密封蛋白18抗体和治疗癌症的方法

密封蛋白18抗体和治疗癌症的方法发明领域1.本公开总体上涉及对密封蛋白18.2(claudin18.2)具有特异性的抗体及其用以治疗癌症的用途。2.相关申请的交叉引用3.本技术要求2019年7月17日提交的美国临时申请第62/875,416号的权益，所述申请的全部内容通过这个引用以它们的整体并入本文。
背景技术：
：：4.抗体构成特征在于由于它们能够特异性靶向细胞、细菌、病毒或毒素上的独特抗原而具有有限副作用的强力治疗剂。在1986年，首个治疗性单克隆抗体orthocloneokt3被引入市场。从那时起，这个类别的生物药物产品就显著增长了。在2014年末，四十七种单克隆抗体产品已在美国或欧洲受到核准用于治疗多种疾病，包括癌症以及炎症性疾病、心血管疾病、呼吸疾病和感染性疾病。5.十多种单克隆抗体当前由美国食品与药物管理局(u.s.foodanddrugadministration)核准用以治疗癌症。在这些剂之中的是被指示用于慢性淋巴细胞性白血病(cll)的阿仑珠单抗(alemtuzumab，)和用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗(trastuzumab，)。一些抗体用化学治疗药物标记，包括例如维布妥昔单抗和ado-埃姆坦辛曲妥珠单抗其他抗体产品诸如博纳吐单抗(blinatumomab，倍林塞妥(blincyto))被设计来识别和结合两种不同抗原。尽管此类抗体产品可商购获得，但当前癌症发病率和癌症死亡数仍然较高。已报道癌症发病率是每年每100,000名男性和女性中大于450名，并且癌症死亡率是每年每100,000名男性和女性中稍稍超过170名。技术实现要素：6.本文提供了结合密封蛋白-18(cldn18)的抗原结合蛋白。在各个方面，本公开的抗原结合蛋白结合人cldn18，并且任选地结合小鼠cldn18。在各个方面，抗原结合蛋白结合cldn18的细胞外结构域(ecd)。在各种实施方案中，本公开提供了一种针对cldn18.2的抗原结合蛋白。在各种情况下，抗原结合蛋白结合cldn18.2的ecd的细胞外环1(el1)。在各个方面，抗原结合蛋白结合el1，并且不结合cldn18.2的ecd的细胞外环2(el2)。在各种实施方案中，结合cldn18.2的抗原结合蛋白结合cldn18.2(seqidno:1)的残基28至74的氨基酸序列内的表位。在各种实施方案中，抗原结合蛋白结合cldn18.2的氨基酸序列glwrscvressgftecrfyftl(seqidno:4)、qglwrscvressgftecrgyftlk(seqidno:5)、dqwstqdlynnpvtavfnyqglwrsc(seqidno:6)或crgyftllflpamlqavr(seqidno:7)。7.在各种情况下，抗原结合蛋白结合cldn18.2，并且不结合密封蛋白家族的任何其他成员。在各个方面，抗原结合蛋白结合由人癌细胞例如hupt4胰腺细胞内源性表达的cldn18.2。在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白在无任何其他部分附接于抗原结合蛋白的情况下抑制受试者例如人中的肿瘤生长。在各种情况下，未缀合于异源性部分(例如未缀合于任何化学治疗剂、药物或毒性部分)的抗原结合蛋白抑制受试者例如人中的肿瘤生长。8.在各个方面，抗原结合蛋白结合由人癌细胞表达的cldn18.2。在各个方面，抗原结合蛋白抑制人cldn18.2与参考抗cldn18.2抗体之间的结合相互作用。在不束缚于特定理论下，本文提供的抗原结合蛋白的抑制作用允许此类实体用于降低肿瘤生长以及治疗患有肿瘤或癌症的受试者的方法中。如本文进一步讨论，在各个方面，抗原结合蛋白是抗体、其抗原结合抗体片段、或抗体蛋白质产物。9.本公开还提供了包含一组指定氨基酸序列中的至少3、4、5个或全部氨基酸序列的抗原结合蛋白。在各个方面，抗原结合蛋白包含本文公开的cldn18.2抗体的至少3、4、5或6个互补决定区(cdr)氨基酸序列。10.本公开还提供了包含如本文详述的氨基酸序列的抗原结合蛋白。在各个方面，抗原结合蛋白包含表a、表b、表c、表d、表6、表8、表9、表10、表11中所列的seqidno:的氨基酸序列，或它们的组合，如本文进一步所述。11.本公开提供了一种结合cldn18.2和第二抗原的双特异性抗原结合蛋白。双特异性抗原结合蛋白可包含此处所述的抗原结合蛋白中的任一者。第二抗原可为细胞表面蛋白，任选是其结合会调节免疫应答的蛋白。双特异性抗原结合蛋白可采用任何结构，例如微型双功能抗体、tandab(串联微型双功能抗体)、bite(双特异性t细胞衔接物)等。示例性双特异性抗原结合蛋白包含表11中阐述的序列。12.本公开还提供了一种包含抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白和异源性部分(例如细胞毒性药物)的缀合物。缀合物可包含可裂解接头或不可裂解接头。缀合物可具有缀合于本文所述的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白的各种数目的异源性部分(剂)，优选是每个蛋白1-8个剂，或每个蛋白3-8个剂。缀合物可为位点特异性缀合物。缀合物可为同质缀合物或异质缀合物。13.本文还提供了相关多肽、核酸、载体、宿主细胞和缀合物。此外，考虑了包含此类实体的药盒和药物组合物。14.还提供了制备抗原结合蛋白的方法。在各种实施方案中，方法包括培养包含编码如本文所述的抗原结合蛋白或多肽的核酸的宿主细胞以便表达所述抗原结合蛋白或多肽。15.本文另外提供了治疗患有癌症的受试者的方法。在各种实施方案中，方法包括以有效治疗受试者中的癌症的量向受试者施用本公开的药物组合物。16.还提供了治疗患有cldn18.2表达性癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。在各种实施方案中，cldn18.2表达性癌症表达cldn18.2。还考虑了一种抑制受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。17.一种降低受试者中的肿瘤大小，或预防受试者中癌症的复发的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。18.本文还提供了一种治疗被诊断为cldn18诸如cldn18.2的低过度表达者的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。19.在各种实施方案中，施用诱导肿瘤细胞中，例如表达cldn18特别是cldn18.2的细胞中的凋亡。在各种实施方案中，施用诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)、肿瘤坏死和细胞死亡或消减、和/或肿瘤细胞粘附的破坏，所述状况中的每一者导致肿瘤消退或肿瘤生长减缓。附图说明20.图1代表一组癌症类型中cldn18.2表达的图。21.图2代表额外癌症类型中cldn18.2表达的图。22.图3代表如通过rna测序测定的在癌细胞系中cldn18.1和cldn18.2表达的图。23.图4说明本文所述的抗cldn18.2抗体检测内源性表达cldn18.2的癌细胞系的表面上的cldn18.2的能力。24.图5a代表在用嵌合抗cldn18.2抗体治疗之后，携带上胃肠道(snu601)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图5b代表相同治疗组中在第30天时肿瘤体积(mm3)的平均变化的图。25.图6a代表在用嵌合抗cldn18.2抗体治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图6b代表相同治疗组中在第28天时肿瘤体积(mm3)的平均变化的图。26.图7a代表在用人源化抗cldn18.2抗体治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图7b代表相同治疗组中在第42天时肿瘤体积(mm3)的平均变化的图。27.图8a描绘在用人源化抗cldn18.2抗体治疗之后，在不同给药时程之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的小鼠中随时间(天数)变化的肿瘤体积的差异。图8b代表相同治疗组中在第42天时肿瘤体积(mm3)的平均变化的图。28.图9a代表在用人源化抗cldn18.2抗体药物缀合物(adc)治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图9b代表用单次剂量的抗cldn18.2adc或对照抗体治疗的小鼠中的肿瘤体积(mm3)的图。29.图10a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2adc治疗之后，携带胰腺(patu8988s)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图10b代表相同治疗组中在第33天时肿瘤体积(mm3)的平均变化的图。30.图11代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2adc治疗之后，携带snu601胃癌的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。31.图12a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2抗体药物缀合物(adc)治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图12b代表相同治疗组中在第32天时肿瘤体积(mm3)的图。32.图13阐述本文所述的cldn18.2抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。33.图14a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2抗体药物缀合物(adc)治疗之后，携带表达cldn18.2的胰腺患者源性(pdx)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图14b代表相同治疗组中在第27天时肿瘤体积(mm3)的图。图14c代表显示pdx模型上的cldn18.2表达的免疫组织化学分析(ihc)。34.图15a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2抗体药物缀合物(adc)治疗之后，携带不表达cldn18.2的胰腺患者源性(pdx)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图15b代表相同治疗组中在第18天时肿瘤体积(mm3)的图。图15c代表显示pdx模型上缺乏cldn18.2表达的免疫组织化学分析(ihc)。35.图16a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2抗体药物缀合物(adc)治疗之后，携带不表达cldn18.2的黑素瘤(m202)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图16b代表相同治疗组中在第23天时肿瘤体积(mm3)的图。36.图17代表抗体307-4h和358-h3的序列以及额外序列变异。这些抗体被产生来提供关于潜在可制造性序列可能性的额外信息。37.图18代表如通过流式细胞计量术所分析，人源化抗体与天然阳性细胞(具有内源性cldn18.2表达的细胞)或人工过度表达细胞(被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞)的结合活性。38.图19代表人源化抗体与人cldn18.2、人cldn18.1、小鼠cldn18.2、狗cldn18和大鼠cldn18的结合活性。39.图20显示对在hupt4细胞的情况下cldn18.2人源化抗体的抗体内化的体外表征。40.图21a代表人源化cldn18.2抗体对内源性表达cldn18.2的细胞或被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞的结合亲和力(kd)。图21b代表各种癌细胞系上的cldn18.2表达水平。pnk-307-h1f06-4是指307-h4抗体；pnk-358-h2c10-3是指358-h3抗体；#307-6h是指307-6h抗体；并且#358-5h是指358-5h抗体。41.图22a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2抗体(307-4h、307-6h、358-3h和358-5h)治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图22b代表相同治疗组中在第24天时肿瘤体积(mm3)的图。42.图23a至图23c代表cldn18.2-cd3双特异性t细胞衔接物(bite)(图23a和图23c)和cldn18.2-cd16tandab(图23b和图23c)的序列。43.图24a至图24e代表cldn18.2-cd3bite与内源性表达cldn18.2的细胞或被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞的结合活性。结合活性通过流式细胞计量术来分析。44.图25a至图25e代表cldn18.2-cd16tandab与内源性表达cldn18.2的细胞或被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞的结合活性。结合活性通过流式细胞计量术来分析。45.图26a至图26e代表cldn18.2-cd16tandab与内源性表达cldn18.2的细胞或被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞的结合活性。结合活性通过流式细胞计量术来分析。46.图27a代表如通过流式细胞计量术所分析，cldn19.2-cd3bite与jurkat细胞的结合活性。图27b显示用bite对jurkat细胞的表面染色。47.图28代表使用内源性表达cldn18.2的细胞或被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞，利用具有nfat-re报告体的jurkat细胞和cldn18.2-cd3bite进行的t细胞活化测定。48.图29代表使用内源性表达cldn18.2的细胞或被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞，利用具有nfat-re报告体的jurkat细胞和cldn18.2-cd3bite进行的t细胞活化测定。49.图30a至图30f显示在处理后5天时cldn18.2-cd3bite细胞毒性测定的代表性图像。50.图31代表在处理后5天时cldn18.2-cd3bite的乳酸脱氢酶(ldh)活性。51.图32代表在用不同剂量的抗cldn18.2bite治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤，并且用人pbmc注射的小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。52.图33a代表在用不同剂量的人源化抗cldn18.2bite治疗之后，携带胰腺(hupt4)肿瘤的人源化blt小鼠中肿瘤的随时间(天数)变化的肿瘤体积(mm3)的图。图33b代表相同治疗组中在第28天时肿瘤体积(mm3)的图。具体实施方式53.本公开描述一种针对cldn18，例如对cldn18.2具有特异性以治疗cldn18.2表达性癌症的抗原结合蛋白。据信抗cldn18.2抗体通过直接阻断cldn18.2在细胞-细胞连接中的功能以及通过免疫募集而是有效的。54.密封蛋白家族55.紧密连接，也被称为封闭连接或闭锁小带，是上皮和内皮细胞片中位于两个相邻细胞之间的调控细胞旁通透性，并且维持细胞极性的脊椎动物结构。密封蛋白(cldn)基因家族编码是紧密连接的重要组分的膜蛋白。cldn蛋白包含四个跨膜(tm)螺旋(tm1、tm2、tm3和tm4)和两个细胞外环(el1和el2)。相邻细胞的cldn蛋白的细胞外环彼此相互作用以密封细胞片，并且调控腔间隙与基底侧间隙之间的细胞旁运输。56.cldn蛋白在各种人类疾病和病变中起作用。举例来说，已显示cldn1基因中的突变导致进行性皮肤脱屑以及胆管梗阻。cldn16基因的突变体导致镁消耗病症。cldn19突变导致眼部疾患，诸如黄斑缺损和近视，而cldn14突变可导致非综合征性隐性耳聋。已知的是cldn3和cldn4是肠道中产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)肠毒素的表面受体，并且cldn1、cldn6和cldn9是丙型肝炎病毒(hcv)进入的共受体。已显示若干cldn蛋白在癌症中异常表达。举例来说，cldn1在乳腺癌和结肠癌中下调，而cldn3和cldn4在多种癌症中高度上调。57.密封蛋白-6(cldn6)是cldn家族的一个成员。编码人cldn6蛋白的基因位于人染色体16的p臂上16p13.3处，并且在黑猩猩、恒河猴、狗、母牛、小鼠、大鼠、斑马鱼和蛙中是保守的。cldn6通常在人中表达为220个氨基酸的前体蛋白，其中前21个氨基酸构成信号肽。58.密封蛋白-18(cldn18)是一种紧密连接蛋白，通常不存在于非种系成体组织中。相对于非干细胞，cldn18.2在干细胞中升高。人cldn18基因具有两种替代性第一外显子，从而产生在包括第一细胞外环的n末端69个氨基酸方面不同的两种蛋白质同工型(cldn18.1和cldn18.2)(niimi等人,molcellbiol2001；21:7380–90)。两种变体在第一细胞外结构域中51个氨基酸中的8者处不同，而它们的第二细胞外环的序列是相同的。cldn18.2仅存在于正常胃组织中。cldn18.2在胰腺癌、食道癌和肺癌中过度表达。高度肿瘤-正常表达差异以及它在肿瘤生物学中的推定作用使得cldn18.2成为一种具有高度吸引力的治疗靶标。cldn18.2前体蛋白的氨基酸序列可在国家生物技术信息中心(ncbi)网站处以ncbi参考序列np_001002026公开获得，并且在本文中提供为seqidno:1。细胞外环1从seqidno:1的氨基酸28延伸至氨基酸80，并且el2在seqidno:1的氨基酸144至174之间。结合密封蛋白-18.2的抗体描述于美国专利第10,137,195号中。59.抗原结合蛋白60.本文提供了结合密封蛋白-18(cldn18)的抗原结合蛋白。在各种实施方案中，抗原结合蛋白结合同工型cldn18.2。本公开的抗原结合蛋白可采用本领域中已知的许多抗原结合蛋白形式中的任一者。在各种实施方案中，本公开的抗原结合蛋白采用抗体、或抗原结合抗体片段、或抗体蛋白质产物的形式。61.在本公开的各种实施方案中，抗原结合蛋白包含抗体，基本上由抗体组成，或由抗体组成。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式，包含重链和轻链，并且包含可变区和恒定区的蛋白质。举例来说，抗体可为igg，其是具有相同的两对多肽链的“y形”结构，每对具有一个“轻”链(通常具有约25kda的分子量)和一个“重”链(通常具有约50-70kda的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在igg形式中，可变区通常是约100-110个或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(cdr)，主要负责抗原识别，并且在结合不同抗原的其他抗体之间实质上不同。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。可变区由每个轻链和重链的n末端区域组成，而恒定区由重链和轻链中的每一者的c末端部分组成。(janeway等人,“structureoftheantibodymoleculeandtheimmunoglobulingenes”,immunobiology:theimmunesysteminhealthanddisease,第4版elsevierscienceltd./garlandpublishing,(1999))。62.抗体的cdr的一般性结构和性质已在本领域中描述。简要来说，在抗体支架中，cdr包埋在重链可变区和轻链可变区中的框架内，在所述可变区中，它们构成主要负责抗原结合和识别的区域。可变区通常包含在框架区(由kabat等人,1991指定为框架区1-4，fr1、fr2、fr3和fr4；还参见chothia和lesk,1987(上文))内的至少三个重链或轻链cdr(kabat等人,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,publichealthservicen.i.h.,bethesda,md.；还参见chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917；chothia等人,1989,nature342:877-883)。在一相关实施方案中，框架的残基被改变。可被改变的重链框架区处于包围重链cdr残基的指定为h-fr1、h-fr2、h-fr3和h-fr4的区域内，并且轻链框架区的可被改变的残基处于包围轻链cdr残基的指定为l-fr1、l-fr2、l-fr3和l-fr4的区域内。框架区内的氨基酸可例如用在人框架或人共有框架中鉴定的任何适合氨基酸替换。63.抗体可包含本领域中已知的任何恒定区。人轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为igm、igd、igg、iga和ige。igg具有若干子类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。igm具有子类，包括但不限于igm1和igm2。本公开的实施方案包括所有此类类别或同种型的抗体。轻链恒定区可为例如κ或λ型轻链恒定区，例如人κ或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ或μ型重链恒定区。因此，在各种实施方案中，抗体是同种型iga、igd、ige、igg或igm的抗体，包括igg1、igg2、igg3或igg4中的任一者。在各个方面，抗体包含相对于天然存在的对应物，包含一个或多个氨基酸修饰以改善半衰期/稳定性或致使抗体更适于表达/可制造的恒定区。在各种情况下，抗体包含其中存在于天然存在的对应物中的c末端lys残基被移除或剪切的恒定区。64.抗体可为单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体包含大体上类似于由哺乳动物例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等产生的天然存在的抗体的序列。就此而言，抗体可被视为哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。在某些方面，抗原结合蛋白是抗体，诸如人抗体。在某些方面，抗原结合蛋白是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”是指含有来自两种或更多种不同抗体的结构域的抗体。嵌合抗体可例如含有来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域，或更一般来说，可含有来自至少两个物种的氨基酸序列链段。嵌合抗体还可含有同一物种内的两种或更多种不同抗体的结构域。术语“人源化”在关于抗体使用时是指至少cdr区来自非人来源的抗体，相比于原始来源抗体，所述抗体被工程改造来具有更类似于真实人抗体的结构和免疫功能。举例来说，人源化可涉及使来自非人抗体诸如小鼠抗体的cdr移植至人抗体中。人源化还可涉及选择氨基酸取代以制备更类似于人序列的非人序列。人抗体重链和轻链恒定区的信息，包括序列信息，可通过uniprot数据库以及为抗体工程改造和生产领域中的人员所熟知的其他数据库公开获得。举例来说，igg2恒定区可从uniprot数据库以通过引用并入本文的uniprot编号p01859获得。65.抗体可由酶诸如像木瓜蛋白酶和胃蛋白酶裂解成片段。木瓜蛋白酶裂解抗体以产生两个fab片段和单一fc片段。胃蛋白酶裂解抗体以产生f(ab’)2片段和pfc’片段。在本公开的各个方面，本公开的抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段(也称为抗原结合抗体片段、抗原结合片段、抗原结合部分)。在各种情况下，抗原结合抗体片段是fab片段或f(ab’)2片段。66.已利用抗体的构造来创建越来越多的替代性抗体形式，其跨越至少约12–150kda的分子量范围，并且具有在单体(n＝1)，至二聚(n＝2)，至三聚(n＝3)，至四聚(n＝4)的范围内，以及潜在更高的效价(n)；此类替代性抗体形式在本文中被称为“抗体蛋白质产物”。抗体蛋白质产物包括基于完全抗体结构的那些以及模拟保留完全抗原结合能力的抗体片段的那些，例如scfv、fab和vhh/vh(以下讨论)。保留它的完整抗原结合位点的最小抗原结合片段是fv片段，其完全由可变(v)区组成。使用可溶性柔性氨基酸肽接头将v区连接成scfv(单链可变片段)片段以达成分子的稳定化，或将恒定(c)结构域添加至v区中以产生fab片段[抗原结合片段]。scfv片段与fab片段两者均可容易地在宿主细胞例如原核宿主细胞中产生。其他抗体蛋白质产物包括二硫键稳定化scfv(ds-scfv)、单链fab(scfab)以及二聚和多聚抗体形式如微型双功能抗体、微型三功能抗体和微型四功能抗体、或包含由连接于寡聚化结构域的scfv组成的不同形式的微型抗体(miniab)。最小片段是骆驼科动物重链ab的vhh/vh以及单结构域ab(sdab)。最经常用于创建新型抗体形式的构筑嵌段是单链可变(v)结构域抗体片段(scfv)，其包含由约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的v结构域(vh和vl结构域)。肽体或肽-fc融合物是另一抗体蛋白质产物。肽体的结构由移植至fc结构域上的生物活性肽组成。肽体在本领域中得到充分描述。参见例如shimamoto等人,mabs4(5):586-591(2012)。[0067]其他抗体蛋白质产物包括单链抗体(sca)；微型双功能抗体；微型三功能抗体；微型四功能抗体；双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可分成五个主要类别：bsigg、附加igg、双特异性抗体(bsab)片段、双特异性融合蛋白和bsab缀合物。参见例如spiess等人,molecularimmunology67(2)a部分:97-106(2015)。[0068]在各个方面，本公开的抗原结合蛋白包含这些抗体蛋白质产物中的任一者，基本上由这些抗体蛋白质产物中的任一者组成，或由这些抗体蛋白质产物中的任一者组成。