用于反刍动物的理想性状的细菌种群1.相关申请2.本技术主张于2019年7月2日提交的美国专利临时申请第62/869616号的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文中。3.序列表声明4.与本技术同时提交的创建于2020年7月1日的名为82892序列表的ascii文件，包含335,610字节，在此通过引用的方式并入本文中。5.
技术领域：
：及
背景技术：
：：6.在本发明的一些实施例中，本发明涉及一种基于微生物群系(microbiome)中特定细菌的存在来选择反刍动物以获得理想的可遗传性状的方法。7.牛瘤胃微生物群系基本上使宿主反刍动物能够通过降解及发酵来消化其饲料。从此意义上来说，这种关系是独特的，不同于人类及非食草动物之间进化的宿主微生物群系相互作用(host-microbiomeinteractions)，在这种相互作用中，不存在这种依赖性。这种严格的强制性宿主微生物群系关系大约建立于5000万年前并且被认为在宿主的生理学中起着重要作用。尽管如此，通过有性生殖及减数分裂重组在宿主中产生的自然遗传变异对瘤胃微生物群系及宿主生理性状之间复杂关系的影响仍知之甚少。众所周知，瘤胃微生物群系的特定成分与动物生理学之间存在关联，主要表现为动物从饲料中获取能量的能力[krugerbenshabats等人，2016年，ismej10:2958-2972]。[0008]这些最新的发现将牛瘤胃微生物群系定位为提高奶牛的饲料效率(feedefficiency)的新前沿。随着人口不断增加，这可能对作为努力补充可供人类消费的食物来源的粮食安全问题产生重要影响，同时降低全球范围内的环境影响。尽管它非常重要，但人们对瘤胃微生物组群系组分与宿主遗传学及生理学之间的复杂关系知之甚少。[0009]
背景技术：
：包括wo2019/030752、wo2017/187433及wo2014/141274，guanll等人，2008年femsmicrobiologyletters288:85-9；roeher等人，2016年plosgenet12:e1005846；liz等人，2016年microbiologyreports8:1016-102。技术实现要素：[0010]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种选择具有一理想的可遗传性状的一反刍动物的方法，所述方法包括：在所述动物的微生物群系中分析与所述可遗传性状相关的至少一种可遗传细菌的一数量，其中所述可遗传细菌的所述数量指示所述动物是否具有一理想的可遗传性状，其中所述可遗传细菌是如表1所示的多个操作分类单元(operationaltaxonomicunits，otu)中的任一者，其中所述性状是表1所示的所述至少一种可遗传细菌的对应性状，从而选择具有一理想的可遗传性状的所述反刍动物。[0011]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种管理一反刍动物的畜群的方法，所述方法包括：[0012](a)在所述畜群的一反刍动物的微生物群系中分析与所述可遗传性状相关的至少一种可遗传细菌的一数量，其中所述可遗传细菌的所述数量指示所述动物具有一非理想的可遗传性状，其中所述可遗传细菌是如表1所示的多个操作分类单元中的任一者，其中所述性状是表1所示的所述至少一种可遗传细菌的对应性状；以及[0013](b)从所述畜群中移除带有所述非理想的性状的所述动物。[0014]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种培育反刍动物的方法，所述方法包括培育根据上述的方法选择的一反刍动物，从而培育所述反刍动物。[0015]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种增加具有一理想的微生物群系的反刍动物数量的方法，所述方法包括培育雄性及雌性的反刍动物，其中所述雄性及/或雌性的反刍动物中的任一者的所述瘤胃微生物群系包括一可遗传微生物，所述可遗传微生物具有如表3所示高于一预定水平的一操作分类单元，从而增加具有一理想的微生物群系的反刍动物的数量。[0016]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种改变反刍动物的一性状的方法，所述方法包括：向所述反刍动物提供一微生物组合物，所述微生物组合物包括至少一种微生物，所述微生物具有如表2所示的一操作分类单元以及具有如seqidno：38-50及314-615所示的一16srrna序列，从而改变所述反刍动物的所述性状，其中所述微生物组合物不包括所述反刍动物的一微生物群系，其中所述性状是表2所示的所述至少一种微生物的对应性状。[0017]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种改变反刍动物的一性状的方法，所述方法包括：向所述反刍动物提供一试剂，所述试剂特异性地下调表2所示的一操作分类单元，从而改变所述反刍动物的所述性状，其中所述性状是表2所示的所述至少一种微生物的对应性状。[0018]根据本发明的一些实施例的一个方面，提供一种微生物组合物，所述微生物组合物包括：至少一种微生物，具有表2所示的一操作分类单元，所述微生物组合物不是一微生物群系。[0019]根据本发明的一些实施例，所述可遗传细菌是属于毛螺菌科(familylachnospiraceae)或普雷沃氏菌属(genusprevotella)。[0020]根据本发明的一些实施例，所述反刍动物是牛。[0021]根据本发明的一些实施例，所述方法进一步包括：使用经选择的动物或其后代进行培育。[0022]根据本发明的一些实施例，通过分析所述至少一种细菌的基因组的至少一个基因的表现来实现所述数量的分析。[0023]根据本发明的一些实施例，通过对来自所述微生物群系的一样品的dna进行测序来实现所述数量的分析。[0024]根据本发明的一些实施例，所述微生物群系包括一瘤胃微生物群系或一粪便微生物群系。[0025]根据本发明的一些实施例，当所述反刍动物被选择为一雌性反刍动物，所述方法包括利用一雄性反刍动物的精子对所述雌性反刍动物进行人工授精。[0026]根据本发明的一些实施例，根据上文所述的方法来选择所述雄性反刍动物。[0027]根据本发明的一些实施例，当所述反刍动物被选择为一雄性反刍动物，所述方法包括利用所述雄性反刍动物的精子对一雌性反刍动物进行人工授精。[0028]根据本发明的一些实施例，所述可遗传微生物与一可遗传性状相关联。[0029]根据本发明的一些实施例，所述微生物组合物包括不超过20种微生物种类。[0030]根据本发明的一些实施例，所述微生物组合物包括不超过50种微生物种类。[0031]根据本发明的一些实施例，所述至少一种微生物具有如表1所示的一操作分类单元。[0032]根据本发明的一些实施例，所述至少一种微生物具有如seqidno：7-37及51-313所示的一16srrna序列。[0033]根据本发明的一些实施例，所述至少一种微生物具有如表1所示的一操作分类单元。[0034]根据本发明的一些实施例，所述微生物组合包括不超过15种细菌种类。[0035]根据本发明的一些实施例，所述微生物组合物不超过20种细菌种类。[0036]除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实施例的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但下文描述示例性方法及/或材料。如果发生冲突，将以包括定义的专利说明书为准。此外，这些材料、方法及例子只是说明性的，并不意味着一定是限制性的。附图说明[0037]本文仅以示例的方式，参考附图描述本发明的一些实施例。现在具体参考附图，需要强调的是，所示的细节是作为示例并用于本发明实施例的说明性讨论。在这方面，通过附图进行的描述使本领域技术人员清楚地知道如何实施本发明的实施例。[0038]图1a至1c。宿主遗传学解释了核心微生物群系的组成，可遗传微生物是微生物相互作用网络中的枢纽。核心微生物群系与动物遗传学相关，因为(a)宿主遗传学显着解释了核心微生物群系(y轴)的变异。根据常见的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)，在前30种微生物(otu表)主成分得分及宿主基因型主成分得分的矩阵之间进行典型相关分析(canonicalcorrelationanalysis，cca)。本研究对最大的荷斯坦奶牛场(x轴)进行了分析。(b)基于遗传相关矩阵(geneticrelatednessmatrix，grm)的遗传力分析显示39种微生物(x轴)与动物基因型的显着相关。遗传力估计值–h2(y轴；条形图显示每种微生物的平均估计值)及p值使用遗传复杂性状分析(geneticscomplextraitanalysis，gcta)软件计算，然后使用benjamini-hochberg方法进行多重测试校正。根据遗传力估计及使用随机近似的快速信心区间(fiesta)软件的grm估计信心区间(95％)。(c)与非可遗传微生物相比，这些微生物的平均连接性(y轴)更高，这表明可遗传微生物是微生物相互作用网络的核心。利用生态关联及统计推断的稀疏逆协方差估计(spieceasi)建立了相互作用网络。结果以微生物相互作用的平均数及标准误差表示。指示的p值，带有*的p＜0.05，带有**的p＜0.005，带有***的p＜0.0005。[0039]图2a至图2d。核心瘤胃微生物群系组合物与宿主性状相关，并能显着预测宿主性状。(a)微生物与寄主性状之间的关联分析显示339种微生物至少与一种性状相关。为了使微生物与给定的性状相关联，它必须与至少四个农场中的每一个农场内的性状显着且单向地相关(在benjamini-hochberg多重测试校正后)且没有农场在相反方向上显示出显着的相关性。(b)大多数性状相关的微生物与瘤胃丙酸盐及醋酸盐的浓度有关，而可遗传的微生物在醋酸盐共存的微生物中及丙酸盐反相关的微生物中都很丰富。(c)使用fisher精确检验进行的富集分析表明，与非核心微生物群系相比，在性状相关的微生物中存在(富含)更多核心微生物(p＜2.2e-16)。表示的p值，p＜0.05为*，p＜0.005为**，p＜0.0005为***。(d)不同宿主性状的解释变异(r2)作为核心微生物群系组合物的功能。r2估计值来自机器学习方法，其中使用岭回归(套索回归(leastabsoluteshrinkageandselectionoperator))预测特定动物的性状值，该回归是由农场中所有其他动物构建的(留一回归(leave-one-outregression))。此后，在观察和预测性状值的向量之间计算预测r2值。通过核心微生物(otu)的丰度概况显着解释(经由预测)指示的宿主性状。多个点代表单个农场的预测r2，而条形高度代表单个农场r2的平均值。[0040]图3。与非可遗传的核心微生物相比，可遗传的微生物通常能更好地解释实验变量。x轴：实验变量。y-轴：解释表型的岭回归r2值。点：r2当可遗传的微生物用作自变量时。箱须图与从1,00个作为自变量的非遗传的核心微生物的随机样品中获得的r2值的平均值和标准误差有关。wilcoxon配对秩和检验(wilcoxonpairedrank-sumstest)用于比较可遗传的微生物的r2值，以解释不同实验变量与非遗传的核心微生物(平均r2)的差异。[0041]图4。不同宿主性状的解释变异(r2)与核心微生物组组成的关系。r2估计值来自机器学习方法，其中使用随机森林模型预测特定动物的性状值，该模型是由农场中所有其他动物构建的(留一回归)。此后，在观察和预测性状值的向量之间计算预测r2值。核心微生物(otu)丰度概况显着解释(通过预测)指示的宿主性状。点代表单个农场的预测r2，而条形高度代表单个农场r2的平均值。具体实施方式[0042]在本发明的一些实施例中，本发明涉及一种基于微生物群系中特定细菌的存在来选择反刍动物以获得理想的可遗传性状的方法。[0043]在详细解释本发明的至少一个实施例之前，应当理解，本发明的应用不一定局限于以下描述中阐述的细节或由示例例示的细节。