元件进行编码。
117.实施例22包括实施例21所述的方法，其中，所述去阻遏型启动子各包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白。
118.实施例23包括实施例22所述的方法，其中，所述表达盒在对四环素阻遏蛋白进行编码的序列之后进一步包含一个kruppel相关盒序列。
119.实施例24包括实施例14-23中任一项所述的方法，其中，所述转座子特异性itr为鳞翅目转座子itr。
120.实施例25包括实施例14-24中任一项所述的方法，其中，在存在转座酶(识别转座子特异性itr)的情况下进行所述转染。
121.实施例26包括实施例25所述的方法，其中，所述转座酶为鳞翅目转座酶mrna或鳞翅目转座cdna。
122.实施例27包括实施例14-26中任一项所述的方法，其中，所述目标基因为治疗目标基因。
123.实施例28是一种慢病毒载体产生方法，包括：根据实施例1产生含慢病毒包装载体的哺乳动物细胞；使用转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列)转染哺乳动物细胞；诱导产生表达盒和核酸；培养转染哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
124.实施例29是一种慢病毒载体产生方法，包括：根据实施例14产生慢病毒载体产生哺乳动物细胞；诱导产生表达盒和核酸；培养转染哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
125.实施例30包括实施例28或29所述的方法，其中，所述表达盒中的各启动子为去阻遏型启动子，包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白，所述诱导包括向哺乳动物细胞中加入强力霉素。
126.实施例31包括实施例28或29所述的方法，其中，在诱导后两天，慢病毒载体的产生量至少约为106个转导单位/ml。
127.实施例32是一种慢病毒载体治疗方法，包括：向哺乳动物受试者施用根据实施例28或29产生的慢病毒载体。
128.实施例33包括实施例32所述的方法，其中，所述施用包括吸入、注射或静脉内施用。
129.实施例34是一种慢病毒载体产生哺乳动物细胞，包含：通过染色体整合到哺乳动物细胞中的核酸分子，所述核酸分子包含：一种受第一启动子控制的慢病毒病毒颗粒蛋白表达调控因子(rev)；一种受第二启动子控制的慢病毒包膜基因；以及受第三启动子控制的慢病毒群特异性抗原(gag)基因和慢病毒聚合酶(pol)基因，其中，所述核酸序列在5’端和
3’端侧接有因转座子特异性反向末端重复序列(itr)重组而产生的序列。
130.实施例35包括实施例34所述的哺乳动物细胞，进一步包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的染色体整合核酸序列。
131.实施例36包括实施例34或35所述的哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞为哺乳动物细胞培养物。
132.实施例37包括实施例36所述的哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞培养物为悬浮培养物。
133.实施例38包括实施例37所述的哺乳动物细胞，其中，所述哺乳动物细胞为hek293t细胞。
134.实施例39包括实施例34-38中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述gag基因为hiv gag基因，所述pol基因为hiv pol基因。
135.实施例40包括实施例34-39中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述慢病毒包膜基因为水疱性口炎病毒糖蛋白(vsv-g)基因。
136.实施例41包括实施例34-40中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述第一、第二和第三启动子为去阻遏型启动子。
137.实施例42包括实施例41所述的哺乳动物细胞，其中，所述表达盒进一步对第一、第二和第三去阻遏型启动子的阻遏子元件进行编码。
138.实施例43包括实施例42所述的哺乳动物细胞，其中，所述去阻遏型启动子各包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白。