在各个方面，本公开的抗原结合蛋白包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：scfv、fabvhh/vh、fv片段、ds-scfv、scfab、二聚抗体、多聚抗体(例如微型双功能抗体、微型三功能抗体、微型四功能抗体)、miniab、骆驼科动物重链抗体的肽体vhh/vh、sdab、微型双功能抗体；微型三功能抗体；微型四功能抗体；双特异性或三特异性抗体、bsigg、附加igg、bsab片段、双特异性融合蛋白和bsab缀合物中的任一者。[0069]在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白是呈单体形式、或聚合、寡聚或多聚形式的抗体蛋白质产物。在其中抗体包含两个或更多个独特抗原结合区片段的某些实施方案中，视由抗体识别和结合的独特表位的数目而定，抗体被视为是双特异性的，三特异性的或多特异性的，或二价的，三价的或多价的。[0070]在各种实施方案中，抗cldn18.2抗体或其抗体变体选自由以下组成的组：人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、单体抗体、微型双功能抗体、微型三功能抗体、微型四功能抗体、fab片段、igg1抗体、igg2抗体、igg3抗体和igg4抗体。[0071]在各个方面，本公开的抗原结合蛋白连接于治疗剂。如下所述，治疗剂可为本领域中已知的任何治疗剂，包括但不限于化学治疗剂、细胞因子和生长因子、细胞毒性剂等。参见以下“缀合物”。[0072]双特异性形式[0073]在示例性方面，抗原结合蛋白是双特异性的，因此能够结合两种不同和独特抗原。在示例性实施方案中，抗原结合蛋白是双特异性的，并且结合cldn18.2和第二抗原。[0074]在示例性情况下，第二抗原是由t细胞表达的细胞表面蛋白。在示例性方面，细胞表面蛋白是t细胞受体(tcr)的组分，例如cd3。在示例性情况下，第二抗原是有助于t细胞活化的共刺激性分子，例如cd40或4-1bb(cd137)。在示例性方面，第二抗原是fc受体。在各个方面，fc受体是fcγ受体、fc-α受体、fc-ε受体。在示例性方面，fc受体是cd64(fc-γri)、cd32(fc-γriia)、cd16a(fc-γriiia)、cd16b(fc-γriiib)、fcεri、cd23(fc-εrii)、cd89(fc-εri)、fcα/μr或fcrn。在示例性方面，fc受体是cd16a。在示例性情况下，第二抗原是免疫检查点分子，例如免疫检查点通路中涉及的蛋白质。免疫检查点通路和在它中起作用的分子或蛋白质在本领域中是已知的。参见例如pardoll,natrevgenet12(4):252-264(2012)。在示例性情况下，免疫检查点分子是a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、ctla4、ido、kir、lag3、nox2、pd-1、tim3、vista或siglec7。任选地，免疫检查点分子是pd-1、lag3、tim3或ctla4。[0075]超过五十种形式的双特异性抗原结合蛋白在本领域中是已知的，其中一些描述于kontermann和brinkmann,drugdiscoverytoday20(7):838-847(2015)；zhang等人,exphematoloncol6:12(2017)；spiess等人,molimmunol.；67(2pta):95-106(2015)中。在示例性方面，本公开的双特异性抗原结合蛋白通过化学工程改造、遗传工程改造或四源杂交瘤技术制备。[0076]在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白用抗体的恒定结构域中的一些或全部构建。在示例性方面，本公开的双特异性抗原结合蛋白包含fc多肽，并且保留fc介导的效应子功能。在各种情况下，双特异性抗原结合蛋白是通过例如两个单克隆抗体(mab)的化学交联或通过钮和孔技术形成的双特异性单克隆抗体。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白通过“钮入孔(knobs-into-holes)”技术制备，其中通过将不同突变引入至两个ch3结构域中来迫使h链异二聚化，从而产生不对称抗体。将“钮”突变制备至一个hc中，并且在另一hc中创建“孔”突变以促进异二聚化。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是通过四源杂交瘤技术产生的双特异性抗体，所述四源杂交瘤技术基于产生具有所需特异性的单克隆抗体的两种不同杂交瘤细胞的体细胞融合。zhang等人,2017(上文)。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是crossmab、正交fabigg、dvd-ig、二合一igg、igg-scfv和scfv2-fc(kontermann和brinkmann,2015(上文))。在各个方面，双特异性抗原结合蛋白是ig-scfv融合物，其中新的抗原结合部分添加至全长igg中，从而产生针对两种独特抗原的具有四价的融合蛋白，例如iggc末端scfv融合物和iggn末端scfv融合物。在示例性情况下，双特异性抗原结合蛋白是双可变结构域-igg(dvd-igg)，其中对一种抗原具有特异性的igg的lc和hc可变区通过接头融合于对第二抗原具有特异性的igg的n末端lc和hc以形成dvd-igg。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是微型双功能抗体-fc融合物，其涉及用双特异性微型双功能抗体替换igg的fab片段。[0077]在替代性情况下，本公开的双特异性抗原结合蛋白不包含fc多肽。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含每个亲本单克隆抗体的可变结构域，并且克隆和连接接头以形成单链双特异性抗体。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是串联scfv、微型双功能抗体形式、单链微型双功能抗体、串联微型双功能抗体(tandab)、双亲和力重靶向分子(dart)、对接和锁定(dnl)形式以及纳米抗体(fan等人,jhematoloncol.2015；8:130)。在各个方面，双特异性抗原结合蛋白是双特异性f(mab1)2、scfv、双特异性微型双功能抗体(bsdb)、单链双特异性微型双功能抗体(scbsdb)、单链双特异性串联可变结构域(scbstafv)、对接和锁定三价fab(dnl-(fab)3)、单结构域抗体(sdab)或双特异性单结构域抗体(bssdab)。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是包含由额外肽接头诸如甘氨酸-丝氨酸重复基序连接的两个scfv片段的串联scfv。任选地，串联scfv包含结构：vla-接头1–vha-接头2–vhb-接头3–vlb(vl和vh源于单链抗体片段；a和b代表亲本单克隆抗体a和b)。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是tandab，其含有连接在单一多肽链中的两对vl和vh结构域(reusch等人,mabs.2015；7(3):584-604)。两个多肽产物以头尾相接方式二聚化，从而在表达后形成具有大分子量(约105kda)的同二聚体。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是使用crossmab技术产生的双特异性抗原结合蛋白，所述crossmab技术描述于pnas108(27):11187-92(2011)中。crossmab不具有任何化学接头或连接头，并且通过加强双特异性异二聚igg抗体中的正确轻链缔合的方法产生。在示例性方面，crossmab是二(1+1)、三(2+1)和四(2+2)价双特异性crossmab，或是非fc串联抗原结合片段(fab)基crossmab。在示例性情况下，crossmab是crossmabfab、crossmabvh-vl或crossmabch1-cl。[0078]在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含含有单一单体可变抗体结构域的单结构域抗体或纳米抗体。任选地，可变结构域基于重链可变结构域。在替代性方面，可变结构域基于轻链可变结构域。[0079]在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是双特异性t细胞衔接物或bite是仅包含抗体的可变区的二价小分子，所述可变区呈由柔性肽接头连接的scfv的形式。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含含有当前公开的cldn18.2抗体的lc和hc可变区以及对第二抗原具有特异性的第二抗体的lc和hc可变区的scfv。在一些实施方案中，bite包含对cd3具有特异性的第二抗体的lc和hc可变区。在一些实施方案中，cd3是cd3e。[0080]在示例性情况下，双特异性抗原结合蛋白是不同于的双亲和力重靶向(dart)形式，dart的两个链之间的共价连接限制抗原结合位点的自由。因此，dart在结构上是紧凑的，并且可形成靶标与效应细胞之间的稳定接触。dart包含两个经工程改造fv片段，所述片段它们自身的vh与另一片段的vh交换。相互更换的fv结构域有利地解除由短连接肽对变异片段的构象约束。[0081]在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白是包含融合于经修饰hsa的两个scfv的hsa体(hsabody)。hsa体描述于mcdonagh等人,molcancerther.2012；11(3):582–93中。[0082]因此，在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含任何当前公开的cldn18.2抗体的抗原结合片段。在示例性方面，抗原结合片段是fab。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含任何当前公开的cldn18.2抗体的f(ab)2’。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含含有任何当前公开的cldn18.2抗体的lc和hc可变区的scfv。在示例性方面，scfv包含seqidno:514或515的氨基酸序列。在各个方面，抗原结合片段基于重链可变区，并且在其他方面，抗原结合片段基于轻链可变区。在示例性方面，抗原结合片段包含hc可变区与lc可变区两者的至少一部分。在示例性方面，双特异性抗原结合蛋白包含当前公开的cldn18.2抗体的lc或hc可变区中的至少一者(如果不是两者)以及对第二抗原具有特异性的第二抗体的lc和hc可变区中的至少一者(如果不是两者)。在示例性情况下，双特异性抗原结合蛋白包含含有当前公开的cldn18.2抗体的lc和hc可变区以及对第二抗原具有特异性的第二抗体的lc和hc可变区的scfv。[0083]cldn18和表位[0084]本公开的抗原结合蛋白结合cldn18.2。在各个方面，cldn18.2是具有以下氨基酸序列的人cldn18.2同工型：[0085]mavtacqglgfvvsligiagiiaatcmdqwstqdlynnpvtavfnyqglwrscvressgftecrgyftllglpamlqavralmivgivlgaigllvsifalkcirigsmedsakanmtltsgimfivsglcaiagvsvfanmlvtnfwmstanmytgmggmvqtvqtrytfgaalfvgwvaggltliggvmmciacrglapeetnykavsyhasghsvaykpggfkastgfgsntknkkiydggartedevqsypskhdyv(seqidno:1)。[0086]在各个方面，本公开的抗原结合蛋白结合cldn18.2的氨基酸序列内的表位。在各个方面，cldn18.2是人cldn18.2，并且本公开的抗原结合蛋白结合人cldn18.2的氨基酸序列例如seqidno:1内的表位。就“表位”来说，其意指cldn18.2的或cldn18.2内由抗原结合蛋白结合的区域。在一些实施方案中，表位是线性表位。“线性表位”是指cldn18.2的或cldn18.2内由抗原结合蛋白结合的区域，并且所述区域由cldn18.2的氨基酸序列的连续氨基酸组成。线性表位的氨基酸在cldn18.2的一级结构中彼此邻接。因此，线性表位是抗原即cldn18.2的氨基酸序列的片段或部分。在其他各种实施方案中，表位是构象性或结构性表位。就“构象性表位”或“结构性表位”来说，其意指由仅当cldn18.2处于它的适当折叠状态时才彼此紧密邻近定位的氨基酸组成的表位。不同于线性表位，构象性或结构性表位在cldn18.2的一级结构(即氨基酸序列)中不彼此邻接。构象性或结构性表位不由抗原(cldn18.2)的氨基酸序列的连续氨基酸组成。[0087]在各个方面，表位位于cldn18.2例如人cldn18.2的细胞外结构域(ecd)内。在各个方面，抗原结合蛋白结合cldn18.2的ecd的具有seqidno:1的残基28至80的氨基酸序列的细胞外环1(el1)。在各个方面，抗原结合蛋白结合的表位在cldn18.2的glwrscvressgftecrfyftl(seqidno:4)、qglwrscvressgftecrgyftlk(seqidno:5)、dqwstqdlynnpvtavfnyqglwrsc(seqidno:6)或crgyftllflpamlqavr(seqidno:7)内。在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白结合cldn18.2的el1，但不结合细胞外环2(el2)。在各个方面，本公开的抗原结合蛋白结合的一个或多个表位不同于由包含含有seqidno:58的序列的轻链可变区和含有seqidno:59的序列的重链可变区，或包含含有seqidno:60的序列的轻链可变区和由seqidno:61编码的重链可变序列，或含有seqidno:62的序列的轻链可变区和由seqidno:63编码的重链可变序列的抗cldn18.2抗体结合的表位。[0088]在各个方面，抗原结合蛋白结合人cldn18.2和非人cldn18.2。在各种情况下，非人cldn18.2是黑猩猩、恒河猴、狗、母牛、小鼠、大鼠、斑马鱼或蛙的cldn18.2。在各种情况下，抗原结合蛋白结合人cldn18.2和小鼠cldn18.2。[0089]亲和力和亲合力[0090]本文提供的抗原结合蛋白以非共价和可逆方式结合cldn18.2。在各种实施方案中，抗原结合蛋白与cldn18.2的结合强度可以它的亲和力描述，所述亲和力是抗原结合蛋白的结合位点与表位之间的相互作用的强度的量度。在各个方面，本文提供的抗原结合蛋白对cldn18.2具有高亲和力，因此，相比于低亲和力抗原结合蛋白，将在更短时期内结合更大量的cldn18.2。在各个方面，抗原结合蛋白具有至少105mol-1、至少106mol-1、至少107mol-1、至少108mol-1、至少109mol-1、或至少1010mol-1或至少1010mol-1、至少1010mol-1的平衡缔合常数ka。如由普通技术人员所了解，ka可受包括ph、温度和缓冲液组成的因素的影响。[0091]在各种实施方案中，抗原结合蛋白与cldn18.2的结合强度可以它的敏感性描述。kd是抗原结合蛋白与cldn18.2之间的平衡解离常数，即k解离/k缔合的比率。kd和ka是逆相关的。kd值与抗原结合蛋白的浓度(为特定实验所需的抗原结合蛋白的量)相关，因此，kd值越低(浓度越低)，抗原结合蛋白的亲和力越高。在各个方面，抗原结合蛋白与cldn18.2的结合强度可以kd描述。在各个方面，本文提供的抗原结合蛋白的kd是约10-1、约10-2、约10-3、约10-4、约10-5、约10-6或更小。在各个方面，本文提供的抗原结合蛋白的kd是微体积摩尔浓度、纳体积摩尔浓度、皮体积摩尔浓度或飞体积摩尔浓度。在各个方面，本文提供的抗原结合蛋白的kd在约10-4至10-6、或10-7至10-9、或10-10至10-12、或10-13至10-15、或10-9至10-12、或10-9至10-15的范围内。在各个方面，本文提供的抗原结合蛋白的kd在约1.0x10-12m至约1.0x10-8m的范围内。在各个方面，抗原结合蛋白的kd在约1.0x10-11m至约1.0x10-9m的范围内。[0092]在各个方面，使用基于流式细胞计量术或荧光激活的细胞分选(facs)的测定来对抗原结合蛋白的亲和力进行测量或分级。基于流式细胞计量术的结合测定在本领域中是已知的。参见例如cedeno-arias等人,scipharm79(3):569-581(2011)；rathanaswami等人,analyticalbiochem373:52-60(2008)；以及geuijen等人,jimmunolmethods302(1-2):68-77(2005)。在各个方面，使用如trikha等人,intjcancer110:326-335(2004)和tam等人,circulation98(11):1085-1091(1998)中以及以下所述的竞争测定来对抗原结合蛋白的亲和力进行测量或分级。参见以下题为“竞争测定”的章节。在trikh等人中，表达抗原的细胞用于放射测定中。用悬浮细胞测量经125i标记的抗原结合蛋白(例如抗体)与细胞表面抗原的结合。在各个方面，通过基于facs的测定来测定cldn18.2抗体的相对亲和力，其中将不同浓度的缀合于荧光团的cldn18.2抗体与表达cldn18.2的细胞一起孵育，并且测定发射的荧光(其是抗体-抗原结合的直接量度)。制作绘制出在每种剂量或浓度下的荧光的曲线。最大值是荧光达到平稳状态或达到最大值即在发生结合饱和时所处的最低浓度。最大值的一半被视为ec50或ic50，并且相对于以相同方式测试的其他抗体，具有最低ec50/ic50的抗体被视为具有最高亲和力。此种测定在本文中在实施例5处描述。[0093]在各个方面，如在竞争性结合抑制测定中测定的ic50值近似于抗原结合蛋白的kd。在各种情况下，如下所讨论，竞争测定是用参考抗体、经荧光团缀合的二级抗体和表达cldn18.2的细胞进行的基于facs的测定。在各个方面，细胞被遗传工程改造来过度表达cldn18.2。在一些方面，细胞是用病毒载体转导以表达cldn18.2的hek293t细胞。在替代性方面，细胞内源性表达cldn18.2。在进行基于facs的测定之前，在一些方面，将内源性表达cldn18.2的细胞预先确定为低cldn18.2表达性细胞或高cldn18.2表达性细胞。在一些方面，细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在各个方面，细胞是由细胞系例如卵巢细胞系、子宫内膜细胞系、膀胱细胞系、肺细胞系、胃肠(gi)细胞系、肝细胞系、肺细胞系等获得的细胞。在各个方面，内源性表达cldn18.2的细胞选自由以下组成的组：hupt4胰腺细胞、umuc-4膀胱细胞、mkn7、katoiii、snu601、nugc4、nugc3、snu620snu520和oe19上胃肠道细胞。在各个方面，抗原结合蛋白抑制由细胞表达的人cldn18.2与参考抗体之间的结合相互作用，已知所述参考抗体结合cldn18.2，但不是本公开的抗原结合蛋白。在各种情况下，如通过体外竞争性结合测定所测定，本公开的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人cldn18.2，并且由此降低结合于参考抗体的人cldn18.2的量。在各个方面，本公开的抗原结合蛋白抑制人cldn18.2与参考抗体之间的结合相互作用，并且抑制作用通过ic50表征。在各个方面，抗原结合蛋白就抑制人cldn18.2与参考抗体之间的结合相互作用来说展现小于约2500nm的ic50。在各个方面，抗原结合蛋白展现小于约2000nm、小于约1500nm、小于约1000nm、小于约900nm、小于约800nm、小于约700nm、小于约600nm、小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、或小于约100nm的ic50。在各个方面，抗原结合蛋白展现小于约90nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm、或小于约10nm的ic50。在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白与已知结合cldn18.2的参考抗体(所述参考抗体不同于本公开的任何抗原结合蛋白)竞争结合cldn18.2。参见在竞争测定下的进一步描述。[0094]亲合力给出抗体-抗原复合物的总体强度的量度。它取决于三个主要参数：抗原结合蛋白对表位的亲和力、抗原结合蛋白与cldn18.2两者的效价、以及相互作用的部分的结构布置。抗原结合蛋白的效价(抗原结合位点的数目)越大，它可结合的抗原(cldn18.2)的量越大。在各个方面，抗原结合蛋白对cldn18.2具有强烈亲合力。在各个方面，抗原结合蛋白是多价的。在各个方面，抗原结合蛋白是二价的。在各种情况下，抗原抗原结合蛋白是单价的。[0095]交叉反应性[0096]在各种实施方案中，本公开的抗原结合蛋白结合cldn18.2，并且不结合cldn家族的任何其他成员，例如不与cldn家族的任何其他成员交叉反应。在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白是cldn18.2特异性的。在各种实施方案中，本公开的抗原结合蛋白对cldn18.2具有的选择性是抗原结合蛋白对cldn18.1或另一cldn蛋白的选择性的至少10倍、5倍、4倍、3倍、2倍。在各种实施方案中，本公开的抗原结合蛋白对cldn18.2具有的选择性是抗原结合蛋白对cldn18.1或任何其他cldn蛋白中的每一者的选择性的至少10倍、5倍、4倍、3倍、2倍。选择性可基于由抗原结合蛋白对cldn18.2或cldn家族成员展现的kd，其中所述kd可通过本领域中已知的技术例如表面等离子体共振、基于facs的亲和测定来测定。[0097]竞争测定[0098]在各种实施方案中，抗原结合蛋白抑制人cldn18.2与参考抗体之间的结合相互作用，已知所述参考抗体结合cldn18.2，但不是本公开的抗原结合蛋白。在各种情况下，如通过体外竞争性结合测定所测定，本公开的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人cldn18.2，并且由此降低结合于参考抗体的人cldn18.2的量。在各种实施方案中，参考抗体结合人cldn18.2的细胞外结构域的氨基酸序列内，任选是el2或el1内的表位。在各个方面，参考抗体包含由seqidno:58编码的轻链可变序列和由seqidno:59编码的重链可变序列，或包含含有seqidno:60的序列的轻链可变区和由seqidno:61编码的重链可变序列，或含有seqidno:62的序列的轻链可变区和由seqidno:63编码的重链可变序列。在各个方面，本公开的抗原结合蛋白抑制人cldn18.2与参考抗体之间的结合相互作用，并且抑制作用通过ic50表征。在各个方面，抗原结合蛋白就抑制人cldn18.2与参考抗体之间的结合相互作用来说展现小于约2500nm的ic50。在各个方面，抗原结合蛋白展现小于约2000nm、小于约1500nm、小于约1000nm、小于约900nm、小于约800nm、小于约700nm、小于约600nm、小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、或小于约100nm的ic50。在各个方面，抗原结合蛋白展现小于约90nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm、或小于约10nm的ic50。[0099]在各种情况下，如通过体外竞争性结合测定所测定，本公开的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人cldn18.2，并且由此降低结合于参考抗体的人cldn18.2的量。在各个方面，体外竞争性结合测定是基于facs的测定，其中在不存在或存在特定量的本公开的抗原结合蛋白下测量结合参考抗体的fc的经荧光团缀合的二级抗体的荧光。此种基于facs的测定在本文中描述于实施例中。在各个方面，用参考抗体、经荧光团缀合的二级抗体和表达cldn18.2的细胞进行基于facs的测定。在各个方面，细胞被遗传工程改造来过度表达cldn18.2。在一些方面，细胞是用病毒载体转导以表达cldn18.2的hek293t细胞。在替代性方面，细胞内源性表达cldn18.2。在进行基于facs的测定之前，在一些方面，将内源性表达cldn18.2的细胞预先确定为低cldn18.2表达性细胞或高cldn18.2表达性细胞。在一些方面，细胞是癌细胞或肿瘤细胞。在各个方面，细胞是由细胞系例如卵巢细胞系、子宫内膜细胞系、膀胱细胞系、肺细胞系、胃肠(gi)细胞系、肝细胞系、肺细胞系等获得的细胞。在各个方面，内源性表达cldn18.2的细胞选自由以下组成的组：hupt4胰腺细胞、umuc-4膀胱细胞、mkn7、katoiii、snu601、nugc4、nugc3、snu620snu520和oe19上胃肠道细胞。在各种情况下，本公开的抗原结合蛋白以高亲和力结合由内源性表达cldn18.2的细胞中的一者或多者内源性表达的cldn18.2。在各个方面，如使用本文所述的hupt4、umuc-4、mkn7、katoiii、snu601、nugc4、nugc3、snu620snu520和oe19细胞中的一者或多者在基于facs的竞争性结合抑制测定中所测定，抗原结合蛋白展现小于约3000nm的ic50。在各个方面，如使用hupt4、umuc-4、mkn7、katoiii、snu601、nugc4、nugc3、snu620snu520和oe19细胞中的一者或多者在基于facs的竞争性结合抑制测定中所测定，抗原结合蛋白展现小于约2500nm、小于约2000nm、小于约1750nm、小于约1500nm、小于约1250nm、小于约1000nm、小于约750nm、或小于约500nm的ic50。在各个方面，如使用hupt4、umuc-4、mkn7、katoiii、snu601、nugc4、nugc3、snu620snu520和oe19细胞中的一者或多者在基于facs的竞争性结合抑制测定中所测定，抗原结合蛋白展现小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm、小于约75nm、小于约50nm、小于约25nm、或小于约10nm的ic50。[0100]测试抗体与第二抗体竞争结合抗原或其表位的能力的其他结合测定例如竞争性结合测定或竞争测定在本领域中是已知的。参见例如trikha等人,intjcancer110:326-335(2004)；tam等人,circulation98(11):1085-1091(1998)。