经修饰的神经氨酸酶

1.相关申请本技术要求于2019年7月5日向日本专利局提交的日本技术号2019-126376的优先权权益，所述申请通过引用整体并入本文。
2.本发明涉及经修饰的神经氨酸酶和编码所述经修饰的神经氨酸酶的基因。本发明还涉及经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的基因和编码组织蛋白酶a的基因的组合。本发明还涉及含有任何这些基因的载体。本发明还涉及含有前述任一项的药物组合物。


背景技术：

3.神经氨酸酶(n-乙酰基-α-神经氨酸酶，也称为溶酶体唾液酸酶)是一类通过水解除去糖链的末端唾液酸残基的糖苷酶。已知人细胞中存在四种类型的神经氨酸酶。其中，神经氨酸酶1(在下文中，也称为neu1)已被积极研究作为两种临床上类似的神经退行性溶酶体贮积病(即唾液酸贮积症和半乳糖唾液酸贮积症)的靶酶。此外，专利文献1描述了neu1的缺乏也与淀粉样变性相关，而非专利文献1描述了neu1也与癌症转移和浸润相关。
4.溶酶体贮积病(也称为溶酶体病)是一组基于编码酸性水解酶(溶酶体酶)或包含在溶酶体中的辅因子的基因的突变的先天性代谢错误的疾病，其中溶酶体是在细胞内外分解和代谢生物分子的细胞内小器官(细胞器)。溶酶体贮积病是一种不可治愈的疾病。然而，在1990年之后，酶替代疗法(ert)已经投入实际应用，并在临床上应用于主要具有外周症状的九类患者(非专利文献2)。酶替代疗法是将从导入了正常人溶酶体酶基因的培养动物或植物细胞株分泌并纯化的重组酶制剂定期(每1-2周)连续静脉内施用给患者的方法。然而，酶替代疗法具有适用疾病有限的问题。因此，需要治疗溶酶体贮积病的另一种方法。
5.现有技术文献专利文献专利文献1: jp 2014-526904 a非专利文献非专利文献1: journal of japanese biochemical society, vol. 80, no. 1, 13-23, 2008非专利文献2: journal of pharmaceutical society of japan, vol.138, no.7 (2018)。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题本发明人已对使用人神经氨酸酶1的基因疗法进行了研究，并且已发现人神经氨酸酶1的过表达引起胞内结晶，导致细胞破裂。因此，已发现将人神经氨酸酶1应用于基因疗法会损害细胞并涉及风险。本发明的一个目的是提供经修饰的神经氨酸酶，其在细胞中不
结晶并且可用于基因疗法。本发明的另一个目的是提供将神经氨酸酶1与溶酶体共定位的方法。
7.本发明人为解决上述问题已进行了广泛研究，并已发现某些经修饰的神经氨酸酶1即使在细胞中过表达时也不结晶。还发现当组织蛋白酶a (ctsa)过表达时，神经氨酸酶1与溶酶体共定位。基于上述发现完成了本发明。
8.具体地说，本发明涉及：(1) 经修饰的神经氨酸酶，其包含与seq id no: 1中所示氨基酸序列具有80％序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于seq id no: 1中所示氨基酸序列具有以下突变：(i) w173n或k175s突变；和(ii) k358n突变；(2) 经修饰的神经氨酸酶，其具有seq id no: 2或seq id no: 3所示的序列；(3) 核酸，其编码(1)或(2)的经修饰的神经氨酸酶；(4) 载体，其包含(3)的核酸；(5) (4)的载体，其为aav载体；(6) (4)或(5)的载体，其进一步包含编码组织蛋白酶a的核酸；(7) 药物组合物，其包含(1)或(2)的经修饰的神经氨酸酶或(4)至(6)中任一项的载体；以及(8) (7)的药物组合物，其用于治疗与神经氨酸酶1活性缺失或减弱相关的疾病。
9.本发明能够提供经修饰的神经氨酸酶1，其即使在过表达时也不结晶或仅轻微结晶。神经氨酸酶1与组织蛋白酶a的组合使用能够使神经氨酸酶1与溶酶体共定位。
附图说明
10.图1是展示表达neu1变体的质粒的实例的示意图。
11.图2是展示neu1变体1和2与野生型neu1相比的神经氨酸酶活性的示意图。
12.图3是展示当野生型neu1过表达时免疫染色结果的示意图。a：neu1，b：溶酶体，c：a和b的叠加图像。细胞核用hoechst 33258染色，neu1用抗neu1染色，而溶酶体用lysotracker染色。
13.图4是展示neu1变体1过表达时免疫染色结果的示意图。a：neu1，b：溶酶体，c：a和b的叠加图像。细胞核用hoechst 33258染色，neu1用抗neu1染色，而溶酶体用lysotracker染色。
14.图5是展示用于制备ctsa过表达细胞的质粒的示意图。
15.图6是展示当neu1变体1在ctsa过表达细胞中过表达时免疫染色结果的示意图。a：neu1，b：溶酶体，c：a和b的叠加图像。细胞核用hoechst 33258染色，neu1用抗neu1染色，而溶酶体用lysotracker染色。
16.图7是展示ctsa + neu1变体共表达质粒的实例的示意图。
17.图8展示了用作阴性对照的表达egfp的质粒。
18.图9展示将每种质粒引入敲除neu1的hek293细胞时的神经氨酸酶活性。
19.图10展示将每种质粒引入敲除neu1的hek293细胞时的羧肽酶活性。
20.图11展示将每种质粒引入敲除ctsa的hek293细胞时的神经氨酸酶活性。
21.图12展示将每种质粒引入敲除ctsa的hek293细胞时的羧肽酶活性。
22.图13是展示制备ctsa + neu1变体共表达aav载体的程序的示意图。
23.图14是展示制备ctsa + neu1变体共表达aav载体的程序的示意图。
24.图15展示用于扩增ctsa + neu1变体共表达aav载体的载体。
25.图16是展示向各种hek293细胞施用egfp表达载体(阴性对照)和ctsa + neu1变体共表达aav载体时神经氨酸酶活性的示意图。
26.图17是展示向各种hek293细胞施用egfp表达载体(阴性对照)和ctsa + neu1变体共表达aav载体时的羧肽酶活性的示意图。
27.图18是展示健康人皮肤成纤维细胞的神经氨酸酶活性，和当向源自半乳糖唾液酸贮积症患者的皮肤成纤维细胞施用egfp表达载体(阴性对照)或ctsa + neu1变体共表达aav载体时的神经氨酸酶活性的示意图。
28.图19是展示健康人皮肤成纤维细胞的神经氨酸酶活性，和当向源自唾液酸沉积症患者的皮肤成纤维细胞施用egfp表达载体(阴性对照)或ctsa + neu1变体共表达aav载体时的神经氨酸酶活性的示意图。
29.图20是展示引入neu1变体的cho细胞培养上清液的神经氨酸酶活性的示意图。
具体实施方式