本发明能够以各种方式实施或实现其他实施例。[0044]反刍动物与其瘤胃微生物群系保持着一种可追溯到5000万年前的长期义务关系。在这种独特的宿主微生物群关系中，宿主消化其饲料的能力完全取决于其共同进化的微生物群系。这种非同寻常的结盟提出了反刍动物的遗传及生理学与瘤胃微生物群系的结构、组成及代谢之间的依赖性问题。为了阐明这种关系，本技术的多位发明人研究了宿主遗传学与瘤胃微生物群系的系统发育及功能组成的关联性。他们通过对四个不同欧洲国家的1000头奶牛进行研究，结合来自每只动物的瘤胃微生物群数据和其他表型以及来自动物子集的基因型数据来实现此目标。这种庞大的种群规模发现了新的和意想不到的细菌，该些细菌可以被用于调节这些动物的理想性状。[0045]因此，根据本发明的第一方面，提供了一种选择具有一理想的可遗传性状的一反刍动物的方法，所述方法包括：在所述动物的微生物群系中分析与所述可遗传性状相关的至少一种可遗传细菌的一数量，其中所述可遗传细菌的所述数量指示所述动物是否具有一理想的可遗传性状，其中所述可遗传细菌是如表1所示的多个操作分类单元中的任一者，其中所述性状是表1所示的所述至少一种可遗传细菌的对应性状，从而选择具有一理想的可遗传性状的所述反刍动物。[0046]本发明设想的反刍动物包括例如：牛(例如奶牛)、山羊、绵羊、长颈鹿、美洲野牛、欧洲野牛、牦牛、水牛、鹿、骆驼、羊驼、美洲驼、牛羚、羚羊、叉角羚和印度大羚羊。[0047]根据一个特定实施例，反刍动物是牛或公牛，例如，牛(bostaurusbovines)或荷斯坦牛(holstein-friesianbovines)。[0048]根据特定实施例，选择的动物是新生的动物，通常不超过一天大。根据另一实施例，选择的动物不超过两天大。根据另一实施例，选择的动物不超过三天大。根据另一实施例，选择的动物不超过1周大。根据另一实施例，选择的动物不超过2周大。根据另一实施例，选择的动物不超过1个月大。根据另一实施例，选择的动物不超过3个月大。根据另一个实施例，动物是成年动物。[0049]本文使用的短语“可遗传的性状”(也被称为“可遗传性状”)是指给定群体中个体之间的部分(或全部)变异归因于遗传变异的性状。由于这些遗传变异，从一代到下一代，微生物群系中特定微生物种群(用作标记)的相对或绝对丰度在统计学上是相似的。[0050]当微生物在一组动物中的丰度变化可以用动物之间的遗传差异来解释时，该微生物可以被归类为可遗传的微生物。[0051]可以在本发明的上下文中使用的统计方法包括但不限于：单成分grm方法、maf分层greml(gremllms)、ldl及maf分层greml(gremllldms)、单成分及maf分层ld调整亲属关系(ldak-sc及ldak-ms)、具有阈值grm的扩展系谱，treelet协方差平滑法(tcs)、ld评分回归及bolt-reml。[0052]根据特定实施例，可遗传细菌如下文表1所示。因此，例如，可遗传细菌可能属于毛螺菌科或普雷沃氏菌属。[0053]在一个实施例中，该性状是表1所列的细菌的相应性状。因此，该性状可能是瘤胃丙酸盐、瘤胃醋酸盐、瘤胃丁酸盐、牛奶乳糖、产奶量、乳脂、瘤胃ph值及瘤胃β-羟基丁酸(beta-hydroxybutyricacid，bhb)。[0054]下文的表1还提供了宿主性状与瘤胃微生物群系中特定细菌数量之间的相关性。因此，例如，表1的第一行涉及一种细菌(具有如seqidno:7所示的16srrna序列)，其丰度与瘤胃丙酸盐呈负相关。如果期望的性状为低瘤胃丙酸盐，则所选动物将具有高于预定水平的具有seqidno:7中所述的16srrna序列的细菌数量。如果期望的性状为高瘤胃丙酸，则所选动物将具有低于预定水平的具有seqidno:7中所述的16srrna序列的细菌数量。表1中的其他细菌及其相应性状也可以用同样的方法选择。[0055]根据一个实施例，当一只动物的性状至少比畜群(畜群至少为15只)的平均性状量低0.05、1、2、3、4、5甚至6个标准差时，该动物可被归类为具有低性状(例如出现在表1或表2中的性状)。[0056]根据一个实施例，当一只动物的性状至少比畜群(畜群至少为15只)的平均性状量高0.05、1、2、3、4、5甚至6个标准差时，该动物可被归类为具有高性状(例如出现在表1或表2中的性状)。[0057]本文使用的术语“微生物群系(microbiome)”是指在规定环境中的微生物(细菌、真菌、原生动物)及其遗传元素(基因组)的总体。[0058]微生物群样品包括来自微生物群系的微生物及/或其成分或产物的样品。[0059]根据一个特定的实施例，该微生物群系是瘤胃微生物群系。在另外一些实施例中，该微生物群系是粪便微生物群系。[0060]根据另一个实施例，该微生物群系来自健康动物(即该微生物群系为非致病性微生物群系)。[0061]为了分析微生物群系的微生物，从动物身上收集微生物组样品。这是通过任何允许回收微生物群系的微生物或其成分或产品的手段而进行的，并且适合相关的微生物群系来源，例如瘤胃。[0062]可以用本领域已知的方法收集瘤胃，例如包括使用带有瘤胃真空采样器的胃管。通常在喂食后收集胃管。[0063]在一些实施例中，代替分析瘤胃样品，使用反映瘤胃的微生物群系的粪便样品。因此，在这个实施例中，分析粪便微生物群系。[0064]根据本发明这方面的一个实施例，分析微生物群系样品中特定细菌分类群的丰度。[0065]下文描述了量化各种分类群的微生物(如细菌)的水平的方法。[0066]在一些实施例中，确定一种或多种类型的微生物或其成分或产物的水平或一组水平(setoflevels)包括确定一个或多个dna序列的水平或一组水平。在一些实施例中，一个或多个dna序列包括可用于区分不同微生物类型的任何dna序列。在某些实施例中，一个或多个dna序列包括16srrna基因序列。在某些实施例中，一个或多个dna序列包括18srrna基因序列。在一些实施例中，1、2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、1000、5000或更多序列被放大。[0067]可使用适当的计算机程序(如：blast)对适当的参考数据库(如16srrna参考数据库)进行物种的分类学分配。[0068]在确定核酸或蛋白质是否与本发明的序列基本同源或共享一定百分比的序列一致性时，序列相似性可由常规算法定义，其通常允许引入少量间隙以实现最佳拟合。特别的，使用karlin和altschul算法(proc.natl.acad.sci.usa87:2264-2268，1993年)确定两个多肽或两个核酸序列的“一致性百分比(percentidentity)”。这种算法被纳入了altschul等人的blastn及blastx程序中(j.mol.biol.215:403-410，1990年)。可以使用blastn程序执行blast核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。同样地，可以使用blastx程序执行blast蛋白质搜索，以获得与本发明的多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙对准，如altschul等人(nucleicacidsres.25:3389-34021997)所述，利用间隙blast。当使用blast及间隙blast程序时，将使用相应程序(例如blastx和blastn)的默认参数。[0069]根据一个实施例，为了将微生物分类为属于特定属(genus)，它必须包含与已知属于特定属的参考微生物具有至少90％的序列同源性、至少91％的序列同源性、至少92％的序列同源性、至少93％的序列同源性、至少94％的序列同源性、至少95％的序列同源性、至少96％的序列同源性、至少97％的序列同源性，至少98％的序列同源性，至少99％的序列同源性。根据特定实施例，序列同源性至少为95％。[0070]根据另一实施例，为了将微生物分类为属于特定物种，它必须包含与已知属于特定属的参考微生物具有至少90％的序列同源性、至少91％的序列同源性、至少92％的序列同源性、至少93％的序列同源性、至少94％的序列同源性、至少95％的序列同源性、至少96％的序列同源性、至少97％的序列同源性、至少98％的序列同源性、至少99％的序列同源性。根据特定实施例，序列同源性为至少97％。[0071]在一些实施例中，直接分析微生物群样品的一个或多个dna序列的一水平或一组水平。在一些实施例中，从微生物群样品中分离dna，并对分离的dna进行一个或多个dna序列的一个或一组水平的分析。分离微生物dna的方法在本领域是众所周知的。多个示例包括但不限于酚氯仿萃取及多种商用试剂盒，包括qjaampdna粪便迷你试剂盒(qiagen，瓦伦西亚区，加利福尼亚州)。[0072]在一些实施例中，通过使用pcr(例如，标准pcr、半定量pcr或定量pcr)扩增dna序列来确定一个或多个dna序列的水平或一组水平。在一些实施例中，使用定量pcr扩增dna序列来确定一个或多个dna序列的一水平或一组水平。这些及其他基本的dna扩增程序为本领域的从业者所熟知，并被描述在ausebel等人的文献中(ausubelfm,brentr,kingstonre,moored,seidmanjg,smithja,struhlk(eds)。1998年。分子生物学现代方法(currentprotocolsinmolecularbiology)。wiley:纽约)。[0073]在一些实施例中，使用特异于一个或多个序列的引物扩增dna序列，该些序列将单个微生物类型与其他不同微生物类型区分开来。在一些实施例中，使用特异于16srrna基因序列的引物扩增16srrna基因序列或其片段。在一些实施例中，使用特异于18sdna序列的引物扩增18sdna序列。[0074]在一些实施例中，使用系统发育芯片技术确定一个或多个16srrna基因序列的水平或一组水平。系统发育芯片的使用在本领域中是众所周知的，并被描述在hazen等人的文献中(“深海油舌丰富了当地的石油降解细菌(deep-seaoilplumeenrichesindigenousoil-degradingbacteria)”science,330,204-208,2010)，其整体内容通过引用的方式并入本文中。简而言之，从微生物群样品中提取的dna中扩增并标记16srrna基因序列。然后将经扩增的dna与含有用于微生物16srrna基因的探针的阵列杂交。然后，通过提供与所探测的16srrna基因序列相对应的微生物类型的样品水平，对每个探针的结合水平进行量化。在一些实施例中，系统发育芯片分析分析由商业供应商执行。多个例子包括但不限于第二基因组公司(旧金山，加利福尼亚州)。[0075]在一些实施例中，确定一种或多种微生物或其组成成分或产品的水平或一组水平包括确定一种或多种微生物rna分子(例如转录物)的水平或一组水平(例如，转录物)。量化rna转录物的水平的多种方法在本领域中是众所周知的，该些方法包括但不限于北方分析、半定量逆转录酶pcr、定量逆转录酶pcr及芯片分析。这些及其他rna转录物侦测程序被描述在ausebel等人的文献中(ausubelfm,brentr,kingstonre,mooredd,seidmanjg,smithja,struhlk(eds)。1998年，分子生物学现代方法，wiley:纽约)。[0076]在一些实施例中，确定一种或多种微生物或其组成成分或产品的水平或一组水平包括确定一种或多种微生物蛋白的水平或一组水平。量化蛋白质的水平的多种方法在本领域中是众所周知的，该些方法包括但不限于西方分析及质谱分析。这些及其他基本蛋白质侦测程序被描述在ausebel等人的文献中(ausubelfm,brentr,kingstonre,mooredd,seidmanjg,smithja,struhlk(eds)。1998年，分子生物学现代方法，wiley:纽约)。在一些实施例中，确定一种或多种微生物或其组成成分或产品的水平或一组水平包括确定一种或多种微生物代谢产物的水平或一组水平。在一些实施例中，通过质谱仪确定代谢产物的水平。在一些实施例中，通过核磁共振波谱确定代谢产物的水平。