美国专利申请公布第us20140178905号，chand等人,biologicals46:168-171(2017)；liu等人,analbiochem525:89-91(2017)；以及goolia等人,jvetdiagninvest29(2):250-253(2017)。此外，比较两种抗体的其他方法在本领域中是已知的，并且包括例如表面等离子体共振(spr)。spr可用于测定抗体和第二抗体的结合常数，并且两个结合常数可加以比较。[0101]抗体产生方法和相关方法[0102]制备抗原结合蛋白(例如抗体、抗原结合抗体片段和抗体蛋白质产物)的适合方法在本领域中是已知的。举例来说，用于产生抗体的标准杂交瘤方法描述于例如harlow和lane(编),antibodies:alaboratorymanual,cshpress(1988)以及ca.janeway等人(编),immunobiology,第5版,garlandpublishing,newyork,ny(2001))中。制备本公开的cldn18.2单克隆抗体的各种方法在本文中提供在实施例中。[0103]视宿主物种而定，可使用各种佐剂增加免疫应答，从而导致由宿主产生更多抗体。此类佐剂包括但不限于弗氏(freund's)佐剂、矿物质凝胶诸如氢氧化铝、以及表面活性物质诸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔虫戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)和二硝基酚。bcg(卡介苗(bacillicalmette-guerin))和短小棒状杆菌(corynebacteriumparvum)是潜在有用的人佐剂。[0104]其他抗体产生方法概述于表1中。[0105]表1[0106][0107][0108]测试抗体结合cldn18.2的表位的能力(不考虑抗体是如何产生的)的方法在本领域中是已知的，并且包括任何抗体-抗原结合测定，诸如像放射免疫测定(ria)、elisa、western印迹、免疫沉淀、spr和竞争性抑制测定(参见例如janeway等人、下文和美国专利申请公布第2002/0197266号，以及与竞争测定相关的以上章节)。[0109]序列/结构[0110]本文提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含(a)表a中阐述的重链(hc)互补决定区(cdr)1氨基酸序列或选自由seqidno:64、88、69、89、72、75、91、94、95、97、99、101、103、106、109组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(b)表a中阐述的hccdr2氨基酸序列或选自由seqidno:65、67、70、90、73、76、92、73、96、98、100、102、104、107、110组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(c)表a中阐述的hccdr3氨基酸序列或选自由seqidno:66、68、71、77、74、77、93、74、105、108、111组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(d)表a中阐述的轻链(lc)cdr1氨基酸序列或选自由seqidno:78、81、82、86、114、120、123、126组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(e)表a中阐述的lccdr2氨基酸序列或选自由seqidno:79、112、79、84、116、118、119、129、121、124、127组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(f)表a中阐述的lccdr3氨基酸序列或选自由seqidno:80、83、113、85、87、115、117、122、125、128组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；或(g)(a)-(f)中的任何两者或更多者的组合。[0111]表a[0112][0113]在各个方面，抗原结合蛋白包含表a中阐述的lccdr1氨基酸序列、lccdr2氨基酸序列和lccdr3氨基酸序列以及表a中阐述的hccdr氨基酸序列中的至少1者或2者。在各个方面，抗原结合蛋白包含表a中阐述的hccdr1氨基酸序列、hccdr2氨基酸序列和hccdr3氨基酸序列以及表a中阐述的lccdr氨基酸序列中的至少1者或2者。[0114]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含由表a的单行中的seqidno:指定的氨基酸序列中的至少3者、4者或5者。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含由表a的单行的seqidno:指定的lccdr氨基酸序列中的每一者以及由表a的单行的seqidno:指定的hccdr氨基酸序列中的至少1者或2者。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含由表a的单行的seqidno:指定的hccdr氨基酸序列中的每一者以及由表a的单行的seqidno:指定的lccdr氨基酸序列中的至少1者或2者。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含由表a的单行的seqidno:指定的cdr氨基酸序列中的全部6者。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含选自由以下组成的组的六个cdr氨基酸序列：(a)seqidno:78、79、80、64、65、66；(b)seqidno:81、112、80、88、65、66；(c)seqidno:81、79、80、64、67、68；(d)seqidno:82、79、83、39、70、71；(e)seqidno:81、79、113、89、90、77；(f)seqidno:81、84、85、72、73、74；(g)seqidno:86、79、87、75、76、77；(h)seqidno:114、79、115、91、92、93；(i)seqidno:81、116、117、94、73、74；(j)seqidno:81、118、117、95、96、74；(k)seqidno:81、119、117、97、98、74；(l)seqidno:81、118、85、99、100、74；(m)seqidno:81、129、117、101、102、74；(n)seqidno:120、121、122、103、104、105；(o)seqidno:123、124、125、106、107、108；和(p)seqidno:126、127、128、109、110、111。[0115]还考虑了本文公开的hcdr和/或lcdr序列，所述hcdr和/或lcdr序列包含相较于表a中标识的任何hcdr或lcdr氨基酸序列，含有一个或多个氨基酸变化(例如取代、插入或缺失)的氨基酸序列。优选取代包括对在表a的另一hcdr1、hcdr2、hcdr3或lcdr1、lcdr2或lcdr3内的相应位置处的氨基酸的取代。或者，hcdr1、hcdr2、hcdr3和/或lcdr1、lcdr2或lcdr3序列可包含本文所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3或lcdr1、lcdr2或lcdr3的共有氨基酸序列。[0116]在各种情况下，表a的氨基酸序列由至少一个或多个(例如至少2,3,4,5,6,7,8,9,10个或更多个)间插氨基酸分隔。在各种情况下，在lccdr1的序列与lccdr2的序列之间存在约10至约20个氨基酸，并且在lccdr2的序列与lccdr3的序列之间存在约25至约40个氨基酸。在各种情况下，在lccdr1的序列与lccdr2的序列之间存在约14至约16个氨基酸，并且在lccdr2的序列与lccdr3的序列之间存在约30至约35个氨基酸。在各种情况下，在hccdr1的序列与hccdr2的序列之间存在约10至约20个氨基酸，并且在hccdr2的序列与hccdr3的序列之间存在约25至约40个氨基酸。在各种情况下，在hccdr1的序列与hccdr2的序列之间存在约14至约16个氨基酸，并且在hccdr2的序列与hccdr3的序列之间存在约30至约35个氨基酸。[0117]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)表b中阐述的重链可变区氨基酸序列或选自由seqidno:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、2、34、36、38和40组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；或(b)表b中阐述的轻链可变区氨基酸序列或选自由seqidno:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；或(c)(a)与(b)两者。[0118]表b[0119]重链可变区轻链可变区ab3071011ab3691213ab3761415ab3581617ab3841819ab3602021ab4322223ab4002425ab3312627ab3472829ab3393031ab3013233ab3923435ab4163637ab4094839ab4244041[0120]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含选自由以下组成的组的一对氨基酸序列：(a)seqidno:10和11；(b)seqidno:12和13；(c)seqidno:14和15；(d)seqidno:16和17；(e)seqidno:18和19；(f)seqidno:20和21；(g)seqidno:22和23；(h)seqidno:24和25；(i)seqidno:26和27；(j)seqidno:28和29；(k)seqidno:30和31；(l)seqidno:32和33；(m)seqidno:34和35；(n)seqidno:36和37；(o)seqidno:38和39；(p)seqidno:40和41。[0121]还考虑了本文公开的vh和/或vl序列，所述vh和/或vl序列包含相较于表b中标识的任何vh或vl氨基酸序列，含有一个或多个氨基酸变化(例如取代、插入或缺失)的氨基酸序列。优选取代包括对在表b的另一vh或vl内的相应位置处的氨基酸的取代。或者，vh和/或vl序列可包含本文所述的vh或vl的共有氨基酸序列。举例来说，cdr或vh或vl可用鉴定为不同于图13中阐述的亲本序列的氨基酸取代。人源化序列中的氨基酸变化被突出显示。本文考虑了本文所述的人源化vh或vl序列的共有序列。[0122]在各个方面，抗原结合蛋白不包含由seqidno:58和59的序列编码的一对氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白不包含seqidno:60和61的一对氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白不包含seqidno:62和63的一对氨基酸序列。[0123]在各个方面，抗原结合蛋白包含与以上提及的氨基酸序列类似的氨基酸序列，但抗原结合蛋白大体上保留它的生物功能，例如它的结合人cldn18.2，降低肿瘤生长，治疗癌症的能力。[0124]在各个方面，抗原结合蛋白包含相对于一个或多个以上提及的氨基酸序列，仅相差1、2、3、4、5、6个或更多个氨基酸的氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白包含所提及序列的变异序列，所述变异序列相对于所提及序列仅相差一个或两个氨基酸。在各个方面，抗原结合蛋白包含发生在cdr的外部的一个或多个氨基酸取代，例如一个或多个氨基酸取代发生在重链或轻链的一个或多个框架区内。在各个方面，抗原结合蛋白包含一个或多个氨基酸取代，但抗原结合蛋白保留六个cdr的氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白包含相对于一个或多个以上提及的氨基酸序列，仅具有1、2、3、4、5、6个或更多个保守性氨基酸取代的氨基酸序列。如本文所用，术语“保守性氨基酸取代”是指一个氨基酸被具有类似性质例如大小、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性的另一氨基酸取代，并且包括在以下五个群组中的一者内的交换：[0125]i.小型脂族非极性或微极性残基：[0126]ala、ser、thr、pro、gly；[0127]ii.极性带负电荷残基以及它们的酰胺和酯：[0128]asp、asn、glu、gln、磺基丙氨酸和高磺基丙氨酸；[0129]iii.极性带正电荷残基：[0130]his、arg、lys；鸟氨酸(orn)[0131]iv.大型脂族非极性残基：[0132]met、leu、ile、val、cys、正亮氨酸(nle)、高半胱氨酸[0133]v.大型芳族残基：[0134]phe、tyr、trp、乙酰基苯丙氨酸。[0135]在各个方面，保守性氨基酸取代是以下氨基酸群组中的一者内的交换：[0136]i.ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ脂族氨基酸：gly、ala、val、leu、ile[0137]ii.ꢀꢀꢀꢀꢀ包含侧链羟基的非芳族氨基酸：sercthr[0138]iii.ꢀꢀꢀꢀ包含硫侧链的氨基酸：cys、met[0139]iv：ꢀꢀꢀꢀꢀ包含侧链芳族环的氨基酸：phe、tyr、trp[0140]v：ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ酸性氨基酸：glu；asp[0141]vi：ꢀꢀꢀꢀꢀ碱性氨基酸：arg；lys[0142]vii：ꢀꢀꢀꢀ包含侧链酰胺的氨基酸：gln、asn[0143]viii：ꢀꢀꢀ包含侧链咪唑的氨基酸：his、α-二甲基咪唑乙酸(dmia)[0144]ix：ꢀꢀꢀꢀꢀ亚氨基酸：pro、4-羟基-pro、4-氨基-pro。[0145]在各个方面，抗原结合蛋白包含与以上提及的氨基酸序列具有大于或约30％、大于或约50％、或大于或约70％序列同一性的氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白包含与以上提及的氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％，或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白包含沿以上提及的氨基酸序列的全长具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％，或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在各个方面，抗原结合蛋白包含沿以上提及的氨基酸序列的全长具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。[0146]在各个方面，抗原结合蛋白包含所提及序列的变异序列，所述变异序列相对于以上提及的序列具有至少或约70％序列同一性。在各个方面，抗原结合蛋白包含所提及序列的变异序列，所述变异序列相对于以上提及的序列具有至少或约80％序列同一性。在各个方面，抗原结合蛋白包含所提及序列的变异序列，所述变异序列相对于以上提及的序列具有至少或约90％序列同一性。在各个方面，抗原结合蛋白包含所提及序列的变异序列，所述变异序列相对于以上提及的序列具有至少或约95％序列同一性。[0147]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含表a的单行中的seqidno.的一个、两个、三个、四个或五个序列以及至少一个与seqidno:64-129中的任一者具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含选自以下的一组序列中的一个、两个、三个、四个或五个序列：(a)seqidno:78、79、80、64、65、66；(b)seqidno:81、112、80、88、65、66；(c)seqidno:81、79、80、64、67、68；(d)seqidno:82、79、83、39、70、71；(e)seqidno:81、79、113、89、90、77；(f)seqidno:81、84、85、72、73、74；(g)seqidno:86、79、87、75、76、77；(h)seqidno:114、79、115、91、92、93；(i)seqidno:81、116、117、94、73、74；(j)seqidno:81、118、117、95、96、74；(k)seqidno:81、119、117、97、98、74；(l)seqidno:81、118、85、99、100、74；(m)seqidno:81、129、117、101、102、74；(n)seqidno:120、121、122、103、104、105；(o)seqidno:123、124、125、106、107、108；和(p)seqidno:126、127、128、109、110、111，其中所述抗原结合蛋白还包含至少一个与这组序列中的至少一者具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列。[0148]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含与seqidno:10-41中的任一者具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的一对变异序列。在各种情况下，抗原结合蛋白包含与(a)seqidno:10和11；(b)seqidno:12和13；(c)seqidno:14和15；(d)seqidno:16和17；(e)seqidno:18和19；(f)seqidno:20和21；(g)seqidno:22和23；(h)seqidno:24和25；(i)seqidno:26和27；(j)seqidno:28和29；(k)seqidno:30和31；(l)seqidno:32和33；(m)seqidno:34和35；(n)seqidno:36和37；(o)seqidno:38和39；和(p)seqidno:40和41具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的一对变异序列。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含一对序列：表b的一个序列和是与seqidno:10-41中的任一者具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列的另一序列。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含一对序列：选自(a)seqidno:10和11；(b)seqidno:12和13；(c)seqidno:14和15；(d)seqidno:16和17；(e)seqidno:18和19；(f)seqidno:20和21；(g)seqidno:22和23；(h)seqidno:24和25；(i)seqidno:26和27；(j)seqidno:28和29；(k)seqidno:30和31；(l)seqidno:32和33；(m)seqidno:34和35；(n)seqidno:36和37；(o)seqidno:38和39；(p)seqidno:40和41的一个序列，和是与(a)–(p)的序列具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列的另一序列。举例来说，在各个方面，抗原结合蛋白包含seqidno:10的序列，并且所述抗原结合蛋白还包含与seqidno11具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列。[0149]在各种情况下，抗原结合蛋白包含以上提及的氨基酸序列的具有一个或多个氨基酸取代以降低或消除反应性氨基酸来减少或防止非所要侧链反应的氨基酸序列。举例来说，抗原结合蛋白包含以上提及的氨基酸序列的具有以下一种或多种状况的氨基酸序列：(i)trp残基被his、tyr或phe取代；(ii)asn残基被gln、ser、ala或asp取代；(iii)紧靠在pro残基之前存在的asp残基被ala、ser或glu取代，(iv)asn残基被gln、ser或ala取代；以及/或者(v)cys残基被tyr、ser或ala取代。在各个方面，抗原结合蛋白包含以上提及的氨基酸序列的具有氨基酸取代的氨基酸序列，所述氨基酸取代基于shm事件或基于众多其他类似抗体序列的统计分析被预测具有更大结合亲和力、更大稳定性或其他正面属性。[0150]人源化抗体[0151]在各个方面，抗原结合蛋白是表a或表b中所述的抗原结合蛋白的人源化形式。[0152]在各个方面，抗原结合蛋白是如表b中阐述的抗体的人源化形式，具有在图13中所示的位置处在重链或轻链可变区或其共有序列中的一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35)个氨基酸取代。[0153]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)表c中阐述的重链可变区氨基酸序列或选自由42、46、49、52、55、56、57和131组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％序列同一性的其变异序列；或(b)表c中阐述的轻链可变区氨基酸序列或选自由43-45、47-48、50-51、53-54、149和150组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％序列同一性的其变异序列；或(c)(a)与(b)两者。[0154]表c[0155][0156]在各种实施方案中，人源化抗原结合蛋白包含如表d中所示的一对氨基酸序列。[0157]表d[0158]人源化abhcseqidno.lcseqidno.huab307-14243huab307-24244huab307-34245huab376-14647huab376-24648huab358-1131149huab358-2131150huab360-15253huab360-25254huab360-35553huab360-45554huab360-55653huab360-65654huab432-15750huab432-25751huab432-34950huab432-44951[0159]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含一对变异序列，各自与表c中所列的seqidno具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性。在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含一对序列：选自表c中所列的seqidno:的一个序列和是与具有表d中所列的seqidno:的序列具有表c中所列的seqidno:的序列具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列的另一序列。[0160]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含一对序列：选自表d中所列的seqidno:的一个序列和是与具有表d中所列的seqidno:的序列具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列的另一序列。举例来说，在各个方面，抗原结合蛋白包含seqidno:42的序列，并且所述抗原结合蛋白还包含与seqidno43具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的变异序列。[0161]无岩藻糖基化抗体[0162]许多分泌型蛋白经受翻译后糖基化，即糖部分(例如聚糖、糖)共价附接于蛋白质的特定氨基酸所采用的过程。在真核细胞中，发生两种类型的糖基化反应：(1)n连接的糖基化，其中聚糖附接于识别序列asn-x-thr/ser的天冬酰胺，其中“x”是除脯氨酸之外的任何氨基酸，和(2)o连接的糖基化，其中聚糖附接于丝氨酸或苏氨酸。无论糖基化类型(n连接或o连接)如何，都存在蛋白质的归因于与每个位点(o或n)相关的各种聚糖结构的微不均一性。[0163]所有n-聚糖都具有共同核心糖序列：manα1–6(manα1–3)manβ1–4glcnacβ1–4glcnacβ1-asn-x-ser/thr(man3glcnac2asn)，并且分类为以下三种类型中的一者：(a)高甘露糖(hm)或寡甘露糖(om)类型，其由两个n-乙酰基葡糖胺(galnac)部分和大量(例如5、6、7、8或9个)甘露糖(man)残基组成，(b)复合类型，其包含超过两个glcnac部分和任何数目的其他糖类型，或(c)杂合类型，其包含在分支的一侧的man残基和在复合分支的基部的glcnac。图1a(取自stanley等人,第8章:n-glycans,essentialsofglycobiology,第2版,coldspringharborlaboratorypress；2009)显示三种类型的n-聚糖。[0164]n连接的聚糖通常包含一个或多个以下单糖：半乳糖(gal)、n-乙酰基半乳糖胺(galnac)、半乳糖胺(galn)、葡萄糖(glc)、n-乙酰基葡糖胺(clcnac)、葡糖胺(glcn)、甘露糖(man)、n-乙酰基甘露糖胺(mannac)、甘露糖胺(mann)、木糖(xyl)、n0乙酰基神经氨酸(neu5ac)、n-羟乙酰基神经氨酸(neu5gc)、2-酮基-3-脱氧壬糖酸(kdn)、岩藻糖(fuc)、葡萄糖醛酸(glca)、艾杜糖醛酸(idoa)、半乳糖醛酸(gala)、甘露糖醛酸(mana)。此类糖的通常使用的符号显示于图29a中。[0165]n连接的糖基化开始于内质网(er)中，在所述内质网中，一组复杂反应导致基本上由两个glcnac残基和三个man残基组成的核心聚糖结构的附接。在er中形成的聚糖复合物在高尔基体中通过酶的作用而得到修饰。如果糖是酶相对不可及的，那么它通常保持原始hm形式。如果酶可到达糖，那么许多man残基被裂解去除，并且糖被进一步修饰，从而产生复合类型n-聚糖结构。举例来说，位于顺面高尔基体中的甘露糖苷酶-1可裂解或水解hm聚糖，而位于内侧高尔基体中的岩藻糖基转移酶fut-8使聚糖岩藻糖基化(hanrueimai-nishiya(2007),bmcbiotechnology,7:84)。