30.一方面，本发明提供经修饰的神经氨酸酶。另一方面，本发明提供了编码经修饰的神经氨酸酶的核酸。
31.该方面的经修饰的神经氨酸酶包含其中在seq id no: 1所示的野生型神经氨酸酶1中分别在氨基酸173和175位处的w和k被突变或在氨基酸358位处的k被突变的序列。更具体地，经修饰的神经氨酸酶包含w173n和k175s突变，或k358n突变。在一个实施方案中，该方面的经修饰的神经氨酸酶具有上述突变，并且包含以下序列或由以下序列组成：与seq id no: 1所示的氨基酸序列具有约75％或更多，例如约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或约99％或更多的序列同一性的序列。在某一实施方案中，该方面的经修饰的神经氨酸酶具有上述突变，并且进一步包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：在seq id no: 1所示的氨基酸序列中取代、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，例如1至约40个、1至约30个、1至约20个、1至约10个、1至约5个(例如1、2、3、4或5个)或1至4个(例如1、2、3或4个)。在另一实施方案中，该方面的经修饰的神经氨酸酶包含seq id no: 2或seq id no: 3所示的氨基酸序列或由其组成。
32.编码该方面的经修饰的神经氨酸酶的核酸的实例包括编码经修饰的神经氨酸酶的核酸。更具体的实例包括在编码seq id no: 4所示的野生型神经氨酸酶1的核酸中，在517至519位和523至525位中的两个或更多个位置包含突变或在1074位包含突变的核酸。更具体的实例包括包含517至519位突变为aat或aac，523至525位突变为tct、tcc、tca、tcg、agt或agc，或1074位突变为t或c的核酸。在某个实施方案中，编码该方面的经修饰的神经氨酸酶的核酸包含以下序列或由以下序列组成：具有上述突变且与seq id no: 4所示的核酸序列具有约75％或更多，例如约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约91％或更多、
约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或约99％或更多的序列同一性的序列。在某一实施方案中，编码该方面的经修饰的神经氨酸酶的核酸包含以下核酸序列或由以下核酸序列组成：具有上述突变且在seq id no: 4所示的核酸序列中具有一个或多个，例如1至约40个、1至约30个、1至约20个、1至约10个、1至约5个(例如1、2、3、4或5个)或1至4个(例如1、2、3或4个)氨基酸的取代、插入、缺失和/或添加。在另一实施方案中，编码该方面的经修饰的神经氨酸酶的核酸包含seq id no: 5或seq id no: 6所示的核酸序列或由其组成。
33.可使用基于互联网的同源性搜索网站确定核苷酸序列或氨基酸序列的同一性(例如，可使用欧洲生物信息学研究所(ebi)网站：http://www.ebi.ac.uk/tools/sss/上的fasta、blast、psi-blast和ssearch进行同源性搜索)。此外，可在国家生物技术信息中心(ncbi)使用blast(例如ncbi网站的blast页面；https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi; altschul, sf等人, j. mol. biol., 1990, 215 (3): 403-10; altschul, s.f. & gish, w., meth. enzymol., 1996, 266: 460-480; altschul, sf等人, nucleic acids res., 1997, 25: 3389-3402)进行搜索。
34.如本文所用，术语“核酸”是指由核苷酸聚合形成的分子，并且包括寡核苷酸和多核苷酸。“核酸”包括单链或双链dna。此外，“核酸”包括仅由天然核苷酸形成的核酸，部分含有非天然碱基、核苷酸和核苷的核酸或合成核酸。通常，核酸是dna。
35.该方面的经修饰的神经氨酸酶可以是经受各种修饰中的任一种的蛋白，例如用糖链等的生理修饰、用例如荧光和放射性物质标记以及与另一种蛋白融合。此外，经修饰的神经氨酸酶可以是这样的神经氨酸酶，其在半胱氨酸残基处经受-sh基团的氧化(例如转化成磺基)、经受谷胱甘肽化、亚硝基化、烷基化或与马来酰亚胺键合以用于例如在生产和纯化期间稳定蛋白的性质和结构以及抑制分子间二硫键的目的。这些中的任一种均可用作该方面的经修饰的神经氨酸酶，只要它们在功能上是等同的。
36.制备该方面的经修饰的神经氨酸酶的方法没有特别限制，并且实例包括重组表达(例如哺乳动物细胞、酵母、大肠杆菌和昆虫细胞)和使用无细胞系统合成。其实例包括这样的方法，其中将具有编码适于宿主的信号序列的核酸序列和编码该方面的经修饰的神经氨酸酶的核酸序列的核酸引入宿主细胞中，并在重组表达后从培养上清液中收集产物；这样的方法，其中将具有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸序列的核酸引入宿主细胞中，并且在重组表达后破坏和收集细胞；和这样的方法，其中提供具有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸序列的核酸作为模板，并且在无细胞系统中进行合成。用于这些方法的细胞没有特别限制，且其实例包括hek293细胞。
37.获得的经修饰的神经氨酸酶可从宿主细胞内部或细胞外部(例如培养基)分离并纯化为基本上纯的和均质的蛋白。对于蛋白的分离和纯化，可以没有限制地使用用于纯化蛋白的常见分离和纯化方法。例如，可通过适当选择和/或组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉淀、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦法、透析和重结晶来分离和纯化蛋白。
38.另一方面，本发明提供了含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体。载体的实例包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、仙台病毒载体、仙台病毒包膜载体和乳头瘤病毒载体。优选的实例包括逆转录病毒载体、慢病