在一些实施例中，通过酶联免疫吸附测定(elisa)确定代谢产物的水平。在一些实施例中，通过比色法确定代谢产物的水平。在一些实施例中，通过质谱仪分析确定代谢产物的水平。[0077]在一些实施例中，确定的是所述微生物群系中的多个微生物科(families)的分布。然而，如果需要的话，特征分析可以进行到更详细的层次，例如到属(genus)及/或种(species)的层次以及/或者到一个物种内的菌株或变异(例如变体)的层次(包括各种遗传元素(例如基因)的存在或不存在，质粒的存在或不存在等)。替代地，可以采用更高阶的分类名称，如门(phyla)、纲(class)或目(order)。目的是确定来自反刍动物的样品中存在哪些微生物(通常是细菌，但也可选择为真菌(例如酵母菌)、原生生物等)以及这些微生物的相对分布，举例来说，以存在的微生物总数的百分比表示，从而为被测试的动物建立一个微生物丛模式(microfloralpattern)或特征。[0078]在本发明的其他实施例中，当考虑许多分类群时，将评估微生物丛的整体模式，即不仅确定特定分类群，而且考虑每个组成分类群的百分比并且与检测到的所有分类群进行比较，通常或选择性地相互比较。本领域技术人员将理解目前存在表达或编译此类数据的许多可能方式，所有这些方式均包含在本发明中。例如，“饼图”格式可用于描绘微生物丛的特征；替代地，这些关系可以用数字或图形表示为检测到的所有分类群的比率或百分比等。此外，可以对数据进行处理，以便只考虑选定的分类群子集(例如，具有强正相关的关键指标)。数据可以表示为检测到的微生物总数的百分比或重量百分比等。此外，可以对数据进行处理，以便只考虑选定的分类群子集(例如，具有强正相关的关键指标)。数据可以表示为检测到的微生物总数的百分比或重量百分比等。[0079]为了识别微生物物种，其中丰度曲线的变化有很大一部分可归因于可遗传的遗传因素，对微生物群样品进行分析，以发现在具有类似遗传背景的动物中表现出类似丰度(无论是绝对丰度或相对丰度)的微生物的分类群(如物种)。[0080]分析两种反刍动物的遗传背景的相似性的方法可以使用本领域已知的基因分型分析进行。[0081]如本文所用，“基因分型(genotyping)”指的是确定一个物种中个体间遗传变异的过程。多种单核苷酸多态性(snp)是用于基因分型的最常见的遗传变异类型，根据定义，snp是在超过1％的人群中发现的特定位点上的单碱基差异。多种snp存在于基因组的编码区及非编码区，并可与感兴趣的表型性状相关，例如感兴趣的数量表型性状。因此，多种snp可以用作感兴趣的数量表型性状的标记。用于基因分型的另一种常见遗传变异类型是“indels”或不同长度核苷酸的插入及删除。对于snp及indel基因分型，存在许多方法来确定个体之间的基因型。选择的方法通常取决于所需的通量(throughput)，这是被基因分型的个体数量及每个个体被检测的基因型数量的函数。选择的方法还取决于来自每个个体或样品的可用样品材料量。例如，测序可用于确定标记的存在或不存在，如多种snp，例如桑格测序(sangersequencing)及高通量测序技术(hts)。桑格测序可能涉及经由(毛细管)电泳检测进行测序，一次可对多达384根毛细管进行序列分析。高通量测序涉及同时对数千、数百万或更多序列进行平行测序。hts可被定义为下一代测序，即基于固相焦磷酸测序的技术或基于单核苷酸实时测序(smrt)的下一代测序。hts技术由罗氏(roche)、illumina和应用生物系统(lifetechnologies)提供。更多的高通量测序技术由helicos、太平洋生物科学(pacificbiosciences)、完整基因组学(completegenomics)、离子激流系统(iontorrentsystems)、牛津纳米孔技术(oxfordnanoporetechnologies)、nabsys、zsgenetics、gnubio描述及/或提供。这些测序技术中的各者在实际测序步骤之前都有自己的样品制备方法。这些步骤可以被包括在高通量测序方法中。在某些情况下，出于效率或经济原因，在实际测序步骤之前，可将测序步骤中的特定步骤整合到样品制备方案中。例如，连接到片段的接头(adapters)可能包含可在后续测序步骤中使用的部分(所谓的测序接头)。测序前用于扩增片段子集的多种引物可能包含其序列中的多个部分，这些部分引入了稍后可用于测序步骤的片段，例如，通过扩增步骤引入测序接头或扩增子中可用于后续测序步骤的捕获部分。根据所使用的测序技术，扩增步骤也可以被省略。[0082]本发明可考虑使用低密度及高密度芯片，包括包含3000到800000个snp的snp阵列。例如，“50k”snp芯片测量约50000个snp，该芯片通常用于畜牧业，以确定遗传价值(geneticmerit)或基因组估计育种值(gebv)。在本发明的某些实施例中，可使用以下任一种snp芯片：bovinesnp50v1beadchip(illumina)、bovinesnpv2beadchip(illumina)、bovine3kbeadchip(illumina)、bovineldbeadchip(illumina)、bovinehdbeadchip(illumina)、geneseekrtmgenomicprofilertmldbeadchip或geneseekrtmgenomicprofilertmhdbeadchip。[0083]在一个实施例中，为了测量动物之间的遗传相似性，基于snp数据计算动物之间的遗传相关性。为此，可以制作一个矩阵来估计每对独特的动物之间的遗传相关性。该矩阵基于共享等位基因的计数，由等位基因的稀有性加权：[0084]其中ajk代表动物j和k之间的遗传关系估计；xij和xik分别是动物j和k中参考等位基因的计数；pi是参考等位基因在群体中的比例；n是用于相关性估计的snp总数。[0085]在一个实施例中，如果微生物或多个otu的遗传力估计值大于0.01且p值小于0.1，则将其视为具有显着可遗传成分的微生物或otu。应当理解，置信水平可根据测试的严格程度而增加或减少。因此，例如在另一个实施例中，如果表现出显着可遗传成分的微生物的遗传力估计值大于0.01且p值小于0.05，则将其视为显着可遗传成分。本发明人设想的其他设想遗传力估计值包括大于0.02且p值小于0.1，大于0.03且p值小于0.1，大于0.04且p值小于0.1，大于0.05且p值小于0.1，大于0.06且p值小于0.1，大于0.07且p值小于0.1，大于0.08且p值小于0.1，大于0.09且p值小于0.1，大于0.1且p值小于0.1，大于0.2且p值小于0.1，大于0.3且p值小于0.1，大于0.4且p值小于0.1，大于0.5且p值小于0.1，大于0.6且p值小于0.1，大于0.7且p值小于0.1，大于0.8且p值小于0.1。[0086]本发明人设想的其他设想遗传力估计值包括大于0.02且p值小于0.05、大于0.03且p值小于0.05、大于0.04且p值小于0.05、大于0.05且p值小于0.05、大于0.06且p值小于0.05、大于0.07且p值小于0.05、大于0.08且p值小于0.05、大于0.09且p值为0.05、大于0.1且p值为0.05、大于0.2且p值为0.05，大于0.3且p值为0.05，大于0.4且p值为0.05，大于0.5且p值为0.05，大于0.6且p值为0.05，大于0.7且p值为0.05，大于0.8且p值为0.05。[0087]根据特定实施例，遗传力估计值大于0.7且p值小于0.05。[0088]为了增加分析的可信度，遗传力分析可能仅限于存在于至少20％、25％、30％、40％、50％或更高基因型子集中的细菌分类群。此外，每个细菌分类群的遗传力分析可以被执行多次，例如在不同的采样日(例如，2、3、4、5或更多天)进行。只有在所有单个采样日内表现出显着可遗传成分的细菌分类群(例如遗传力估计值大于0.7且p值小于0.05)才能够被视为是可遗传的。[0089]本文使用的术语“otu”是指系统发育树中的末端叶，该otu由核酸序列定义，例如整体基因组或特定的基因序列，以及在物种水平上与该核酸序列具有序列一致性的所有序列。在一些实施例中，特定基因序列可以是16s序列或16s序列的一部分。在其他实施例中，对两个实体的整体基因组进行测序及比较。在另一实施例中，可选择诸如多位点序列标签(mlst)、特定基因或基因组等区域以进行遗传比较。在16s实施例中，在整体16s或16s的一些可变区域中共享大于97％平均核苷酸同一性的otu被认为是相同的otu。例如，参见claesson等人，2010年。比较两种下一代测序技术，使用串联可变16srrna基因区域解析高度复杂的微生物群组成。nucleicacidsres38:e200.konstantinidis等人，2006年。基因组时代的细菌种类定义，philostransrsoclondbbiolsci361:1929-1940。在涉及完整基因组的实施例中，mlst、除16s以外的特定基因或共享大于95％平均核苷酸一致性的基因组otu被视为相同的otu。例如，参见achtman及wagner，2008年。微生物多样性及微生物物种的遗传性质，nat.rev.microbiol.6:431-440；konstantinidis等人，2006年，同上。基因组时代的细菌种类定义。philostransrsoclondbbiolsci361:1929-1940。多个otu可以通过比较生物体之间的序列来定义。通常，序列一致性小于95％的序列不被视为构成相同otu的一部分。多个otu还可以由核苷酸标记或基因的任何组合来表征，尤其是高度保守的基因(例如，“管家”基因)或其组合。例如，这种表征采用wgs数据或全基因组序列。如本文所用，细菌的“类型”指的是可以处于菌株、物种、进化支或科的层级的otu。[0090]本发明还设想分析多个上述otu。因此，至少一个otu、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或以上所述的所有otu都被分析。[0091]应当理解，一旦动物被分类为具有足够数量的与理想表型相关的可遗传微生物，就可以选择该动物(例如，与畜群的其余部分分离)并将其分类为具有该表型。根据一个实施例，该动物被标记为清楚地包含该表型。[0092]除了选择具有理想表型的特定动物外，本发明人还设想从不具有理想表型的畜群中移除(例如扑杀)动物。该动物可能被标记为具有不理想的表型。因此，本发明可用于管理畜群，以确保畜群中具有理想表型的动物的百分比处于其最大值及/或畜群中具有非理想表型的动物的百分比处于其最小值。[0093]在一个实施例中，选择被认为具有理想性状的动物作为育种候选。因此，该动物可能被认为适合作为配子供体以进行自然交配、人工授精或体外受精。[0094]因此，根据本发明的另一个方面，提供了一种培育反刍动物的方法，包括：使用来自雄性反刍动物的精液使根据本文所述方法选择的雌性反刍动物受精，从而培育反刍动物。[0095]在一个实施例中，所述雄性反刍动物也可经由本文所述的方法进行选择。[0096]根据本发明的另一个方面，提供了一种培育反刍动物的方法，包括：利用来自如上所述选择的雄性反刍动物的精液使雌性反刍动物受精，从而培育反刍动物。[0097]一头或多头公牛与奶牛的培育最优选地是通过人工授精，但也可以通过自然授精。[0098]在一个实施例中，所述雌性反刍动物也可经由本文所述的方法进行选择。[0099]本发明人在瘤胃微生物群系中发现了额外的可遗传细菌。表3总结了可遗传细菌。通过培育在瘤胃微生物群系中含有其中一种可遗传细菌的动物，可以确保该动物的后代在其瘤胃微生物群系中也含有这种细菌。如果可遗传细菌与特定性状相关(参见表1)，则通过培育具有包含这些可遗传细菌和相关性状之一的瘤胃微生物群系的动物，可以确保该动物的后代在其瘤胃微生物群系中也包含该细菌，并且因此能够凭借这种性状。[0100]因此，根据本发明的另一方面，提供了一种增加具有一理想的微生物群系的反刍动物数量的方法，所述方法包括培育雄性及雌性的反刍动物，其中所述雄性及/或雌性的反刍动物中的任一者的所述瘤胃微生物群系包括一可遗传微生物，所述可遗传微生物具有如表3所示高于一预定水平的一操作分类单元(otu)，从而增加具有一理想的微生物群系的反刍动物的数量。