检测和监测病原体的系统和方法与流程

检测和监测病原体的系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本公开要求于2019年7月23日提交的美国临时申请第62/877,783号的较早申请日的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本公开涉及病原体领域，具体而言，涉及用于检测和监测病原体，例如细菌、真菌和病毒食源性病原体的系统和方法。


背景技术：

4.细菌和病毒食源性病原体是造成持续水平的人类疾病的原因，这会造成重大的公共卫生和经济负担。每年约有六分之一的美国人感染食源性疾病，估计每年的经济影响约为160亿美元。今天快速食品病原体分析的一个主要障碍是拥有一种足够灵敏的方法来捕获和检测病原体。因此，目前的方法依赖于富集来获得足够的细胞数量来检测细菌真菌和一些病毒病原体。根据检测的目标病原体和富集培养基的有效性，此步骤可能需要8小时至24小时或更长的孵育时间。此外，由于对所有食源性病原体的培养尚不可行，因此基于标准培养的方法无法分析某些肠道病毒病原体的样品。因此，需要改进的检测和监测食源性病原体的测定和方法。


技术实现要素：

5.食源性病原体检测和分析中培养的一些主要驱动因素包括需要高拷贝数以满足检测检测测定限(lod)和稀释原始样品中的检测抑制剂。食源性病原体检测的“圣杯”是一种可现场部署或现场部署的仪器，配备一次性、单次使用试剂盒，用于快速、独立于培养的样品制备以及细菌、真菌和病毒病原体分析，用于监管和公共卫生机构、食品工业和其他研究人员监测和归因。该系统理想地分离和分析活细胞，每25ml检测1个菌落形成单位(colony forming unit，cfu)，处理大型和复杂的样品基质，并在短时间内(例如90分钟或更少)提供半定量、从样品到答案的结果。
6.本文公开的是消除了培养细菌或真菌的需要并提供了所有工业所需和提供的用于食源性病原体检测的能力的系统和方法。所公开的测定法和方法提供了对环境、食物和水样品的不依赖培养的分析，以能够在需要的时候快速、便携、高度灵敏和特异性地检测病原体。在分析之前消除对培养的需求，大大减少了病原体检测的总时间，实现了定量分析，并实现了有效的干预策略，以减少和减轻食品供应中病原体的存在。它还大大减少了系统识别、隔离、根除和确认修复和解决病原体污染所需的时间。这可以大大减少患病人数和食品供应中病原体对整体经济的影响。食品工业通常在等待病原体检测结果的同时将成品存放三天或更长时间。对于食品加工商，所公开的测定和方法将降低与储存食品相关的运营成本，并将促进更加灵活和客户驱动的食品供应链模型，显著减少对订单做出反应所需的时间、所需携带的库存数量以及因腐败而产生的废物量。
7.在一些实施方案中，所公开的系统和方法使用基于适体的病原体捕获或抗体/抗原病原体捕获，然后从适体或抗体释放病原体。例如，一项测定使用dna适体从污染基质中特异性隔离病原体，包括其他非靶向生物和核酸扩增抑制剂，所有这些都可以在dna/rna提取、扩增、和分析之前通过积极和彻底的清洗来移除。
8.在一些实施方案中，用于检测、定量和/或监测病原体的方法包括：
9.通过基于适体的捕获或基于抗体的捕获从样品内的污染基质中捕获一种或多种活病原体；以及从适体或抗体中释放一种或多种捕获的活病原体，从而允许在不需要细胞培养的情况下检测一种或多种活病原体、对一种或多种活病原体进行定量和/或监测一种或多种活病原体。
10.在一些实施方案中，所述一种或多种活病原体是一种或多种产生疾病的生物体，例如细菌、真菌、原生动物和/或蠕虫。
11.在一些实施方案中，所述一种或多种活病原体是来自食物、水、环境、土壤、植物、动物、昆虫或人的样品中的一种或多种病原体。
12.在一些实施方案中，捕获一种或多种活病原体包括将所述样品施加到包含一种或多种尺寸的多个珠子的病原体分离柱上。
13.在一些实施方案中，病原体捕获柱的横截面积是恒定的。
14.在一些实施方案中，病原体捕获柱的横截面积是变化的。
15.在一些实施方案中，病原体捕获柱的横截面具有均匀的形状，例如圆形、椭圆形或多边形。
16.在一些实施方案中，病原体捕获的横截面是不均匀的形状。
17.在一些实施方案中，镁在病原体捕获时以足以增加适体熔化温度以导致稳定的二级结构形成同时在小于100mm钠和小于20摄氏度的存在下的浓度存在。
18.在一些实施方案中，镁浓度大于0.1mm。
19.在一些实施方案中，多个珠子中的每一个珠子的珠子表面包含已被修饰以用于适体或抗体附着的材料。
20.在一些实施方案中，捕获一种或多种活病原体进一步包括将所述样品施加到预过滤容器中，所述预过滤容器在病原体分离柱包含一种或多种尺寸的多个珠子之前包含与病原体分离柱相同尺寸或更小尺寸的珠子。
21.在一些实施方案中，预过滤容器的珠子具有不结垢的表面特性。
22.在一些实施方案中，从适体或抗体捕获一种或多种捕获的活病原体包括：通过使液体流过所述预过滤容器和捕获柱来任选地调节所述预过滤容器和捕获柱。
23.在一些实施方案中，样品是病原体样品。
24.在一些实施方案中，该方法还包括在释放所述一种或多种捕获的活病原体之前洗涤所述一种或多种活的捕获的病原体以去除未特异性结合的物质。
25.在一些实施方案中，未特异性结合的物质包括非靶向生物和核酸扩增抑制剂。
26.在一些实施方案中，从适体或抗体释放所述一种或多种捕获的活病原体包括用释放缓冲液洗涤所述捕获的一种或多种活病原体。
27.在一些实施方案中，从适体或抗体释放所述一种或多种捕获的活病原体通过使用等于或高于用于捕获所述一种或多种病原体的流速的流速进行。
28.在一些实施方案中，用于从适体或抗体释放所述一种或多种捕获的活病原体的流速比用于捕获所述一种或多种病原体的流速高至少2倍。
29.在一些实施方案中，从适体或抗体释放所述一种或多种捕获的活病原体包括在用释放缓冲液洗涤所述捕获的一种或多种活病原体之前的气隙。
30.在一些实施方案中，在液体中的一种或多种活病原体流过过滤器以收集释放的一种或多种病原体之前，任选地在作为储存器并用于去除空气的排气式气泡捕集器中的液体中收集所述释放的活病原体。
31.在一些实施方案中，排气式气泡捕集器包括至少一个入口端口、至少一个出口端口和通向空气的排放口。
32.在一些实施方案中，排放口任选地包括一个或多个传感器，所述传感器允许对泵入所述排气式气泡捕集器的液体的体积进行反馈控制。
33.在一些实施方案中，一个或多个传感器包括一个或多个能够检测液位的液位传感器和/或一个或多个能够检测液体中气泡的气泡传感器。
34.在一些实施方案中，该方法是基于适体的，并且适体用于将病原体特异性地隔离远离所述污染基质。
35.在一些实施方案中，适体包含dna、rna、pna、肽或其他天然或合成分子。
36.在一些实施方案中，该方法进一步包括通过在释放捕获的活病原体后执行核酸检测来检测病原体、对病原体进行定量和/或监测病原体。
37.在一些实施方案中，核酸检测包括检测dna或rna。
38.在一些实施方案中，核酸检测包括进行聚合酶链式反应、等温扩增、杂交检测和/或测序。