毒载体和腺伴随病毒(aav)载体。在更具体的实施方案中，载体是aav载体。aav包括但不限于aav1、aav2、aav3(包括3a和3b)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、鸟aav、牛aav、狗aav、马aav和绵羊aav以及任何其它未知的或以后将发现的aav。在某一实施方案中，aav载体是aav2。载体可含有有效诱导基因表达的启动子dna序列、控制基因表达的因子和维持dna稳定性所必需的分子。
39.在某一实施方案中，该方面的载体进一步包含编码组织蛋白酶a的核酸。具体实例包括编码包含以下序列或由以下序列组成的序列的核酸：与seq id no: 13所示的氨基酸序列具有约75％或更多，例如约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或约99％或更多的序列同一性的序列；编码包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的序列的核酸：在seq id no: 13所示的氨基酸序列中具有一个或多个，例如1至约40个、1至约30个、1至约20个、1至约10个、1至约5个(例如1、2、3、4或5个)或1至4个(例如1、2、3或4个)氨基酸的取代、插入、缺失和/或添加；编码包含seq id no: 3所示的氨基酸序列或由其组成的序列的核酸；与seq id no: 14所示核酸序列具有约75％或更多，例如约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多、约91％或更多、约92％或更多、约93％或更多、约94％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多或约99％或更多的序列同一性的核酸；包含以下序列或由以下序列组成的核酸：在seq id no: 14所示的核酸序列中取代、插入、缺失和/或添加一个或多个核酸，例如1至约40个、1至约30个、1至约20个、1至约10个、1至约5个(例如1、2、3、4或5个)或1至4个(例如1、2、3或4个)；和包含seq id no: 14所示的核酸序列或由其组成的核酸。
40.在另一方面，本发明提供了分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞。在某一实施方案中，分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞也分泌组织蛋白酶a。分泌该方面的经修饰的神经氨酸酶的细胞是例如具有任何上述核酸序列的细胞。分泌该方面的经修饰的神经氨酸酶的细胞可通过例如引入任何上述载体来制备。
41.在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含经修饰的神经氨酸酶、经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸和编码组织蛋白酶a的核酸的组合、含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体或分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞。
42.该方面的药物组合物可根据常规方法(参见例如remington's pharmaceutical science, 最新版本, mark publishing company, easton, usa)配制，并且含有药学上可接受的载体和添加剂。其实例包括表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲剂、悬浮剂、张度剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂和调味剂。然而，并不限于此，并且可以适当地使用其他常用的载体。其具体实例包括轻质无水硅酸、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙氨基乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉和无机盐。
43.用于施用该方面的药物组合物的方法的实例包括经口施用和肠胃外施用，并且此类施用方法的具体实例包括注射施用、经鼻施用、经肺施用和经皮施用。作为注射施用的实例，该方面的药物组合物可以通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射或皮下注射全身或局
部(例如皮下、皮内、皮肤表面、眼球或睑结膜、鼻粘膜、口腔、胃肠粘膜、阴道/子宫内粘膜、腹膜内、鞘内(例如鞘内或腰髓内)或心室内)施用。
44.此外，可根据例如患者的年龄和症状适当地选择施用方法。当施用经修饰的神经氨酸酶时，例如，剂量可在每次施用每1 kg体重约0.0000001 mg至约1000 mg的范围内选择。或者，例如，剂量可在每位患者约0.00001至约100000 mg/身体的范围内选择。当施用含有分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞或编码经修饰的神经氨酸酶的dna的基因疗法载体时，可以以使得靶组织中经修饰的神经氨酸酶的量在上述范围内的方式进行施用。然而，组合物的剂量不限于上述那些。
45.该方面的药物组合物可用于治疗由神经氨酸酶1活性的缺失或减弱引起的疾病。疾病的实例包括溶酶体贮积病、淀粉样变性和癌症。作为更具体的实例，该方面的药物组合物可用于治疗半乳糖唾液酸贮积症或唾液酸贮积症。
46.如本文所用，术语“患者”或“受试者”包括人或非人动物，且其实例包括但不限于人、小鼠、大鼠、猴、猪、狗、兔、仓鼠和豚鼠。
47.如本文所用，术语“治疗”是指例如症状的缓解、改善和/或消除、消退和/或稳定中的任一种(例如，其意指症状不进展至更晚期阶段)。