[0101]如上所述，除了选择具有理想的微生物群系的特定动物外，本发明人还设想从不具有理想的微生物群系的畜群中移除(例如扑杀)动物。因此，本发明可用于管理畜群，确保畜群中具有理想微生物群系的动物百分比达到最大值及/或畜群中具有非理想微生物群系的动物百分比达到最小值。[0102]本发明人还发现了许多与性状有关的细菌。因此，本发明人提出通过改变反刍动物的瘤胃微生物群系来决定其性状。[0103]根据本发明的这一方面，理想的微生物群系是包含可遗传细菌的微生物群系。因此，本发明人设想可遗传细菌本身可被认为是可遗传的性状。[0104]因此，根据本发明的另一方面，提供一种改变反刍动物的一性状的方法，所述方法包括：向所述反刍动物提供一微生物组合物，所述微生物组合物包括至少一种微生物，所述微生物具有如表2所示的一操作分类单元(otu)以及具有如seqidno：38-50及314-615所示的一16srrna序列，从而改变所述反刍动物的所述性状，其中所述微生物组合物不包括所述反刍动物的一微生物群系，其中所述性状是表2所示的所述至少一种微生物的对应性状。[0105]根据一特定实施例，该细菌具有如seqid:38-50及314-615所示的16srrna序列。[0106]在一个实施例中，微生物组合物包括至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种、至少十种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少16种、至少17种、至少18种、至少19种或至少20种或以上的表2中提到的微生物物种。[0107]优选地，本发明的此方面的微生物组合物包括至少两种微生物物种。在一个实施例中，本发明这方面的微生物组合物包含少于100种微生物物种、少于50种微生物物种、少于40种微生物物种、少于30种微生物物种。微生物物种的典型范围包括2至100、2至50、2至25、2至20、2至15、2至10。[0108]微生物组合物可直接从高能源效率的动物的微生物样品中获得。替代地，可以通过添加已知量的不同微生物来人工创建微生物组合物。应当理解，可通过增加特定物种的量(例如，增加/或消耗特定物种的量)在施用之前操纵源自动物的微生物样品的微生物组合物。在另一个实施例中，微生物组合物未以任何用于改变微生物物种与其中所含分类群之间的相对平衡的方式进行处理。在一些实施例中，在施用之前，使用已知培养方法体外扩增微生物组合物。在其他实施例中，在施用之前不在体外扩增微生物组合物。[0109]根据一个实施例，所述微生物组合物并非源自粪便材料。[0110]根据又一实施例，所述微生物组合物不含(或仅包含微量)粪便物质(例如，纤维)。[0111]施用前，可使用用于减少自然产生的瘤胃微生物群系数量的试剂(例如，通过抗生素治疗)对动物进行预处理。根据特定的实施例，所述处理显着地将自然产生的瘤胃微生物丛消除至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％。[0112]除了增加动物的瘤胃微生物群系中的上述细菌种群外，本发明人还考虑减少下文表2中所述的任何一种细菌物种，从而改变相应的性状。[0113]根据特定实施例，所述细菌具有如seqidno1-37及51-313所示的16srrna序列。[0114]根据一个实施例，降低细菌丰度的试剂不是抗生素试剂。[0115]根据另一实施例，降低细菌丰度的试剂为抗菌肽。[0116]根据另一个实施例，降低细菌丰度的试剂是噬菌体。[0117]根据又一实施例，降低细菌丰度的试剂能够下调本文所述多个细菌物种中至少一个细菌物种的必需基因。[0118]因此，例如，本发明人考虑使用巨核酸酶，例如多种锌指核酸酶(zincfingernucleases，zfn)、多种转录激活因子样效应核酸酶(transcription-activatorlikeeffectornucleases，talen)及crispr/cas系统来下调必需基因。[0119]crispr-cas系统：许多细菌及古细菌含有内源性的基于rna的适应性免疫系统，该免疫系统可以降解入侵噬菌体及质粒的核酸。这些系统由产生rna成分的规律间隔成簇短回文重复序列(crispr)基因及编码蛋白质成分的crispr相关基因(cas)组成。多个crisprrna(crrna)包含与特定病毒和质粒同源的短片段，并作为指导以引导cas核酸酶降解相应病原体的互补核酸。针对化脓性链球菌的ii型crispr/cas系统的研究表明，三种组分形成rna/蛋白质复合物，并且三种组分一起足以产生序列特异性核酸酶活性：cas9核酸酶，一种含有20个与目标序列同源的碱基对的crrna，以及反式激活的crrna(tracrrna)(jinek等人，science(2012年)337:816-821)。进一步证明，由crrna及tracrrna融合而成的合成嵌合指导rna(grna)可以在体外引导cas9切割与crrna互补的多个dna靶点。研究还进一步证明，cas9的瞬时表达结合合成的多个grna可被用于在多种不同物种中产生靶向双股断裂(cho等人，2013年；cong等人，2013年；dicarlo等人，2013年；hwang等人，2013a，b；jinek等人，2013年；mali等人，2013年)。[0120]用于基因组编辑的cripsr/cas系统包含两个不同的组成部分：grna及内切酶，例如cas9。[0121]grna通常是20个核苷酸的序列，该序列编码目标同源序列(crrna)及内源性细菌rna的组合，该内源性细菌rna在单个嵌合转录物中将crrna连接至cas9核酸酶(protospaceradjacentmotif，tracrrna)。grna/cas9复合物通过grna序列与补体基因组dna之间的碱基配对而被招募到目标序列。为了成功结合cas9，基因组目标序列还必须包含紧跟在目标序列之后的正确原间隔区相邻基序(pam)序列。grna/cas9复合物的结合使cas9定位于基因组目标序列，因此cas9可以切割dna的两条链，导致双链断裂。如同多个zfn及talen，由crispr/cas产生的双链断裂可以进行同源重组或nhej。[0122]cas9核酸酶有两个功能域：ruvc及hnh，每个功能域切割不同的dna链。当这两个功能域都激活时，cas9会导致基因组dna中的双链断裂。[0123]crispr/cas的一个显着优势是该系统的高效性加上易于创建多个合成的grna的能力，使多个基因能够同时被靶向。此外，大多数携带突变的细胞在目标基因中存在双等位基因突变(biallelicmutations)。[0124]然而，grna序列及基因组dna目标序列之间的碱基配对相互作用的明显灵活性使得与目标序列的不完全匹配可以被cas9切割。[0125]含有单一非活性催化域(ruvc-或hnh-)的改良版cas9酶被称为“内切酶(nickases)”。由于只有一个活性核酸酶结构域，cas9内切酶只切割目标dna的一条链，形成一个单链断裂或“缺口”。使用完整的互补dna链作为模板，单链断裂或缺口通常通过hdr途径快速修复。然而，在通常被称为“双缺口”crispr系统中，由cas9-内切酶引入的两个近端相反的链缺口被视为双链断裂。双缺口可以通过nhej或hdr修复，其取决于对基因靶点的预期效果。因此，如果特异性及减少脱靶效应是至关重要的，使用cas9内切酶通过设计与目标序列相近且位于基因组dna相反链上的两个grna来创造双缺口将减少脱靶效应，因为单独的grna将导致缺口不改变基因组dna。[0126]含有两个非活性催化结构域(死cas9或dcas9)的改良版cas9酶不具有核酸酶活性，但仍然能够基于grna特异性与dna结合。dcas9可以作为dna转录调节因子的平台，通过将非活性酶融合到已知的调节域来激活或抑制基因表达。例如，dcas9单独与基因组dna中的目标序列结合会干扰基因转录。[0127]许多公开可用的工具可用于帮助选择及/或设计目标序列，以及生物信息学确定的多个独特grna的列表可用于不同物种中的不同基因，例如，张峰实验室的目标查找器、迈克尔·布特罗斯实验室的目标查找器(e-crisp)、rgen工具：cas-offinder，casfinder：用于识别基因组中特定cas9靶点的灵活计算程序及crispr最佳靶点查找器。[0128]为了使用crispr系统，grna及cas9都应该在目标细胞中被表达。插入载体可以包含单个质粒上的两个盒(cassettes)，或者盒由两个单独的质粒表达。crispr质粒可在市场上买到，如addgene的px330质粒。[0129]本文所述的组合物(例如，微生物组合物)可单独施用(例如，使用导管或注射器)，或可在动物的饲料(例如，作为饲料添加剂)或动物的饮料中一起施用。[0130]这些反刍动物可在其一生中的任何时间以任何量被喂食本发明的饲料添加剂组合物。也就是说，反刍动物可以通过单独或作为包含其他饲料的日粮的一部分而被喂食本发明的饲料添加剂组合物。此外，反刍动物可在其一生中的任何时间被喂食本发明的饲料添加剂组合物。反刍动物可以被连续、定期或间歇地喂食本发明的饲料添加剂组合物。反刍动物可以被喂食本发明的饲料添加剂组合物，喂食量应使其在反刍动物一生的任何时间段内占反刍动物饲料中的全部、大部分或少数饲料。根据一个实施例，向反刍动物喂食本发明的饲料添加剂组合物，喂食量应使其在动物一生的大部分时间内占动物饲料中的大部分。[0131]可与本发明的饲料添加剂一起提供的额外瘤胃活性饲料添加剂的实例包括缓冲剂、发酵可溶物、精油、表面活性剂、莫能菌素钠、有机酸及补充酶。[0132]本发明还考虑使用本领域已知的方法将微生物封装在纳米颗粒或微粒中，已知的方法包括ep085805、ep1742728a1、wo200610038a2及us8449916中公开的方法，其内容通过引用的方式并入本文中。[0133]可通过口服、直肠或对动物有益的任何其他方式施用所述组合物，以使微生物到达动物的瘤胃。[0134]在另一个实施例中，本发明提供了通过喂食反刍动物这种饲料添加剂组合物来饲养反刍动物的新方法。[0135]如本文所用，术语“约”指的是±10％[0136]术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”及其变化形式表示“包括但不限于”。[0137]术语“由…组成”表示“包括并限于”。[0138]术语“基本上包括”指该组合物、方法或结构可包括附加成分、步骤及/或部分，但前提是附加成分、步骤及/或部分不会实质性改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本及新颖特征。[0139]如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。[0140]在本技术中，本发明的各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便及简洁，不应被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被视为已经明确地公开了该范围内所有可能的子范围以及单个数值。例如，诸如从1到6的范围的描述应被视为具有具体公开的子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5及6。这适用于任何范围的宽度。[0141]每当本文指示数字范围时，其意指包括指示范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在第一指示数字及第二指示数字之间的范围”以及“从第一指示数字到第二指示数字之间的范围”在本文中可交换地使用，并且意味着包括第一指示数字及第二指示数字以及它们之间的所有小数及整数。[0142]如本文所用，术语“方法”是指完成给定任务的方式、方法、技术及程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学及医学领域的从业者已知的或从已知的方式、方法、技术及程序发展而来的那些方式、方法、技术及程序。