39.在一些实施方案中，所公开方法的一个或多个步骤通过自动化来执行。
40.在一些实施方案中，该方法还包括在执行检测病原体、检测病原体、对病原体进行定量和/或监测病原体的方法之后进行消毒。
41.在一些实施方案中，消毒包括在使用用于检测一种或多种病原体、监测一种或多种病原体或对一种或多种病原体进行定量的系统之前或之后使用包括试剂盒和卫生溶液的卫生系统用于进行卫生处理。
42.在一些实施方案中，该方法还包括通过一个或多个冷却或加热元件施加样品温度以在病原体捕获之前将温度传递至样品。
43.在一些实施方案中，用于检测病原体、对病原体进行定量和/或监测病原体的系统，包括：用于在处理之前保持所述样品的样品输入源；与所述样品输入源耦合的样品吸管；与所述样品吸管耦合的泵，用于提供所述样品进行处理；以及一个或多个传感器，用于检测何时收集到足够的样品量或样品量不再可检测。
44.在一些实施方案中，一个或多个传感器包括一个或多个能够检测液位的液位传感器和/或一个或多个能够检测液体中气泡的气泡传感器。
45.在一些实施方案中，该系统还包括用于通知采集的样品量不足的过程。
46.在一些实施方案中，该系统还包括耦合到所述样品吸管的病原体捕获系统，其中捕获一种或多种病原体，以及分析捕获的病原体的方法。
47.在一些实施方案中，样品输入源是临时的或永久的袋子或储存器。
48.在一些实施方案中，吸管是临时的或永久的。
49.在一些实施方案中，该系统还包括卫生系统用于在使用所述系统之前或之后进行卫生处理。
50.在一些实施方案中，卫生系统包括卫生试剂盒和卫生溶液，用于在使用用于检测一种或多种病原体、监测一种或多种病原体或对一种或多种病原体进行定量的系统之前或之后进行卫生处理。
51.在一些实施方案中，检测病原体、对病原体进行定量和/或监测病原体的方法，包括：通过基于适体的病原体捕获或抗体/抗原病原体捕获从样品内的污染基质中捕获一种或多种食源性病原体；以及从适体或抗体释放一种或多种捕获的食源性病原体，从而允许检测一种或多种食源性病原体、对一种或多种食源性病原体进行定量和/或监测一种或多种食源性病原体而不需要细胞培养。
52.在一些实施方案中，通过基于适体的病原体捕获从污染样品基质中捕获活病原体的方法，包括：在病原体捕获条件下将钠浓度降低至小于100mm；在病原体捕获条件下将温度降低到20摄氏度以下；以及提供浓度大于0.1mm且足以提高适体熔化温度以导致稳定的二级结构形成的镁。
53.在一些实施方案中，该方法还包括通过一个或多个冷却或加热元件施加样品温度，以在病原体捕获之前将所述样品温度传递到所述样品。
54.在一些实施方案中，通过基于适体的病原体捕获从污染样品基质中捕获活病原体的方法，包括：在病原体捕获条件下将钠浓度降低至小于70mm；在病原体捕获条件下将温度降低到20摄氏度以下；以及提供浓度大于0.25mm且足以提高适体熔化温度以导致所需二级结构形成的镁。
55.在一些实施方案中，该方法还包括通过一个或多个冷却或加热元件施加样品温度，以在病原体捕获之前将温度传递到所述样品。
56.在一些实施方案中，用于检测传染性颗粒、对传染性颗粒定量和/或监测传染性颗粒的方法，包括：通过基于适体的捕获或抗体/抗原捕获从样品内的污染基质中捕获一种或多种传染性颗粒；以及从适体或抗体释放所述一种或多种捕获的传染性颗粒，从而允许检测一种或多种传染性颗粒、对一种或多种传染性颗粒定量和/或监测一种或多种传染性颗粒而不需要细胞培养。
57.在一些实施方案中，一种或多种传染性颗粒是细菌、病毒、真菌、原生动物、蠕虫、蛋白质和肽中的一种。
58.在一些实施方案中，捕获一种或多种传染性颗粒包括将所述样品施加到包含一种或多种尺寸的多个珠子的分离柱上。
59.在一些实施方案中，多个珠子中的每一个珠子的珠子表面包含已经被修饰以用于适体或抗体附着的材料。
60.在一些实施方案中，捕获一种或多种传染性颗粒进一步包括在包含一种或多种尺寸的多个珠子分离柱之前将所述样品施加到包含与分离柱相同尺寸或更小的珠子的预过滤容器中。
61.在一些实施方案中，预过滤容器的珠子具有不结垢的表面特性。
62.在一些实施方案中，该方法还包括在释放所述一种或多种捕获的传染性颗粒之前
洗涤所述一种或多种捕获的传染性颗粒。
63.在一些实施方案中，一种或多种从适体或抗体释放的捕获的传染性颗粒在检测之前被浓缩。
64.在一些实施方案中，适体包含dna、rna、pna、肽或其他天然或合成分子。
65.在一些实施方案中，该方法进一步包括在检测之前进行核酸提取。
66.在一些实施方案中，检测包括核酸检测，包括检测dna或rna。
67.在一些实施方案中，核酸检测包括进行聚合酶链式反应、等温扩增、杂交检测和/或测序。
68.在一些实施方案中，将来自食品工业样品的样品收集袋上的机器可读代码自动链接到样品分析结果的系统，包括：所述样品收集袋上的机器可读代码；用于桨式混合样品的袋子上的机器可读代码；用于样品分析的试剂盒上的机器可读代码；确定样品分析结果的方法；以及数据库，用于将所述样品收集袋上的所述机器可读代码自动链接到所述样品分析。
69.在一些实施方案中，样品收集袋和用于桨式混合样品的袋是相同的袋。
70.在一些实施方案中，试剂盒上的机器可读代码任选地链接到用于该试剂盒的分析类型。
71.在一些实施方案中，用于链接所述样品收集袋上的机器可读代码的所述数据库驻留在能从计算机网络访问的服务器上。
72.在一些实施方案中，样品收集信息与试剂盒上的机器可读代码相关联。
73.在一些实施方案中，样品收集信息与试剂盒上的机器可读代码相关联，以确认试剂盒能够执行分析，包括：确定试剂盒已被配置为分析的病原体或传染原的类型；以及确定试剂盒的生存能力，例如使用年限和试剂盒之前是否已使用过。
74.在一些实施方案中，食品工业样品是食品或食品加工环境样品中的一种或多种。
75.在一些实施方案中，食品工业样品在分析之前与超过25毫升的水溶液进行桨式混合。
76.在一些实施方案中，用于对病原体进行检测、定量和/或监测的方法包括：将污染矩阵施加到包含非易失性数字数据的可移除试剂盒；制造试剂盒时写入数字数据的能力；以及在样品分析之前、期间和之后读取和写入试剂盒数字数据的能力。
77.在一些实施方案中，所述病原体是来自食物、水、环境、土壤、植物、动物、昆虫或人类中的一种或多种的细菌、病毒、真菌、原生动物、蠕虫、蛋白质和肽中的一种。
78.在一些实施方案中，数字数据能够与试剂盒制造信息、试剂盒存储信息、试剂盒活力、试剂盒寿命、试剂盒设计用于的一种或多种病原体、待应用于试剂盒的样品类型、与试剂盒先前使用相关的数据以及试剂盒使用数据中的一项相关联。
79.在一些实施方案中，试剂盒数字数据能够在分析之前、分析期间或分析之后中的一项或多项自动写入。
80.在一些实施方案中，用于生成分析数据的图形表示的系统，包括坐标轴，其中每个数据点的第一轴和第二轴能够与样品收集位置相关，并且每个位置处的病原体的数量由第三坐标轴、数值以及颜色、色调或强度的一种或多种差异中的一项或多项表示。
81.在一些实施方案中，样品收集位置是收集样品的一个或多个位置，例如加工、制