[0166]因此，聚糖结构的糖组成和结构构型视er和高尔基体中的糖基化机构、机构酶对聚糖结构的可及性、每种酶的作用顺序和蛋白质从糖基化机构释放所处的阶段以及其他因素而变化。[0167]在本公开的示例性实施方案中，抗原结合蛋白包含fc多肽。如本文所用的术语“fc多肽”包括源于抗体的fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。在示例性方面，当前公开的抗原结合蛋白的fc多肽包含聚糖。在各种情况下，聚糖缺乏岩藻糖或是无岩藻糖基化的。在示例性方面，抗原结合蛋白包含无岩藻糖基化聚糖。如本文所用，术语“无岩藻糖基化聚糖”或“afuco聚糖”或“无岩藻糖基化糖形式”或“afuc”是指缺乏在涉及于与n-糖基化位点的asn的酰胺键中的glcnac残基上的核心岩藻糖例如α1,6-连接的岩藻糖的糖形式。无岩藻糖基化糖形式包括但不限于a1g0、a2g0、a2g1a、a2g1b、a2g2和a1g1m5。额外无岩藻糖基化聚糖包括例如a1g1a、g0[h3n4]、g0[h4n4]、g0[h5n4]、fo-n[h3n3]。参见例如reusch和tejada,glycobiology25(12):1325-1334(2015)。[0168]本公开还提供了一种包含抗原结合蛋白的组合物例如药物组合物，所述抗原结合蛋白包含含有无岩藻糖基化聚糖的fc多肽。在示例性方面，存在于组合物中的抗原结合蛋白的至少或约25％是包含含有无岩藻糖基化聚糖的fc多肽的抗原结合蛋白。在示例性方面，存在于组合物中的抗原结合蛋白的至少或约25％是无岩藻糖基化的。任选地，存在于组合物中的抗原结合蛋白的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多是无岩藻糖基化的。产生包含特定糖概况的抗原结合蛋白的组合物的方法在本领域中是已知的。在示例性实施方案中，抗原结合蛋白在被遗传修饰来改变从头途径或补救途径的酶的活性的细胞中重组产生。岩藻糖代谢的这两种途径显示于图29b中。在示例性实施方案中，细胞被遗传修饰来改变以下中的任何一者或多者的活性：岩藻糖基转移酶(fut，例如fut1、fut2、fut3、fut4、fut5、fut6、fut7、fut8、fut9)、岩藻糖激酶、gdp-岩藻糖焦磷酸化酶、gdp-d-甘露糖-4,6-脱水酶(gmd)和gdp-酮基-6-脱氧甘露糖-3,5-表异构酶4-还原酶(fx)。在示例性实施方案中，细胞被遗传修饰来剔除编码fx的基因。参见例如国际专利公布第wo2017/079165a1号；kanda等人,jbiotechnol130,2007,300-310，yamane-ohunuki等人,biotechnolbioeng87,2004,614-622，malphettes等人,biotechnolbioeng106,2010,774-783。[0169]核酸[0170]本公开还提供了包含编码本公开的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸。就如本文所用的“核酸”来说，其包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指dna或rna聚合物或其经修饰形式，所述dna或rna聚合物或其经修饰形式可为单链或双链，合成的或从天然来源获得(例如分离和/或纯化)的，可含有天然、非天然或改变的核苷酸，并且可含有天然、非天然或改变的核苷酸间键联，诸如氨基磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联，而非见于未修饰寡核苷酸的核苷酸之间的磷酸二酯。核酸可包含编码本公开的任何抗原结合蛋白的任何核苷酸序列。在各个方面，核酸包含编码抗原结合蛋白的核苷酸序列，所述抗原结合蛋白包含(a)表a中阐述的重链(hc)互补决定区(cdr)1氨基酸序列或选自由seqidno:64、88、69、89、72、75、91、94、95、97、99、101、103、106、109组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(b)表a中阐述的hccdr2氨基酸序列或选自由seqidno:65、67、70、90、73、76、92、73、96、98、100、102、104、107、110组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(c)表a中阐述的hccdr3氨基酸序列或选自由seqidno:66、68、71、77、74、77、93、74、105、108、111组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(d)表a中阐述的轻链(lc)cdr1氨基酸序列或选自由seqidno:78、81、82、86、114、120、123、126组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约no:40和41。在各种实施方案中，核酸包含编码抗原结合蛋白的核苷酸序列，所述抗原结合蛋白包含选自由表d中所列的配对组成的组的一对氨基酸序列。在各个方面，核酸包含含有编码以seqidno:42-57中的任何一者或多者阐述的氨基酸的序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。在其他实施方案中，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或取代。[0172]在一些方面，本公开的核酸是重组的。如本文所用，术语“重组”是指(i)通过将天然或合成核酸区段接合于可在活细胞中复制的核酸分子来在活细胞外部构建的分子，或(ii)由以上在(i)中描述的那些分子的复制产生的分子。出于本文目的，复制可为体外复制或体内复制。[0173]在一些方面，核酸基于使用本领域中已知的程序进行化学合成和/或酶促连接反应来构建。参见例如sambrook等人(上文)；以及ausubel等人(上文)。举例来说，可使用天然存在的核苷酸或被设计来增加分子的生物稳定性或增加在杂交后形成的双链体的物理稳定性的以各种方式修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。可用于产生核酸的经修饰核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-d-半乳糖基q核苷、肌苷、n6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基n6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-n-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。或者，本公开的核酸中的一者或多者可从公司诸如macromolecularresources(fortcollins,co)和synthegen(houston,tx)购买。[0174]载体[0175]在一些方面，本公开的核酸并入至载体中。就此而言，本公开提供了包含任何当前公开的核酸的载体。在各个方面，载体是重组表达载体。出于本文目的，术语“重组表达载体”意指经遗传修饰寡核苷酸或多核苷酸构建体，其在以下情况下容许由宿主细胞表达mrna、蛋白质、多肽或肽：当所述构建体包含编码所述mrna、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以使所述mrna、蛋白质、多肽或肽在所述细胞内表达的条件下使载体与所述细胞接触时。本公开的载体整体来看不是天然存在的。然而，载体的部分可为天然存在的。当前公开的载体可包含任何类型的核苷酸，包括但不限于dna和rna，所述任何类型的核苷酸可为单链或双链，合成的或部分地从天然来源获得的，并且可含有天然、非天然或改变的核苷酸。载体可包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间键联，或两种类型的键联。在一些方面，改变的核苷酸或非天然存在的核苷酸间键联不阻碍载体的转录或复制。[0176]本公开的载体可为任何适合载体，并且可用于转导、转化或转染任何适合宿主。适合载体包括被设计用于繁殖和扩增，或用于表达，或用于这两者的那些，诸如质粒和病毒。载体可为基于质粒的表达载体。在各个方面，载体选自由以下组成的组：puc系列(fermentaslifesciences)、pbluescript系列(stratagene,lajoiia,ca)、pet系列(novagen,madison,wi)、pgex系列(pharmaciabiotech,uppsala,sweden)和pex系列(clontech,paloalto,ca)。还可使用噬菌体载体，诸如λgtio、λgtl1、λzapii(stratagene)、λembl4和λnml149。植物表达载体的实例包括pbiol、pbi101.2、pbi101.3、pbi121和pbin19(clontech)。动物表达载体的实例包括peuk-cl、pmam和pmamneo(clontech)。在一些方面，载体是病毒载体，例如逆转录病毒载体。在各个方面，载体是腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、单纯疱疹病毒(hsv)载体、水疱性口炎病毒(vsv)载体、痘苗病毒载体或慢病毒载体。参见例如howarth等人,cellbiol.toxicol.26(1):1-20(2010)。在各个方面，载体是感染节肢动物例如昆虫的杆状病毒载体。在各个方面，杆状病毒载体是苜蓿银纹夜蛾多核衣壳核型病毒(acmnpv)或家蚕核型多角体病毒(bmnpv)。参见例如khan,advpharmbull3(2):257-263(2013)；miller,bioessays11(4):91-96(1989)；atkinson等人,pesticsci28:215-224(1990)。[0177]本公开的载体可使用描述于例如sambrook等人(上文)以及ausubel等人(上文)中的标准重组dna技术制备。可制备环状或线性的表达载体构建体以含有在原核或真核宿主细胞中具有功能性的复制系统。复制系统可源于例如coiel、2μ质粒、λ、sv40、牛乳头状瘤病毒等。[0178]在一些方面，在适当时以及在考虑载体是基于dna还是rna的情况下，载体包含对于载体被引入至其中的宿主的类型(例如细菌、真菌、植物或动物)是特异性的调控序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子。[0179]载体可包括一个或多个允许选择经转化或经转染宿主的标记基因。标记基因包括杀生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，在营养缺陷型宿主中进行补充以提供原养型等。适于当前公开的表达载体的标记基因包括例如新霉素/g418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。[0180]载体可包含可操作地连接于编码多肽(包括其功能性部分和功能性变体)的核苷酸序列或互补于或杂交于编码多肽的核苷酸序列的核苷酸序列的天然或标准启动子。对启动子的选择属于技术人员的普通技能，所述启动子例如是强力的、微弱的、诱导型的、组织特异性的和发育特异性的。类似地，将核苷酸序列与启动子组合也属于技术人员的技能。启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子和见于鼠干细胞病毒的长末端重复序列中的启动子。[0181]宿主细胞[0182]本文提供了包含本公开的核酸或载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可含有当前公开的载体，并且能够产生由核酸编码的表达产物(例如mrna、蛋白质)的任何类型的细胞。在一些方面，宿主细胞是贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。在各个方面，宿主细胞是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体例如人分离的细胞。宿主细胞可为任何细胞类型，可源于任何类型的组织，并且可处于任何发育阶段。[0183]在各个方面，抗原结合蛋白是糖基化蛋白，并且宿主细胞是有糖基化能力的细胞。在各个方面，有糖基化能力的细胞是真核细胞，包括但不限于酵母细胞、丝状真菌细胞、原虫细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。本领域中描述了此类宿主细胞。参见例如frenzel,等人,frontimmunol4:217(2013)。在各个方面，真核细胞是哺乳动物细胞。在各个方面，哺乳动物细胞是非人哺乳动物细胞。在一些方面，细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞及其衍生物(例如cho-k1、chopro-3)、小鼠骨髓瘤细胞(例如ns0、gs-ns0、sp2/0)、被工程改造来缺乏二氢叶酸还原酶(dhfr)活性的细胞(例如dukx-x11、dg44)、人胚肾293(hek293)细胞或其衍生物(例如hek293t、hek293-ebna)、非洲绿猴肾细胞(例如cos细胞、vero细胞)、人子宫颈癌细胞(例如hela)、人骨骨肉瘤上皮细胞u2-os、腺癌性人肺泡基底上皮细胞a549、人纤维肉瘤细胞ht1080、小鼠脑肿瘤细胞cad、胚胎癌细胞p19、小鼠胚胎成纤维细胞nih3t3、小鼠成纤维细胞l929、小鼠神经母细胞瘤细胞n2a、人乳腺癌细胞mcf-7、视网膜母细胞瘤细胞y79、人视网膜母细胞瘤细胞so-rb50、人肝癌细胞hepg2、小鼠b骨髓瘤细胞j558l、或幼小仓鼠肾(bhk)细胞(gaillet等人2007；khan,advpharmbull3(2):257-263(2013))。[0184]出于扩增或复制载体的目的，在一些方面，宿主细胞是原核细胞，例如细菌细胞。[0185]本公开还提供了一种包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群体。在一些方面，细胞群体是异质群体，所述异质群体包含含有所描述的载体的宿主细胞，外加至少一种不包含任何载体的其他细胞。或者，在一些方面，细胞群体是大体上同质群体，其中所述群体主要包含含有载体的宿主细胞(例如基本上由所述宿主细胞组成)。在一些方面，群体是纯系细胞群体，其中所述群体的所有细胞都是包含载体的单一宿主细胞的克隆，以致所述群体的所有细胞都包含所述载体。在本公开的各种实施方案中，细胞群体是包含含有如本文所述的载体的宿主细胞的纯系群体。[0186]制造方法[0187]本文还提供了产生结合cldn18.2的抗原结合蛋白的方法。在各种实施方案中，方法包括在细胞培养基中培养包含含有编码如本文所述的抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸的宿主细胞，以及从所述细胞培养基收集所述抗原结合蛋白。宿主细胞可为本文所述的任何宿主细胞。在各个方面，宿主细胞选自由以下组成的组：cho细胞、ns0细胞、cos细胞、vero细胞和bhk细胞。在各个方面，培养宿主细胞的步骤包括在生长培养基中培养所述宿主细胞以支持所述宿主细胞的生长和扩增。在各个方面，生长培养基以适时方式增加细胞密度、培养物活力和生产力。在各个方面，生长培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和作为生长因子、激素和附着因子的来源的血清。在各个方面，生长培养基是一种化学成分完全确定的培养基，由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂质和胰岛素或胰岛素样生长因子组成。除营养物之外，生长培养基还帮助维持ph和重量摩尔渗透压浓度。若干生长培养基可商购获得，并且在本领域中得到描述。参见例如arora,“cellculturemedia:areview”matermethods3:175(2013)。[0188]在各个方面，方法包括在补料培养基中培养宿主细胞。在各个方面，方法包括以补料分批模式在补料培养基中培养。重组蛋白产生方法在本领域中是已知的。参见例如li等人,“cellcultureprocessesformonoclonalantibodyproduction”mabs2(5):466–477(2010)。[0189]制备抗原结合蛋白的方法可包括一个或多个用于从细胞培养物或其上清液纯化蛋白质，以及优选地回收纯化的蛋白质的步骤。在各个方面，方法包括一个或多个色谱法步骤，例如亲和色谱法(例如蛋白a亲和色谱法)、离子交换色谱法、疏水性相互作用色谱法。在各个方面，方法包括使用蛋白a亲和色谱法树脂纯化蛋白质。[0190]在各种实施方案中，方法还包括用于配制纯化的蛋白质等，由此获得包含纯化的蛋白质的制剂的步骤。此类步骤描述于formulationandprocessdevelopmentstrategiesformanufacturing,jameel和hershenson编,johnwiley&sons,inc.(hoboken,nj),2010中。[0191]在各个方面，抗原结合蛋白连接于多肽，因此抗原结合蛋白是融合蛋白的一部分。因此，本公开还提供了产生包含结合cldn18.2的抗原结合蛋白的融合蛋白的方法。在各种实施方案中，方法包括在细胞培养基中培养包含含有编码如本文所述的融合蛋白的核苷酸序列的核酸的宿主细胞，以及从所述细胞培养基收集所述融合蛋白。[0192]缀合物[0193]本公开还提供了附接、连接或缀合于第二部分(例如异源性部分、缀合部分)的抗原结合蛋白。因此，本公开提供了一种包含抗原结合蛋白和异源性部分的缀合物。如本文所用，术语“异源性部分”与“缀合部分”同义，并且是指不同于本公开的抗原结合蛋白的任何分子(化学的或生物化学的，天然存在的或非编码的)。各种异源性部分包括但不限于聚合物、碳水化合物、脂质、核酸、寡核苷酸、dna或rna、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、治疗剂(例如细胞毒性剂、细胞因子)或诊断剂。[0194]在一些实施方案中，异源性部分是聚合物。聚合物可为支化的或未支化的。聚合物可具有任何分子量。在一些实施方案中，聚合物具有在约2kda至约100kda之间的平均分子量(术语“约”指示在水溶性聚合物的制剂中，相比于所陈述的分子量，一些分子将更重，一些分子将更轻)。在一些方面，聚合物的平均分子量在约5kda与约50kda之间，在约12kda至约40kda之间，或在约20kda至约35kda之间。[0195]在一些实施方案中，聚合物被修饰来具有单一反应性基团，诸如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，以使聚合度可加以控制。在一些实施方案中，聚合物是水溶性的，以使它所附接的蛋白质在水性环境诸如生理环境中不沉淀。在一些实施方案中，当例如组合物用于治疗用途时，聚合物是药学上可接受的。另外，在一些方面，聚合物是聚合物的混合物，例如共聚物、嵌段共聚物。[0196]在一些实施方案中，聚合物选自由以下组成的组：聚酰胺；聚碳酸酯；聚烯烃及其衍生物，包括聚亚烷基二醇、聚氧化烯、聚对苯二甲酸亚烷基酯；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物，包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八酯)；聚乙烯聚合物，包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚(乙酸乙烯酯)和聚乙烯吡咯烷酮；聚乙交酯；聚硅氧烷；聚氨酯及其共聚物；纤维素，包括烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基-丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素和纤维素硫酸钠盐；聚丙烯；聚乙烯，包括聚(乙二醇)、聚(氧化乙烯)和聚(对苯二甲酸乙二酯)；以及聚苯乙烯。[0197]用于在本文中使用的一特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇(peg)。如本文所用，聚乙二醇意图涵盖可用于衍生其他蛋白质的任何peg形式，诸如单(c1-c10)烷氧基或芳基氧基-聚乙二醇。peg是可以广泛范围的分子量获得的线性或支化中性聚醚，并且可溶于水和大多数有机溶剂中。[0198]在一些实施方案中，异源性部分是碳水化合物。在一些实施方案中，碳水化合物是单糖(例如葡萄糖、半乳糖、果糖)、二糖(例如蔗糖、乳糖、麦芽糖)、寡糖(例如棉子糖、水苏糖)、多糖(淀粉、淀粉酶、支链淀粉、纤维素、几丁质、胼胝质、昆布多糖(laminarin)、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖。[0199]在一些实施方案中，异源性部分是脂质。在一些实施方案中，脂质是脂肪酸、类花生酸、前列腺素、白三烯、血栓烷、n-酰基乙醇胺)、甘油脂质(例如单取代的甘油、二取代的甘油、三取代的甘油)、甘油磷脂(例如磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如鞘氨醇、神经酰胺)、固醇脂质(例如类固醇、胆固醇)、异戊烯醇脂质、糖脂、或聚酮、油、蜡、胆固醇、固醇、脂溶性维生素、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂。[0200]在一些实施方案中，异源性部分是治疗剂。治疗剂可为本领域中已知的那些中的任一者。本文考虑的治疗剂的实例包括但不限于天然酶、源于天然来源的蛋白质、重组蛋白、天然肽、合成肽、环状肽、抗体、受体激动剂、细胞毒性剂、免疫球蛋白、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道阻断剂、冠状血管扩张药、强心苷、抗心律失常剂、心脏拟交感神经药、血管紧张素转化酶(ace)抑制剂、利尿剂、正性肌力药、胆固醇和甘油三酯降低剂、胆汁酸螯合剂、贝特(fibrate)、3-羟基-3-甲基戊二酰基(hmg)-辅酶a还原酶抑制剂、烟酸衍生物、抗肾上腺素能剂、α-肾上腺素能阻滞剂、中枢作用性抗肾上腺素能剂、血管扩张药、保钾剂、噻嗪化物和相关剂、血管紧张素ii受体拮抗剂、周围血管扩张药、抗雄激素剂、雌激素、抗生素、类视黄醇、胰岛素和类似物、α-葡糖苷酶抑制剂、双胍、氯茴苯酸、磺酰脲、噻唑烷二酮、雄激素、孕激素、骨代谢调控剂、垂体前叶激素、下丘脑激素、垂体后叶激素、促性腺激素、促性腺激素释放激素拮抗剂、排卵刺激剂、选择性雌激素受体调节剂、抗甲状腺剂、甲状腺激素、膨胀性泻剂(bulkformingagent)、轻泻药、逆蠕动剂、菌丛调节剂、肠吸附剂、肠抗感染剂、抗厌食剂、抗恶病质剂、抗贪食剂、食欲抑制剂、抗肥胖剂、抗酸剂、上胃肠道剂、抗胆碱能剂、氨基水杨酸衍生物、生物应答调节剂、皮质类固醇、解痉药、5-ht4部分激动剂、抗组胺剂、大麻素、多巴胺拮抗剂、血清素拮抗剂、细胞保护剂、组胺h2受体拮抗剂、粘膜保护剂、质子泵抑制剂、幽门螺杆菌(h.pylori)根除疗法、红细胞生成刺激剂、造血剂、贫血剂、肝素、抗纤维蛋白溶解剂、止血剂、凝血因子、二磷酸腺苷抑制剂、糖蛋白受体抑制剂、纤维蛋白原-血小板结合抑制剂、血栓烷-a2抑制剂、纤溶酶原激活物、抗血栓形成剂、糖皮质激素、盐皮质激素、皮质类固醇、选择性免疫抑制剂、抗真菌剂、预防性疗法中涉及的药物、aids相关感染、巨细胞病毒、非核苷逆转录酶抑制剂、核苷类似物逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、贫血、卡波西氏肉瘤(kaposi’ssarcoma)、氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽、林可酰胺、大环内酯、噁唑烷酮、青霉素、链阳性菌素、磺酰胺、甲氧苄啶(trimethoprim)和衍生物、四环素、驱虫剂、抗阿米巴药、双胍、金鸡纳生物碱(cinchonaalkaloid)、叶酸拮抗剂、喹啉衍生物、卡氏肺囊虫(pneumocystiscarinii)疗法、酰肼、咪唑、三唑、硝基咪唑、环胺、神经氨酸酶抑制剂、核苷、磷酸盐结合剂、胆碱酯酶抑制剂、辅助疗法、巴比妥类药物和衍生物、苯并二氮杂γ氨基丁酸衍生物、乙内酰脲衍生物、亚氨基均二苯乙烯衍生物、丁二酰亚胺衍生物、抗惊厥剂、麦角生物碱、抗偏头痛制剂、生物应答调节剂、氨基甲酸酯、三环衍生物、去极性剂、非去极性剂、神经肌肉麻痹剂、cns刺激剂、多巴胺能试剂、单胺氧化酶抑制剂、comt抑制剂、烷基磺酸酯、乙烯亚胺、咪唑四嗪、氮芥类似物、亚硝基脲、含铂化合物、抗代谢物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、脲衍生物、蒽环霉素、更生霉素、喜树碱衍生物、表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)、紫杉烷、长春花生物碱和类似物、抗雄激素剂、抗雌激素剂、非类固醇芳香酶抑制剂、蛋白激酶抑制剂、抗赘生剂、氮杂螺癸烷二酮衍生物、抗焦虑剂、刺激剂、单胺再摄取抑制剂、选择性血清素再摄取抑制剂、抗抑郁剂、苯并异噁唑衍生物、丁酰苯衍生物、二苯并二氮杂衍生物、二苯并硫氮杂衍生物、二苯基丁基哌啶衍生物、吩噻嗪、噻吩并苯并二氮杂衍生物、噻吨衍生物、变应原浸出物、非类固醇剂、白三烯受体拮抗剂、黄嘌呤、内皮素受体拮抗剂、前列腺素、肺表面活性剂、粘液溶解剂、抗有丝分裂剂、排尿酸药、黄嘌呤氧化酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、乌洛托品(metheamine)盐、硝基呋喃衍生物、喹诺酮、平滑肌松弛剂、拟副交感神经剂、卤化烃、氨基苯甲酸酯、酰胺(例如利多卡因(lidocaine)、盐酸阿替卡因(articainehydrochloride)、盐酸丁哌卡因(bupivacainehydrochloride))、退热剂、安眠剂和镇静剂、环吡咯酮、吡唑并嘧啶类、非类固醇消炎药物、阿片样物质、对氨基苯酚衍生物、醇脱氢酶抑制剂、肝素拮抗剂、吸附剂、催吐药、阿片样物质拮抗剂、胆碱酯酶复活剂、尼古丁替代疗法、维生素a类似物和拮抗剂、维生素b类似物和拮抗剂、维生素c类似物和拮抗剂、维生素d类似物和拮抗剂、维生素e类似物和拮抗剂、维生素k类似物和拮抗剂。[0201]本公开的抗原结合蛋白可缀合于一种或多种有效抑制肿瘤转移的细胞因子和生长因子，并且其中所述细胞因子或生长因子已被证明对至少一种细胞群体具有抗增生作用。此类细胞因子、淋巴因子、生长因子或其他造血因子包括但不限于：m-csf、gm-csf、tnf、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、ifn、tnfα、tnf1、tnf2、g-csf、meg-csf、gm-csf、血小板生成素、干细胞因子和红细胞生成素。