48.本发明还提供以下方面：(1) 用于治疗溶酶体贮积病、淀粉样变性病或癌症，优选溶酶体贮积病，更优选半乳糖唾液酸贮积症或唾液酸贮积症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用经修饰的神经氨酸酶、经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸和编码组织蛋白酶a的核酸的组合、含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体或分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞；(2) 用于治疗溶酶体贮积病、淀粉样变性病或癌症，优选溶酶体贮积病，更优选半乳糖唾液酸贮积症或唾液酸贮积症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用含有经修饰的神经氨酸酶、经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸和编码组织蛋白酶a的核酸的组合、含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体或分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞的组合物；(3) 经修饰的神经氨酸酶、经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸和编码组织蛋白酶a的核酸的组合、含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体或分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞用于治疗溶酶体贮积病、淀粉样变性病或癌症，优选溶酶体贮积病，更优选半乳糖唾液酸贮积症或唾液酸贮积症的用途；以及(4) 经修饰的神经氨酸酶、经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸和编码组织蛋白酶a的核酸的组合、含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体或分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞在制造用于治疗溶酶体贮积病、淀粉样变性病或癌症，优选溶酶体贮积病，更优选半乳糖唾液酸贮积症或唾液酸贮积症的药剂中的用途。
49.在这些方面，经修饰的神经氨酸酶、编码经修饰的神经氨酸酶的核酸、含有编码经修饰的神经氨酸酶的核酸的载体或分泌经修饰的神经氨酸酶的细胞，其形式、制剂、施用方法和剂量以及其它实施方案的描述如上所述。
50.在经修饰的神经氨酸酶和组织蛋白酶a的组合的情况下，它们可以同时或依次施用，或可以作为一种制剂施用。
51.本文引用的现有技术文献通过引用整体并入本文。如果在本说明书和引用的文献的描述之间存在差异，则通过本说明书的描述解决该差异。如本文所用，术语“约”意指
±
10％，优选
±
5％，更优选
±
1％的范围。给出范围的边界值的数值被认为在本说明书中描述。
实施例
52.在下文中，将通过实施例详细描述本发明，这些实施例不一定限制本发明的范围。
53.(测量方法)《神经氨酸酶活性的测量》1. 破碎细胞液的制备除去培养基，且然后用pbs剥离细胞并在1.5 ml管中回收。将细胞在4℃以500
×
g离心5分钟，除去上清液，且将细胞重悬于1 ml pbs中，并再次离心。除去上清液，加入250 μl裂解缓冲液(1％ triton x-100/150 mm nacl/50 mm乙酸钠缓冲液(ph 4.5)/1 μm胃酶抑素a(peptide institute inc.)/2 mm edta)，并用移液管吸取混合物以获得破碎细胞液。
54.2. 破碎细胞液蛋白的定量将用裂解缓冲液稀释的破碎细胞液以5 μl分配到96孔板的每个孔中。在96孔板中制备下表中所示浓度的校准曲线。
55.[表1]将dc蛋白测定试剂(bio-rad)的溶液a和s以50:1的比例混合，向各孔中加入25 μl混合物，然后加入200 μl溶液b，并使混合物在室温下反应15分钟。用平板读数器(tecan)测量750 nm处的吸光度以定量蛋白。
[0056]
3. 神经氨酸酶活性的测量将破碎细胞液以20 μl分配，加入20 μl底物溶液(0.2m乙酸钠缓冲液(ph 4.5)：8 μl，mili-q水：5 μl，50 mg/ml bsa (sigma aldrich)：2 μl和2 mm 4-mu-nana(carbosynth)：5 μl)，并使混合物在37℃下反应30分钟。此后，加入370 μl的0.2 m甘氨酸-naoh缓冲液(ph 10.7)以终止反应。制备下表中所示浓度的校准曲线。
[0057]
[表2]在355 nm的激发波长和460 nm的荧光波长下测量荧光强度，并计算比活性。
[0058]
《羧肽酶活性的测量》
将破碎细胞液在4℃以12000
×
g离心5分钟，并回收上清液且作为细胞提取物。用bio-rad dc蛋白测定试剂定量蛋白。
[0059]
1. 一级反应将25微升细胞提取物加入三个1.5 ml管中。将12.5 μl的0.2 m naoac缓冲液(ph 5.6)和12.5 μl的3 mm z-phe-leu(sigma aldrich)的混合物加入两个管中作为底物mix，并将12.5 μl的0.2 m naoac缓冲液和12.5 μl的水而不是3 mm z-phe-leu的混合物加入一个管中作为底物(-)。使混合物在25℃下反应30分钟，且然后浸入100℃的沸水中3分钟以停止反应。
[0060]
2. 二级反应校准曲线标准如下表所示制备。
[0061]
[表3]二级反应液如下制备：每管混合500 μl的0.1 m磷酸钾缓冲液(ph 7.0)，1.25 μl的0.2 m n-乙基马来酰亚胺(sigma aldrich)，1 μl的l-氨基酸氧化酶(得自西部菱斑响尾蛇(corotalus atrox), sigma aldrich)/20mm磷酸钾(ph 7.0)，0.5 μl的过氧化物酶(sigma aldrich)和15 μl的10 mg/ml邻联茴香胺(sigma aldrich)溶液，并加入每个样品和标准品中，并将混合物在37℃下孵育40分钟。40分钟后，向每个样品和标准品中加入500 μl的6 m hcl以终止反应。向96孔板的每个孔中加入200 μl的每种样品和标准品，并在540 nm下测量吸光度。
[0062]
《免疫荧光染色》1. 转移到8孔腔室载玻片将含有终浓度为10％的胎牛血清(biosera)的f-10 ham (sigma aldrich)和pbs温热。转染进行24小时，替换培养基24小时后，用抽吸器抽吸cho培养基，并用1 ml的1
×
pbs洗涤。加入1毫升的0.05％胰蛋白酶-1 mm edta/pbs，并将细胞在37℃培养2分钟。加入1毫升的f-10 ham，并剥离细胞，且在15 ml管中完全回收。将细胞在室温下以200
×
g离心5分钟，除去上清液，将细胞悬浮在1 ml的f-10 ham中，且取出30 μl悬浮液并加入1.5 ml管中。通过加入并混合30 μl的0.3％台盼蓝将细胞染色。使用血细胞计数板计数细胞。将细胞以1
×
104个细胞/孔加到8孔腔室载玻片(thermo)中，并用f-10 ham稀释至300 μl。
[0063]