备、分发和/或销售食物的位置，或存在人员的位置，例如更衣室，或农场、田野或屠宰场的一个或多个位置。
82.本公开的前述和其他特征将从以下参照附图进行的详细描述中变得更加明显。
附图说明
83.图1是根据示例性实施方案的样品处理步骤的示意图。
84.图2是说明当与食品工业广泛使用的商业试剂盒相比时，所公开的基于探针的测定的示例性实施方案的改进敏感性的图。将所公开的基于探针的测定的性能与商业试剂盒microseqtm单核细胞增生李斯特菌检测试剂盒进行了比较。将单核细胞增生李斯特菌的细胞裂解物和10倍稀释的裂解物分开，并用基于探针的测定法和microseqtm测定法进行测试。发现所公开的基于探针的测定比商业试剂盒灵敏1000倍。
85.图3和图4说明了在过量非靶rna存在下用于靶rna检测的基于探针的测定的示例性实施方案的特异性。检测100fg李斯特菌rna的基于探针的测定的特异性使用20ng非靶rna进行了测试，这相当于大约200万个非靶细胞和40亿个非靶rn序列拷贝。从环境革兰氏阳性细菌菌株、蜡样芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌斯皮兹仁亚种中提取非靶rna，它们与单核细胞增生李斯特菌以及革兰氏阴性菌株、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌和丁香假单胞菌密切相关。当使用基于探针的测定法时，在所有测试的非目标菌株中均未检测到扩增(未记录ct值)。
86.图5是说明来自单核细胞增生李斯特菌的纯化的靶核酸与来自蜡状芽孢杆菌的过量非靶核酸的共孵育的图。在存在过量非靶标的情况下，测定敏感性不受影响。为了进一步验证基于探针的测定的特异性，通过在存在不同数量的蜡样芽孢杆菌菌株atcc 14579的情况下共孵育来自单核细胞增生李斯特菌的少量rna。结果表明，未观察到ct值的显著差异。为了检查不同量的芽孢杆菌rna对李斯特菌序列扩增效率的影响，检查了拐点前曲线的斜率。扩增曲线的分析导致在测试的各种条件下曲线斜率没有显著变化，这表明扩增效率可能不会受到添加非靶模板的不利影响。
87.图6是说明使用所公开平台的敏感性分析的图表。测定灵敏，效率接近100％。通过测量样品的光密度和16倍连续稀释到少于1000个细胞的估计感染剂量来确定含有超过估计1,000,000个格氏李斯特菌细胞的反应测试了敏感性。连续稀释的ct值相隔约4个循环，表明效率接近100％。
88.图7是说明拭子样品计数结果的图表(盲研究)。被选为尽可能具有代表性和挑战性的十个环境样品是从新鲜农产品设施中收集的，这些设施使用安装在棒上的海绵，例如3m sponge-stick，通常用10ml中和缓冲液预先润湿。收集后，将90ml缓冲液添加到过滤袋中，然后在桨式搅拌机(例如seward stomacher)中处理海绵2分钟以将病原体细胞释放到缓冲液中。五个环境样品以盲法加标灰李斯特菌，从每个样品管中取出1ml等分试样并计数板。如图中的计数结果所示，在样品中检测到李斯特菌的浓度范围为3.5cfu/ml及以上。所披露的基于dna的平台展示了处理“真实世界”环境海绵样品的能力，并能够准确识别那些添加李斯特菌的样品和未添加的样品。
89.图8是根据本公开的示例性实施方案的系统的框图。
90.图9是根据本公开的示例性实施方案的系统的框图。
91.图10描绘了其中可以实现所描述的技术的示例云计算环境1000。
92.图11图示了合适的计算系统1100的一般实施例，其中描述了实施例、方法和技术，包括所公开系统的构造、部署、操作和维护。
具体实施方式
93.一、术语
94.提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实施本公开。可以以有助于理解实施方案的方式将各种操作依次描述为多个离散操作；然而，描述的顺序不应被解释为暗示这些操作是依赖于顺序的。
95.描述可以使用基于透视的描述，例如上/下、后/前和顶/底。这样的描述仅用于促进讨论并且不旨在限制本公开的范围。
96.可以使用术语“耦合”和“连接”以及它们的派生词。这些术语不作为彼此的同义词。相反，“连接”方面可以用于指示两个或更多个元素彼此直接物理或电接触。“耦合”可能意味着两个或更多个元素直接物理或电接触。但是，“耦合”也可能意味着两个或更多个元素彼此不直接接触，但仍相互协作或相互作用。
97.为了描述的目的，“a/b”形式或“a和/或b”形式的短语是指(a)、(b)或(a和b)。为了描述的目的，“a、b和c中的至少一个”形式的短语是指(a)、(b)、(c)、(a和b)、(a和c)、(b和c)或(a、b和c)。为了描述的目的，“(a)b”形式的短语是指(b)或(ab)，即a是任选元素。
98.除非上下文另有明确说明，否则单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数指代。类似地，除非上下文另有明确说明，否则“或”一词旨在包括“和”。术语“包括(comprise)”是指“包含(include)”。因此，“包括a或b”是指“包含a、b或a和b”，而不排除其他元素。
99.描述可以使用术语“实施方案”或“多个实施方案”，每个可以指代相同或不同实施方案中的一个或多个。此外，关于实施方案使用的术语“包括”、“包含”、“具有”等是同义词，并且通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括”应被解释为如“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”，“包括”应解释为“包括但不限于”等)。
100.关于本文中任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用从复数翻译成单数和/或从单数翻译成复数。为了清楚起见，可以在本文中明确阐述各种单数/复数排列。
101.除非另有说明，否则按照常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于benjamin lewin，genes ix，jones and bartlet出版，2008(isbn 0763752223)；kendrew等人(编辑)，the encyclopedia of molecular biology，由blackwell science ltd.出版，1994年(isbn 0632021829)；和robert a.meyers(编辑)，molecular biology and biotechnology：a comprehensive desk reference，由vch publishers,inc.出版，1995年(isbn 9780471185710)；以及其他类似的参考资料。
102.下文描述了用于实践或测试本公开的合适方法和材料。这样的方法和材料仅是说明性的而不是限制性的。可以使用与本文描述的那些相似或等效的其他方法和材料。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