用于在本文中使用的额外生长因子包括血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-14、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体ia、骨形态发生蛋白受体ib、脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β内皮细胞生长因子、内皮素1、上皮源性嗜中性粒细胞引诱剂、胶质细胞系源性神经营养因子受体α1、胶质细胞系源性神经营养因子受体α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白α、生长相关蛋白β、生长相关蛋白γ、肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子i、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子ii、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质化细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养素-3、神经营养素-4、前b细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子α、转化生长因子β、转化生长因子β1、转化生长因子β1.2、转化生长因子β2、转化生长因子β3、转化生长因子β5、潜活转化生长因子β1、转化生长因子β结合蛋白i、转化生长因子β结合蛋白ii、转化生长因子β结合蛋白iii、i型肿瘤坏死因子受体、ii型肿瘤坏死因子受体、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、以及它们的嵌合蛋白和生物或免疫活性片段。[0202]在一些实施方案中，缀合物包含如本文所述的抗原结合蛋白和细胞毒性剂。细胞毒性剂是对细胞具有毒性的任何分子(化学或生物化学)。在一些方面，当细胞毒性剂缀合于本公开的抗原结合蛋白时，获得的结果是协同的。也就是说，抗原结合蛋白和细胞毒性剂的组合疗法的有效性是协同的，即有效性大于从各自的累加单独作用预期的有效性。因此，细胞毒性剂的剂量可降低，从而，毒性问题和其他副作用的风险得到相伴降低。在一些实施方案中，细胞毒性剂是化学治疗剂。化学治疗剂在本领域中是已知的，并且包括但不限于铂配位化合物、拓扑异构酶抑制剂、抗生素、抗有丝分裂生物碱和二氟核苷，如美国专利第6,630,124号中所述。[0203]在一些实施方案中，化学治疗剂是铂配位化合物。术语“铂配位化合物”是指以离子形式提供铂的任何肿瘤细胞生长抑制性铂配位化合物。[0204]在一些实施方案中，铂配位化合物是顺式二胺二水合铂(ii)-离子；氯(二乙三胺)-氯化铂(ii)；二氯(乙二胺)-铂(ii)；二胺(1,1-环丁烷二羧酸根离子基)铂(ii)(卡铂)；螺铂；异丙铂；二氨(2-乙基丙二酸根离子基)-铂(ii)；乙二胺丙二酸铂(ii)；水合(1,2-二氨基二环己烷)-硫酸铂(ii)；(1,2-二氨基环己烷)丙二酸铂(ii)；(4-羧基邻苯二甲酸根离子基)(1,2-二氨基环己烷)铂(ii)；(1,2-二氨基环己烷)-(异柠檬酸根离子基)铂(ii)；(1,2-二氨基环己烷)顺式(丙酮酸根离子基)铂(ii)；(1,2-二氨基环己烷)草酸铂(ii)；奥马铂；和四铂。[0205]在一些实施方案中，顺铂是用于本发明的组合物和方法中的铂配位化合物。顺铂可以名称platinoltm从bristolmyers-squibbcorporation商购获得，并且可以用于用水、无菌盐水或其他适合媒介物复原的粉末形式获得。适用于本发明中的其他铂配位化合物是已知的，并且可商购获得以及/或者可通过常规技术制备。顺铂或顺式二氯二胺铂ii已作为各种人实体恶性肿瘤的治疗中的化学治疗剂成功使用多年。更新近地，也已显示其他二氨基铂络合物作为各种人实体恶性肿瘤的治疗中的化学治疗剂的功效。此类二氨基铂络合物包括但不限于螺铂和卡铂。尽管顺铂和其他二氨基铂络合物已广泛用作人中的化学治疗剂，但它们必须以可导致毒性问题诸如肾损害的高剂量水平递送。[0206]在一些实施方案中，化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶是真核细胞中能够改变dna拓扑结构的酶。它们对于细胞功能和细胞增殖至关重要。通常，在真核细胞中存在两个类别的拓扑异构酶，即i型和ii型。拓扑异构酶i是具有约100,000分子量的单体酶。所述酶结合dna，并且引入短暂单链断裂，展开双螺旋(或允许它展开)，并且随后在从dna链解离之前再密封所述断裂。各种拓扑异构酶抑制剂近来已显示在对受卵巢癌、食道癌或非小细胞肺癌折磨的人的治疗中的临床功效。[0207]在一些方面，拓扑异构酶抑制剂是喜树碱或喜树碱类似物。喜树碱是一种水不溶性细胞毒性生物碱，由原产于中国的喜树(camptothecaaccuminata)和原产于印度的臭味假柴龙树(nothapodytesfoetida)产生。喜树碱展现针对许多肿瘤细胞的肿瘤细胞生长抑制活性。喜树碱类似物类别的化合物通常是dna拓扑异构酶i的特异性抑制剂。就术语“拓扑异构酶的抑制剂”来说，其意指在结构上与喜树碱相关的任何肿瘤细胞生长抑制性化合物。喜树碱类似物类别的化合物包括但不限于拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)和9-氨基-喜树碱。[0208]在额外实施方案中，细胞毒性剂是以下中要求保护或描述的任何肿瘤细胞生长抑制性喜树碱类似物：1991年4月2日授予的美国专利第5,004,758号和1989年6月21日以20'公布号ep0321122授予的欧洲专利申请第88311366.4号；1986年8月5日授予的美国专利第4,604,463号和1985年4月17日公布的欧洲专利申请公布第ep0137145号；1984年9月25日授予的美国专利第4,473,692号和1983年3月16日公布的欧洲专利申请公布第ep0074256号；1985年10月8日授予的美国专利第4,545,880号和1983年3月16日公布的欧洲专利申请公布第ep0074256号；1983年9月14日公布的欧洲专利申请公布第ep0088642号；wani等人,j.med.chem.,29,2358-2363(1986)；nitta等人,proc.14thinternationalcongr.chemotherapy,kyoto,1985,tokyopress,anticancersection1,第28-30页，尤其是称为cpt-11的化合物。cpt-11是一种具有通过氨基甲酸酯键联接合在10-羟基-7-乙基喜树碱的c-10处的4-(哌啶子基)-哌啶侧链的喜树碱类似物。cpt-11当前正在进行人临床试验，并且也被称为伊立替康；wani等人,j.med.chem.,23,554(1980)；wani等人,j.med.chem.,30,1774(1987)；1982年8月3日授予的美国专利第4,342,776号；1990年9月13日提交的序列号为581,916的美国专利申请和1991年3月20日公布的欧洲专利申请公布第ep418099号；1985年4月23日授予的美国专利第4,513,138号和1983年3月23日公布的欧洲专利申请公布第ep0074770号；1983年8月16日授予的美国专利第4,399,276号和1982年7月28日公布的欧洲专利申请公布第0056692号；所述文献和专利中的每一者的全部公开内容据此通过引用并入本文。所有以上所列的喜树碱类似物类别的化合物都可商购获得以及/或者可通过常规技术制备，所述常规技术包括以上所列的参考文献中所述的那些。拓扑异构酶抑制剂可选自由拓扑替康、伊立替康和9-氨基喜树碱组成的组。[0209]在一些实施方案中，喜树碱类似物是伊立替康(cpt-11)的活性代谢物。在一些此类实施方案中，喜树碱类似物是7-乙基-10-羟基喜树碱(sn-38)。作为一种代谢物，sn-38通过羧酸酯酶水解伊立替康而形成。在一些实施方案中，sn-38具有以下结构中的一者：[0210]sn-38已描述于序列号为7,999,083的美国专利申请；序列号为8,080,250的美国专利申请；序列号为8,759,496的美国专利申请；序列号为8,999,344的美国专利申请；序列号为10,195,288的美国专利申请；和序列号为9,808,537的美国专利申请中。[0211]在一些实施方案中，喜树碱类似物是甲烷磺酸依沙替康(exatecanmethanesulfonate)。甲烷磺酸依沙替康是一种相比于其他cpt类似物展现更强力拓扑异构酶i抑制活性和抗肿瘤活性的水溶性喜树碱(cpt)。此外，依沙替康有效针对p-糖蛋白(p-gp)介导的多药物抗性细胞。[0212]在一些实施方案中，喜树碱类似物是依沙替康的强力衍生物德鲁替康(deruxtecan，dxd)，其具有的拓扑异构酶i抑制效能是sn-38的10倍。在一些实施方案中，dxd具有以下结构：[0213][0214]dxd已描述于序列号为6,407,115的美国专利申请；序列号为10,195,288的美国专利申请；序列号为9,808,537的美国专利申请；和序列号为6,407,115的美国专利申请中。[0215]喜树碱类似物类别的众多化合物(包括其药学上可接受的盐、水合物和溶剂化物)的制备以及包含此种喜树碱类似物类别的化合物和惰性药学上可接受的载体或稀释剂的口服和胃肠外药物组合物的制备广泛描述于1991年4月2日授予的美国专利第5,004,758号和1989年6月21日以公布号ep0321122公布的欧洲专利申请第88311366.4号中，所述专利的教示内容通过引用并入本文。[0216]在本发明的其他实施方案中，化学治疗剂是抗生素化合物。适合抗生素包括但不限于多柔比星(doxorubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、博莱霉素(bleomycin)、柔红霉素(daunorubicin)和链脲霉素(streptozocin)。[0217]在一些实施方案中，化学治疗剂是抗有丝分裂生物碱。一般来说，抗有丝分裂生物碱可从长春花(cantharanthusroseus)提取，并且已被表明有效作为抗癌化学治疗剂。已在化学上和药理学上研究了大量半合成衍生物(参见o.vantellingen等人,anticancerresearch,12,1699-1716(1992))。本发明的抗有丝分裂生物碱包括但不限于长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、紫杉醇(taxol)和长春瑞滨(vinorelbine)。后两种抗有丝分裂生物碱可分别从elilillyandcompany和pierrefabrelaboratories商购获得(参见美国专利第5,620,985号)。在一个实施方案中，抗有丝分裂生物碱是长春瑞滨。[0218]在本发明的其他实施方案中，化学治疗剂是二氟核苷。2'-脱氧-2',2'-二氟核苷在本领域中是已知为具有抗病毒活性。此类化合物公开和教导于美国专利第4,526,988和4,808614号中。欧洲专利申请公布184,365公开这些上述二氟核苷具有溶瘤活性。在某些方面，用于本发明的组合物和方法中的2'-脱氧-2',2'-二氟核苷是盐酸2'-脱氧-2',2'-二氟胞苷，也被称为盐酸吉西他滨(gemcitabinehydrochloride)。吉西他滨可商购获得，或可如美国专利第4,526,988、4,808,614和5,223,608号中所公开和教导以多步工艺合成，所述专利的教示内容通过引用并入本文。[0219]在各个方面，化学治疗剂是通过阻断微管蛋白聚合、使微管去稳定，或改变微管动力学来抑制细胞分裂的抗有丝分裂剂，例如类美登素(maytansinoid)或其衍生物(例如dm1或dm4)、澳瑞他汀(auristatin)或其衍生物。在各种情况下，化学治疗剂是澳瑞他汀。举例来说，在一些方面，澳瑞他汀是多拉司他汀(dolastatin)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)、单甲基澳瑞他汀e(mmae)或pf-06380101。本领域中描述了澳瑞他汀。参见例如maderna,a.；等人,molpharmaceutics12(6):1798-1812(2015)。在各个方面，缀合物包含与mmae组合的本公开的抗体。任选地，缀合物包含接头。在一些方面，接头包含可裂解连接部分。在各种情况下，缀合物包含连接于附接基团的本公开的抗体，所述附接基团连接于组织蛋白酶可裂解接头，所述组织蛋白酶可裂解接头转而连接于间隔体，所述间隔体连接于mmae。在各个方面，附接基团通过抗体的fc区的cys残基附接于抗体。在示例性方面，附接基团包含式i结构：[0220][0221]在示例性方面，组织蛋白酶可裂解接头包含式ii结构：[0222][0223]在示例性方面，间隔体包含式iii结构：[0224][0225]在一些实施方案中，mmae具有以下结构：[0226][0227]本公开还提供了包含连接于多肽的本公开的抗原结合蛋白的缀合物，以致所述缀合物是融合蛋白。因此，本公开提供了包含连接于多肽的本公开的抗原结合蛋白的融合蛋白。在各种实施方案中，多肽是诊断标记，例如荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白；或其他标签，例如myc标签。在各个方面，多肽是以上所列的细胞因子、淋巴因子、生长因子或其他造血因子中的一者。[0228]接头[0229]在一些实施方案中，缀合物直接连接于异源性部分。在替代性实施方案中，缀合物包含使本公开的化合物接合于异源性部分的接头。在一些方面，接头包含1至约60、或1至30个原子或更长、2至5个原子、2至10个原子、5至10个原子、或10至20个原子长的原子链。在一些实施方案中，链原子全都是碳原子。在一些实施方案中，接头的主链中的链原子选自由c、o、n和s组成的组。链原子和接头可根据它们的预期溶解性(亲水性)加以选择以便提供更可溶的缀合物。在一些实施方案中，接头提供经受由见于靶标组织或器官或细胞中的酶或其他催化剂或水解条件裂解的官能团。在一些实施方案中，接头的长度足够长，以降低空间位阻的可能性。在一些实施方案中，接头是氨基酸或肽基接头。此类肽基接头可为任何长度。各种接头在长度方面是约1至50个氨基酸，在长度方面是5至50、3至5、5至10、5至15、或10至30个氨基酸。[0230]多种适合接头在本领域中是已知的。接头可为可裂解的(可裂解接头)，例如在生理条件下，例如在细胞内条件下，以致接头的裂解在细胞内环境中释放药物。或者，接头可为在细胞外条件下可裂解的，例如在肿瘤细胞外部或在肿瘤团块附近，以致接头的裂解释放优先渗透进肿瘤细胞内部的药物。在其他实施方案中，接头不是可裂解的(非可裂解接头)，并且药物例如通过抗体降解而释放。[0231]接头可键合于抗体部分上的化学反应性基团，例如键合于游离氨基、亚氨基、羟基、硫醇或羧基(例如键合于n末端或c末端，键合于一个或多个赖氨酸残基的ε氨基，键合于一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的游离羧酸基团，键合于一个或多个半胱氨酰基残基的氢硫基，或键合于一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的羟基)。接头所结合的位点可为抗体部分的氨基酸序列中的天然残基，或它可例如通过dna重组技术(例如通过在氨基酸序列中引入半胱氨酸或蛋白酶裂解位点)或通过蛋白质生物化学(例如还原、ph调整或蛋白水解)来引入至抗体部分中。接头所结合的位点还可为非天然氨基酸。接头所结合的位点还可为抗体上的聚糖。[0232]通常，接头在它正在连接的两个基团连接的条件下是大体上惰性的。术语“双官能交联剂”、“双官能接头”或“交联剂”是指具有两个在接头的每个末端处的反应性基团的修饰剂，以致一个反应性基团可首先与细胞毒性化合物反应以提供携带接头部分和第二反应性基团的化合物，所述第二反应性基团可接着与抗体反应。或者，双官能交联剂的一个末端可首先与抗体反应以提供携带接头部分和第二反应性基团的抗体，所述第二反应性基团可接着与细胞毒性化合物反应。连接部分可含有允许细胞毒性部分在特定部位处释放的化学键。适合化学键在本领域中是熟知的，并且包括二硫键、硫醚键、酸不稳定键、光不稳定键、蛋白酶/肽酶不稳定键和酯酶不稳定键。参见例如美国专利第5,208,020；5,475,092；6,441,163；6,716,821；6,913,748；7,276,497；7,276,499；7,368,565；7,388,026和7,414,073号。在一些实施方案中，键是二硫键、硫醚和/或蛋白酶/肽酶不稳定键。可用于本发明中的其他接头包括非可裂解接头，诸如详述于us20050169933中的那些；带电荷接头或亲水性接头，诸如us2009/0274713、us2010/0129314和wo2009/134976中所述的那些，所述专利中的每一者通过引用明确并入本文。[0233]在一些实施方案中，接头是对缀合物赋予亲水性的亲水性接头。在一些实施方案中，亲水性接头包含聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，亲水性接头是cla2。在一些实施方案中，cla2接头具有以下结构：[0234][0235]cla2已描述于美国专利第8,080,250；8,759,496；和10,195,288号中。[0236]在一些实施方案中，亲水性接头是cl2e。在一些实施方案中，cl2e具有以下结构：[0237][0238]cl2e已描述于美国专利第8,080,250；8,759,496；和10,195,288号中。[0239]在一些实施方案中，接头可由存在于细胞内环境中(例如溶酶体或内体或胞膜窖内)的裂解剂裂解。接头可为例如由细胞内或细胞外肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)裂解的肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含至少两个、至少三个、至少四个或至少五个氨基酸长。[0240]在一些实施方案中，肽接头是包含缬氨酸和瓜氨酸残基的mc-vc-pab。在一些实施方案中，mc-vc-pab接头具有以下结构：[0241][0242]mc-vc-pab已描述于美国专利第7,659,241；7,829,531；6,884,869；6,214,345；和6,214,345号中。[0243]在一些实施方案中，肽接头是顺丁烯二酰亚胺基己酰基甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸(mc-ggfg)。在一些实施方案中，mc-ggfg接头具有以下结构：[0244][0245]mc-ggfg已描述于美国专利第9,808,537和10,195,288号中。[0246]在其他实施方案中，可裂解接头是ph敏感性的，即在某些ph值下对水解敏感。在一些实施方案中，ph敏感性接头可在酸性条件下水解。举例来说，可使用可在溶酶体中水解的酸不稳定接头(例如腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺乌头酸酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)(参见例如美国专利第5,122,368；5,824,805；5,622,929号；dubowchik和walker,1999,pharm.therapeutics83:67-123；neville等人,1989,biol.chem.264:14653-14661)。此类接头在中性ph条件诸如血液中的那些条件下相对稳定，但在低于ph5.5或5.0即溶酶体的近似ph下不稳定。在某些实施方案中，可水解接头是硫醚接头(诸如像通过酰腙键附接于治疗剂的硫醚)(参见例如美国专利第5,622,929号)。[0247]在其他实施方案中，接头可在还原性条件下裂解(例如二硫接头)。使得能够通过二硫键来使抗体与细胞毒性化合物连接的双官能交联剂包括但不限于4-(4-硝基吡啶基-2-二硫基)丁酸n-丁二酰亚胺酯、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸n-丁二酰亚胺酯(spdp)、4-(2-吡啶基二硫基)戊酸n-丁二酰亚胺酯(spp)、4-(2-吡啶基二硫基)丁酸n-丁二酰亚胺酯(spdb)、4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸n-丁二酰亚胺酯(磺基-spdb)。磺基-spdb描述于例如美国专利8,236,319中，所述美国专利通过引用并入本文。或者，可使用引入硫醇基团的交联剂，诸如2-亚氨基硫杂环戊烷、高半胱氨酸硫代内酯、或s-乙酰基丁二酸酐。在其他实施方案中，接头可含有先前所述的肽接头、ph敏感性接头或二硫接头中的一者或多者的组合。[0248]“异双官能交联剂”是具有两个不同反应性基团的双官能交联剂。含有胺反应性n-羟基丁二酰亚胺基团(nhs基团)和羰基反应性肼基团的异双官能交联剂也可用于使细胞毒性化合物与抗体连接。此类可商购获得的异双官能交联剂的实例包括丁二酰亚胺基6-肼基烟酰胺丙酮腙(sanh)、4-肼替基对苯二甲酸丁二酰亚胺酯盐酸盐(shth)和肼基烟酸丁二酰亚胺酯盐酸盐(shnh)。携带酸不稳定键联的缀合物还可使用本发明的携带肼的苯并二氮杂衍生物制备。可使用的双官能交联剂的实例包括对甲酰基苯甲酸丁二酰亚胺酯(sfb)和对甲酰基苯氧基乙酸丁二酰亚胺酯(sfpa)。[0249]本文所述的接头可与本文所述的异源性部分以任何组合使用。本文所述的所有以上所列的接头和异源性部分都可商购获得以及/或者可通过常规技术制备，所述常规技术包括以上所列的参考文献中所述的那些。[0250]缀合[0251]异源性部分与抗原结合蛋白比率(har)代表每个抗原结合分子连接的异源性部分的数目。在一些实施方案中，har在1至15、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2的范围内。在一些实施方案中，har在2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4或2至3的范围内。在其他实施方案中，har是约2、约2.5、约3、约4、约5或约6。在一些实施方案中，har在约2至约4的范围内。har可通过常规手段表征，所述常规手段诸如是质谱测定法、uv/vis光谱法、elisa测定和/或hplc。[0252]在一些实施方案中，缀合物是异质缀合物(也被称为“常规的”)，其中抗原结合蛋白缀合于不同数目的异源性部分。在一些实施方案中，异质缀合物遵循缀合物的高斯分布(gaussiandistribution)或拟高斯分布，其中所述分布集中于平均异源性部分荷载值，有一些抗原结合蛋白以高于平均值缀合，并且一些抗原结合蛋白以低于平均值缀合。[0253]在一些实施方案中，缀合物是同质缀合物，其中相当大百分比的抗原结合蛋白缀合于确定数目的异源性部分。在一些实施方案中，同质缀合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的har。在一些实施方案中，同质缀合物包含2、4、6或8的har。在优选实施方案中，同质缀合物包含4的har。在其他优选实施方案中，同质缀合物包含2的har。在一些实施方案中，同质缀合物包含大于或等于70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的具有确定har的缀合物。在一些实施方案中，同质缀合物包含约70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的具有确定har的缀合物。在一些实施方案中，同质缀合物包含至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的具有确定har的缀合物。在一些实施方案中，同质缀合物包含不是高斯分布或拟高斯分布的har分布。在一些实施方案中，同质缀合物的同质性通过色谱图例如hplc或任何适合色谱法来确定。在一些实施方案中，色谱图是hic色谱图。同质缀合物可通过位点特异性缀合产生。[0254]在一些实施方案中，异源性部分以位点特异性方式缀合于抗原结合蛋白(例如抗体)。各种位点特异性缀合方法在本领域中是已知的，例如thiomab或tdc或在未配对的半胱氨酸残基处缀合(junutula等人(2008)nat.biotechnol.26:925-932；dimasi等人(2017)mol.pharm.14:1501-1516；shen等人(2012)nat.biotechnol.30:184-9)；硫醇桥接头(behrens等人(2015)mol.pharm.12:3986-98)；使用转谷氨酰胺酶在谷氨酰胺处缀合(dennler等人(2013)methodsmol.bio.1045:205-15；dennler等人(2014)bioconjugchem.25:569-78)；在工程改造的非天然氨基酸残基处缀合(axup等人(2012)procnatlacadsciu.s.a.104-16101-6；tian等人(2014)procnatlacadsciu.s.a.111:1766-71；vanbrunt等人(2015)bioconjugchem26:2249-60；zimmerman等人(2014)bioconjugchem25:351-61)；硒代半胱氨酸缀合(li等人(2017)cellchembiol24:433-442)；聚糖介导的缀合(okeley等人(2013)bioconjugchem24:1650-5)；在半乳糖或galnac类似物处缀合(ramakrishnan和qasba(2002)jbiolchem277:20833-9；vangeel等人(2015)bioconjugchem26:2233-42)；通过聚糖工程改造(zhou等人(2014)bioconjugchem25:510-20；tang等人(2017)natprotoc12:1702-1721)；通过短肽标签，诸如工程改造谷氨酰胺标签或分选酶a介导的转肽(strop等人(2013)chembiol20:161-7；beerli等人(2015)plosone10:e0131177)；以及通过醛标签(wu等人(2009)procnatlacadsciu.s.a.106:3000-5)。[0255]缀合物(例如adc)的不可预测性[0256]不可能简单地基于抗体概况或药物有效载荷概况来提前预测哪些抗体-药物缀合物对于临床应用将是足够安全和有效的。举例来说，特定药物在缀合于针对一种靶标的抗体时可能十分良好地起作用，但它在缀合于针对不同靶标的抗体或甚至针对相同靶标的不同抗体时可能不几乎同样地起作用。为何不同抗体-药物缀合物显示不同体内抗肿瘤活性未得到充分了解，以致不允许在新抗体-药物缀合物的设计中进行准确预测。推测许多因素的不可预测的相互影响在起作用。这些因素可包括例如抗体-药物缀合物对靶标抗原的结合亲和力、缀合物穿透实体肿瘤的能力以及适当暴露于肿瘤而不导致毒性的循环半衰期。[0257]单独抗体亲和力充分说明了复杂性和不可预测性。