139.实施例44包括实施例43所述的哺乳动物细胞，其中，所述表达盒在对四环素阻遏蛋白进行编码的序列之后进一步包含一个kruppel相关盒序列。
140.实施例45包括实施例34-44中任一项所述的哺乳动物细胞，其中，所述转座子特异性itr为鳞翅目转座子itr。
141.实施例46包括实施例35所述的哺乳动物细胞，其中，所述目标基因为治疗目标基因。
142.实施例47是一种慢病毒载体产生方法，包括：使用转移载体(包含一种受第四启动子控制对目标基因进行编码的核酸序列)转染实施例34所述的哺乳动物细胞；诱导产生表达盒和核酸；培养转染哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
143.实施例48是一种慢病毒载体产生方法，包括：诱导产生染色体整合核酸序列以及对实施例35所述哺乳动物目标基因进行编码的染色体整合核酸序列；培养哺乳动物细胞；以及收获慢病毒载体。
144.实施例49包括实施例47或48所述的方法，其中，所述表达盒中的各启动子为去阻遏型启动子，包含一个功能性启动子和一个四环素操纵子序列(teto)，所述阻遏子元件为四环素阻遏蛋白，所述诱导包括向哺乳动物细胞中加入强力霉素。
145.实施例50包括实施例47或48所述的方法，其中，在诱导后两天，慢病毒载体的产生量至少约为106个转导单位/ml。
146.实施例51是一种慢病毒载体治疗方法，包括：向哺乳动物受试者施用根据实施例47或48产生的慢病毒载体。
147.实施例52包括实施例51所述的方法，其中，所述施用包括吸入、注射或静脉内施
用。
148.实施例53包括实施例28-31和47-50中任一项所述的方法，其中，在不存在抗生素的情况下至少部分培养哺乳动物细胞。
149.实施例54包括实施例53所述的方法，其中，所述部分培养从第3次传代到诱导阶段。
150.示例
151.示例1：慢病毒产生细胞系的设计和构建
152.材料和方法
153.为了构建慢病毒产生细胞系，设计了两种质粒：
154.1)以可调控的方式表达gag-pol、vsv-g和rev的包装质粒；以及
155.2)表达目标基因的转移载体。
156.经证明，密码子优化是在不改变蛋白实际氨基酸序列的情况下增加蛋白合成的一种最有效的方法，因此，对vsv-g和rev的编码序列进行密码子优化(co)。
157.未对gag-pol进行编码的序列进行密码子优化。所有这些序列均在cmv-to启动子的控制下，在不存在四环素或强力霉素的情况下，其活性受tetr阻遏。在我们的设计中，在tetr编码序列之后插入kruppel相关盒(krab)序列(来自人锌指蛋白10的一个转录阻遏结构域)，以对cmv-to进行更严格的调控。
158.在与tetr结合后，加入强力霉素会诱导tetr发生构象变化，从cmv-to中释放tetr。因此，cmv-to具有活性，并表达vsv-g、rev和gag-pol。vsv-g、rev和gag-pol的可调控型表达最大限度地降低了与这些蛋白有关的任何细胞毒性，还将任何诱导前的慢病毒载体产生量保持在基础水平。为了促进选择过程，将抗生素抗药标志物(嘌呤霉素)引入krab序列之后的ires序列质粒下游。因此，人磷酸甘油酸启动子同时驱动tetr-krab和嘌呤霉素耐药基因的表达。
159.为了测试慢病毒载体产生量，将增强型绿色荧光蛋白(egfp)选作目标基因(goi)。将其置于cmv启动子之下，以进行组成型表达。将博来霉素耐药标志物(bleor)引入转移载体中，以提高选作过程的效率。
160.在常规方法中，表达盒整合依靠随机整合事件。因此，它在本质上并不是一个受控、有效的过程。此外，由于可将包含不完全表达盒的碎裂部分抗生素标志物偶然整合到染色体中，因此最终选择的克隆体可呈假阳性(即，不表达预期goi)。
161.为了避免在产生细胞系产生时出现这些不必要的事件，包装和转移载体质粒中的所有表达盒均侧接有反向末端重复序列(itr)。转座酶特异性可识别这些itr序列，促进体内位点特异性重组。因此，在转座酶mrna共转染后，将包含整个表达盒的质粒区有效整合到细胞的染色体中。
162.图1为包装载体的示意图；图2为转移载体的示意图。图中显示了对egfp进行编码的序列及其启动子。图中还显示了5’和3’itr，以及用于产生慢病毒载体的元件，如5’ltr、hiv-1rre、cppt/cts和3’ltr。
163.图1中所示包装载体的核酸序列提供如下：atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagat
cagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcgcgcccgccgggtaactcacggggtatccatgtccatttctgcggcatccagccaggatacccgtcctcgctgacgtaatatcccagcgccgcaccgctgtcattaatctgcacaccggcacggcagttccggctgtcgccggtattgttcgggttgctgatgcgcttcgggctgaccatccggaactgtgtccggaaaagccgcgacgaactggtatcccaggtggcctgaacgaacagttcaccgttaaaggcgtgcatggccacaccttcccgaatcatcatggtaaacgtgcgttttcgctcaacgtcaatgcagcagcagtcatcctcggcaaactctttccatgccgcttcaacctcgcgggaaaaggcacgggcttcttcctccccgatgcccagatagcgccagcttgggcgatgactgagccggaaaaaagacccgacgatatgatcctgatgcagctagattaaccctagaaagatagtctgcgtaaaattgacgcatgcattcttgaaatattgctctctctttctaaatagcgcgaatccgtcgctgtgcatttaggacatctcagtcgccgcttggagctcccgtgaggcgtgcttgtcaatgcggtaagtgtcactgattttgaactataacgaccgcgtgagtcaaaatgacgcatgattatcttttacgtgacttttaagatttaactcatacgataattatattgttatttcatgttctacttacgtgataacttattatatatatattttcttgttatagatatcaagcttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattaagatctaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctccaccgcggtggcggccgctctagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccga
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164.图2中所示转移载体的核酸序列提供如下：atgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccga
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165.分离hek293t细胞的单细胞克隆体，并进行悬浮适应，以转染包装和转移载体质粒。为了测试并确认转座酶的作用，在存在或不存在转座酶mrna的情况下进行转染。在所述转染中，使用peipro转染剂。
166.为了产生lenti-egfp的包装细胞系，对egfp进行编码的包装质粒和转移载体进行共转染。为了产生仅用于包装的包装细胞系(即，无目标表达基因)，仅转染包装质粒。在转染后4天，加入嘌呤霉素和吉欧霉素(对于lenti-egfp)以及仅加入嘌呤霉素(对于包装细胞系)，从而选择稳定转染细胞。
167.结果
168.转座酶mrna共转染使抗生素抗药集落显著增强，这表明，转座酶表达的确促进了表达盒的染色体整合。图3a-3d显示了在存在(图3a和3c)或不存在(图3b和3d)转座酶mrna(tp mrna)的情况下使用包装载体和egfp转移载体转染的hek293t细胞的结果。在转染后4天，加入嘌呤霉素(0.5ug/ml)和吉欧霉素(300ug/ml)，从而选择抗生素耐药细胞。在转染后26天，在荧光显微镜下观察细胞，并采集gfp和黑白(b/w)图像。
169.同样，在包装细胞系的产生过程中，转座酶mrna共转染也使抗生素耐药集落增强(数据未显示)。
170.在表征前，扩增并冷冻抗生素耐药包装细胞系。将对lv-egfp进行编码的包装细胞解冻，并在存在嘌呤霉素和吉欧霉素的情况下在进行悬浮培养。为了诱导产生慢病毒载体，向包装细胞培养物中加入丁酸钠(6mm)和强力霉素(2ug/ml)。