[0143]应当理解，为清楚起见，在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合在单个实施例中提供。相反，为简洁起见，在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以被单独提供，或者在任何合适的子组合中提供，或者在本发明的任何其他描述的实施例中提供。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不应被视为这些实施例的基本特征，除非在没有这些元件的情况下该实施例无法操作。[0144]如上文所述以及如下文权利要求部分所述的本发明的各种实施例及方面在以下示例中得到实验支持。[0145]多个示例：[0146]现在参考以下示例，其与上述描述一起以非限制性方式示出本发明的一些实施例。[0147]通常，本文使用的命名法和及发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物及重组dna技术。这些技术在文献中有详尽的解释。例如，参见“分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)”，sambrook等人(1989年)；“分子生物学中的当前方案(currentprotocolsinmolecularbiology)”第1-3卷，ausubel，r.m.编辑(1994年)；ausubel等人，“分子生物学的当前方案(currentprotocolsinmolecularbiology)”，johnwiley及sons，马里兰州(1989年)；perbal，“分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)”，johnwiley及sons，纽约(1988年)；watson等人，“重组dna(recombinantdna)”，美国科学出版社，纽约；birren等人(编辑)，“基因组分析：实验室手册系列(genomeanalysis:alaboratorymanualseries)”，卷1-4，冷泉港实验室出版社，纽约(1998年)；美国专利中规定的方法，第4666828号；4,683,202；4,801,531；5192659和5272057；“细胞生物学：实验室手册(cellbiology:alaboratoryhandbook)”，第1-3卷，cellis，j.e.编辑(1994年)；“动物细胞培养-基本技术手册(cultureofanimalcells-amanualofbasictechnique)”，freshney,wiley-liss，纽约州(1994年)，第三版；“免疫学的当前方案(currentprotocolsinimmunology)”第1-3卷，coliganj.e.版(1994年)；stites等人(编辑)，“基础和临床免疫学(basicandclinicalimmunology)”(第8版)，appleton&lange，诺沃克，ct(1994年)；mishell和shiigi(编辑)，“细胞免疫学中的选择方法(selectedmethodsincellularimmunology)”，w.h.freemanandco.，纽约(1980年)；专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫分析方法，例如参见美国专利第3791932号；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5011771和5281521；“寡核苷酸合成(oligonucleotidesynthesis)”gait,m.j编辑(1984年)；“核酸杂交(nucleicacidhybridization)”hames,b.d.和higginss.j.编辑(1985年)；“转录与转译(transcriptionandtranslation)”hames,b.d.和higginss.j.编辑(1984年)；“动物细胞培养(animalcellculture)“freshney，r.i.编辑(1986年)“固定化细胞与酶(immobilizedcellsandenzymes)”irl出版社(1986年)；“分子克隆实用指南(apracticalguidetomolecularcloning)”perbal，b.(1984年)和“酶学方法(methodsinenzymology)”第1-317卷，学术出版社；“pcr方案：方法和应用指南(pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications)”，学术出版社，加利福尼亚州圣地亚哥(1990年)；marshak等人，“蛋白质纯化和特性分析策略-实验室课程手册(strategiesforproteinpurificationandcharacterization-alaboratorycoursemanual)”，cshl出版社(1996年)；所有这些内容均以引用的方式并入本文件，如同本文件中完全阐述的一样。本文件中还提供了其他一般参考资料。其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了方便读者而提供的。此处包含的所有信息通过引用的方式并入本文中。[0148]材料及方法：[0149]实验设计及主题细节[0150]本研究的主要目的是将动物基因组与泌乳奶牛的瘤胃微生物群系、饲料效率及甲烷排放量联系起来。从一开始就详细说明以下研究问题：宿主遗传学对整体微生物群系的组成是否具有显着影响？影响程度如何？不同地理位置、品种及日粮的瘤胃微生物群系的一astronauta3,lelyukltd.,stneots,uk)，平均每天挤奶2.85次。[0161]在采样期间，从每头奶牛的四次挤奶中采集牛奶样品，利用含有溴硝醇及纳他霉素(d&fcontrolsystemsinc，加利福尼亚州圣拉蒙)或溴硝醇(valioltd，芬兰)的广谱microtabsii保存，并在4℃下储存，直到分析。使用中红外仪器(fossmilkoscan、foss、denmark或类似仪器)分析牛奶样品中的脂肪、蛋白质、乳糖及尿素浓度。牛奶成分的平均浓度是通过将浓度与晚上及早上挤奶时的产奶量成比例加权而计算的。[0162]在每个采样期间记录体重三次(se)或两次(it，fi)，并在uk的每次挤奶期间自动记录体重。计算每头牛的平均体重。[0163]采食量测量与估算[0164]在se及fi的每个采样期间，分别使用粗饲料摄入控制(ric)喂食器(insentecb.v.，marknesse，荷兰)以及手动的方式分别记录每天的采食量。在uk及it，使用饲料及粪便(27)中的不可消化标记物(烷烃)来估计采食量。在uk，通过挤奶时喂养的浓缩物来施用烷烃(c30及c32)，在it则是当奶牛被锁在锁头轭上时，通过剂量枪(bolusgun)来施用。通过ric喂食器(英国fullwood有限公司，埃尔斯米尔，英国)同时直接测量uk中的50头奶牛的个体采食量，并将该方法应用于it(28)中的一个研究畜群中的个体奶牛的采食量，从而对估计采食量的烷烃方法进行验证。[0165]收集瘤胃样品[0166]所有中心都对瘤胃液体取样方法进行了标准化，并使用专门为牛设计的瘤胃探测器(ruminator；profsproducts.com)。该探测器包括一个穿孔黄铜圆筒，该圆筒连接到一根加强软管、一个吸入泵及一个收集容器。将黄铜圆筒轻轻地推到奶牛的嘴巴后面，轻轻地施加压力，直到装置被吞咽到管道上的一个环为止，该环表明在瘤胃中的正确定位。第一公升的瘤胃液体被丢弃以避免唾液污染，接下来的0.5公升被保留用于取样。在奶牛之间利用自来水彻底冲洗装置。[0167]在早晨给奶牛喂食后的2至5小时的取样期内，在一天内收集瘤胃液样品。对于所有样品，立即记录瘤胃液的ph值。旋转后，利用移液管将四分试样(各1ml)移入抗冻管(容量为2ml)，立即在液氮或干冰中冷冻该些试样，在-80℃下储存，并在取样日后一个月内冷冻干燥。利用移液管将另外四份2.5ml的试样移入含有0.5ml的25％偏磷酸的离心管中进行挥发性脂肪酸(vfa)及氨氮分析，在1000g下离心3分钟，并将上清液转移至新鲜管中。在实验室分析之前，将试管密封并在-20℃下冷冻。[0168]瘤胃挥发性脂肪酸测定[0169]采用playne(29)法，通过气相色谱法测定挥发性脂肪酸浓度。通过使用酶紫外法(如randoxlaboratories有限公司，克拉姆林，英国)的临床化学自动分析仪进行光度测试来确定氨氮浓度。[0170]dna提取：[0171]根据yu及morrison(30)，从1ml冷冻干燥的瘤胃样品中分离总基因组dna。这种方法结合了珠磨式研磨及qiaampdna粪便迷你试剂盒(qiagen，希尔登，德国)的柱过滤步骤。[0172]扩增子测序：[0173]使用ecoprimers(31)、obitools软件套件(32)及genbank中存储的序列创建的数据库，以计算机模拟方式设计用于细菌及古细菌16srrna基因、纤毛虫原生动物18srrna基因及真菌its1基因的pcr扩增的引物。对于每个样品，重复进行pcr扩增。将每个pcr重复序列特有的八个核苷酸标签连接到引物序列上，以便能够汇集所有pcr产物进行测序，并随后将序列读数分配给各自的样品。pcr扩增产物以等体积组合，并使用qiaquickpcr纯化试剂盒(qiagen，德国)进行纯化。在使用仅五个pcr周期的标准方案制备文库后，使用illumina(fasteris，sa，日内瓦，瑞士)的miseq技术对扩增子进行测序，该技术为所有标记产生250个碱基配对末端读数，除了使用illumina的hiseq技术测序的古细菌标记之外，该技术产生100个碱基对末端读数。[0174]甲烷及二氧化碳排放测量：[0175]在uk的挤奶期间(33)或当奶牛逗留于it及se的诱饵站时(greenfeed)(34)，使用呼吸取样法测量甲烷。通过将奶牛饲养在呼吸室中5天(35)，在fi中测量甲烷。在it、se及fi中，同时测量二氧化碳与甲烷。[0176]血液取样及分析：[0177]在使用颈静脉穿刺进行瘤胃取样的同时采集血液样品，并将其收集到真空管(vacutainer)中。收集一根含有锂肝素或乙二胺四乙酸钠(na-edta)作为抗凝剂的试管进行代谢参数测定，收集两根含有柠檬酸钠的试管进行基因分型。收集后，将试管轻轻倒置8至10次，以确保最佳添加剂活性并防止凝结。收集管后，立即将其放入冰箱的冷冻水中或冰与水的混合物中并且在2至8℃下冷却。为代谢参数收集的试管离心10至15分钟(在4℃时为3500g)，将获得的血浆分为四等份。为基因分型采集的血液样品未进行离心。所有样品均在-20℃下储存，直至进行分析。[0178]使用商业试剂盒(贝德福德仪器实验室，马萨诸塞州，美国；wakochemicalsgmbh，neuss，德国；randoxlaboratories有限公司，克拉姆林，英国)在每个中心分析血浆非酯化脂肪酸、β-羟基丁酸酯、葡萄糖、白蛋白、胆固醇、尿素及肌酐。根据skinner等人的方法(36)，来自每个中心的血液样品被送往it进行结合珠蛋白测定。[0179]16s及18srrna基因的定量pcr：[0180]dna在5μg/ml的鲱精dna中稀释至0.1ng/μl，利用通用细菌引物unif(gtgstgcayggyygtcgtca-seqidno:1)及unir(acgtcrtccmcnccttcctc-seqidno:2)(37)进行扩增，以及在5μg/ml的鲱精dna中稀释至1ng/μl以用于扩增其他组别(38)。如ramirezfarias等人(39)所述，使用bioradcfx96进行定量pcr。如hook等人(40)所述，使用引物met630f(ggattagatacccsggtagt-seqidno：3)及met803r(gttgartccaattaaaccgca-seqidno：4)进行古菌16srna基因的扩增，并使用来自伊利诺伊大学m.p.bryant的赠与物meaboebeabuttersmithiips提取的dna进行校准。