103.本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限
制性的。
104.为了便于查阅本公开的各种实施方案，提供以下对特定术语的解释：
105.3'末端：核酸分子的末端，其末端残基的3'没有与其结合的核苷酸。
106.5'末端：末端残基的5'位置不被核苷酸结合的核酸序列的末端。
107.试剂：任何蛋白质、核酸分子(包括化学修饰的核酸)、化合物、抗体、小分子、有机化合物、无机化合物或其他感兴趣的分子。试剂可以包括治疗剂、诊断剂或药剂。
108.扩增：一种增加核酸分子(如rna或dna)拷贝数的技术。扩增的示例是聚合酶链式反应(pcr)，其中样品与一对寡核苷酸引物在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下接触。引物在合适的条件下(例如，在存在聚合酶和dntps的情况下)延伸、从模板上解离、重新退火、延伸和解离以扩增核酸的拷贝数。扩增产物可以通过电泳、限制性核酸内切酶切割模式、寡核苷酸杂交或连接和/或使用标准技术的核酸测序来表征或定量。例如，反应的数量和效率可以在扩增过程中使用标记物(如下定义)来确定，例如荧光报道分子(包括猝灭报道分子)。也可以使用紫外光谱等方法在没有标记物的情况下完成。还可以使用各种商业产品，例如thermofisher scientific的qubit。
109.扩增的其他示例包括如美国专利no.5,744,311中公开的定量实时聚合酶链式反应(qpcr)、链置换扩增，；如美国专利号6,033,881中所公开的无转录等温扩增；如pct公开wo 90/01069中所公开的修复链反应扩增；连接酶链式反应扩增，如欧洲专利出版物ep-a-320,308中所公开的；间隙填充连接酶链反应扩增，如美国专利第5,427,930号中所公开的；和nasba rna无转录扩增，如美国专利第6,025,134号中所公开的。几个实施方案包括多重qpcr测定，其可用于在单个反应中扩增和检测多个核酸序列。
110.抗体：至少包括轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽，其特异性识别和结合抗原的表位，例如sclc相关分子或其片段。抗体由一条重链和一条轻链组成，每条链都有一个可变区，称为重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)。vh区和v
l
区一起负责结合抗体识别的抗原。本公开的抗体包括对公开的sclc相关分子特异的那些。
111.术语抗体包括完整的免疫球蛋白及其变体和部分，例如fab'片段、f(ab)'2片段、单链fv蛋白(“scfv”)和二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)。scfv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合，而在dsfv中，这些链已发生突变以引入二硫键以稳定结合的链条。该术语还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源偶联抗体(例如，双特异性抗体)。另见pierce catalog and handbook，1994-1995(pierce chemical co.,rockford,if)；kuby，j.，immunology，第3版，w.h.freeman&co.，纽约，1997年。
112.通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(h)链和轻(f)链。轻链有两种类型，拉姆达(λ)和卡帕(k)。有五种主要的重链类别(或同种型)决定了抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。
113.每条重链和轻链都包含一个恒定区和一个可变区(这些区域也称为“结构域”)。组合时，重链可变区和轻链可变区特异性结合抗原。轻链可变区和重链可变区包含被三个高变区中断的“框架”区，也称为“互补决定区”或“cdr”。已经定义了框架区和cdr的范围(参见kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，u.s.department of health and human services，1991)。kabat数据库现在在线维护。不同轻链或重链的框架
区序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐cdr。
114.cdr主要负责与抗原的表位结合。每条链的cdr通常称为cdr1、cdr2和cdr3，从n端开始按顺序编号，并且通常也由特定cdr所在的链标识。因此，v
h cdr3位于它所在的抗体重链可变域中，而v
l cdr1是来自它所在的抗体轻链可变域的cdr1。结合ret的抗体将具有特定的vh区和v
l
区序列，因此具有特定的cdr序列。具有不同特异性(如不同抗原结合位点不同)的抗体具有不同的cdr。尽管cdr因抗体而异，但cdr内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。cdr中的这些位置称为特异性决定残基(sdr)。
115.提及“v
h”或“vh”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括fv、scfv、dsfv或fab的可变区。提及“v
l”或“vf”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括fv、scfv、dsfv或fab的可变区。
[0116]“单克隆抗体”是由单个b淋巴细胞或由转染了单一抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过从骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合体中制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0117]“多克隆抗体”是衍生自不同b细胞系的抗体。多克隆抗体是针对特定抗原分泌的免疫球蛋白分子的混合物，每个分子识别不同的表位。这些抗体是通过本领域技术人员已知的方法产生的，例如，通过将抗原注射到合适的哺乳动物(例如小鼠、兔或山羊)中，诱导b淋巴细胞产生抗原特异性的igg免疫球蛋白，然后从哺乳动物的血清中纯化。
[0118]“嵌合抗体”具有来自一个物种如人类的框架残基和来自另一物种的cdr(通常赋予抗原结合)，如特异性结合sclc相关分子的鼠抗体。