2. 免疫荧光染色当用lysotracker进行染色时，用f-10 ham将lysotracker red dnd-99 (thermo)稀释到1 μm的终浓度，用含有lysotracker的培养基替换培养基，并将细胞培养1小时。除去培养基，将细胞用pbs以500 μm/孔洗涤一次，并加入200 μl的4% pfa/pbs以在室温下进行固定30分钟。将细胞以500 μl/孔洗涤三次。以200 μl/孔加入5%山羊血清(cedarlane)和1% bsa (sigma aldrich)/pbs，以在室温下封闭1小时。用一抗(抗neu1 f-8 (santa cruz, 稀释100倍)或抗lamp1 (abcam, 稀释300倍)) (以150 μl/孔)处理细胞，并在4℃下静置16小时。除去一抗溶液，并用0.1% tween20/pbs 500 μl洗涤(
×
5次)。用500 μl的pbs洗涤细胞
(
×
1次)。用二抗(缀合alexa fluor 488的抗小鼠igg (h + l) f(ab') 2 (cst, 稀释1000次)或缀合alexa fluor 555的抗兔igg (h + l) f(ab') 2 (cst, 稀释1000次))和hoechst 33258 (150 μl/孔)在室温下处理细胞1小时。用0.1% tween20/pbs以500 μl/孔洗涤细胞(
×
5次)。用pbs以500 μl/孔洗涤细胞(
×
2次)。用50%甘油/pbs包封细胞，并用共聚焦激光扫描显微镜lsm700观察。
[0064]
《sds-page》1. 分离胶的制备将3.125 ml的30％丙烯酰胺、1.875 ml的4
×
下层缓冲液(1.5 m tris-hcl, ph 8.8)、2.425 ml milliq水、75 μl的10％ sds、25 μl 10％ aps和5 μl temed的混合物倒入凝胶板中，在其上沉积水饱和的丁醇，并将混合物在室温下固化以制备分离胶(12.5％)。
[0065]
2. 浓缩胶的制备将0.65 ml的30%丙烯酰胺、1.25 ml的4
×
上层缓冲液(0.5 m tris-hcl, ph 6.8)、3.02 ml的milliq水、50 μl的10% sds、25 μl 的10% aps和5 μl的temed的混合物倒入凝胶板中，插入梳齿，并将混合物在室温下固化以制备浓缩胶。
[0066]
3. 样品的制备将4微升的6
×
样品缓冲液(0.3 m tris-hcl, ph 6.8, 36%甘油, 24% sds, 1.2% 2-巯基乙醇和0.012%溴酚蓝)加入稀释至20 μl的40 μg的破碎细胞液中，并将混合物煮沸3分钟。将4微升的6
×
样品缓冲液加入5 μl的生物素化标记物或预染色标记物中，并用milli-q水稀释至24 μl。将样品浸入100℃的热水浴中持续3分钟。
[0067]
4. 电泳用电泳缓冲液(25 mm tris, 192 mm甘氨酸, 0.1% sds)填充电泳浴，放好凝胶板，并在阴极侧加入电泳缓冲液。除去梳齿，调整孔，并施加所有样品。在20 ma的恒定电流下进行sds-page。
[0068]
《蛋白质印迹》电泳后从凝胶上切下浓缩胶，并浸入印迹缓冲液(48 mm tris, 39 mm甘油, 20%甲醇)中持续约15分钟。将pvdf膜浸入甲醇中，且然后浸入印迹缓冲液中持续15分钟。将滤纸(6张)浸入印迹缓冲液中持续15分钟。用转膜缓冲液湿润转膜仪(transblotter)，按此顺序放置滤纸(3张)、pvdf膜、凝胶和滤纸(3张)，并开始转膜。转膜在15v下进行约1小时。取出转膜的pvdf膜，加入50%封闭one/tbs以进行封闭1小时。施加一抗溶液，并使混合物在4℃下反应过夜。用pbs-t进行洗涤(5分钟
×
3次)，接着用pbs洗涤两次。将二抗溶液施加到pvdf膜上。用pbs-t进行洗涤(5分钟
×
3次)，接着用pbs洗涤一次，接着用tbs洗涤一次。此后，在hrp标记的情况下，将膜浸入western lightning ultra (perkinelmer)中，并用bio-rad chemi doc rxs+进行检测。在ap标记的情况下，将膜浸入bcip/nbt (wako)/50 mm mgso4/tbs中，并进行检测。
[0069]
实施例1. 经修饰的神经氨酸酶的制备和活性的证实1. 编码野生型人神经氨酸酶1的基因的扩增通过pcr反应扩增编码人神经氨酸酶1 (seq id no: 4)的基因，其中在94℃反应2分钟，进行一次，并进行包括在94℃反应30秒，在57℃反应30秒和在68℃反应60秒的循环35次，使用以下引物：
正向引物：tttttctagacaccatgactggggagcgac (seq id no: 7)；和反向引物：atataagctttcagagtgtcccataga (seq id no: 8)。pcr反应液通过用milli-q水将1 μl (50 pmol)的正向引物、1 μl (50 pmol)的反向引物、1 μl (10 ng)的模板质粒(pcdna3.1 hygro (-) neu1)、5 μl的10
×
kod缓冲液、2 μl的25 mm mgso4、5 μl的2 mm dntps和1 μl的kod plus (toyobo)稀释至50 μl来制备。
[0070]
2. 变体1和2的制备和扩增除了上述引物，以下引物：正向引物：ctaccatgttggtaaacagcagcgatgatggtgtttc (seq id no: 9)；和反向引物：gaaacaccatcatcgctgctgtttaccaacatggtag (seq id no: 10)被用于制备变体1，而以下引物：正向引物：ctcatggcggaacgagacagtcc (seq id no: 11)；和反向引物：ggactgtctcgttccgccatgag (seq id no: 12)被用作制备变体2。
[0071]
以与上述1.相同的方式进行pcr扩增，然后加入125 μl的乙醇和5 μl 的2 m nacl，且将混合物在4℃下以18000
×
g离心30分钟。除去上清液，并将剩余物溶于dna样品缓冲液(10 mm tris-hcl (ph 8.0), 50 mm edta, 33%甘油和0.3%溴酚蓝)。所有溶液用1％琼脂糖凝胶进行电泳。切出主要条带，并用凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化dna。将获得的dna片段以等摩尔比混合。用水将2 μl的25 mm mgso4、5 μl的2 mm dntps、5 μl的kod plus缓冲液和1 μl的kod plus的混合物稀释至50 μl。这通过pcr反应扩增，其中在94℃反应2分钟，进行一次，并进行包括在94℃反应30秒，在57℃反应30秒和在68℃反应80秒的循环35次。