具有高亲和力的抗体或抗体-药物缀合物以更好的细胞摄取进行移动，此导致更高水平的细胞毒性有效载荷在细胞内部释放。还已知较高亲和力会增强抗体依赖性细胞性细胞毒性(adcc)。所有这些属性都有利于抗体-药物缀合物的细胞杀灭性质。然而，还已知的是，抗体或抗体-药物缀合物的高亲和力可通过“抗原屏障效应”阻止高效肿瘤穿透，从而表明为实现强力体内抗肿瘤活性，抗体-药物缀合物的亲和力必须正好：既不过高也不过低。迄今为止，不知道如何预测多少将是抗体-药物缀合物的最高效或有效亲和力水平。[0258]此外，不能通过单独接头和有效载荷的机制预测体内抗肿瘤活性。举例来说，o.ab等人,mol.cancerther.14(&):1605-1613(2015)证明当在临床前癌症模型中测试时，通过不同接头缀合于相同抗微管蛋白毒素的相同抗体展现显著不同的抗肿瘤活性。这个实例是特别惊人的，因为两个接头的化学结构是极其类似的。此外，存在于优越缀合物中的接头含有亲水性部分。亲水性代谢物通常具有较小膜通透性，并且被认为从溶酶体(缀合物降解部位)流出较慢，从而导致释放的有效载荷的抗微管蛋白活性的延迟。这个发现支持有效载荷递送的“理想”动力学，但迄今为止，不存在对什么构成此类动力学的了解。增加这个复杂性的是即使关于特定细胞类型得到确定，有效载荷递送的理想动力学是否将适用于所有细胞类型的待解决问题。因此，不可能仅从接头或有效载荷的化学组成预测最有效的体内抗肿瘤活性。[0259]组合物、药物组合物和制剂[0260]本文提供了包含如当前公开的抗原结合蛋白、核酸、载体、宿主细胞或缀合物的组合物。在一些方面，组合物包含呈分离和/或纯化形式的抗原结合蛋白。在一些方面，组合物包含单一类型(例如结构)的本公开的抗原结合蛋白，或包含两种或更多种本公开的抗原结合蛋白的组合，其中所述组合包含不同类型(例如结构)的两种或更多种抗原结合蛋白。[0261]在一些方面，组合物包含增强抗原结合蛋白的化学物理特征的剂，例如通过使抗原结合蛋白在某些温度例如室温下稳定，增加储存期限，降低降解例如氧化蛋白酶介导的降解，增加抗原结合蛋白的半衰期等。在一些方面，组合物包含本文公开的任何剂作为异源性部分或缀合部分，任选地与本公开的抗原结合蛋白掺混或缀合于抗原结合蛋白。[0262]在本公开的各个方面，组合物另外包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，如当前公开的抗原结合蛋白、核酸、载体、宿主细胞或缀合物(在下文中被称为“活性剂”)被配制成包含活性剂以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。就此而言，本公开还提供了包含意图用于施用至受试者例如哺乳动物的活性剂的药物组合物。[0263]在一些实施方案中，活性剂以适于施用至患者的纯度水平存在于药物组合物中。在一些实施方案中，活性剂具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的纯度水平，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在一些实施方案中，组合物含有在约0.001至约30.0mg/ml的浓度下的活性剂。[0264]在各个方面，药物组合物包含药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可publishingcompany。[0268]药物组合物可被配制来达到生理上可相容的ph。在一些实施方案中，药物组合物的ph可例如在约4或约5与约8.0，或约4.5与约7.5，或约5.0至约7.5之间。在各种实施方案中，药物组合物的ph在5.5与7.5之间。[0269]本公开提供了产生药物组合物的方法。在各个方面，方法包括将抗原结合蛋白、缀合物、融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞、或它们的组合与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。[0270]施用途径[0271]关于本公开，可通过任何适合施用途径将活性剂或包含所述活性剂的药物组合物施用至受试者。举例来说，可通过胃肠外、经鼻、口服、经肺、表面、经阴道或经直肠施用将活性剂施用至受试者。关于施用途径的以下讨论仅为说明各种实施方案而提供，并且不应解释为以任何方式限制范围。[0272]适于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“胃肠外”意指不通过消化管，而是通过某一其他途径，诸如皮下、肌肉内、脊柱内或静脉内。本公开的活性剂可在药物载体诸如无菌液体或液体混合物中与生理上可接受的稀释剂一起施用，所述无菌液体或液体混合物包括水、盐水、水性右旋糖和相关糖溶液、醇诸如乙醇或十六醇、二醇诸如丙二醇或聚乙二醇、二甲亚砜、甘油、缩酮诸如2,2-二甲基-l53-二氧杂环戊烷-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯、或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂，诸如皂或洗涤剂；助悬剂，诸如果胶、卡波姆(carbomer)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素；或乳化剂和其他药物佐剂。[0273]可用于胃肠外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂和矿物油。适用于胃肠外制剂中的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是适合脂肪酸酯的实例。[0274]适用于胃肠外制剂中的皂包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，并且适合洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，诸如像二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶鎓，(b)阴离子洗涤剂，诸如像烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐、烯烃硫酸盐、醚硫酸盐和甘油单酯硫酸盐、以及丁二酸酯磺酸盐，(c)非离子洗涤剂，诸如像脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，诸如像烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐，以及(e)它们的混合物。[0275]在一些实施方案中，胃肠外制剂含有在溶液中的约0.5重量％至约25重量％的本公开的活性剂。可使用防腐剂和缓冲剂。为使注射部位处的刺激最小化或消除，此类组合物可含有一种或多种具有约12至约17的亲水亲油平衡(hlb)值的非离子表面活性剂。此类制剂中的表面活性剂的量将通常在约5重量％至约15重量％的范围内。适合表面活性剂包括聚乙二醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯诸如脱水山梨糖醇单油酸酯、以及氧化乙烯与通过氧化丙烯与丙二醇的缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。在一些方面，胃肠外制剂呈现于单剂量或多剂量密封容器诸如安瓿和小瓶中，并且可以冷冻干燥(冻干)状态储存，仅需要在使用之前即刻添加注射用无菌液体赋形剂例如水。在一些方面，即时注射溶液和混悬剂由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。[0276]可注射制剂是根据本公开的。对于用于可注射组合物的有效药物载体的要求为本领域普通技术人员所熟知(参见例如pharmaceuticsandpharmacypractice,j.b.lippincottcompany,philadelphia,pa,banker和chalmers编,第238-250页(1982)，以及ashphandbookoninjectabledrugs,toissel,第4版,第622-630页(1986))。[0277]剂量[0278]据信本公开的活性剂可用于抑制肿瘤生长的方法以及如本文进一步所述的其他方法中，所述其他方法包括治疗或预防癌症的方法。出于本公开的目的，施用的活性剂的量或剂量应足以在合理时间范围内在受试者或动物中实现例如治疗或预防响应。举例来说，本公开的活性剂的剂量应足以在从施用时起约1至4分钟，1至4小时，或1至4周或更久，例如5至20或更多周的时期内治疗如本文所述的癌症。在某些实施方案中，时期可甚至更久。剂量将由特定活性剂的功效和动物(例如人)的状况以及待治疗的动物(例如人)的体重决定。[0279]用于确定施用剂量的许多测定在本领域中是已知的。出于本文目的，可使用测定来确定待施用至哺乳动物的起始剂量，所述测定包括比较在将给定剂量的本公开的活性剂施用至一组哺乳动物之中的哺乳动物后癌症得到治疗的程度，每组哺乳动物被给与不同剂量的活性剂。在施用某一剂量后癌症得到治疗的程度可由例如用活性剂在小鼠异种移植模型中实现的肿瘤消退程度表示。测定肿瘤消退的方法在本领域中是已知的，并且在本文中描述于实施例中。[0280]本公开的活性剂的剂量还将由可能伴随本公开的特定活性剂的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度决定。通常，主治医师将在考虑多种因素的情况下决定本公开的活性剂的治疗每个单独患者所采用的剂量，所述多种因素诸如是年龄、体重、总体健康状况、膳食、性别、待施用的本公开的活性剂、施用途径、以及所治疗疾患的严重性。举例来说而非意图限制本公开，本公开的活性剂的剂量可为约0.0001至约1g/kg所治疗受试者的体重/天、约0.0001至约0.001g/kg体重/天、或约0.01mg至约1g/kg体重/天。[0281]控制释放制剂[0282]在一些实施方案中，本文所述的活性剂可被修饰成储库形式，以致本公开的活性剂释放至它所施用的身体中的方式关于时间和在身体内的位置受到控制(参见例如美国专利第4,450,150号)。本公开的活性剂的储库形式可为例如包含活性剂和多孔或非多孔材料诸如聚合物的可植入组合物，其中活性剂由材料包封或扩散在整个材料中和/或非多孔材料的降解。接着将储库植入至受试者的身体内的所需位置中，并且活性剂在预定速率下从植入物释放。[0283]在某些方面，包含活性剂的药物组合物被修饰来具有任何类型的体内释放概况。在一些方面，药物组合物是立即释放制剂、控制释放制剂、持续释放制剂、延长释放制剂、延迟释放制剂或双相释放制剂。配制用于控制释放的肽的方法在本领域中是已知的。参见例如qian等人,jpharm374:46-52(2009)以及国际专利申请公布第wo2008/130158、wo2004/033036；wo2000/032218；和wo1999/040942号。[0284]本发明组合物可还包含例如胶束或脂质体或某一其他包封形式，或可以延长释放形式施用以提供延长储存和/或递送效果。[0285]用途[0286]本公开的抗原结合蛋白可用于抑制肿瘤生长。在不束缚于特定理论下，本文提供的抗原结合蛋白的抑制作用允许此类实体用于治疗癌症的方法中。[0287]因此，本文提供了抑制受试者中的肿瘤生长的方法和降低受试者中的肿瘤大小的方法。在各种实施方案中，方法包括以有效抑制受试者中的肿瘤生长或降低受试者中的肿瘤大小的量向受试者施用本公开的药物组合物。在各个方面，卵巢肿瘤、黑素瘤肿瘤、膀胱肿瘤或子宫内膜肿瘤的生长受到抑制。在各个方面，卵巢肿瘤、黑素瘤肿瘤、膀胱肿瘤或子宫内膜肿瘤的大小得到降低。[0288]如本文所用，术语“抑制”或“降低”和起源于它们的词语可不是100％或完全抑制或降低。而是，存在本领域普通技术人员认定为具有潜在益处或治疗作用的不同抑制或降低程度。在这个方面，本公开的抗原结合蛋白可抑制肿瘤生长或降低肿瘤大小至任何量或水平。在各种实施方案中，由本公开的方法提供的抑制是至少或约10％抑制(例如至少或约20％抑制、至少或约30％抑制、至少或约40％抑制、至少或约50％抑制、至少或约60％抑制、至少或约70％抑制、至少或约80％抑制、至少或约90％抑制、至少或约95％抑制、至少或约98％抑制)。在各种实施方案中，由本公开的方法提供的降低是至少或约10％降低(例如至少或约20％降低、至少或约30％降低、至少或约40％降低、至少或约50％降低、至少或约60％降低、至少或约70％降低、至少或约80％降低、至少或约90％降低、至少或约95％降低、至少或约98％降低)。[0289]本文另外提供了治疗患有癌症例如cldn18.2表达性癌症的受试者的方法。在各种实施方案中，方法包括以有效治疗受试者中的癌症的量向受试者施用本公开的药物组合物。[0290]出于本文目的，本文公开的方法的癌症可为任何癌症，例如由异常和不受控制的细胞分裂引起的任何恶性生长或肿瘤，其可通过淋巴系统或血流扩散至身体的其他部分。在一些方面，癌症是选自由以下组成的组的癌症：急性淋巴细胞性癌症、急性髓系白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈部癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系癌症、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、胃肠类癌肿瘤、霍奇金淋巴瘤(hodgkinlymphoma)、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌(例如肾细胞癌(rcc))、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和膀胱癌。在特定方面，癌症选自由以下组成的组：头颈部癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱癌和食道癌、胰腺癌、胃肠癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、肺癌例如非小细胞肺癌(nsclc)、细支气管肺泡癌。在各个方面，癌症是胰腺癌、胃肠癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌。在各个方面，癌症是特征在于中度至高度表达cldn18.2的任何癌症。参见例如图1至图2。在各个方面，癌症是急性髓系白血病、大b细胞淋巴瘤、胃癌、前列腺癌、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、乳腺癌、肾透明细胞癌、头颈部癌、肉瘤、肾嫌色细胞癌、低级胶质瘤、肾上腺皮质癌、胶质母细胞瘤、肾乳头状细胞癌、肺鳞状细胞癌、甲状腺癌、肺腺癌、胰腺癌、子宫内膜样癌症、子宫癌肉瘤或卵巢癌。在各个方面，癌症选自胰腺癌、胃肠癌、膀胱癌、结肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌、子宫内膜样癌症、子宫癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)和子宫颈癌。[0291]如本文所用，术语“治疗”以及与其相关的词语未必暗示100％或完全治疗。而是，存在本领域普通技术人员认定为具有潜在益处或治疗作用的不同治疗程度。在这个方面，本公开的治疗癌症的方法可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本公开的方法提供的治疗可包括对所治疗癌症的一种或多种状况或症状或体征的治疗。此外，由本公开的方法提供的治疗可涵盖减缓癌症的进展。举例来说，方法可借助于增强t细胞活性或针对癌症的免疫应答，降低肿瘤或癌生长，降低肿瘤细胞的转移，增加肿瘤或癌细胞的细胞死亡等来治疗癌症。在各个方面，方法经由使癌症的发作或复发延迟至少1天、2天、4天、6天、8天、10天、15天、30天、两个月、3个月、4个月、6个月、1年、2年、3年、4年或更久进行治疗。在各个方面，方法经由增加受试者的存活期进行治疗。[0292]本公开的抗原结合蛋白还可用于检测样品中的cldn18.2或诊断cldn18.2阳性癌症。因此，本公开提供了检测样品中的cldn18.2的方法。在各种实施方案中，方法包括使样品与如本文所述的抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白接触，以及测定包含结合于cldn18.2的所述抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白的免疫复合物。本公开还提供了诊断受试者中的cldn18.2阳性癌症的方法。在各种实施方案中，方法包括使从受试者获得的包含细胞或组织的生物样品与如本文所述的抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白接触，以及测定包含结合于cldn18.2的所述抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白的免疫复合物。[0293]受试者[0294]在本公开的一些实施方案中，受试者是哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠；以及兔形目哺乳动物，诸如兔；来自食肉目的哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)；来自偶蹄目的哺乳动物，包括牛科动物(母牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目哺乳动物，包括马科动物(马)。在一些方面，哺乳动物属于灵长目、类猴目或类猿目(猴)或属于类人猿目(人和猿)。在一些方面，哺乳动物是人。[0295]药盒[0296]在一些实施方案中，本公开的抗原结合蛋白提供在药盒中。在各个方面，药盒包括一种或多种呈单位剂量形式的抗原结合蛋白。出于本文目的，“单位剂量”是指分散在适合载体中的离散量。在各个方面，单位剂量是足以对受试者提供所需作用例如抑制肿瘤生长、降低肿瘤大小、治疗癌症的量。因此，本文提供了包括任选地以单位剂量提供的本公开的抗原结合蛋白的药盒。在各个方面，药盒包括若干单位剂量，例如单位剂量的一周或一个月供给，任选地，所述单位剂量中的每一者被单独包装或以其他方式与其他单位剂量分开。在一些实施方案中，药盒的组分/单位剂量与关于向患者进行施用的说明书一起包装。在一些实施方案中，药盒包括一种或多种用于向患者进行施用的装置，例如针和注射器等。在一些方面，本公开的抗原结合蛋白、其药学上可接受的盐、包含抗原结合蛋白的缀合物、或包含抗原结合蛋白的多聚体或二聚体以即用形式例如注射器、静脉内袋等预包装。在一些方面，药盒还包括其他治疗剂或诊断剂或药学上可接受的载体(例如溶剂、缓冲剂、稀释剂等)，包括本文所述的那些中的任一者。在特定方面，药盒包括本公开的抗原结合蛋白以及用于化学疗法或放射疗法中的剂例如治疗剂。[0297]各种实施方案[0298]在本公开的各种实施方案中，抗原结合蛋白结合人cldn18.2蛋白(seqidno:1)，其中(a)抗原结合蛋白结合cldn18.2的细胞外结构域(ecd)的细胞外环1(el1)，并且不结合cldn18.2的ecd的细胞外环2(el2)；或(b)不结合密封蛋白18.1(cldn18.1)或任何其他密封蛋白，并且以大于参考抗体的亲和力的1.5倍的亲和力结合由hupt4细胞内源性表达的cldn18.2；或(c)前述各项的组合。在各种实施方案中，本文中的抗原结合蛋白以是参考抗体的至少1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更多倍的亲和力结合内源性表达cldn18.2的细胞(例如hupt4或其他细胞)。[0299]在各种情况下，抗原结合蛋白结合cldn18.2的氨基酸序列glwrscvressgftecrfyftl(seqidno:4)、qglwrscvressgftecrgyftlk(seqidno:5)、dqwstqdlynnpvtavfnyqglwrsc(seqidno:6)或crgyftllflpamlqavr(seqidno:7)内的表位。[0300]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)表a中阐述的重链(cdr)1氨基酸序列或选自由seqidno:64、88、69、89、72、75、91、94、95、97、99、101、103、106、109组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(b)表a中阐述的hccdr2氨基酸序列或选自由seqidno:65、67、70、90、73、76、92、73、96、98、100、102、104、107、110组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(c)表a中阐述的hccdr3氨基酸序列或选自由seqidno:66、68、71、77、74、77、93、74、105、108、111组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(d)表a中阐述的轻链(lc)cdr1氨基酸序列或选自由seqidno:78、81、82、86、114、120、123、126组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(e)表a中阐述的lccdr2氨基酸序列或选自由seqidno:79、112、79、84、116、118、119、129、121、124、127组成的组的序列；或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％)序列同一性的其变异序列；(f)表a中阐述的lccdr3氨基酸序列或选自由seqidno:80、83、113、85、87、115、117、122、125、128组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少或约85％、至少或约90％)序列同一性的其变异序列；(g)(a)-(f)中的任何两者或更多者的组合。[0301]在各个方面，抗原结合蛋白包含表a中阐述的轻链cdr1氨基酸序列、轻链cdr2氨基酸序列和轻链cdr3氨基酸序列以及表a中阐述的重链cdr氨基酸序列中的1者或2者。在一些情况下，抗原结合蛋白包含表a中阐述的重链cdr1氨基酸序列、重链cdr2氨基酸序列和重链cdr3氨基酸序列以及表a中阐述的轻链cdr氨基酸序列中的1者或2者。在各个方面，抗原结合蛋白包含选自由以下组成的组的六个cdr氨基酸序列：(a)seqidno:78、79、80、64、65、66；(b)seqidno:81、112、80、88、65、66；(c)seqidno:81、79、80、64、67、68；(d)seqidno:82、79、83、39、70、71；(e)seqidno:81、79、113、89、90、77；(f)seqidno:81、84、85、72、73、74；(g)seqidno:86、79、87、75、76、77；(h)seqidno:114、79、115、91、92、93；(i)seqidno:81、116、117、94、73、74；(j)seqidno:81、118、117、95、96、74；(k)seqidno:81、119、117、97、98、74；(l)seqidno:81、118、85、99、100、74；(m)seqidno:81、129、117、101、102、74；(n)seqidno:120、121、122、103、104、105；(o)seqidno:123、124、125、106、107、108；和(p)seqidno:126、127、128、109、110、111。[0302]在各个方面，抗原结合蛋白包含(a)表b中阐述的重链可变区氨基酸序列或选自由seqidno:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、2、34、36、38和40组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少或约85％、至少或约90％)序列同一性的其变异序列；或(b)表b中阐述的轻链可变区氨基酸序列或选自由seqidno:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％(例如至少或约85％、至少或约90％)序列同一性的其变异序列；或(a)与(b)两者。在各个方面，抗原结合蛋白包含选自由以下组成的组的一对氨基酸序列：(a)seqidno:10和11；(b)seqidno:12和13；(c)seqidno:14和15；(d)seqidno:16和17；(e)seqidno:18和19；(f)seqidno:20和21；(g)seqidno:22和23；(h)seqidno:24和25；(i)seqidno:26和27；(j)seqidno:28和29；(k)seqidno:30和31；(l)seqidno:32和33；(m)seqidno:34和35；(n)seqidno:36和37；(o)seqidno:38和39；(p)seqidno:40和41。[0303]在各种实施方案中，抗原结合蛋白包含(a)表c、表d、表6、表8、表9、表10中阐述的重链可变区氨基酸序列或选自由seqidno:42、46、49、52、55、56、57和131组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％、或约80％、或约90％、或约95％序列同一性的其变异序列；或(b)表c、表d、表6、表8、表9、表10中阐述的轻链可变区氨基酸序列或选自由seqidno:43-45、47-48、50-51、53-54、130、132、147、149和150组成的组的序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％、或约80％、或约90％、或约95％序列同一性的其变异序列；或(c)(a)与(b)两者。在各个方面，抗原结合蛋白包含如表d中所列的一对氨基酸序列。[0304]在各个方面，本公开的抗原结合蛋白包含选自由以下组成的组的一对氨基酸序列：(a)seqidno:42和43；(b)seqidno:42和44；(c)seqidno:42和45；(d)seqidno:46和47；(e)seqidno:46和48；(f)seqidno:131和149；(g)seqidno:131和150；(h)seqidno:52和53；(i)seqidno:52和54；(j)seqidno:55和53；(k)seqidno:55和54；(l)seqidno:56和53；(m)seqidno:56和54；(n)seqidno:57和50；(o)seqidno:57和51；(p)seqidno:49和50；(q)seqidno:49和51；(r)seqidno:42和130；(s)seqidno:131和147；和(t)seqidno:131和132。[0305]在一些实施方案中，本公开的抗原结合蛋白包含fc多肽。