[0119]“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人类(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个cdr的免疫球蛋白。提供cdr的非人免疫球蛋白称为“供体”，而提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施例中，所有的cdr都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区不必存在，但如果存在，它们与人免疫球蛋白恒定区完全相同，例如至少约85-90％，例如约95％或更多相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，可能除了cdr，与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。人源化免疫球蛋白可以通过基因工程构建(参见例如美国专利号5,585,089)。
[0120]“自身抗体”是由免疫系统产生的针对个体自身的一种或多种蛋白质的抗体。
[0121]
表达的改变或调节：基因、基因产物或其调节剂的表达改变。该短语是指在生物样品中可检测到的基因、基因产物或其调节剂的水平相对于已知指示在没有病原体的情况下基因、基因产物或其调节剂的水平对照或参考值。表达中的“改变”包括表达增加(上调)或表达减少(下调)。
[0122]
适体：本文所指的术语“适体”应理解为包括合成抗体、肽适体和核酸适体，其中至少一部分能够与另一分子结合。核酸适体通常是具有复杂二级或三级结构的单链核酸分子(如稍后讨论的，其可以包括双链部分或区域)，其可以以高亲和力特异性结合靶分子。考虑用于本文的适体可以是任何合适的核酸或其等价物。在这点上，适体可以包括例如dna、rna、核酸类似物(xna)，如肽核酸(pna)或锁核酸(lna)、乙二醇核酸(gna)或苏糖核酸(tna)或包含一种或多种修饰核苷酸的dna或rna等。开发和使用适体的方法是本领域技术人员已知的，例如，参见reverdatto等人，current topics in medicinal chemistry，2015年卷15第12期，特此通过引用将其全部并入。“修饰的”核苷酸包括例如对核苷酸的任何磷酸骨架、
糖部分或碱基部分、三苯甲基化碱基和不常见的碱基如肌苷具有化学修饰的核苷酸。修饰核苷酸的使用还可以影响适体与核酸酶的结合特性，例如，如latham等人所述(nucl acids res 22(14):2817-2822,1994，其全文以引用方式并入本文)。
[0123]
在一些具体实施方案中，使用rna适体。核酸适体可以通过多种方式进行修饰，例如增加稳定性，包括例如：(i)使用l-核苷酸(天然核苷酸的镜像)合成适体，使其不会被天然存在的核酸酶降解；(ii)将锁核酸(lna)和/或肽核酸(pna)残基掺入适体中。lna和pna也增加了核酸双链体的稳定性；(iii)核糖核苷酸的其他化学修饰，例如2'-氨基和2'-氟代嘧啶核苷酸或2'-0-甲基核苷酸；和/或(iv)在3'末端用脱氧胸苷加帽以增加对核酸外切酶降解的抗性。可以使用本文公开的和本领域已知的方法生产核酸适体。例如，可以使用体外选择方法(例如，参见ellington和szostak,nature 346(6287):818-22,1990，其通过引用整体并入本文)和selex方法(例如，参见tuerk和gold，science 249(4968):505-510,1990)其全部内容以引用方式并入本文)。与适体的生产和选择有关的更多细节也可以在osborne和ellington的评论中找到(chem rev 97(2):349-370,1997，其全文以引用方式并入本文)。在一些实施方案中，适体包括接头(参见，例如，2019年7月23日提供的idtdna.com/site/catalog/modifications/category/2，其通过引用整体并入本文)以促进与固体表面的附接并且可以包含一个或多个间隔物。
[0124]
细菌病原体：引起感染或疾病的细菌(病原菌)。病原菌的实例包括但不限于以下中的任何一种或多种(或其组合)：鲍曼不动杆菌、放线杆菌、放线菌、放线菌属(如以色列放线菌和内氏放线菌)、气单胞菌属(如嗜冷气单胞菌、维罗氏气单胞菌(aeromonas sobria)和豚鼠气单胞菌)、嗜吞噬无形体、边缘无形体、木糖氧化产碱菌、鲍曼不动杆菌、放线共生放线杆菌、芽孢杆菌属(例如炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌)、拟杆菌属(例如脆弱拟杆菌属)、巴尔通体(如芽孢杆菌和汉氏巴尔通体、双歧杆菌、博德特氏菌(如百日咳博德特氏菌、副百日氏杆菌和支气管败血博德特氏菌)、疏螺旋体(如鲍氏疏螺旋体和伯氏疏螺旋体)、布鲁氏菌(如流产布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、布鲁氏菌和猪布鲁氏菌)、伯克霍尔德菌(如假马氏伯克霍尔德菌和洋葱伯克霍尔德菌)、弯曲杆菌属(如空肠弯曲杆菌、大肠弯曲菌、弯曲杆菌和胎儿弯曲杆菌)、嗜二氧化碳菌属、人心脏杆菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、贝氏考克斯柠檬酸杆菌、棒状杆菌(例如，白喉棒状杆菌、杰氏棒状杆菌和棒状杆菌)、梭状芽孢杆菌属(例如产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肉毒杆菌和破伤风梭菌)、啮蚀艾肯菌、肠细菌属(例如，脂肪酶产生菌、絮凝肠细杆菌、阴沟肠杆菌和大肠埃希氏菌，包括机会性大肠杆菌，如产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌和尿路致病性大肠杆菌)肠球菌属(例如粪肠球菌和粪肠球菌)埃里希氏菌属(例如沙芬埃里希氏菌和犬埃里希氏菌)、红斑丹毒丝菌、真杆菌属、土拉弗朗西斯菌、具核梭杆菌、阴道加德纳菌、麻疹双胞菌、嗜血杆菌属(例如流感嗜血杆菌、杜克雷伊嗜血杆菌、埃及嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌、溶血性嗜血杆菌和副溶血性嗜血杆菌、幽门螺杆菌属(例如幽门螺杆菌、华氏螺杆菌和茴香螺杆菌)、金氏杆菌、克雷伯氏菌属(例如肺炎克雷伯菌、肉芽肿杆菌和产酸克雷伯菌)、乳酸杆菌属、单核细胞增生李斯特菌、问号钩端螺旋体、嗜肺军团菌、问号钩端螺旋体、消化链球菌属、溶血曼海姆菌、卡他莫拉菌、摩根氏菌属、动弯杆菌属、微球菌属、分枝杆菌属(例如麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、牛分枝杆菌和海