[0072]
3. 限制酶处理在pcr之后将te饱和苯酚和cia(氯仿和异戊醇以24 : 1的比例的混合物)各25微升加入反应液中，并充分振荡混合物。在4℃下以20000
×
g离心5分钟。在新的1.5 ml管中回收上清液，并加入50 μl的cia。在4℃下以20000
×
g离心5分钟。在新的1.5 ml管中回收上清液，并加入125 μl乙醇和5 μl 2 m nacl。在4℃下以20000
×
g离心20分钟。弃去上清液，并将沉淀风干。通过加入10 μl的milli-q水溶解沉淀。如下表所示制备限制酶反应液，并在37℃下反应16小时。
[0073]
4. 连接所有限制酶反应液均用1％琼脂糖凝胶进行电泳。切出主要条带，并用凝胶提取试剂盒纯化dna。将25 fmol质粒和125 fmol插入物的混合物与相同体积的dna ligation kit mighty mix (takara)在16℃下反应16小时。
[0074]
5. 大肠杆菌的转化将连接产物加入100 μl的dh5α感受态细胞(nippon gene)中，并置于冰上30分钟。在42℃下施加热激60秒。加入300微升soc培养基，并将混合物在37℃孵育1小时。将所有混合物施加至lb(含有100 μg/ml氨苄青霉素)。在37℃下孵育14小时。
[0075]
6. 小量制备将2微升的100 mg/ml氨苄青霉素加入 2 ml的lb培养基中。用牙签挑取菌落，然后置于培养基中，并在37℃振荡16小时。取1毫升菌液，并在室温以1000
×
g离心5分钟。除去上清液，并加入100 μl冰冷却的sol i (50 mm蔗糖, 25 mm tris-hcl (ph 8.0)和10 mm edta)并重悬。加入200微升的sol ii (0.2 m naoh和1% sds)并通过倒置混合，并在冰上静置5分钟。加入150微升冰冷却的sol iii (3 m乙酸钾和2 m乙酸)并通过倒置混合。在4℃下以12000
×
g离心5分钟。回收上清液，并加入1 μl 10 mg/ml的rnase a (sigma aldrich)，并将混合物在37℃下孵育1小时。加入te饱和苯酚和cia各255 μl，并充分震荡混合物。在4℃下以12000
×
g离心5分钟。回收上清液，加入450 μl cia，并充分震荡混合物。在4℃下以12000
×
g离心5分钟。回收上清液，加入450 μl的2-丙醇，并充分搅拌混合物。在4℃下以18000
×
g离心20分钟。除去上清液，加入1 ml 75％乙醇。在4℃下以18000
×
g离心5分钟。除去上清液，将沉淀风干。将沉淀溶解在10 μl te缓冲液(ph 8.0)中。将1 μl各dna溶液，2 μl的10
×
m缓冲液，2 μl的0.1% bsa，14 μl的milli-q水，0.5 μl的xba i和0.5 μl的hind iii的混合物在37℃孵育1小时。加入4微升6
×
dna样品缓冲液，且混合物用1％琼脂糖凝胶进行电泳。
[0076]
7. 中量制备将具有在小量制备中其中插入物已被精确插入的质粒的菌落置于1 ml lb培养基(含有100 μg/ml氨苄青霉素)中，并在37下培养12小时。将细胞转移到200 ml lb培养基(含有100 μg/ml氨苄青霉素)中，并在37℃下培养16小时。使用hipure质粒中量制备试剂盒(thermo)提取并纯化dna。检查序列以确定获得的质粒是否含有预期的突变(引入neu1变体的质粒，图1)。
[0077]
8. 转染hek293细胞将含有终浓度10%的胎牛血清(biosera)的dmem (4500 mg/ml的葡萄糖) (sigma aldrich)和pbs温热。用抽吸器抽吸在10 cm皿(iwaki collagen i型涂布)中培养的hek293的培养基，并用4 ml的1
×
pbs洗涤。加入1毫升的0.05% 胰蛋白酶-1 mm edta/pbs，并将细胞在37℃培养2分钟。加入1毫升dmem，并将细胞剥离且在15 ml管中完全回收。将细胞在室温下以200
×
g离心5分钟，除去上清液，将细胞悬浮在1 ml的dmem中，并回收30 μl的悬浮液并加入1.5 ml管中。通过加入和混合30 μl的0.3%台盼蓝将细胞染色。使用血细胞计数板计数细胞。将细胞以1
×
106接种在35 mm皿(iwaki collagen i型涂布)上。加入dmem至终浓度为1.5 ml。将细胞在5％co2和37℃下培养24小时。opti-mem (thermo)由150 μl
ꢀ×2×
质粒数分配。向一侧加入2.5 μg每种质粒和5 μl p3000(thermo)。向另一侧加入7.5 μl的lipofectamine 3000(thermo)。将两种液体混合并在室温下放置15分钟。将混合液施加于细胞，并将细胞培养24小时。用2 ml新dmem替换培养基。
[0078]
9. neu1活性的证实野生型neu1和neu1变体1和2各自的神经氨酸酶活性根据以上《神经氨酸酶活性的
测量》中描述的方法测量。通过从获得的测量值减去未引入neu1的细胞的神经氨酸酶活性的测量值获得的值被定义为神经氨酸酶活性。结果示于下表和图2中。变体1和2都具有相对高的活性，尽管它们的活性低于野生型neu1。
[0079]
[表5]实施例2. 经修饰的神经氨酸酶是否结晶的证实1. 转染cho细胞用含有编码野生型neu1和neu1变体1(除非另有说明，下文中neu1变体1也简称为neu1变体)的基因的质粒转染cho细胞。具体而言，根据以下程序进行转染。将含有终浓度为10％的胎牛血清的f-10 ham (sigma aldrich)和pbs温热。用抽吸器抽吸在10 cm皿(greiner)中培养的cho的培养基，并用5 ml的1
×
pbs洗涤。加入1毫升的0.05% 胰蛋白酶-1 mm edta/pbs，并将细胞在37℃培养2分钟。加入1毫升f-10 ham，并将细胞剥离且在15 ml管中完全回收。将细胞在室温下以200
×
g离心5分钟，除去上清液，将细胞悬浮在1 ml的f-10 ham中，并回收30 μl的悬浮液并加入1.5 ml管中。通过加入和混合30 μl的0.3%台盼蓝将细胞染色。使用血细胞计数板计数细胞。将细胞以1
×
106接种在35 mm皿(greiner)上。加入f-10 ham至终浓度为1.5 ml。将细胞在5％ co2和37℃下培养24小时。opti-mem (thermo)由150 μl
ꢀ×2×
质粒数分配。向一侧加入2.5 μg每种质粒和5 μl p3000 (thermo)。向另一侧加入7.5 μl的lipofectamine 3000 (thermo)。将两种液体混合并在室温下放置15分钟。将混合液施加于细胞，并将细胞培养24小时。用2 ml新f-10 ham替换培养基。