在一些实施方案中，本公开的抗原结合蛋白包含含有无岩藻糖基化聚糖的fc多肽。[0306]在各个方面，本公开的抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体。在各种情况下，抗原结合蛋白是igg。在各个方面，抗原结合蛋白在软琼脂3d增殖测定中抑制至少约50％集落生长，或抑制用人癌细胞注射的异种移植小鼠中的肿瘤生长。在各个方面，抗原结合蛋白抑制用卵巢癌细胞、黑素瘤癌细胞、膀胱癌细胞或子宫内膜癌细胞注射的异种移植小鼠中的肿瘤生长。在各种情况下，抗原结合蛋白抑制用卵巢癌细胞、膀胱癌细胞或子宫内膜癌细胞注射的异种移植小鼠中至少50％肿瘤生长。[0307]本公开提供了一种结合cldn18.2和第二抗原的双特异性抗原结合蛋白，其中结合cldn18.2的抗原结合蛋白是本文所述的抗原结合蛋白中的任一者。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含：(a)表b、表c、表d、表6、表8、表9、表10中阐述的重链可变区氨基酸序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变异序列；(b)表b、表d、表6、表8、表9、表10中阐述的轻链可变区氨基酸序列，或仅相差一个或两个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变异序列；或(c)(a)与(b)两者。在一些实施方案中，变异序列具有至少约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含fc多肽。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含含有无岩藻糖基化聚糖的fc多肽。[0308]在各个方面，双特异性抗原结合蛋白结合cldn18.2和第二抗原。在一些实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含对第二抗原具有特异性的抗体的抗原结合片段。在各种实施方案中，第二抗原是由t细胞表达的细胞表面蛋白，任选是t细胞受体(tcr)的组分，例如cd3。在一些实施方案中，第二抗原是cd3。在一些实施方案中，第二抗原是cd3e。[0309]在各种实施方案中，第二抗原是有助于t细胞活化的共刺激性分子，例如cd40或4-1bb(cd137)。在各种实施方案中，第二抗原是fc受体，任选是fcγ受体、fc-α受体或fc-ε受体。在一些实施方案中，fc受体是cd64(fc-γri)、cd32(fc-γriia)、cd16a(fc-γriiia)、cd16b(fc-γriiib)、fcεri、cd23(fc-εrii)、cd89(fc-εri)、fcα/μr或fcrn。在一些实施方案中，fc受体是cd16a。[0310]在各种实施方案中，第二抗原是免疫检查点分子，例如免疫检查点通路中涉及的蛋白质，任选是a2ar、b7-h3、b7-h4、btla、ctla4、ido、kir、lag3、nox2、pd-1、tim3、vista或siglec7。在一些实施方案中，免疫检查点分子是pd-1、lag3、tim3或ctla4。在各种实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含任何当前公开的cldn18.2抗体(例如表b、表c、表d、表6、表8、图13或图17)的scfv、fab或f(ab)2’。[0311]在各种实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含含有表11中或以seqidno:143、144、145或146阐述的序列，或仅相差1-5个氨基酸或具有至少或约70％序列同一性的其变异序列的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，变异序列具有至少或约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在各种实施方案中，双特异性抗原结合蛋白包含纳米抗体、微型双功能抗体、dart、tandab、crossmab或hsa体的结构。本公开提供了一种包含本文所述的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白和异源性部分的缀合物。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含以seqidno:42和seqidno:45阐述的氨基酸序列。在一些实施方案中，缀合物包含细胞毒性剂或化学治疗剂。在一些实施方案中，化学治疗剂是通过阻断微管蛋白聚合来抑制细胞分裂的抗有丝分裂剂。在一些实施方案中，抗有丝分裂剂是澳瑞他汀。在一些实施方案中，澳瑞他汀是mmae。[0312]在各种实施方案中，本公开的缀合物通过可裂解接头缀合于抗原结合蛋白。在一些实施方案中，可裂解接头是mc-vc-pab。[0313]在一些实施方案中，缀合物包含是抗体的抗原结合蛋白，即缀合物是抗体缀合物。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体，任选地，其中所述单克隆抗体是igg抗体。在一些实施方案中，抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。[0314]在各种实施方案中，本公开的缀合物具有的每个抗原结合蛋白缀合的剂的平均单元数目在1至8的范围内，优选地，其中每个抗原结合蛋白缀合的剂的所述平均单元数目在3-8的范围内。在一些实施方案中，缀合物是异质缀合物。在其他实施方案中，缀合物是同质缀合物。在一些实施方案中，缀合物包含异源性部分或剂，其中所述剂缀合在抗原结合蛋白的特定位点处。在一些实施方案中，特定位点是未配对的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，缀合物包含缀合于mc-vc-pab-mmae的包含以seqidno:42和seqidno:45阐述的氨基酸的多肽。[0315]本公开还提供了一种包含本文所述的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白的融合蛋白。本公开还提供了一种包含编码本公开的抗原结合蛋白、双特异性抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸。本公开提供了一种包含含有编码本公开的抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸的载体。本公开另外提供了一种包含本公开的核酸或载体的宿主细胞。[0316]本公开提供了一种产生结合密封蛋白18.2(cldn18.2)蛋白的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括(i)在细胞培养基中培养本公开的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含含有编码本文所述的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白的核苷酸序列的核酸，以及(ii)从所述细胞培养基收集所述抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白。此外，提供了一种产生包含结合密封蛋白18.2(cldn18.2)蛋白的抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白的融合蛋白的方法，所述方法包括(i)在细胞培养基中培养本公开的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含含有编码本公开的融合蛋白的核苷酸序列的核酸，以及(ii)从所述细胞培养基收集所述融合蛋白。[0317]此外，本公开提供了一种产生药物组合物的方法，所述方法包括将本公开的抗原结合蛋白、双特异性抗原结合蛋白、缀合物、融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞、或它们的组合和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。还提供了药物组合物，所述药物组合物包含本公开的抗原结合蛋白、双特异性抗原结合蛋白、缀合物、融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞、或它们的组合和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。[0318]本文提供了一种治疗患有cldn18.2表达性癌症的受试者的方法，所述方法包括以有效治疗所述癌症的量向所述受试者施用本文所述的药物组合物。还提供了一种抑制受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括以有效抑制肿瘤生长的量向所述受试者施用本文所述的药物组合物。本公开提供了一种降低受试者中的肿瘤大小的方法，所述方法包括以有效降低肿瘤大小的量向所述受试者施用本文所述的药物组合物。还提供了一种预防受试者中癌症的复发的方法，所述方法包括以有效预防癌症的复发的量向所述受试者施用本文所述的药物组合物。[0319]本公开提供了一种检测样品中的密封蛋白18.2(cld18.2)的方法，所述方法包括使所述样品与本公开的抗原结合蛋白、双特异性抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白接触，以及测定包含结合于cld18.2的所述抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白的免疫复合物。本文还提供了一种诊断受试者中的密封蛋白18.2(cld18.2)阳性癌症的方法，所述方法包括使从所述受试者获得的包含细胞或组织的生物样品与本公开的抗原结合蛋白、双特异性抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白接触，以及测定包含结合于cld18.2的所述抗原结合蛋白、缀合物或融合蛋白的免疫复合物。[0320]本公开还提供了一种治疗被诊断为cldn18.2的低过度表达者的受试者中的癌症的方法。在各种实施方案中，方法包括以有效预防癌症的复发的量向受试者施用当前公开的药物组合物。在一些方面，施用诱导肿瘤细胞中的凋亡，任选地，施用诱导表达cldn18.2的细胞中的凋亡。在各个方面，受试者患有肿瘤，并且所述肿瘤被半定量分类为以下四个群组中的一者：高表达者、中度表达者、低表达者和非表达者。在各种情况下，高表达者定义为cldn8.2rna大于12log每100万个经定位读段中比对到转录物的每1千个碱基的片段数(fpkm)，其中cldn8.2rna通过rnaseq测量，或cldn18.2蛋白水平大于3+，如通过免疫组织化学分析(ihc)所测量。在各种情况下，中度表达者定义为cldn8.2rna大于10logfpkm，其中cldn18.2rna通过rnaseq测量，或cldn18.2蛋白水平大于2+，如通过ihc所测量。在各种情况下，低表达者定义为cldn18.2rna大于6logfpkm，其中cldn8.2rna通过rnaseq测量，或cldn18.2蛋白水平大于1+，如通过ihc所测量。在各种情况下，非表达者定义为cldn8.2rna小于6logfpkm，其中cldn18.2rna通过rnaseq测量，或cldn18.2蛋白水平低于ihc检测限。在各个方面，患有所述肿瘤的受试者同样地描述为cldn18.2的高表达者、中度表达者、低表达者或非表达者。[0321]以下实施例仅为说明本公开而给出，并且不以任何方式限制它的范围。[0322]实施例[0323]实施例1[0324]这个实施例显示对不同细胞和组织来源中的cldn18.2rna水平的分析。[0325]为建立不同来源材料中cldn18.2的表达的基线，测定了患者样品和由转化肿瘤学研究实验室(torl)创建的细胞系中cldn18.2表达的表达水平。[0326]使用由国立癌症研究所(nci)管理的癌症基因组图谱(tcga)数据库中含有的信息测量患者样品中cldn8.2rna的水平。使用由共同基金维护的基因型-组织表达(gtex)数据库中的信息测量正常组织中的cldn18.2水平。对来自gtex数据库的组织的分析显示cldn18.2可在各种部位中检测到，包括肺、胃、前列腺、结肠、胰腺和乳腺以及其他组织。[0327]使用agilent44k微阵列(4x44k阵列芯片，agilenttechnologies,santaclara,ca)和rna测序(rna-seq)测定测量torl癌细胞系中的cldn18.2表达水平。由bgiamericas(cambridge,ma)使用它们的“定量rna测序”服务进行rna测序。如图1和图2中所示，上胃肠道(gi)、胰腺和结肠癌细胞表达最高水平的cldn18.2，但cldn18.2表达水平可在头颈部、黑素瘤、乳腺、肺、前列腺、肉瘤和淋巴瘤癌细胞中检测到。[0328]图3显示是高cldn18.2表达者的那些细胞不表达cldn18.1。图4显示表达cldn18.2的天然细胞系的分布，并且证明cldn18.2rna阳性细胞具有阳性流动信号。[0329]实施例2[0330]这个实施例显示被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞的产生。[0331]产生了被工程改造来过度表达cldn18.2的模型。这些模型用于测定本文所述的cldn18.2抗体的功效。简要来说，将编码cldn18.2的核苷酸序列工程改造至具有cmv启动子和脑心肌炎病毒(emcv)的减弱内部核糖体进入位点(ires)的慢病毒载体中。ires位于目标基因(goi)cdna(cldn18.2)与嘌呤霉素cdna之间。土拔鼠转录后调控元件(wpre)位于嘌呤霉素cdna的下游。载体还表达gfp标记序列或mycddk标签。[0332]将表达载体以病毒方式转导至hek293t细胞(用于筛选目的)和nih3t3细胞(用于免疫)中。基于在含有嘌呤霉素(1μg/ml)的培养基中的存活选择阳性转导细胞。将阳性细胞亚克隆以获得cldn18.2过度表达性细胞的稳定均一纯系群体。[0333]使用用以确认cldn18.2的过度表达的gfp标签，通过荧光显微术确认亚克隆cldn18.2表达。[0334]实施例3[0335]这个实施例显示参考和对照抗体的产生。[0336]通过将抗体重链可变区和轻链可变区克隆至expichotm表达系统(thermofisherscientific,waltham,ma)中以产生重组小鼠igg2a嵌合抗体来制备基准(参考)cldn18.2特异性抗体和对照抗体。这些抗体与实施例5中所述的新产生的cldn18.2特异性抗体并行加以测试。[0337]简要来说，根据制造商方案，使用expichotm表达系统(目录号：a29133，thermofisherscientific,usa)转染含有对照和基准抗体序列的质粒。在试剂盒中提供的培养基中，在第1天时在37℃和8％co2下培养细胞，接着在转染后在32℃和5％co2下培养细胞。通过在1,000g下离心10分钟，继之以在5,000g下离心30分钟使expichotm培养基澄清来纯化抗体。接着依次使用0.45μm过滤器和0.22μm过滤器过滤上清液。随后，根据制造商方案，使用蛋白a/g树脂(lifetechnologies,carlsbad,ca；目录号20424)，使上清液经受亲和纯化。在elisa纯化之前，大致测定培养基中的抗体滴度以确保上样的培养基的量占据树脂结合量的小于80％。在孵育之后，将树脂用pbs洗涤，并且用洗脱缓冲液(lifetechnologies，目录号21004)洗脱。立刻通过添加ph8.0tris缓冲液将洗脱级分调整至生理ph。随后使用amiconultra-15离心过滤装置(lifetechnologies，目录号ufc900324)，在pbs缓冲液中，使纯化的抗体经受缓冲液更换和蛋白质浓缩。通过bca蛋白测定来测定抗体浓度。进行sds-page和考马斯(coomassie)染色以测试抗体纯度。将纯化的蛋白质等分，并且在-80℃下储存以达成长期储存，或在4℃下保持以供立刻使用。[0338]通过在非还原性条件相对于还原性条件下依次进行sds-page和考马斯染色来验证抗体的完整性；在非还原性条件下，在约150kda处有一个主要条带，而在还原性条件下，观察到两个条带，即50kda和25kda。[0339]实施例4[0340]这个实施例显示对具有高内源性cldn18.2表达的细胞系的表征。[0341]通过facs分析了一组癌细胞系的内源性cldn18.2表达。简要来说，使用过度表达cldn18.2的细胞(例如实施例2中所述的过度表达cldn18.2的hek293t细胞)和如实施例1中所测定在高水平或低水平下内源性表达cldn18.2的细胞系，通过facs验证抗体与靶标的结合。将cldn18.2表达性细胞与参考或对照抗体(实施例3中所述)一起在冰上孵育30分钟，并且在洗涤之后，与alexa647缀合的山羊抗小鼠igg(最小x反应性)抗体(biolegend目录号405322)一起在冰上孵育30分钟。通过bdbiosciencesaccuritm流式细胞仪(sanjose,ca)读取荧光。[0342]过度表达株系用于验证对照和参考抗体，并且一旦验证，对照和参考抗体即用于表征内源性细胞系。过度表达cldn18.2的细胞作为阳性对照包括在这些测定中。[0343]facs测定显示除胰腺、结肠和膀胱癌细胞系之外，四个上胃肠道癌细胞系也在高水平下在表面上表达cldn18.2。测试的癌细胞系的内源性cldn18.2表达水平概述于表2中。也参见图4。[0344]表2[0345][0346][0347]实施例5[0348]这个实施例描述用于产生cldn18.2特异性抗体的小鼠免疫。[0349]遵循弗雷德哈钦森癌症研究中心(fredhutchinsoncancerresearchcenter)的技术，通过用六种不同肽免疫原的混合物使balb/c和cd1小鼠免疫来产生cldn18.2特异性抗体。肽跨越cldn18.2细胞外结构域中的第一环或第二环(即el1或el2)。肽包括全长el1、跨越el1的第一(n末端)半部的肽、以及跨越el1的第二(c末端)半部的肽。表3提供肽的序列。[0350]表3[0351][0352]还使用包含人cldn18.2-myc-ddk表达载体的质粒，用过度表达全长cldn18.2的3t3细胞使小鼠免疫。[0353]从经免疫小鼠收集脾细胞，并且通过btx电融合(btx,holliston,ma)与骨髓瘤株系融合以产生杂交瘤。产生了7000种初级杂交瘤培养物，并且在384孔板中培养。使用表达三种不同肽靶标的珠粒，通过珠粒阵列评估抗体结合肽的能力。将约2000种潜在阳性抗体再阵列化至96孔板中，通过流式细胞计量术针对内源性和人工细胞系模型进一步筛选。[0354]接着通过流式细胞计量术针对与靶标区域具有序列类似性的蛋白质(例如其他cldn蛋白)的内源性和人工模型来反向筛选阳性杂交瘤上清液。根据次级筛选和反向筛选，选择约20种cldn18.2特异性抗体用于额外研究。将这些抗体亚克隆，并且测定可变重链和轻链序列。参见表b和序列表。[0355]使用expichotm表达使cldn18.2抗体形式化为全长igg抗体。将抗体的重链可变区和轻链可变区克隆至基于pcdnatm3.4-载体(目录号：a14697，thermofisherscientific,usa)在实验室中工程改造的抗体表达载体中，并且通过(根据试剂盒(expichotm表达系统，目录号：a29133，thermofisherscientific,usa)中提供的方案)来转染至cho细胞中。将抗体纯化，并且通过facs测定抗体与cldn18.2的细胞表面结合和抗体ic50，其中cldn18.2抗体遵循制造商方案直接与alexa647nhs酯(丁二酰亚胺酯)(目录号a20106(thermofisherscientific))缀合。采用150,000个细胞的系统，在50μl体积中，从0.32nm至1000nm(连续1:5稀释，6个点)测试cldn18.2抗体。[0356]cldn18.2表达性细胞在facs测定中用于测定cldn18.2抗体结合细胞的表面上的cldn18.2，以及与其他cldn家族成员交叉反应的能力。被工程改造来表达融合于gfp的人cldn18.2、融合于gfp的小鼠cldn18.2、cldn18.1-gfp、或单独gfp(无cldn18.2)的hek293t细胞用作cldn18.2表达的人工模型。hupt4、snu601和patu8988s细胞用作cldn18.2表达的内源性模型。[0357]对于测试的每种细胞类型以及对于每种mab，通过凡尔生(versene)(而非胰蛋白酶)使细胞从培养瓶的表面脱离以保护细胞表面蛋白。接着将脱离的细胞与alexa标记的cldn18.2mab一起在预定浓度下在冰上在黑暗中孵育30分钟。cldn18.2mab直接用alexafluor647nhs酯(丁二酰亚胺酯)标记。在洗涤之后，通过bdaccuritm流式细胞仪c6读取细胞以检测通道fl4h中的抗体-抗原蛋白质结合。在不同浓度下测试每种抗体以建立剂量-荧光曲线。使用可在线获得的verysimpleic50工具包，基于fl4h的值(以活的单细胞门控)计算抗体的ec50/ic50(最大值的一半所处的抗体浓度)，所述工具包允许绘制生物剂量-响应数据，并且相对于曲线类型加以拟合以给出ec50/ic50。最大值是荧光最大时所处的最低抗体浓度。还筛选了抗体与另一cldn18同工型cldn18.1交叉反应的能力。这些值用于确定测试的一组抗体之中每种抗体的相对亲和力。使用类似方法获得交叉反应性数据。[0358]如以这个方式确定的相对亲和力数据阐述于表4中。[0359]表4[0360][0361]实施例6[0362]这个实施例显示对嵌合小鼠iggmab的表征。[0363]在用人癌细胞系注射的异种移植小鼠中进行体内结合研究。简要来说，在六周龄cd-1无胸腺裸小鼠(charlesriverlaboratories)中建立人癌细胞系的异种移植模型。对于每种细胞系的皮下注射，遵循以下条件：hupt41.0×107个细胞，snu6011.0×107个细胞，加50％基质胶(bdbiosciences)。对足够数目的小鼠进行注射以实现每个治疗组别8只小鼠。当肿瘤达到150至300mm3的平均大小时，将小鼠随机分入治疗组中。对于治疗，将每种治疗性抗体(ab384、ab400、参考ab1、参考ab2和非靶向igg2对照)在无菌盐水中稀释至1mg/ml的工作浓度以用于静脉内尾部静脉(iv)注射。每周用测径规测量肿瘤异种移植物三次，并且通过高度×宽度×长度确定以mm3计的肿瘤体积。将小鼠治疗2-5周。在研究结束时，使动物安乐死，并且切除和划分肿瘤组织以作为快速冷冻或经福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织储存以用于生物标志物分析。所有动物研究都根据由iacuc和加利福尼亚大学洛杉矶分校动物研究委员会(universityofcaliforniaatlosangelesanimalresearchcommittee)核准的方案进行。使用来自studydirector(sanfrancisco,ca)的studylog软件分析数据。每个组的结果呈现为平均体积。误差棒代表平均值的标准误差(se)。[0364]异种移植测定的结果显示于图5至图6中。如图5a和图5b中所示，在携带胃肠肿瘤的小鼠中，相对于对照igg2抗体，ab384和ab400中的每一者在第30天时导致肿瘤体积的实质性平均变化。如图6a和图6b中所示，在携带胰腺肿瘤的小鼠中，相对于对照igg2抗体，克隆ab384、ab376、ab307和ab432在第28天时导致肿瘤体积的实质性平均变化。[0365]实施例7[0366]这个实施例显示本公开的抗体的人源化。[0367]选择表a/表b中所列的抗体的子组用于人源化分析。将ab307、ab376、ab358、ab360和ab432抗体的重链可变(vh)和轻链可变(vl)序列与来自人vh基因和人vlκ基因的已知人种系序列的文库(internationalimmunogeneticsinformationwww.imgt.org；建立者和领导者：marie-paulelefranc,montpellier,france)进行比较；使用的数据库是imgt人vh基因(f+orf，273个种系序列)和imgt人vlκ基因(f+orf，74个种系序列)。接受体人种系选自在序列方面与亲本抗体最接近的那些。[0368]根据abm定义确定cdr(对于将cdr定义进行比较的表格，参见andrewc.r.martin博士的网站www.bioinf.org.uk/abs/)。[0369]使人种系框架(即vh和vl中的非cdr残基)位置改变成相应亲本鼠序列可能为使人源化抗体的结合最优化所需。人源化抗体形式的序列以seqidno:42-57提供。[0370]表6显示用于将人源化vh和vl组合的方案。如果人源化形式都不等效于嵌合mab。[0371]表6[0372][0373][0374]构建了表6中所述的人源化抗体，并且如基本上在实施例5中所述来表达。进行facs测定以测定人源化抗体(在1.5μg或0.3μg下)结合如由指示的癌细胞系表达的cldn18.2的相对抗原结合强度。测定的结果提供在表7中。佐尔贝妥昔单抗(zolbetuximab)、163e12和175d10用作参考抗体。相应亲本抗体(在人源化之前的抗体)用作对照，并且以“chim”指定。[0375]表7[0376][0377][0378]基于体外抗原结合数据，选择五种人源化抗体用于进一步测试和开发。所述抗体源于ab307、ab376、ab358、ab360和ab432。[0379]如基本上在实施例6中所述，在用胰腺癌细胞系hupt4注射的异种移植小鼠中进行ab307、ab376、ab358、ab360和ab432的人源化形式的体内结合研究。简要来说，在六周龄cd-1无胸腺裸小鼠(charlesriverlaboratories)中建立hupt4的异种移植模型。在肿瘤达到150至300mm3的平均大小之后，将小鼠随机分入治疗组中。将人源化抗体在无菌盐水中稀释至1mg/ml的工作浓度以用于静脉内尾部静脉(iv)注射。一周用测径规测量肿瘤异种移植物三次，并且通过高度×宽度×长度确定以mm3计的肿瘤体积。将小鼠治疗2-7周。在研究结束时，使动物安乐死，并且切除和划分肿瘤组织以作为快速冷冻或经福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织储存以用于生物标志物分析。[0380]异种移植测定的结果显示于图7至图12中。图7a至图7b显示人源化ab307、ab376、ab358、ab360、ab432的异种移植测定结果，其中抗体每周1次持续5周加以施用。对照包括媒介物对照(pbs)、人igg1(10mg/kgq4d)和307的鼠形式(10mg/kgq4d)。如图7中所示，用人源化ab307(huab307)和huab358治疗的动物在42天治疗时期内显示肿瘤体积的最高降低，而huab360和huab432治疗诱导了肿瘤体积的中度降低。