分枝杆菌)、支原体菌属(例如肺炎支原体、人型支原体和生殖支原体)、诺卡氏菌属(例如星形诺卡氏菌、盖尔森基兴诺卡氏菌和巴西土壤丝菌)、奈瑟氏球菌(例如淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌)、多杀性巴氏杆菌、志贺氏杆菌、普氏菌属、紫单胞菌属、产黑普雷沃氏菌、变形杆菌属(如变形杆菌和奇异变形杆菌)，普罗威登斯菌属(例如产碱普罗登斯菌、雷氏普罗威登斯菌和斯氏普罗威登斯菌)、铜绿假单胞菌、痤疮丙酸杆菌、马红球菌、类立克次氏体(例如立克次体立克次体、明立克次体和普氏立克次体、恙虫东方体(原：恙虫立克次体)和伤寒立克次体)、红球菌属、粘质沙雷氏菌、嗜麦芽窄食单胞菌、沙门氏菌属(如肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)、沙雷氏菌属(例如沙雷氏菌和液化沙雷氏菌)，志贺氏菌属(例如痢疾杆菌、福氏志贺菌、博伊氏志贺氏菌和松内志贺氏菌)、葡萄球菌属(例如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、腐生葡萄球菌)、链球菌属(例如肺炎链球菌(例如耐氯霉素4型肺炎链球菌、耐壮观霉素6b血清型肺炎链球菌、耐链霉素9v血清型肺炎链球菌、耐红霉素14型肺炎链球菌、抗光霉素14型肺炎链球菌、利福安耐药18c型肺炎链球菌、耐四环素19f型肺炎链球菌、耐青霉素19f型肺炎链球菌、耐甲氧苄啶23f型肺炎链球菌、耐氯霉素4型肺炎链球菌、耐壮观霉素血清型6b肺炎链球菌、耐链霉素血清型9v肺炎链球菌、耐奥托钦血清型14肺炎链球菌、耐利福平血清型18c肺炎链球菌、耐青霉素血清型19f肺炎链球菌或甲氧苄啶耐药的23f血清型肺炎链球菌)、无乳链球菌、变形链球菌、化脓性链球菌、a组链球菌、化脓性链球菌、b组链球菌、无乳链球菌、c组链球菌、心绞痛链球菌、马链球菌、d组链球菌、牛链球菌、f组链球菌和心绞痛链球菌g组链球菌)、螺旋菌减、串珠链球菌、密螺旋体属(例如卡拉托密螺旋体、细长螺旋体、梅毒螺旋体和地方性密螺旋体、惠氏螺旋体、解脲脲原体、韦荣氏菌属、弧菌属(如霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟似弧菌、霍利弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、达姆塞拉弧菌和弗氏弧菌)、耶尔森菌属(如小肠结肠炎耶尔森菌、鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌)和嗜麦芽黄单胞菌等等。
[0125]
珠子：具有体积和一个或多个表面的不溶性结构。一些珠子表面可以被修饰以包括反应性官能团，包括但不限于醇、卤化物、醛、环氧化物、胺、叠氮化物、炔烃、四嗪、马来酰亚胺、酯、硫醇、二硫化物、磺酰卤或酯，使得可以形成共价键。其他珠子表面具有防污性能，可能不容易修改。珠子可以有规则或不规则的形状。
[0126]
结合或稳定结合：两种物质或分子之间的缔合，例如一种核酸分子与另一种(或自身)的杂交，抗体与肽的缔合，或蛋白质与另一种蛋白质或核酸分子的缔合。如果足够量的寡核苷酸分子形成碱基对或与其靶核酸分子杂交以允许检测该结合，则寡核苷酸分子与靶核酸分子结合或稳定结合。“优先结合”表示一个分子与另一个分子以高亲和力结合，并以低亲和力与异源分子结合。
[0127]
可以通过本领域技术人员已知的任何程序检测结合，例如通过靶复合物的物理或功能特性。例如，可以通过确定结合是否对诸如基因表达、dna复制、转录、翻译等的生物合成过程具有可观察到的影响来功能性地检测结合。检测抗体与蛋白质结合的方法可以包括已知的蛋白质检测方法，例如蛋白质印迹法。
[0128]
试剂盒：用于样品处理的各个方面的可拆卸组件。试剂盒可用于样品分析。示例包括用于李斯特菌属的单个测定试剂盒，用于沙门氏菌和大肠杆菌的多路复用试剂盒可用于系统功能，包括但不限于卫生、灌注、运输、储存和校准。
[0129]
接触：直接物理关联的放置，包括固体和液体形式。
[0130]
检测：识别待检测物体的存在、不存在或相对或绝对数量。
[0131]
表位：抗原决定簇。这些是分子上具有抗原性的特定化学基团或肽序列，因此它们会引发特定的免疫反应。适体可以结合特定病原体表面上的表位，例如细胞壁，或者抗体可以结合特定抗原表位，例如病原体表面上的表位。
[0132]
表达：将基因的编码信息转化为细胞的可操作、非操作或结构部分的过程，例如蛋白质的合成。基因表达会受到外部信号的影响。例如，细胞暴露于激素可能会刺激激素诱导基因的表达。不同类型的细胞可以对相同的信号做出不同的反应。基因的表达也可以在从dna到rna到蛋白质的途径中的任何地方进行调节。调控可包括对转录、翻译、rna转运和加工、中间分子(如mrna)的降解或通过特定蛋白质分子产生后的特定蛋白质分子活化、失活、区室化或降解的控制。
[0133]
相对于正常(野生型)核酸分子，可以改变核酸分子的表达。基因表达的改变，例如差异表达，包括但不限于：(1)过表达；(2)表达不足；或(3)抑制表达。核酸分子表达的变化可能与相应蛋白质的表达变化相关联，实际上是引起相应蛋白质表达的变化。
[0134]
也可以以某种方式改变蛋白质表达以不同于正常(野生型)情况下的蛋白质表达。这包括但不一定限于：(1)蛋白质中的一个或多个氨基酸残基不同的突变；(2)蛋白质序列中一个或几个(例如不超过10-20个)氨基酸残基的短缺失或添加；(3)更长的氨基酸残基缺失或添加(例如至少20个残基)，使得整个蛋白质结构域或亚结构域被移除或添加；(4)与对照或标准量相比，增加量的蛋白质的表达；(5)与对照或标准量相比，减少量的蛋白质的表达；(6)改变蛋白质的亚细胞定位或靶向；(7)改变蛋白质的时间调节表达(使得在正常情况下不应表达的情况下蛋白质表达，或者在正常情况下应表达的情况下蛋白质不表达)；(8)通过增加蛋白质在细胞中保持定位时的寿命来改变蛋白质的稳定性；(9)蛋白质局部表达的改变(使得蛋白质在正常表达的地方不表达或在正常不表达的地方表达)，每个都与对照或标准进行比较。用于与样品比较、用于确定差异表达的对照或标准包括被认为是正常的样品以及实验室值(例如，值的范围)，即使可能是任意设置的，应注意的是，这些值可以变化从实验室到实验室发生变化。
[0135]
实验室标准和值可以基于已知或确定的总体值来设置，并且可以以图表或表格的形式提供，允许比较测量的、实验确定的值。
[0136]
真菌病原体：引起感染或疾病的真菌。真菌病原体的实例包括但不限于红色毛癣菌、须癣毛癣菌、绒毛癣菌、犬小孢子菌、圆形糠秕孢菌(糠秕马拉色氏霉菌)、念珠菌属(例如，白色念珠菌)、曲霉属(例如，烟曲霉、黄曲霉菌和棒曲霉)、隐球酵母(例如，新型隐球菌、加特隐球菌、劳伦隐球菌和白色隐球菌)、组织胞浆菌属(例如，荚膜组织胞浆菌)、肺孢子菌属(如耶氏肺孢子虫)和葡萄穗霉属(例如，黑葡萄穗霉)等等。
[0137]
杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键(包括watson-crick、hoogsteen或反向hoogsteen氢键)进行杂交。通常，核酸由含氮碱基组成，它们是嘧啶(胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)和胸腺嘧啶(t))或嘌呤(腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，嘧啶与嘌呤的键合称为碱基配对。更具体地说，a将与t或u形成氢键，g将与c键合。在rna分子中，g也将与u键合。互补是指发生在两个不同核酸序列或相同的核酸序列的两个不同区域之间的碱基配对。