171.在诱导后第2天和第3天，收集培养上清液，以测量慢病毒滴度。为了测量未经诱导的慢病毒载体滴度，使用未经诱导的样本的培养上清液。经观察，在诱导后(第2天和第3天)，慢病毒载体的产生量超过4e6个转导单位/ml，而任何诱导前(第0天)的慢病毒基础产生量仅为基础水平(图4)。
172.示例2：慢病毒产生细胞系的进一步表征
173.a.为了研究不同转染剂及本文所述载体的用途，设计了其他研究。如图5所示，在存在转座酶mrna的情况下，pei和lipofectamine 3000成功使感染性慢病毒滴度较pcl池增加约100倍，这表明，所述转座酶表达可将内容物序列有效整合到宿主细胞的染色体中。
174.b.为了确定不使用抗生素对成功产生慢病毒的影响，进行了进一步的实验。在此类实验中，选择hek-293t单细胞克隆体(scc)指定dh4来证明在诱导至第21次传代后的感染性滴度一致。
175.如图6所示，未经诱导的细胞具有较低的感染性滴度水平。在第7次传代后(第2天)，诱导细胞为1.2e7 tu/ml(转导单位/ml)。为了选择细胞，去除抗生素，并继续细胞传代。在第11次传代后(第2天、第3天)，存在抗生素的细胞的滴度达到1.5e7 tu/ml(第2天)和5.3e7 tu/ml(第3天)。与不存在抗生素相比，在第2天，感染性滴度仍达1.6e7 tu/ml。直到第17次和第21次传代(约七周)，在存在和不存在抗生素的情况下，病毒滴度继续保持在相同水平(4.4e7)。第2天与第3天是指诱导后及收获前的pcl培养天数，比较诱导和收获之间另外一天的作用。
176.图7显示了使用另一个单细胞克隆体ed8的相同结果。与dh4克隆体相同，在第7次传代时去除抗生素并未显著影响细胞克隆体产生感染性病毒滴度(与经抗生素处理的细胞规模相同)的能力。如图所示，通过第21次传代，感染性滴度达到3.5e7 tu/ml，与继续使用抗生素处理的细胞的4.3e7 tu/ml类似。
177.图8显示了整合到宿主细胞染色体中的拷贝数(目标基因或包装质粒)(通过ddpcr检测测量)。通过公式“vcn＝靶序列的拷贝数/rpp30(核糖核酸酶p/mrp亚基p30)*2”计算载体拷贝数(vcn)。使用对长末端重复序列(ltr)和水疱性口炎病毒糖蛋白g(vsv-g)具有特异性的引物/探针组分别检测goi和包装质粒。如图所示，对于两个细胞克隆体，所述目标基因和包装质粒均被有效整合到细胞染色体中。虽然在细胞传代(仍在第70次传代时)时去除抗生素会使拷贝数略有减少，但仍可将goi和包装质粒充分整合到细胞中。
178.此结果令人吃惊且出乎意料，表明即使在存在抗生素的情况下，根据本文所述的方法制备的产生细胞系也能够产生高病毒滴度。这为慢病毒生产提供了显著优势，因为从产生细胞系培养物中去除抗生素非常可取，这样可尽量降低产品(随后用于人类患者群体)受抗生素污染的风险。
179.c.为了确定使用本文所述的产生细胞系产生的慢病毒载体的转导效率(与通过瞬时转染产生的慢病毒相比)，也进行了实验。使用dh4和ed8细胞系中的pcl以及通过hek-293细胞的瞬时转染产生慢病毒。产生后，将慢病毒载体转导到外周血单核细胞(pbmc)中，感染复数(moi)为5。简而言之，按4e5个细胞/孔，在24孔板中接种pmbc。在第1天，使用il-2(15ng/ml)以及抗cd3和抗cd-28(25μl/1e6个细胞)刺激细胞。然后，使用慢病毒转导细胞，感染复数为5，绿色荧光蛋白作为目标基因(goi)。5天后，通过流式细胞术分析细胞，确定荧光阳性细胞的比例，并计算转导效率。
180.如图9所示，在转导pmbc(感染复数为5)时，观察到使用瞬时转染方法产生的慢病毒的转导效率类似于使用pcl(dh4和ed8系)以及本文所述的方法产生的慢病毒的转导效率(转导效率约为55％-62％)。
181.对于相关领域的普通技术人员，显而易见的是，在不脱离任何实施例范围的情况下，可对本文所述的方法和应用进行其他适当的修改。
182.应理解，当本文对某些实施例进行说明时，权利要求并不限于所述部分的具体形式或安排。在说明书中，公开了说明性实施例，虽然采用了特定术语，但仅在一般及说明性意义上使用它们，并不用于限制目的。根据上述教导，可对实施例进行修改和变更。因此，应理解，可以非本文具体说明的其他方式实施这些实施例。
183.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过本发明的引用，成为本发明的一部分，就像各个出版物、专利或专利申请均具体、单独表明通过本发明的引用，成为本发明的一部分。