使用人罗斯氏菌a2-183(dsm16839t)的模板dna评估总细菌扩增效率。使用引物316f(gctttcgwtggtagtgtatt-seqidno:5)及539r(cttgccctcyaatcgtwct-seqidno:6)(41)扩增原生动物18srrna基因，并使用从牛瘤胃消化液中扩增的dna与引物54f及1747r(41)进行校准。使用通用细菌校准方程，根据四倍ct值计算细菌丰度。[0181]牛基因分型：[0182]从血液样品中提取基因组dna并进行量化，以进行snp基因分型。所有动物均在牛ggphd(geneseek基因组分析仪)上进行基因分型。来自芬兰及瑞典的200头奶牛使用包含76.883个snp的牛ggphd芯片v1(80k)进行基因分型，因为制造商不再提供v1版的该芯片，来自英国及意大利的800份样品使用包含138.892个snp的牛ggphd芯片v2(150k)进行基因分型。该芯片的v2版包含了该芯片之前的v1版中存在的所有snp，同时为相同的最终处理成本提供了更多标记。neogen公司根据制造商的协议(illuminainc.)对基因分型芯片进行了dna杂交、图像扫描及数据采集。所有个体的检出率均高于0.90(93.5％的个体的检出率高于0.99)。超过99％的snp的检出率高于0.99(93.2％的snp的检出率高于0.99)。次要等位基因频率(maf)分布证明，90％以上的标记具有大于大于5％的maf以及近4％的单态snp。[0183]量化及统计分析：[0184]使用的统计方法及软件将在后续章节、附图及结果中详细介绍。在p《0.05、p《0.01及p《0.001(视情况而定)时宣布具有统计学意义。[0185]引物组衍生微生物群系的数据在统计分析中的应用：[0186]微生物结构域丰富度的关联性是基于以下引物组的扩增子测序数据：bact(细菌)、arch(古细菌)、neoc(真菌)、cili(原生动物)。个别微生物(作为物种层级的多个otu)的关联性是基于以下引物组的扩增子测序数据：proka(细菌及古细菌)、neoc(真菌)、cili(原生动物)。[0187]将obitools的fasta文件转换为qiime就绪格式：[0188]扩增子序列最初由obitools(32)处理，该工具去除条形码，并将来自两个测序轮次中各次的每个样品分割成一个单独的fastq文件。在每个结构域的扩增子序列中，然后将两轮次的单个样品序列汇集成单一的fastq文件，该文件的格式用于在qiime(42)中进行进一步处理，以挑选otu。详细地，每个fastq条目的标题都附加了一个前缀，格式如下[round_id][sample_id][running_number][space]。[0189]微生物标记基因扩增子序列的聚类以及选择代表性新物种out(denovospeciesotu)：[0190]来自每个域的引物组(古细菌、细菌、原核生物、纤毛虫、原生动物及真菌)的标记基因序列使用97％核苷酸序列相似性阈值，使用uclust算法(43)，按照以下qiime命令进行聚类：pick_otus.py-muclust-s0.97。使用qiime命令选择每个otu集群的多个代表性out，该iime命令为：pick_rep_set.py-mmost_abundant。[0191]为otu指定分类：[0192]使用核糖体数据库项目(rdp)分类器(44)，按照qiime命令：assign_taxonomy.py-mrdp，为每个域中的otu指定分类。根据greengenes数据库(45)，为来自原核、古细菌及细菌的扩增域的otu指定分类。根据silva数据库为纤毛虫原生动物的otu指定分类；第123(46)条。根据来自koetschan(47)的neocallimastigomycotaits1数据库为真菌out指定分类。[0193]创建otu表格、样品子集和二次抽样：[0194]扩增子域otu表是使用qiime命令make_otu_table.py从每个样品中的代表性otu集合计数及其被指定的分类法创建而成。然后对每个otu表进行细分，从而仅包括获得最高序列深度的每只动物的样品(在两个不同测序轮次中测序的两个样品中)。此外，在所有分析中，将扩增子域otu表进行二次抽样至7000次读数深度，但以下例外情况除外：域丰富度(8000次读取)及微生物丰度与性状的关联(8000次读取)以及域间微生物相互作用分析，其中未进行二次抽样。[0195]微生物域与细胞计数的相关性：[0196]使用斯皮尔曼等级相关系数(spearmanrcorrelation)以及使用r(48)cor函数，将每个域的定量pcr衍生微生物计数相互关联。使用bonferronihochberg(49)程序(bh)校正每个农场内所有域间相关性的p值。[0197]微生物域的细胞计数与实验变量的相关性：[0198]在每个农场内，每个实验变量都与每个微生物域的细胞计数相关(spearmanr)。接下来，只对所有农场中相关性方向相同的实验变量与域计数对进行分析。随后，通过使用z程序的加权和(50,51)进行荟萃分析，组合每个农场内选定的实验变量与域细胞计数对的相关性的p值，并按农场规模进行加权。通过r软件包metap(52)进行荟萃分析。最后，使用bh程序校正组合的p值。[0199]微生物域丰富度与实验变量的相关性：在农场内，每个实验变量分别与每个微生物域的丰富度相关，如使用多个域特异性引物观察到的物种计数(spearmanr)。接下来，只对所有农场中相关性方向相同的实验变量与域丰富度对进行分析。随后，通过使用z程序的加权和进行荟萃分析，组合每个农场内选定的实验变量与域丰富度对的相关性的p值，并按每个农场的奶牛数量进行加权。[0200]通过r软件包metap(52)进行荟萃分析。最后，使用bh程序校正组合p值。[0201]通过核心微生物群系预测表型及其他实验变量：[0202]每个农场内核心微生物的丰度被用作岭回归(56)的特征，以预测每个性状(分别地)。我们的方法遵循k-折叠交叉验证方法(k＝10)，其中每次折叠从整体集合中省略一次，并使用从所有其他折叠(训练集)构建的模型来预测排除的样品(动物)的性状值。这是使用来自glmnetr软件包(57)的函数cv.glmnet(alpha＝0,k＝10)实现的。然后，使用r代码计算总体预测值r2。[0203]1-model_fit$cvm[which(model_fit$glmnet.fit$lambda＝＝model_fit$lambda.min)]/var(exp_covar)。重复交叉验证程序1,00次，取r2测量值的平均值。[0204]通过核心微生物群系预测表型，同时对日粮进行修正：[0205]为了估计核心微生物在忽略饲料成分影响的情况下解释的表型变异性，我们重复了上述分析，但存在一个区别。也就是说，在进行回归分析之前，对日粮中的表型值及微生物out计数进行校正。具体而言，以日粮成分为自变量，以表型或out为因变量，采用岭回归(19)。此后，使用表型残差(日粮预测表型－实际表型)及out残差(日粮预测otu计数－实际otu计数)来输入glmnet函数(20)。[0206]通过日粮成分预测表型：[0207]每个农场内的饲料成分被用作岭回归(19)的特征，以预测每个表型(分别地)。我们的方法遵循k-折叠交叉验证方法(k＝10)，其中每次折叠从整体集合中省略一次，并使用从所有其他折叠(训练集)构建的模型来预测排除的样品(动物)的性状值。这是使用来自glmnetr软件包(20)的函数cv.glmnet(alpha＝0,k＝10)实现的。然后，使用r代码计算总体预测值r2。[0208]1-model_fit$cvm[which(model_fit$glmnet.fit$lambda＝＝model_fit$lambda.min)]/var(exp_covar)。重复交叉验证程序1,00次，取r2测量值的平均值。[0209]利用随机森林(randomforest)预测核心微生物群系的表型及其他实验变量：[0210]作为额外的分析，为了进一步验证我们对宿主表型及实验变量的核心微生物群系的可解释性(通过预测)的发现，我们使用随机森林(rf)回归重复该分析。每个农场内核心微生物的丰度被用作输入rf回归模型(21,22)的特征，以便预测每个性状(分别地)。我们的方法遵循留一交叉验证方法(leave-one-outcross-validationmethodology)，在每次迭代中，从整体集合中省略一个样品(动物)，并使用从所有其他动物(训练集)构建的模型来预测排除的样品(动物)的特征值。此后，使用rcaret软件包函数r2计算实际及预测值的向量之间的预测r2值。[0211]牛基因型质量控制：[0212]两个品种的基因型是独立处理的。基因型首先接受质量控制筛选，包括5％的次等位基因频率、5％的基因型缺失及5％的个体缺失，遵循plink(54)命令：plink‑‑noweb‑‑cow‑‑maf0.05‑‑geno0.05‑‑mind0.05。用于关联性/遗传力分析的基因型(荷斯坦牛，不包括uk2农场)的质量控制导致5377个snp缺失，14119个snp失败频率，635个个体中有48个被移除以及进行低基因分型，导致剩余587个个体及121066个snp。[0213]检验全球瘤胃原核核心与宿主遗传学的相关性：[0214]在每个农场内，提取核心otu的前30个主成分(pc)(rprcomp)。此外，使用rsnpgdspca(55)提取第一批的多个基因型主成分。然后，在多个otu主成分及多个基因型主成分的矩阵之间进行典型相关分析(cca)(56)，并通过所有典型变量计算多个otu方差占基因型变量的总分数。这种实际数值与1000个随机排列的数值进行比较，其中多个表型主成分的顺序被改变。[0215]遗传关系矩阵的建立：[0216]使用命令：gcta64‑‑make-grm-bin‑‑make-bed‑‑autosome-num29‑‑autosome，创建一个遗传相关矩阵(grm)，该遗传相关矩阵包含除uk2农场(57)以外的所有荷斯坦动物。[0217]遗传力估计：为了估计多个otu遗传力，将核心微生物计数进行分位数标准化，然后提供给gcta，从而利用greml方法(57,58)估计由所有snp解释的表型方差，其中多个农场作为定性协变量，前五个grm主要成分及饲料成分作为定量协变量，并遵循gcta命令：gcta64‑‑reml–pheno[phenotype_file]–mpheno[phneotype_index]‑‑grm‑‑autosome-num29–covar[farms_covars_file]‑‑qcovar[quant_covariates_file]。[0218]遗传力置信区间估计：[0219]95％的遗传力置信区间是基于遗传力估计及grm估计的，使用grm特征值及农场作为fiesta项目的协变量(59)。使用以下命令：fiesta.py‑‑kinship_eigenvalues[grm_eigenvalues_file]‑‑kinship_eigenvectors[grm_eigenvectors_file]‑‑estimates_filename[heritability_estimates_file]‑‑covariates[farms_covariate_file]‑‑confidence0.95‑‑iterations100‑‑output_filename[otu_file]。[0220]多个牛基因组snp：微生物协会的努力：[0221]荷斯坦子集(不包括uk2群组，通过基因型pca及admixture祖先背景分析显示uk2群组具有不同的基因组成)内的多个微生物物种层级otu表型使用分位数标准化进行转换。此外，前五个基因型的多个最主要的成分(pc)及农场身份(farmidentity)分别被用作连续及分类协变量。使用混合线性模型选项(mlma)进行分析，其中被检查的snp与协变量一起被视为固定效应，grm效应被视为随机效应。在表型数(455)及关联性分析中包含的snp数(121066)方面，无关联p值超过bonferroni校正显着性阈值(9.076876e-10)。