[0138]
导致特定严格程度的杂交条件将根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是na
+
浓度)将决定杂交的严格程度。sambrook等人(编辑)讨论了有关获得特定严格程度所需的杂交条件的计算，molecular cloning:a laboratory manual，第二版，卷1-3，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny，1989，第9章和第11章，通过引用并入本文。
[0139]
分离的：“分离的”生物成分(例如核酸分子、蛋白质或细胞)已与生物体细胞或生物体本身的其他生物成分(其中天然存在该成分)基本分离或纯化，如其他染色体和染色体外的dna和rna、蛋白质和细胞。已“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质以及化学合成的核酸分子和蛋白质。术语“分离的”或“分离”还包括从无机和有机材料中分离或纯化一种或多种生物成分。术语“分离”和“捕获”在本文中可互换使用。
[0140]
标记或可检测部分：可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁或化学方法检测的组合物。例如，有用的标记包括放射性标记，例如，
32
p、
35
s或
125
i；重同位素，如
15
n或
13
c或重原子，如硒或金属；荧光染料；发色团、电子致密试剂；产生可检测信号的酶(例如，elisa中常用的碱性磷酸酶或过氧化物酶)；或旋转标记。标记或可检测部分具有或产生可测量信号，例如放射性、显色或荧光信号，可用于量化样品中结合的可检测部分的量。可检测部分可以以共价方式或例如通过离子键、范德华键或氢键，或通过掺入标记的前体，掺入或附接至分子(例如蛋白质，例如抗体)。标记或可检测部分可以是直接或间接可检测的。间接检测可以涉及第二个直接或间接可检测部分与可检测部分的结合。例如，可检测部分可以是结合伴侣的配体，例如生物素，它是链霉亲和素的结合伴侣，可以连接到直接可检测的标记上。结合伴侣本身可以是直接可检测的，例如，抗体本身可以用荧光分子标记。结合伴侣也可以是间接可检测的，例如，它可以被包含标记的另一个部分结合。信号的定量通过任何合适的方式来实现，例如荧光检测、分光光度检测(例如，在特定波长处的吸收)、闪烁计数、质谱、密度测定或流式细胞术。例如，在sambrook等人中讨论了标记方法和选择适合各种目的的标记的指导(molecular cloning:a laboratory manual，cold spring harbor，纽约，1989年)和ausubel等人(in current protocols in molecular biology,john wiley&sons，纽约，1998年)。
[0141]
测量：检测、量化或限定物理实体或化学组合物的量(包括摩尔量)、浓度或质量，在量化的情况下以绝对值表示，或以相对于可比较的物理实体或化学组合物的角度表示。
[0142]
病原体：任何能引起疾病的东西。在一些实施例中，病原体是传染性分子。在一些实施例中，病原体是活病原体，例如一种或多种产生疾病的生物，例如细菌、真菌、原生动物和/或蠕虫。在一些实施例中，病原体是一种或多种病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫、蛋白质和/或肽，其存在于从食物、水、环境、土壤、植物、动物、昆虫或人类获得的样品中。
[0143]
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它是一个相对术语。因此，例如，纯化的蛋白质制剂是其中所指的蛋白质比细胞内其自然环境中的蛋白质更纯的制剂。例如，纯化蛋白质制剂，使得蛋白质占制剂总蛋白质含量的至少50％。类似地，纯化的mrna制剂是其中mrna比在包括核酸分子的复杂混合物的环境中更纯的制剂。
[0144]
实时pcr(qpcr)：检测和测量pcr的每个循环期间产生的产物的方法，这些产物与pcr开始前的模板核酸量成正比。所获得的信息，例如扩增曲线，可用于确定靶核酸的存在
和/或对靶核酸序列的初始量定量。qpcr的示例性程序可见于perkin elmer applied biosystems(1999)出版的“quantitation of dna/rna using real-timepcrdetection”；pcr protocols((academic press，纽约，1989年)；a-z of quantitative pcr,bustin(编辑)，international university line,la jolla,ca,2004；和quantitative real-timepcrin applied microbiology，filion(编辑)，caister academic press，2012。
[0145]
在一些实施例中，使用标记的探针检测扩增的靶核酸的量，例如用荧光团标记的探针，例如探针。在其他实施例中，使用dna嵌入染料检测扩增的靶核酸的量。在qpcr过程中实时测量荧光发射的增加。这种荧光发射的增加与靶核酸扩增的增加直接相关。在一些实施例中，荧光变化(δrn；drn；δrn)使用等式drn＝rn
+-rn-计算，其中rn
+
是产物在每个时间点的荧光发射，rn-是基线的荧光发射。将drn值与循环数作图，得到每个样品的扩增图。阈值循环(ct)是荧光发射(drn)超过所选阈值的pcr循环数，该阈值通常是基线标准偏差的10倍(但是，如果需要，可以更改此阈值水平)。
[0146]
阈值周期是当系统开始检测到在对数线性阶段期间与pcr产物指数增长相关的信号增加时。此阶段提供有关反应的信息。对数线性阶段的斜率反映了放大效率。反应效率可以通过以下等式计算：例如，e＝10
(-1/斜率)
。pcr的效率应为90-100％，这意味着在每个循环中扩增子加倍。这对应于ct中-3.1到-3.6的斜率相对于对数模板量标准曲线。
[0147]
样品：用于分析或测试的水溶液或悬浮液。在一些实施例中，样品可能包含食物、水或环境材料。在一些实施例中，样品可以包含生物材料，例如尿液、唾液、痰、粪便、精液和其他体液和组织。在一些实施例中，材料可以被预处理，例如通过添加水溶液和桨式混合或通过分离、浓缩或去除材料，例如通过离心或过滤。样品可以包含物质，包括但不限于微生物(例如，细菌、病毒和真菌)、昆虫、植物、动物和/或粪便物质。
[0148]