[0381]图8a至图8b显示用不同剂量的huab307抗体治疗hupt4胰腺癌的异种移植测定结果，所述不同剂量例如是每4天(q4d)、每周(qw)、每3周(q3w)给与的10mg/kg，或每4天给与的2.5mg/kg。截至治疗后第42天，相较于每3周给与的抗体，每周或每4天治疗显示更好结果。[0382]实施例8[0383]还测试了抗体携带细胞毒性有效载荷的能力。在不同剂量和剂量时程下测试携带mmae的人源化抗体以评估抗体在胰腺癌或膀胱癌的模型中介导细胞细胞毒性的能力。[0384]简要来说，用hupt4或patu8988s胰腺细胞或snu601膀胱细胞皮下注射至cd-1裸小鼠(每组8只小鼠)的右侧腹中。当肿瘤达到150至300mm3的平均大小时，将小鼠随机分入治疗组中。对于治疗，通过尾部静脉注射人源化抗cldn18.2mmae抗体或人igg对照抗体每周一次对小鼠进行施用。一周用测径规测量肿瘤异种移植物三次，并且通过高度×宽度×长度确定以mm3计的肿瘤体积。将小鼠治疗20-42天。在研究结束时，使动物安乐死，并且切除和划分肿瘤组织以作为快速冷冻或经福尔马林固定的石蜡包埋(ffpe)组织储存以用于生物标志物分析。所有动物研究都根据由iacuc和加利福尼亚大学洛杉矶分校动物研究委员会核准的方案进行。使用来自studydirector(sanfrancisco,ca)的studylog软件分析数据。每个组的结果呈现为平均体积。误差棒代表平均值的标准误差(se)。[0385]图9a至图9b显示用以5mg/kg、2.5mg/kg或1mg/kg每周施用持续三周的抗体huab307-mmae和huab358-mmae在胰腺肿瘤模型中治疗的结果。相比于单独有效载荷，抗cldn18.2-adc更有效降低肿瘤体积。5mg/kg的单次剂量的huab307也有效杀灭肿瘤细胞直至第40天。[0386]将以10mg/kg施用的抗体huab307、huab368、huab360和huab432的功效与缀合于mmae，并且每周以5mg/kg在胰腺癌细胞模型中施用的huab307和huab358-adc进行比较。单独抗体降低了肿瘤体积大小，但抗cldn18.2-adc显示改善的肿瘤杀灭直至48天(图10a至图10b)。在胃癌模型中观察到类似结果(图11)。[0387]在另一实验中，以不同剂量静脉内施用ab307和ab358-adc缀合物。结果显示i.v.治疗是剂量依赖性的(图12a至图12b)。[0388]这些结果显示抗体是一种用于达成细胞毒性剂进入实体肿瘤中的有用递送系统。[0389]本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，都据此通过引用并入本文，所述引用的程度就好像单独地和具体地指出将每个参考文献通过引用并入本文并且以它的整体在本文中阐述一样。[0390]除非本文另外指示或由上下文明确反驳，否则在描述本公开的情形下(尤其是在以下权利要求的情形下)使用术语“一个(种)(a/an)”和“这个(种)(the)”以及类似指示物应解释为涵盖单数与复数两者。除非另外指示，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开端术语(即意指“包括但不限于”)。[0391]除非本文另外指示，否则在本文中叙述数值范围仅意图充当单独地提及属于范围内的每个单独值和每个端点的简写方法，并且每个单独值和端点就好像它单独地在本文中叙述一样并入说明书中。[0392]除非本文另外指示或另外由上下文明确反驳，否则本文所述的所有方法都可以任何适合顺序进行。除非另外要求，否则对本文提供的任何和所有实例或各种措辞(例如“诸如”)的使用都仅意图更好地阐明本公开，并且不对本公开的范围造成限制。说明书中没有措辞应解释为指示任何非要求保护的要素为本公开的的实践所必需。[0393]本文描述了本公开的优选实施方案，包括为发明者所知的用于执行本公开的最佳模式。那些优选实施方案的变化形式可在阅读先前描述后变得为本领域普通技术人员显而易知。发明人预期熟练技术人员在适当时采用此类变化形式，并且发明人意图本公开不同于如本文具体描述的那样加以实践。因此，本公开包括随附于其的权利要求中叙述的主题的如由适用法律所容许的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外由上下文明确反驳，否则上述要素以其所有可能的变化形式的任何组合都由本公开涵盖。[0394]实施例9[0395]这个实施例显示人源化抗cldn18.2-307抗体药物缀合物(adc)在胰腺癌患者源性异种移植物(pdx)的情况下的体内活性。[0396]方法：在胰腺癌的两种患者源性异种移植物的情况下评估cldn18.2定向adc(cldn18.2-307-adc(缀合于mc-vc-pab-mmae))和cldn18.2定向mabcldn18.2-307的抗肿瘤活性。每种pdx先前已通过ihc证明是cldn18.2蛋白阳性(xwr6)或阴性(xwr187)(图14c和图15c)。通过将肿瘤片块皮下植入至动物的右后侧腹中而在小鼠中体内传代肿瘤组织来在六周龄cd-1无胸腺裸小鼠(charlesriverlaboratories)中建立患者源性异种移植物。一旦已达到足够数目的携带异种移植肿瘤的小鼠并且肿瘤体积在200-300mm3之间的范围内，就将小鼠随机分入治疗组中以接受非靶向igg2a对照抗体(10mg/kgqwiv)、人源化mabcldn18.2-307(10mg/kgqwiv)或cldn18.2-307-adc(5mg/kgqwiv)，共3次重复剂量。对于所有实验，3次/周用测径规测量肿瘤异种移植物，并且通过高度x宽度x长度确定以mm3计的肿瘤体积。所有动物研究都根据由iacuc和ucla动物研究委员会核准的方案进行。使用来自studydirector(sanfrancisco,ca)的studylog软件分析数据。[0397]简要概述：在cldn18.2阳性xwr6模型中，相对于非靶向对照，用mabcldn18.2-307进行的治疗减缓了pdx的平均进展速率，然而，307-adc诱导了群组中4只小鼠中的每一者中的异种移植肿瘤负荷的完全消退(图14a和图14b)。与cldn18.2阳性模型不同，cldn18.2-307-adc或mabcldn18.2-307显示对cldn18.2阴性pdxxwr187的异种移植肿瘤进展没有影响(图15a和图15b)。[0398]实施例10[0399]这个实施例显示对人源化cldn18.2mab和人源化cldn18.2adc在靶标阴性癌细胞系异种移植物的情况下的活性的评估。[0400]方法：在先前已被证明是cldn18.2蛋白阴性(即缺乏cldn18.2蛋白的表达)的人黑素瘤(m202)的细胞系异种移植模型中评估两种cldn18.2adc(缀合于mc-vc-pab-mmae)和两种cldn18.2mab的靶标选择活性。通过将1.0×107个细胞与50％基质胶(bdbiosciences)一起注射至动物的右后侧腹中来在六周龄cd-1无胸腺裸小鼠(charlesriverlaboratories)中建立癌细胞系异种移植物。当肿瘤达到250mm3至300mm3的平均大小时，将小鼠随机分组以用非靶向人源化igg1对照抗体(10mg/kgqwiv)、mabcldn18.2-307(10mg/kgqwiv)、mabcldn18.2-358(10mg/kgqwiv)、cldn18.2-307-adc(5mg/kgqwiv)或cldn18.2-338-adc(5mg/kgqwiv)治疗，共三次重复剂量。对于所有实验，3次/周用测径规测量肿瘤异种移植物，并且通过高度x宽度x长度确定以mm3计的肿瘤体积。所有动物研究都根据由iacuc和ucla动物研究委员会核准的方案进行。使用来自studydirector(sanfrancisco,ca)的studylog软件分析数据。[0401]简要概述：在这个cldn18.2阴性模型中，在这些mab或adc中的任一者的情况下，未观察到显著抗肿瘤活性(图16a和图16b)。这些数据指示这些分子具有极小脱靶活性。[0402]实施例11[0403]这个实施例显示如通过流式细胞计量术所分析，人源化抗体与天然阳性细胞(具有内源性cldn18.2表达的细胞)或人工过度表达细胞(被工程改造来过度表达cldn18.2的细胞)的结合活性。[0404]方法：将人源化抗体在三种不同浓度下与150,000个细胞一起在4℃下在50μl2％fbs/pbs中孵育30分钟，随后用2％fbs/pbs洗涤；接着与来自biolegend的alexa647抗人iggfc抗体(409320)一起在4℃下孵育30分钟。接着通过ique先进流式细胞计量术平台测量样品。[0405]简要概述：在天然cldn18.2表达性hupt4细胞的情况下，或在人工cldn18.2过度表达性hek293t细胞的情况下，根据流式细胞计量术，针对cldn18.2的8种基于307(h1f06)加以修饰的人源化抗体和8种基于358加以修饰的人源化抗体相较于它们的亲本抗体显示各种结合亲和力，而不显示针对阴性对照m202细胞和hek293t亲本细胞的活性(图18)。[0406]实施例122％fbs/pbs中孵育30分钟，随后用2％fbs/pbs洗涤；接着与来自biolegend的alexa647抗人iggfc抗体(409320)一起在4℃下孵育30分钟。接着通过ique先进流式细胞计量术平台测量样品。[0413]简要概述：在人cldn18.2、人cldn18.1、小鼠cldn18.2、狗cldn18和大鼠cldn18的情况下，根据流式细胞计量术，4种基于307和358加以修饰的人源化抗体显示显著不同结合亲和力(图19)。在人与食蟹猕猴(macacafascicularis)(食蟹猴)之间，环1与环2两者均是相同的，因此猴cldn18.2oe株系未包括至这个测定中。[0414]实施例14[0415]这个实施例显示对在hupt4细胞的情况下cldn18.2人源化抗体的抗体内化的体外表征。[0416]方法：在37℃下用每毫升培养基1ugdna染料hoechst33342将核染色过夜。用celllighttm溶酶体-gfp,bacmam2.0(c10507)染色溶酶体，在37℃下转染，2ul/10k细胞，过夜。用af647对cldn18.2抗体进行初级标记。在4℃下以8ug抗体/300ul生长培养基将hupt4细胞染色30分钟。[0417]简要概述：测试的所有4种抗体(02-0307-h4、02-0307-h6、02-0358-h3和02-0358-h5)都在染色之后24-48小时之间完全内化(图20)。在内化之后，抗体(红色)融入溶酶体(绿色)中，并且在核(蓝色)周围形成黄色色斑(图20)。[0418]实施例15[0419]这个实施例显示人源化cldn18.2抗体的结合亲和力(kd)以及各种癌细胞系的表面上的cldn18.2表达水平。[0420]方法：通过来自sapidye的kinexa4000测量基于细胞的抗体亲和力kd(图21a)。对于每次kd测量，一般来说，使用同一批次的细胞(同一代)制备至少两条抗体浓度曲线以避免代与代之间的表达水平变化。简要来说，使用凡尔生使hek293tcldn18.2-mgfpc12细胞(经工程改造的过度表达细胞系)或hupt4细胞(天然阳性细胞系)脱离。接着在4℃下在分别处于2％fbs/dmem或2％fbs/rpmi中的不同浓度的抗体溶液中使细胞平衡过夜。细胞浓度以1.8x107个细胞/毫升起始，并且进行2倍连续稀释以获得10个点。此外，在每条曲线中包括仅抗体溶液(100％信号)和仅非特异性结合(nsb)缓冲液。次日，在1500rpm下将细胞旋转10分钟，并且保存上清液用于测量。将pmma珠粒(sapidye,440176)用30μg/ml的山羊抗人igg(jacksonimmunoresearchlabs，109-005-003)预包被，随后在室温下与10mg/mlbsa/pbs一起孵育1小时。将fluorescentalexa647affinipure山羊抗人igg(jacksonimmunoresearchlabs，109-605-088)以0.5μg/ml在1％bsa/pbs中稀释。使用通过n-曲线分析来分析的两条抗体曲线计算kd和抗原表达水平。[0421]还通过使用quantummesf试剂盒(用不同量的alexafluor647标记的四个荧光微球体群体，bangslaboratoriesinc，目录号647)和quantumsimplycellular(4种标准物，bangslaboratoriesinc，目录号816)或simplycellular试剂盒(1种标准物，目录号812)的组合，经由定量流式细胞计量测量来对细胞表面抗原表达水平进行测量(图21b)。简要来说，使用凡尔生溶液使细胞脱离；在4℃下用以alexafluor647染料初级标记的cldn18.2抗体将细胞和qsc珠粒染色30分钟；在用2％fbs/pbs洗涤之后，在accuric6上在围绕单细胞群体进行门控的相同设置下分析细胞、mesf和qsc珠粒。使用与每个试剂盒一起提供的quickcal分析模板，mesf试剂盒用于产生标准曲线，并且定量荧光；接着相对于曲线读取细胞样品以确定表达。此外，使用quantumsimplycellular或simplycellular试剂盒定量荧光团:蛋白质(f/p)比率。使用quickcal分析模板。随后，使用f/p比率将来自mesf的结果转换成abc单位。最后，计算的单价abc乘以2是二价结合的abc值。[0422]简要概述：4种人源化cldn18.2抗体显示不同的对cldn18.2阳性细胞系的结合亲和力；相较于cldn18.2过度表达人工细胞，对天然cldn18.2阳性细胞的结合亲和力更高(图21a)。在不同组织学之间，在内源性细胞系的情况下，细胞表面上cldn18.2的表达水平不同(图21b)。[0423]实施例16[0424]这个实施例显示cldn18.2人源化mab在cldn18.2+胰腺癌细胞系(hupt4)异种移植物的情况下的功效。[0425]方法：比较四种cld18.2定向抗体在人胰腺癌的hupt4细胞系异种移植模型中的抗肿瘤活性。通过将1.0×107个细胞与50％基质胶(bdbiosciences)一起注射至动物的右后侧腹中来在六周龄cd-1无胸腺裸小鼠(charlesriverlaboratories)中建立癌细胞系异种移植物。当肿瘤达到200mm3的平均大小时，将小鼠随机分入治疗组中。每周一次(qw)通过以10mg/kg静脉内(iv)注射非靶向人源化igg1对照抗体、cldn18.2抗体克隆#307-4、#02-307-6h、#358-3或#02-358-5h来治疗小鼠。对于所有实验，3次/周用测径规测量肿瘤异种移植物，并且通过高度x宽度x长度确定以mm3计的肿瘤体积。所有动物研究都根据由iacuc和ucla动物研究委员会核准的方案进行。使用来自studydirector(sanfrancisco,ca)的studylog软件分析数据。[0426]简要概述：用每种抗体进行的治疗在给药的24天期间诱导了对异种移植肿瘤进展的完全阻断。在测试的四种cldn18.2mab之中，克隆#307-4显示相比于其他三种克隆略微改善的功效(图22a和图22b)。[0427]实施例17[0428]这个实施例显示根据流式细胞计量术，cldn18.2-cd3双特异性t细胞衔接物(bite)与天然阳性细胞或人工过度表达细胞的结合活性。[0429]方法：将#307-cd3e-bite(2个批次)和358-cd3e-bite与150,000个细胞一起在4℃下在50μl2％fbs/pbs中孵育30分钟，随后用2％fbs/pbs洗涤；接着与抗hisalexa647抗体(biolegend#652513)一起在4℃下孵育30分钟。接着通过bdaccuritmc6流式细胞仪测量样品。[0430]简要概述：在天然cldn18.2表达性hupt4细胞和人工cldn18.2过度表达性hek293t细胞的情况下，根据流式测定，cldn18.2bite[#307-cd3e-bite(2个批次)和358-cd3e-bite]显示良好结合亲和力，而不显示针对阴性对照ark2细胞的活性(图24a至图24e)。然而，抗his-af647(biolegend#652513)与hek293t亲本细胞具有极高的背景/非特异性结合。[0431]实施例18[0432]这个实施例显示根据流式细胞计量术，cldn18.2-cd16-tandab(串联微型双功能抗体)与天然阳性细胞或人工过度表达细胞的结合活性。[0433]方法：使用307或358抗体的抗原结合蛋白构建包含各自结合cd16a或cldn18.2的抗原结合部分的tandab。本文所述的tandab的结构是cd16avh-(g2s)3-cldn18.2abvl-(g2s)3-cldn18.2abvh-(g2s)3-cd16avl-his标签(图23a至图23c)。将tandab307-cd16a和tandab358-cd16a以及afm13与150,000个细胞一起在4℃下在50μl2％fbs/pbs中孵育30分钟，随后用2％fbs/pbs洗涤；接着与抗hisalexa647抗体(biolegend#652513)一起在4℃下孵育30分钟。接着通过bdaccuritmc6流式细胞仪测量样品。[0434]简要概述：在天然cldn18.2表达性hupt4细胞的情况下，根据流式测定，tandab307-cd16a和tandab358-cd16a显示良好结合亲和力，而针对阴性对照ark2细胞显示较小活性。然而，抗his-af647(biolegend#652513)具有极高的背景/非特异性结合。afm13抗体(具有cd16a和cd30双特异性)用作在jurkat-lucia-nfat-cd16a细胞的情况下关于与cd16a的结合的阳性对照。这个流式测定中的结果证明307-cd16a和358-cd16a的tandab成功结合cldn18.2与cd16a两者(图25a至图25e)。[0435]实施例19[0436]这个实施例显示根据流式细胞计量术，cldn18.2-cd16-tandab与天然阳性细胞或人工过度表达细胞的结合活性。[0437]方法：将tandab307-cd16a和tandab358-cd16a以及afm13与150,000个细胞一起在4℃下在50μl2％fbs/pbs中孵育30分钟，随后用2％fbs/pbs洗涤；接着与抗hisalexa647抗体(biolegend#652513)一起在4℃下孵育30分钟。接着通过bdaccuritmc6流式细胞仪测量样品。[0438]简要概述：在天然cldn18.2表达性hupt4细胞的情况下，tandab307-cd16a和tandab358-cd16a显示良好结合亲和力，而针对cldn18.2阴性ark2细胞显示较小活性(图26a至图26e)。然而，抗his-af647(biolegend#652513)具有高背景/非特异性结合。afm13抗体(具有cd16a和cd30双特异性)用作在jurkat-lucia-nfat-cd16a细胞的情况下关于与cd16a的结合的阳性对照。这个流式测定中的结果显示tandab307-cd16a和tandab358-cd16a成功结合cldn18.2与cd16a两者(图26a至图26e)。[0439]实施例20[0440]这个实施例显示根据流式细胞计量术，cldn18.2-cd3bite与jurkat细胞的结合活性。[0441]方法：将内源性cd3阳性的jurkat细胞与1ug的每种目标bite(倍林塞妥-his标签、p307bite-his标签、p358bite-his标签)一起孵育，在4℃下孵育至少30分钟，洗涤，并且与0.5ug的抗his二级抗体一起孵育。洗涤样品，并且在同一天进行流式细胞计量术。对于阴性对照，将jurkat细胞仅与抗his二级抗体一起孵育。[0442]简要概述：流动结果指示基准抗体(倍林塞妥)以及我们的cldn18.2bitep307和p358的抗cd3结合能力(如图27a中所示)。40xkeyence图像指示一致的表面染色(图27b)。[0443]实施例21[0444]这个实施例显示使用天然或人工过度表达细胞，利用具有nfat-re报告体的jurkat细胞和cldn18.2-cd3bite进行的t细胞活化测定。[0445]方法：使用promega的t细胞活化生物测定试剂盒(nfat-rej1621)进行测定。将靶标细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在白色96孔板孔中，并且在37℃下孵育过夜，此后，将包括在测定试剂盒中的解冻并使用jurkatt细胞(被工程改造来在活化时发光)连同bite处理剂一起添加至接种的细胞(1:1细胞比率)中。将bite处理剂于九个连续1:4稀释液中添加，起始浓度是10nm。在37℃下在6小时期间孵育经处理板，此后，添加bio-glo试剂(包括在试剂盒中)，并且立刻在victor3v光度计上以每秒计数(cps)单位读取。[0446]简要概述：发光数据证明p307bite诱导cd3+jurkat细胞的cldn18.2特异性活化(图28)。换句话说，bite诱导相对活化水平需要存在肿瘤相关抗原(taa)阳性细胞。[0447]实施例22[0448]这个实施例显示使用人工过度表达细胞和内源性细胞系，利用具有nfat-re报告体的jurkat细胞和cldn18.2-cd3bite进行的t细胞活化测定。[0449]方法：(与图28相同，但采用两种cldn18.2bite)使用promega的t细胞活化生物测定试剂盒(nfat-rej1621)进行测定。将靶标细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在白色96孔板孔中，并且在37℃下孵育过夜，此后，将包括在测定试剂盒中的解冻并使用jurkatt细胞(被工程改造来在活化时发光)连同bite处理剂一起添加至接种的细胞(1:1细胞比率)中。将bite处理剂于九个连续1:4稀释液中添加，起始浓度是10nm。在37℃下在6小时期间孵育经处理板，此后，添加bio-glo试剂(包括在试剂盒中)，并且立刻在victor3v光度计上以每秒计数(cps)单位读取。[0450]简要概述：发光数据证明p307和p358bite诱导cd3+jurkat细胞的cldn18.2特异性活化(图29)。换句话说，肿瘤相关抗原(taa)阳性细胞为bite诱导相对活化水平所需。[0451]实施例23[0452]这个实施例显示在处理后5天时cldn18.2-cd3双特异性细胞毒性测定的代表性图像。[0453]方法：在96孔板中，将全cd3+人pbmc(购自humancellsbio)与cldn18.2+细胞系hupt4在不同效应物:靶标比率下共培养，并且用p307cldn18.2bite或阴性对照倍林塞妥处理。处理剂的浓度起始于125ng/ml，并且以1:10比率连续稀释。在处理后五天之后，用cellavista成像系统将板成像以确定共培养和处理是否将诱导对hupt4细胞的细胞毒性作用以及达到哪个程度。[0454]简要概述：cellavista图像证明p307cldn18.2bite诱导对hupt4细胞的细胞毒性作用。相比之下，对cd19而非cldn18.2具有特异性的阴性对照倍林塞妥在相同浓度下不影响hupt4细胞(图30a至图30f)。[0455]实施例24[0456]这个实施例显示在处理后5天时cldn18.2-cd3bite的ldh活性。[0457]方法：收集来自在实施例22中详述的实验的培养基，并且在14,500rpm下旋转10分钟以准备进行ldh测定(sigma：mak066)。来自每个孔的6μl培养基用于ldh活性测定。具有10％fbs的rpmi用作阴性对照。在37℃下进行测定，并且使用微板读取器(moleculardevice)在30秒间隔下每15分钟测量od450nm。[0458]简要概述：ldh比色测定作为简单方法用于测量相对细胞毒性水平。结果证明靶标特异性细胞毒性和剂量依赖性响应；相较于用阴性对照博纳吐单抗(倍林塞妥)处理的细胞，与cd3+人pbmc共培养，并且用p307bite处理的hupt4细胞释放了明显更高水平的ldh。还观察到效应细胞与靶标细胞比率依赖性响应，从而指示cd3+细胞为细胞毒性作用所需(图31)。[0459]实施例25[0460]这个实施例显示cldn18.2定向bite(cd3)在人pbmc注射的小鼠的cldn18.2阳性hupt4胰腺癌细胞系异种移植物的情况下的体内活性。[0461]方法：使用以人pbmc注射进行补充的免疫损害小鼠，在细胞系异种移植研究中评估cldn18.2定向bite的抗肿瘤活性。在腹膜内注射1.0×107个用il-2刺激的人供体外周血液单个核细胞(pbmc)之前12天，用1.0×107个hupt4胰腺癌细胞注射免疫损害(nsg)小鼠。在注射pbmc之后那天，基于平均肿瘤体积(150-200mm3)将小鼠随机分组，并且以每日静脉内(iv)注射1mg/kg倍林塞妥(非靶向对照)、1mg/kgcldn18.2-bite-307或1mg/kgcldn18.2-bite-358连续治疗7天。还用非靶向人igg1抗体(10mg/kgivqw)、cldn18.2-mab-307(10mg/kgivqw)或cldn18.2-mab-358(10mg/kgivqw)治疗额外对照组。[0462]简要概述：仅在用cldn18.2-bite-307或cldn18.2-bite-358治疗的小鼠中观察到cldn18.2阳性hupt4异种移植物的显著肿瘤消退(图32)。未观察到响应于用cd19定向bite倍林塞妥进行的治疗的抗肿瘤活性。hupt4细胞不表达cd19蛋白。针对cldn18.2的mab在这个模型中也不具有活性(图32)。这些数据说明cldn18.2bite的强力活性以及使用bite技术靶向clnd18.2的优势。[0463]实施例26[0464]这个实施例显示cldn18.2定向bite(cd3)在人源化blt小鼠中的cldn18.2阳性hupt4癌细胞系异种移植物的情况下的体内活性。[0465]方法：使用用胎儿供体cd38+干细胞以及供体肝和胸腺的片段植入以产生完全人源化免疫系统的免疫损害(nsg)小鼠，在细胞系异种移植研究中评估cldn18.2定向bite的抗肿瘤活性。在用1.0×107个hupt4胰腺癌细胞注射之前确认这些blt(骨髓肝胸腺)小鼠中人免疫细胞的重构。一旦肿瘤达到200mm3的平均体积，即用10mg/kghu-igg1对照ivqw或1mg/kgcldn18.2-bite-307iv连续5天治疗小鼠。[0466]简要概述：在用cldn18.2-bite-307治疗的小鼠中观察到显著肿瘤消退(图33a和图33b)。这些数据证明本文所述的靶向cldn18.2的bite在携带cldn18.2阳性癌细胞系异种移植物的人源化小鼠中诱导显著抗肿瘤活性。[0467]下表9-11代表结合cldn18.2的各种抗原结合蛋白或双特异性抗原结合蛋白。[0468]表9(还显示于图13中)[0469][0470][0471][0472][0473][0474][0475][0476]表10(还显示于图17中)[0477][0478][0479][0480][0481]表10中的抗体代表抗体307-4h和358-h3的序列以及额外序列变异。这些抗体被产生来提供关于潜在可制造性序列可能性的额外信息。[0482]表11(还显示于图23中)[0483][0484]当前第1页12当前第1页12