[0222]亲属关系矩阵的估计：[0223]基于从上述质量控制程序后过滤的多个常见单核苷酸多态性(snp)推断的基因组相关性，估计农场动物遗传亲缘关系矩阵。用于估计的工具是emmax，命令行如下：emmax-kin-intel64-v-m10farm_genotypes_tped_file-ofarm.hbn.kinf[0224]基因组预测：[0225]根据每个农场的亲缘关系矩阵进行基因组预测。使用gapit工具预测表型值，函数为gapit(参数ca.total＝3,snp.test＝false)。来自rcaret软件包(53)的crearefolds命令用于创建三个折叠(folds)，每个折叠中的观察值都被忽略，并由来自剩下的两个折叠建构r2的模型进行预测。在观察到的性状值及预测性状值之间进行估计r2，然后使用caretr2函数进行关联。在给定的农场中，对给定的性状重复该过程10次，然后计算所有测量值的平均值。[0226]使微生物的丰度与实验变量相关联：[0227]对于每个农场及域，占据该农场10％以上动物的多个otu与每个实验变量成对相关(spearman)。然后，使用bh程序对由给定域及农场内的相关测试得出的所有p值进行多次校正。最后，在大多数(》3)具有相同r系数符号的农场中，otu与特定实验变量存在显着相关性(校正后的p值《0.05)，而在其余农场中，otu与相反的r符号无显着相关性，则该otu被确定为与该变量相关。[0228]多个域内微生物相互作用网络的推断：[0229]在每个域及农场内，创建一个otu表，其中包含至少5000次读取深度的样品(动物)的子集，然后移除小于50％的动物中的otu。将otu表中的原始计数输入rspieceasi(60)框架，并使用spiec.easi函数(“mb”方法)识别边缘。按照软件包作者的建议，使用symbeta函数为边缘赋予权重。此后，对生成的网络进行过滤，使其仅包括绝对权重大于0.2的边缘。最后，合并某个域内的所有个别农场，并移除具有相同分类注释的连接节点(微生物)的边缘。[0230]域间微生物网络的推断：[0231]在每个农场内，来自不同域的otu使用斯皮尔曼相关性相互关联，然后对农场检查的所有相关性进行bh校正，并以校正后的p《0.05的相关性进行过滤。然后，对所有农场的显着相关性进行汇总。最后，去除相关系数r《0.5的相关性。[0232]核心原核微生物与随机抽样的系统发育相关性比较：[0233]使用mafft(61,62)及默认参数计算所有核心原核微生物之间的多序列比对。根据命令：fasttree-nt-makematrix，使用fasttree(63,64)从比对序列中获得基于系统发育树的距离矩阵。然后，计算核心微生物之间的系统发育中位数。[0234]接下来，对随机的otu序列集(n＝100)进行相同的处理。p值被计算为p＝(i(mcsd》mrsd)+1)/101，其中mcsd代表中位数核心系统发育距离，以及mrsd代表用于随机抽样集计算的中位数核心系统发育距离的向量。[0235]检查与核心及性状相关的微生物群系以进行分类富集：[0236]计算受检组及整体原核微生物群细目录之间，受检组(核心微生物群系或性状相关微生物群系)中出现的每个原核序列的优势比(o.r.)。接下来，显示o.r.》1(在受检组中更高)的条目被过滤进来。最后，计算优势比的p值(费舍尔精确检验，双尾)，并使用bh程序进行校正。[0237]比较可遗传微生物与其他核心微生物解释实验变量的能力[0238]为了比较可遗传微生物与其他核心微生物解释实验变量的能力，我们使用岭回归拟合可遗传微生物作为自变量，实验变量作为预测变量。然后，我们将这个r2值与从相同大小的非可遗传核心微生物(39个随机微生物)随机样品中获得的其他100个r2值进行对比。岭回归由rglmnet软件包进行。然后，我们使用配对威尔科克森符号秩检验(pairedwilcoxonrank-sumstest)，将所有实验变量的可遗传微生物的r2与非可遗传核心微生物的平均r2一起进行比较。[0239]季节性测试：[0240]每个农场的核心微生物都经过日粮校正。此后，农场中的样品被分为两组，冬季(秋分到春分)及夏季(春分到秋分)。接下来，使用威尔科克森符号秩检验对每个微生物otu丰度进行比较，该检验用于检验两个季节之间给定otu的丰度之间的差异，然后使用bonferroni方法进行多重比较校正。至少一个农场内的核心微生物otu的经校正后p值《0.05，因此被认为存在季节关联性。[0241]结果：[0242]该研究队列由1016只动物组成，其中816头荷斯坦奶牛来自两个英国农场及三个意大利农场。此外，从瑞典及芬兰抽取了200头北欧红色奶牛。荷斯坦奶牛接受以玉米青贮为基础的饲料，而北欧红色奶牛则接受以青贮牧草饲料为基础的营养相当饲料。使用常见的多个单核苷酸多态性(snp)对动物进行基因分型，并测量产奶量及成分；采食量及消化率；血浆成分；甲烷及二氧化碳排放；以及基于ssrrna基因分析的瘤胃微生物群系。[0243]细菌、原生动物、真菌及古细菌群落的丰富度及丰度是相互依赖的，并以广泛了解的方式与多种宿主表型相关，包括瘤胃代谢物、产奶指数及血浆代谢物。为了深入研究宿主与微生物群系与表型的关系，本发明人继续调查(i)在我们的大型动物群中有多少种及哪些物种是常见的，(ii)是否可以识别一个共同的或核心的群体，(iii)核心物种是否受宿主基因组影响，以及(iv)核心及非核心物种如何确定表型及生产特征。[0244]分类分析显示，在研究的七个农场中，至少50％的动物体内都存在瘤胃微生物的核心群体(512个物种层级的微生物操作分类单元(otu)、454个原核生物、12个原生动物及46个真菌)。该群组包括11个原核目、1个真菌目及2个原生动物目，该些目与已发表的核心微生物群落具有一些相似处(4,15)。核心群体在荷斯坦奶牛及北欧红奶牛品种之间共享，并且该结果是特别有用的，因为它们适用于在发达国家中使用的最受欢迎且最高产的奶牛品种(荷斯坦奶牛)，以及北欧纬度地区使用的较小品种(北欧红奶牛)。然而，研究结果再次表明，这种微生物群落在一般的反刍动物中具有代表性，特别是在细菌及原生动物物种方面。这种核心群落显着丰富拟杆菌目、螺旋体目及wchb1-4目。核心微生物群系在整体微生物物种库中所占比例不到0.25％(250000个otu中有512个)，但其数量非常丰富，占整体微生物群系的30至60％。该核心群体也与整体微生物群系密切相关，反映在已识别的核心微生物群系的β多样性指标与整个农场的微生物群系之间的高度相关性(r值介于0.45及0.7之间)上，这强化了在这样一个代谢复杂的生态系统中多个微生物之间的强连通性的概念，其中多种微生物的相互作用可能会被促进。这些核心微生物在地理、品种及日粮上表现出高度保守的丰度等级结构，不同个体的物种丰度顺序几乎相同。此外，经由ssrrna基因树确定的系统发育距离的差异表明，与非核心微生物群系的成员相比，核心成员之间的关系更为密切。因此，瘤胃核心微生物群系的成员之间的这种相关性可能表明，它们共享一组功能性状，该功能性状是该环境不可或缺的，并且可能与其他生态系统中的物种相关性所建议的宿主要求兼容(16)。尽管瘤胃微生物群系包含数百个物种，但这些核心物种通常属于整个细菌系统学的一个相当狭窄的部分(17)。[0245]通过典型相关分析(cca)发现，核心微生物群系与宿主遗传学显着相关，该分析针对每个农场分别计算(图1a)。随后，对每个品种的核心微生物群系的所有成员分别进行严格的遗传力分析，将农场及日粮成分作为混杂效应纳入考量(农场包括其他混杂效应，如位置级饲养制度)。此外，一个荷斯坦奶牛场(uk2)被从分析中删除，因为它显示了不同的遗传背景(uk2)。目前的遗传力分析专门对狭义的遗传力进行量化，这与基于双生子的研究不同，后者没有严格定义遗传力的类型(14)。这对于双胎率较低的牛来说尤其如此，这些个体出生时通常身体不适，因此不适合进行此类研究。在荷斯坦-弗里斯兰品种(n＝650，排除166个)中，鉴定出39个可遗传的核心微生物otu，这些otu均匀分布在秩丰度曲线上，因此指出低丰度物种也可能与宿主基因组有关，并表示与宿主的要求相关。这些微生物主要属于类杆菌目及梭菌目，但也包括新美鞭菌属(新美鞭菌属)的其他五个细菌门及两种真菌的代表(图1b)。瘤胃球菌(瘤胃球菌属)及丝状杆菌(瘤胃球菌属)属于核心可遗传细菌，与它们在纤维素分解中的关键作用一致，琥珀酸弧菌(succinovibrionaceae)也是如此，这似乎是动物间甲烷排放差异的关键决定因素(18)。这些可遗传微生物otu显示出从0.2到0.6之间的显着遗传力估计值(p《0.05fdr)，并显示微生物可遗传物种的数量比之前的研究(15)增加了两倍，其中包括一个较小的动物队列。此外，这些高度可靠的发现也强化了我们以前关于遗传性牛瘤胃微生物的研究结果，这些微生物由相似的分类群组成。此外，基于遗传相关矩阵(grm)，除一种微生物外，所有微生物的遗传力置信区间的下限均大于0.1。在规模较小的北欧红色奶牛队列中，只有三种细菌被鉴定为高度可遗传的，它们都与普雷沃氏菌(普雷沃氏菌属ceae)有关。总而言之，我们鉴定出的多个可遗传的物种级微生物otu几乎是可比较的人类研究(14)的十倍，因此进一步证实了牛宿主与其常驻瘤胃微生物群系之间的深度相互作用，这可能反映了牛对其肠道微生物群系的依赖程度高于人类。[0246]表1总结了所有与性状相关的可遗传细菌。[0247]表1[0248][0249][0250][0251]表2总结了与本研究中鑑定的性狀相关的所有细菌。[0252][0253][0254][0255][0256][0257][0258][0259][0260][0261][0262][0263][0264][0265][0266][0267][0268][0269][0270][0271][0272][0273][0274][0275][0276][0277][0278][0279][0280][0281][0282][0283][0284][0285][0286][0287][0288][0289][0290][0291][0292][0293][0294][0295][0296][0297][0298][0299][0300][0301][0302][0303][0304][0305][0306][0307][0308][0309][0310][0311][0312][0313][0314][0315][0316][0317][0318][0319][0320][0321][0322][0323][0324][0325][0326][0327][0328][0329][0330][0331][0332][0333][0334][0335][0336][0337][0338][0339][0340][0341][0342][0343][0344][0345][0346][0347][0348][0349][0350][0351][0352][0353][0354][0355][0356][0357][0358][0359][0360][0361][0362]表3总结了本研究中鑑定的所有可遗传细菌。[0363][0364][0365][0366][0367][0368]总而言之，当在单个农场内推断出微生物共生网络时，显然地，可遗传微生物比非可遗传微生物之间的联系更紧密，这与可遗传微生物在瘤胃共生网络中的中心位置一致(图1c)。[0369]在核心可以控制这些特性的前提下，在此对可遗传的、相互作用的微生物的展示，提出了为特定的微生物群系从而为表型及生产特性培育动物的可能性。共现网络进一步研究了核心丰度与表型结果的关系。[0370]这里发现的关联性非常复杂(图2a)，具有339种微生物，主要是原核生物，但也有少量的原生动物及真菌，该些微生物与瘤胃代谢及各种宿主表型有关。当进行独立分析时，结果网络(图2a)仅包括至少四个农场内具有相同方向性(fdr《0.05)的重复显着的相关性。如同反刍动物对瘤胃发酵产生的vfa的营养依赖性所预期的那样，大量的核心微生物群系的成员被发现与瘤胃醋酸盐及丙酸盐浓度等性状有关，与产奶量及甲烷排放等生产性状的相关性较小(分别为204、254、23及7，图2b)。