[0080]
2. 细胞内结晶的观察根据上述《免疫荧光染色》中描述的方法，在引入基因后4天使用抗neu1抗体对neu1和使用抗lamp1对溶酶体进行免疫染色。
[0081]
野生型的结果示于图3，而变体1的结果示于图4。如图3所示，在野生型中观察到neu1的结晶。如图4所示，在变体1中没有观察到neu1的结晶。对于变体2，观察到轻微结晶，其与野生型相比小得多。如图所示，neu1几乎不与溶酶体共定位。
[0082]
实施例3. 在组织蛋白酶a过表达细胞中neu1与溶酶体的共定位根据已知方法进行转化以制备具有全长人组织蛋白酶a (ctsa) cdna (seq id no: 14)的pcxn2质粒(称为pcxn
2 ctsa)(图5)。根据上述方法用pcxn
2 ctsa转染cho细胞。替换培养基24小时后，用2 ml新培养基替换培养基。加入400 μg/ml g418(invivogen)作为选择药物，并将细胞培养3天。替换培养基，再次加入选择药物，并将细胞再培养1周。用不含选择药物的培养基替换培养基以增加细胞数目。根据上述方法将neu1变体1引入获得的ctsa过表达细胞中，并进行免疫染色。结果示于图6。如图所示，在ctsa过表达细胞中neu1变体与溶酶体共定位。这表明如果存在足够的ctsa，neu1被转运到溶酶体。
[0083]
实施例4. 共表达两种基因(ctsa和neu1变体)的载体的制备1. neu1变体1 (mod neu1)的cdna扩增并掺入载体中根据与以上实施例1.1中相同的程序使用以下引物制备载体：正向引物：ttttgaattccaccatgactggggagcgacc (seq id no: 15)；和
反向引物：aaaaagatcttcagagtgtcccatagacac (seq id no: 16).2. 限制酶处理除了如下表中所示制备限制酶反应液之外，以与实施例1.3中相同的程序进行处理。
[0084]
[表6]3. 连接，4. 大肠杆菌的转化和5. 小量制备除了使用0.5 μl的ecor i和0.5 μl的bgl ii作为限制酶之外，以与实施例1.4至6中相同的程序进行处理。将获得的插入物准确掺入其中的质粒定义为pbi-cmv1 mod neu1，并用于接下来ctsa cdna的掺入。
[0085]
6. ctsa cdna扩增根据与实施例1.1中相同的程序使用以下引物处理编码ctsa cdna (seq id no: 14)的基因：正向引物：ttttagatctcaccatgatccgagccgcgcc (seq id no: 17)；和反向引物：aaaagcggccgctcagtatggctgcttgttc (seq id no: 18)，和pcxn
2 ctsa作为模板质粒。
[0086]
7. 限制酶处理除了如下表中所示制备限制酶反应液之外，以与实施例1.3中相同的程序进行处理。
[0087]
[表7]8. 连接，9. 大肠杆菌的转化和10. 小量制备除了使用0.5 μl的bgi ii 和0.5 μl的not i作为限制酶之外，以与实施例1.4至6中相同的程序进行处理。将获得的插入物准确掺入其中的质粒定义为pbi-cmv1 ctsa + mod neu1 (图7)，并用于随后的实验。
[0088]
11. 中量制备
以与实施例1.7中相同的方式进行处理。
[0089]
实施例5. 引入质粒的细胞中的酶活性除了上述ctsa + mod neu1，还根据上述方法将egfp (阴性对照，图8)、ctsa(图5)和mod neu1(图1)的质粒各自引入ctsa敲除(ko)或neu1敲除hek293细胞。引入后，用表面活性剂裂解细胞，且根据上述方法测量神经氨酸酶活性和羧肽酶活性。结果示于图9-12。对于其中同时引入表达两种酶的质粒的细胞，在ctsa ko和neu1 ko细胞中神经氨酸酶活性和羧肽酶活性均增加。此外，对于其中引入了仅表达神经氨酸酶的质粒的细胞，在neu1 ko细胞中表现出与正常hek293中同等的神经氨酸酶活性，而在ctsa ko细胞中表现出低于正常hek293细胞中的神经氨酸酶活性。这揭示了ctsa活性对于神经氨酸酶活性是重要的。甚至其中仅导入mod neu1的质粒也表现出几乎一般水平的neu1活性。因此，当考虑到不发生结晶时，认为变体比野生型neu1更有效。此外，显示出共表达ctsa和neu1的载体将有效用于溶酶体贮积病，特别是半乳糖唾液酸贮积症和唾液酸贮积症的基因疗法。
[0090]
实施例6. ctsa + mod neu1-共表达aav2的制备1. 用于模板的pbi-cmv1 ctsa + mod neu1 nv的制备除了如下表中所示制备限制酶反应液，用于溶解风干的沉淀的milli-q水的量从10 μl变为8 μl，并且使用0.5 μl的ecor v和0.5 μl的xho i (takara)作为限制酶之外，以与实施例1.3至6中相同的程序进行处理。具有一条带的载体被定义为pbi-cmv1 ctsa + mod neu1 nv，并用作制备用于产生aav的载体的模板(图13)。
[0091]
[表8]2. ctsa、mod neu1共表达单元和egfp cdna扩增以与实施例1.1中相同的程序进行处理，使用以下引物：正向引物：ttttaagcttgagtcagtgagcgaggaagc (seq id no: 19)，和ttttgaattccaccatggtgagcaaggg (seq id no: 20)；和反向引物：tttttctagatcagagtgtcccatagacactg (seq id no: 21)，和aaaaagatctttacttgtacagctcgtccatgc (seq id no: 22)，使用pbi-cmv1 ctsa + mod neu1 nv作为模板质粒，和使用pegfp-n1 (takara)。
[0092]
3. 限制酶处理除了如下表中所示制备限制酶反应液之外，以与实施例1.3中相同的程序进行处理。
[0093]
[表9]
[表10]4. 连接，5. 大肠杆菌的转化和6. 小量制备除了使用0.5 μl的bgi ii和0.5 μl 的not i作为限制酶之外，以与实施例1.4至6中相同的程序进行处理。将获得的插入物准确掺入其中的载体定义为paav-cmv ctsa +mod neu1(图14)或paav-cmv egfp，并用于随后的实验。
[0094]
7. 中量制备以与实施例1.7中相同的方式进行处理。
[0095]
实施例7. ctsa + mod neu1共表达aav2转染到hek293细胞1. hek293ft的接种将含有终浓度10%的胎牛血清(biosera)的dmem (4500 mg/ml的葡萄糖) (sigma aldrich)和pbs温热。用抽吸器抽吸在10 cm皿(iwaki collagen i型涂布)中培养的hek293的培养基，并用4 ml的1
×
pbs洗涤。加入1毫升的0.05% 胰蛋白酶-1 mm edta/pbs，并将细胞在37℃培养2分钟。加入1毫升dmem，并将细胞剥离且在15 ml管中完全收集。将细胞在室温下以200
×
g离心5分钟，除去上清液，将细胞悬浮在3 ml的dmem中，且回收30 μl的悬浮液并加入1.5 ml管中。通过加入和混合30 μl的0.3%台盼蓝将细胞染色。使用血细胞计数板计数细胞。将细胞以4
×
106接种在10 cm皿(greiner)上。加入dmem至终浓度为10 ml。将细胞在5％ co2和37℃下培养24小时。
[0096]
2. 转染使用calphos转染试剂(takara)。用无菌水将钙溶液稀释6倍。向1000 μl的稀释的钙溶液中加入6 μl的3种质粒(paav-cmv egfp或paav ctsa + mod neu1; prc2-mi342; 和phelper，在各自te缓冲液(ph 8.0)中浓度为1 μg/μl，图15)的每一种。加入1018微升2
×
hbs，并将混合物剧烈震荡15次以混合。将混合物在室温下静置3分钟，并完全加入细胞中。12小时后，用8 ml dmem(2％胎牛血清)替换所有培养基。
[0097]
3. aav的提取向细胞中加入100微升的0.5 m edta-naoh (ph 8.0)，并将细胞在室温下静置10分钟。将细胞剥离，并回收在15 ml管中。用2 ml的dmem + 25 μl的0.5 m edat-naoh (ph 8.0)洗涤皿，并收集在上述管中。在4℃下以1700
×
g离心10分钟。尽可能除去上清液，并通过涡旋使细胞松散。加入500微升aav提取溶液a (takara)。涡旋进行15秒。将内容物转移至
1.5 ml管中，并在4℃下以10000
×
g离心10分钟。再次进行15秒的涡旋和离心。将上清液转移到新的1.5 ml管中，加入50 μl的aav提取溶液b (takara)，并搅拌混合物。分装100微升的混合物并储存在-80℃下。
[0098]
4. aav量化通过用移液管轻轻混合5 μl的aav溶液、12 μl的水、2 μl的10
×
dnase缓冲液和1 μl的dnase i (takara )制备dnase反应溶液，并且使溶液在7℃和30分钟至95℃和10分钟的条件下反应。使用以下引物：正向引物：5'-ggaacccctagtgatggagtt (seq id no: 23)；和反向引物：5'-cggcctcagtgagcga (seq id no: 24)并混合10 μl 的iq cybr green supermix (2
×
) (bio-rad)、0.1 μl的100 μm正向引物、0.1 μl 的100 μm反向引物和4.8 μl的无核酸酶水以制备总量为15 μl/样品的主混合物。将paav-cmv 稀释至2
×
10
9 摩尔/μl。
[0099]
如下表所示分阶段稀释质粒。
[0100]
[表11]样品如下稀释。
[0101]
1 : 20稀释：5 μl的样品+ 95 μl的水，1 : 100稀释：20 μl的1 : 20稀释样品+ 80 μl的水，1 : 500稀释：20 μl的1 : 100稀释样品+ 80 μl的水，和1 : 2500稀释：20 μl的1 : 500稀释样品+ 80 μl的水将5 μl的每种样品和标准品施加到96孔板的每个孔中，将15 μl的主混合物加入其每个孔中，并通过移液管进行混合。在95℃和3分钟/95℃和15秒/60℃和60秒/读板/来自步骤3的40个循环/在55℃至95℃下解链曲线的条件下进行pcr。使用bio-rad cfx connect实时pcr分析系统进行分析。
[0102]
5. 神经氨酸酶活性和羧肽酶活性的测量将含病毒提取物以1
×
10
5 vg/细胞加入neu1敲除(ko)或ctsa ko hek293中，并将混合物培养1周。用表面活性剂裂解细胞，用4-mu-nana测量神经氨酸酶活性，并用z-phe-leu-oh测量羧肽酶活性。结果示于图16和17。如图所示，加入aav2 ctsa + mod neu1增加了ctsa ko和neu1 ko hek293二者中的神经氨酸酶活性和羧肽酶活性。
[0103]
实施例7. ctsa + mod neu1共表达aav2的感染将含病毒提取物以2
×
10
5 vg/细胞或1
×
10
5 vg/细胞加入源自半乳糖唾液酸贮积症(gs)和唾液酸贮积症(sd)患者的皮肤成纤维细胞中，并培养1周。使用源自半乳糖唾液酸贮积症患者的皮肤成纤维细胞f598、源自唾液酸贮积症患者的皮肤成纤维细胞f643和作为
阳性对照的源自健康人的皮肤成纤维细胞f258。用表面活性剂裂解细胞，并用4-mu-nana测量神经氨酸酶活性。结果示于图18和19。加入aav2 ctsa + mod neu1增加了源自gs患者和源自sd患者二者的皮肤成纤维细胞中的神经氨酸酶活性。
[0104]
实施例8. neu1变体分泌到cho细胞上清液中将以与实施例2.1相同的程序转染的cho细胞在无血清培养基中培养，收集培养上清液，加入纯化的ctsa，并根据上述方法测量神经氨酸酶活性。结果示于图20。结果，每升培养基分泌1.18 mg neu1修饰型1。
[0105]
实施例9. ctsa + mod neu1共表达aav2载体的纯化根据zolotukhin等人. gene ther.，6，973-985 (1999)中描述的不连续梯度法纯化载体。将含有1 mm氯化镁的pbs (pbs-mk)加入冷冻保存的细胞以解冻细胞。加入dnase i和rnase a，并使混合物在37℃反应1小时。在10℃下以10000
×
g离心5分钟，并用0.45 μm过滤器过滤上清液。使pbs-mk通过过滤器，并将残留在过滤器中的液体压出。将样品加入超速离心管中，并用具有长针头的注射器在样品下施加15％碘克沙醇/1m nacl/pbs-mk。随后，在下层施加25％碘克沙醇/酚红/pbs-mk。此外，在下层施加40％碘克沙醇/pbs-mk。此外，在下层施加54％碘克沙醇/pb-mk。在18℃下以50000 rpm离心2小时(使用的转子为70.1 ti，200000
×
g)。离心后，收集40％碘克沙醇层。用100 kda截留amicon ultra由pbs替换缓冲液。
[0106]
实施例10. 体内侧脑室内施用方案将ctsa突变体小鼠麻醉，并将其头皮切开。在离前囟右侧1 mm和到尾部0.5 mm的位置插入两步针，并施用25 μl的aav溶液。将小鼠置于体暖器(body warmer)上以维持体温直到小鼠从麻醉中苏醒。一周后，解剖小鼠以分别分离大脑和小脑，并测量酶活性。