与甲烷排放有关的是琥珀酸菌弧菌科(succinovibrionaceae)，其证实先前在肉牛中发现的情况(18)。重要地，与整体瘤胃微生物群系相比，核心微生物群系的原核成员富含性状相关微生物(332个性状相关及454个原核核心成员之间的优势比为388以及p《2.2e-16fisher精确检验；图2c)，其强调核心微生物群系在宿主功能及微生物群系代谢中的重要性及核心作用。基于核心微生物群系的组成，应用两种独特的机器学习算法来预测瘤胃代谢的饮食及宿主性状；岭回归(19,20)及随机森林(21,22)分别使用线性回归及基于决策树的方法。这使我们能够调查预测值及实际值之间的一致程度(r2)(图2d)。这些工具强调了核心微生物群系对日粮成分及瘤胃代谢物的高度解释性，在一些农场，丙酸盐接近r2＝0.9的一致性。重要的是，根据瘤胃微生物群系的组成，甲烷排放量也可以得到解释，在一些农场，甲烷排放量的数值达到r2＝0.4。此外，尽管具有较低的解释力，许多寄主性状(包括寄主血浆代谢物及牛奶成分)在一定程度上可以通过核心微生物群系的组成来解释(图2d)。我们的研究结果还显示，与宿主动物的基因型(基于基因组关系矩阵)相比，核心微生物群系具有更高的预测能力，日粮成分也是如此。总而言之，在这两种机器学习算法中，与其他核心微生物相比，可遗传微生物对宿主表型及其他实验变量的平均解释力显着更高(图3、图4、wilcoxon配对秩及检验，p《0.005)，其进一步强调可遗传微生物在瘤胃微生物生态及宿主中的核心作用。重要的是，这些微生物中的绝大多数的微生物在时间上表现出稳定性，只有一小部分的微生物(39个，3个可遗传以及一个性状相关)表现出季节性，该一小部分的微生物中的大多数的微生物仅在其中一个农场表现出季节性。[0371]讨论及结论：[0372]本示例表明，少量由宿主决定的可遗传微生物在解释实验变量及宿主表型方面提供更大的贡献(图3)，并提出了以微生物群系为主导的培育/遗传计划，从而提供一种可持续的解决方案以提高效率并降低反刍家畜的排放。基于可遗传微生物的遗传决定因素，应该可以通过选择性培育计划优化其丰度。这一数据的另一个，也许是更直接的应用是改变生命早期的群落化(colonization)，该因素已被证明会推动微生物群系的组成及以后的活动(23-25)。接种与饲料效率或甲烷排放相关的关键核心物种作为精确的益生菌方法，可以被视为可能补充可遗传的微生物群系，以实现优化瘤胃功能。[0373]目前的研究集中在两个奶牛品种上，但结果可能适用于肉牛及其他反刍动物。鉴于日粮对性能及瘤胃微生物群系的组成的高度重要性，此类计划应特别注意可能的喂养方式。在此背景下，根据已鉴定的性状相关可遗传微生物对生产指数的整体预测影响，反刍动物畜牧业应该能够更有效率且更环保。[0374]尽管已经结合本发明的多个具体实施例来描述本发明，明显地，许多替代方案、修改及变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明旨在包含落入所附权利要求书的精神及广泛范围内的所有此类替代方案、修改及变化。[0375]本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请通过引用整体的方式并入本说明书中，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用的方式明确且单独地被指示并入本说明书相同。此外，本技术中引用或标识的任何引用文件不应被解释为承认此类引用文件可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的情况下，不应将其解释为必然的限制。此外，本技术的任何优先权文件通过引用其整体的方式并入本文中。[0376]参考文献[0377]1.h.steinfeld,p.gerber,t.wassenaar,v.caste,m.rosales,c.dehaanc,“牲畜的长期阴影(livestock’slongshadow)”。(fao，罗马，2006年)。[0378]2.p.r.myer,t.p.smith,j.e.wells,l.a.kuehn,h.c.i.freetly,不同饲料效率的肉牛瘤胃微生物群(rumenmicrobiomefromsteersdifferinginfeedefficiency)。plosone10,e0129174(2015年)。[0379]3.s.k.shabat,g.sasson,a.doron-faigenboim,t.durman,s.yaacoby,m.e.bergmiller,b.a.white,n.shterzer,i.mizrahi,特定的微生物依赖机制构成反刍动物能量收集效率的基础(specificmicrobiom-dependentmechanismsunderlietheenergyharvestefficiencyofruminants)。ismej.10,2958-72(2016)。[0380]4.g.henderson,f.cox,s.ganesh,a.jonker,w.young,p.h.janssen.。瘤胃微生物群落组成随饮食及宿主而变化，但在广泛的地理范围内发现了一个核心微生物群系(rumenmicrobialcommunitycompositionvarieswithdietandhost,butacoremicrobiomeisfoundacrossawidegeographicalrange)。sci.rep.5,14567(2015年)。[0381]5.i.mizrahi,原核生物(theprokaryotes)。(springerberlinheidelberg,2013年)。[0382]6.a.g.williams,g.s.coleman,瘤胃微生物生态系统(therumenmicrobialecosystem),(chapman&hall,london,1997年)。[0383]7.c.j.newbold,g.delafuente,a.belanche,e.ramos-morales,e,n.r.mcewan,纤毛虫原生动物在瘤胃中的作用(theroleofciliateprotozoaintherumen)。front.microbiol.6,1313(2015年)。[0384]8.r.j.gruninger,a.k.puniya,t.m.callaghan,j.e.edwards,n.youssef,s.s.dagar,k.fliegerová,gw..griffith,r.forster,a.tsang,t.mcallister,m.s.elshahed,厌氧真菌(新美鞭菌门)：在了解其分类、生命周期、生态学、作用及生物技术潜力方面的进展(anaerobicfungi(phylumneocallimastigomycota):advancesinunderstandingtheirtaxonomy,lifecycle,ecology,roleandbiotechnologicalpotential)。femsmicrobiol.ecol.90,1-17(2014年)。[0385]9.p.h.janssen,m.kirs,瘤胃的古菌群的结构(structureofthearchaealcommunityoftherumen)。appl.environ.microbiol.74,3619-3625(2008年)。[0386]10.d.p.morgavi,e.rathahao-paris,m.popova,j.boccard,k.f.nielsen,h.boudra。瘤胃微生物群落影响羔羊的代谢表型(rumenmicrobialcommunitiesinfluencemetabolicphenotypesinlambs)。front.microbiol.6,1060(2015年)。[0387]11.b.j.hayes,k.a.donoghue,c.m.reich,b.a.mason,t.bird-gardiner,r.m.herd,p.f.arthur,安格斯牛的甲烷性状的基因组遗传力和基因组估计育种值(genomicheritabilitiesandgenomicestimatedbreedingvaluesformethanetraitsinanguscattle)。j.anim.sci.94,902-908(2016年).[0388]12.r.roehe,r.j.dewhurst,c.a.duthie,j.a.rooke,n.mckain,d.w.ross,j.j.hyslop,a.waterhouse,t.c.freeman,m.watson,r.j.wallace,牛宿主遗传变异影响瘤胃微生物甲烷生产，基于元基因组基因丰度的低甲烷排放及高效饲料转化宿主的最佳选择标准(bovinehostgeneticvariationinfluencesrumenmicrobialmethaneproductionwithbestselectioncriterionforlowmethaneemittingandefficientlyfeedconvertinghostsbasedonmetagenomicgeneabundance)。plosgenet.12,e1005846(2016年)。[0389]13.j.a.rooke,r.j.wallace,c.a.duthie,n.mckain,s.m.desouza,j.j.hyslop,d.w.ross,t.waterhouse,r.roehe,肉牛及其瘤胃微生物群落的氢气和甲烷排放随饮食、喂食后的时间和基因型而变化(hydrogenandmethaneemissionsfrombeefcattleandtheirrumenmicrobialcommunityvarywithdiet,timeafterfeedingandgenotype).br.jnutr.112,398(2014年)。[0390]14.j.k.goodrich,s.c.dirienzi,a.c.poole,o.koren,w.a.walters,j.g.caporaso,r.knight,r.e.ley,开展微生物组研究(conductingamicrobiomestudy)。cell158,250-262(2014年)。[0391]15.g.sasson,s.krugerben-shabat,e.seroussi,a.doron-faigenboim,n.shterzer,s.yaacoby,m.e.bergmiller,b.a.white,e.halperin,i.mizrahi。可遗传的牛瘤胃细菌在系统上相关，并且与奶牛从饲料中获取能量的能力有关(heritablebovinerumenbacteriaarephylogeneticallyrelatedandcorrelatedwiththecow'scapacitytoharvestenergyfromitsfeed)。mbio.8,(2017年)。[0392]16.a.c.martiny,k.treseder,g.pusch,微生物中的功能特征的系统发育保守性(phylogeneticconservatismoffunctionaltraitsinmicroorganisms)。ismej7,830(2013年)。[0393]17.j.e.edwards,n.r.mcewan,a.j.travis,r.j.wallace,基于16srdna库的瘤胃细菌多样性分析(16srdnalibrary-basedanalysisofruminalbacterialdiversity)。antonievanleeuwenhoek86,263(2004年)。[0394]18.r.j.wallace,j.a.rooke,n.mckain,c.a.duthie,j.j.hyslop,d.w.ross,a.waterhouse,m.watson,r.roehe,与牛的高甲烷产量有关的瘤胃微生物元基因组(therumenm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