敏感性和特异性：二元分类测试性能的统计测量。敏感性衡量被正确识别的实际阳性的比例(例如，被识别为包括来自特定病原体的核酸的样品的百分比)。特异性衡量正确识别的阴性比例(例如，被识别为不包括来自特定病原体的核酸的样品的百分比)。
[0149]
溶液：溶解在溶剂中的一种或多种溶质的均匀混合物。如本文所用，术语缓冲剂和溶液可互换使用，并且术语缓冲剂不一定表示溶液具有缓冲能力。
[0150]
标准品：已知量、纯度或浓度的物质或物质溶液。可以将标准品(例如通过光谱分析、色谱分析或分光光度分析)与未知样品(相同或相似物质的)进行比较，以确定样品中物质的存在和/或确定未知样品的数量、纯度或浓度。在一个实施方案中，标准品是肽标准品。内标准品是在样品制备和/或分析之前以已知量添加到样品中并用作计算样品组分浓度的参考的化合物。在一个实施例中，核酸标准品用作特定核酸表达水平的参考值。在一些实施例中，肽标准品作为特定肽表达水平的参考值。同位素标记的肽作为肽分析的内标准品特别有用，因为标记的肽标准的化学性质与其未标记的对应物几乎相同。因此，在化学样品制备步骤(例如色谱法，例如hplc)期间，未标记肽的任何损失都反映在已标记肽的类似损失中。
[0151]
病毒：在活细胞内繁殖的微观传染性有机体。病毒基本上由被蛋白质外壳包围的核酸核心组成，并且只能在活细胞内复制。“病毒复制”是通过发生至少一个病毒生命周期来产生额外的病毒。病毒可能会破坏宿主细胞的正常功能，导致细胞以病毒决定的方式行事。例如，病毒感染可能导致细胞产生细胞因子，或对细胞因子作出反应，而未感染的细胞
通常不会这样做。在一些实施例中，病毒是病原体。病毒病原体的具体实例包括但不限于；沙粒病毒(如瓜纳里托病毒、拉沙病毒、胡宁病毒、马丘波病毒和萨比亚病毒)、动脉病毒、罗尼病毒、星状病毒、布尼亚病毒(如克里米亚-刚果出血热病毒和汉坦病毒)、巴纳病毒、伯纳病毒、波马病毒(如博马病病毒)、雀麦花叶病毒、杯状病毒、金色病毒属、冠状病毒属(例如，冠状病毒和sar)、囊状病毒、丝状病毒属、豇豆花叶病毒组、双旋病毒、黄病毒属(例如黄热病病毒、西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒和登革热病毒)、丝状病毒(例如，埃博拉病毒和马尔堡病毒)、弹性病毒(flexivirus)、肝炎病毒属(例如戊型肝炎病毒)、人腺病毒(例如人腺病毒a-f)、人星状病毒、人bk多瘤病毒、人博卡病毒、人冠状病毒(例如人冠状病毒hku1、nl63和oc43)、人类肠道病毒(如人类肠道病毒a-d)、人类红细胞病毒v9、人类泡沫病毒、人类疱疹病毒(如人类疱疹病毒1(单纯疱疹病毒1型)、人类疱疹病毒2(单纯疱疹病毒2型)、人疱疹病毒3(水痘带状疱疹病毒)、人疱疹病毒4型1(爱泼斯坦-巴尔病毒1型)、人疱疹病毒4型2(爱泼斯坦-巴尔病毒2型)、人疱疹病毒5株ad169、人疱疹病毒5株merlin株、人疱疹病毒6a、人疱疹病毒6b、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8型m、人疱疹病毒8型p和人巨细胞病毒)、人免疫缺陷病毒(hiv)(如hiv 1和hiv 2)、人偏肺病毒、人乳头瘤病毒(如人乳头瘤病毒-1、人乳头瘤病毒-18、人乳头瘤病毒-2、人乳头瘤病毒-54、人乳头瘤病毒-61、人乳头瘤病毒-cand90、人乳头瘤病毒rtrx7、人乳头瘤病毒10型、人乳头瘤病毒101型、人乳头瘤病毒103型、人乳头瘤病毒107型、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒24型、人乳头瘤病毒26型、人乳头瘤病毒32型、人乳头瘤病毒34型、人乳头瘤病毒4型、人乳头瘤病毒41型、人乳头瘤病毒48型、人乳头瘤病毒49型、人乳头瘤病毒5型、人乳头瘤病毒50型、人乳头瘤病毒53型、人乳头瘤病毒60型、人乳头瘤病毒63型、人乳头瘤病毒6b型、人乳头瘤病毒7型、人乳头瘤病毒71型、人乳头瘤病毒9型、人乳头瘤病毒92型和人乳头瘤病毒96型)、人副流感病毒(如人副流感病毒1-3)、人副流感病毒、人细小病毒(如人细小病毒4和人细小病毒b19)、人呼吸道合胞病毒、人鼻病毒(例如人鼻病毒a和人鼻病毒b)、人泡沫病毒、人t淋巴细胞病毒(例如人t淋巴细胞病毒1和人t淋巴细胞病毒2)、人多瘤病毒、次病毒、李维病毒、黄矮病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcm)、海洋rna病毒属、裸露核糖核酸病毒属、网巢病毒属、野田病毒属、正粘病毒(如流感病毒)、分体病毒属、副粘病毒(如麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒)、皮瘤病毒(如脊髓灰质炎病毒、普通感冒病毒和甲型肝炎病毒)、马铃薯病毒、痘病毒(如天花和牛痘)、伴生病毒属、呼肠孤病毒(如轮状病毒)、弹状病毒(例如狂犬病病毒)、弹状病毒(例如水疱性口炎病毒、四病毒、披膜病毒(例如风疹病毒和罗斯河病毒)、汤姆布病毒、全病毒、蒂莫病毒、诺如病毒、牛疱疹病毒(包括牛疱疹病毒(bhv))、恶性卡他热病毒(mcfv)等。
[0152]
二、介绍
[0153]
食品行业当前的“黄金”标准做法是使用专为培养目标细菌而设计的富集肉汤培养食品和环境样品，然后通过一种或多种缓冲液交换进行细胞分离，通常通过离心、细胞裂解和dna或rna提取来完成，如果要使用rna，从rna逆转录为cdna，纯化以去除可能抑制或以其他方式对扩增产生负面影响的物质，以及使用pcr或等温扩增进行分析以扩增和检测病原体dna或cdna。在没有培养过程的情况下，商业化、现成的核酸扩增套盒的特异性和可靠性是不够的。可靠的扩增涉及识别目标生物特有的小dna序列。食品或环境样品中多样化和巨大的生物多样性排除了可靠的特异性扩增。样品可能包含微生物，例如细菌、病毒和真菌，以及昆虫、植物、动物和粪便材料。这些中的每一个都可以具有具有数百万个碱基的dna
序列。许多生物是未知的，每个物种的每种可能的基因型或血清型的序列也是未知的。如果知道它不会与可能存在于食品或环境样品中的dna序列结合，那么即使不是不可能，也很难定义仅与目标病原体中的特定序列结合的dna序列。此外，叶绿素和腐殖酸等化合物的存在，其成分会抑制核酸扩增并混淆结果的解释(例如，由于基线漂移)。此外，只要核酸序列不降解，核酸扩增对死细胞的作用与对活细胞的作用一样好。食品工业只需要检测活细胞，因为“杀灭步骤”(如卫生、巴氏杀菌或烹饪)可以杀死病原体而不降解病原体核酸。
[0154]
培养通过增加培养基中目标病原体的数量来解决在大型生物多样性样品中检测相对较低的病原体细胞拷贝数的挑战。培养显著降低了样品中的生物多样性，因为在此过程中只有细菌和真菌会繁殖。培养还可以进行活细胞分析，因为在此过程中只有活细胞会繁殖。它还可以有效地稀释许多核酸扩增抑制剂，但可能会残留其他与基质相关的污染物，这些污染物是下游酶促应用的抑制剂来源。例如，土壤和农产品中常见的腐植酸已被证明难以消除，因为它可以很容易地与目标dna一起共同提取。腐植酸通过序列特异性dna结合被认为是强核酸扩增抑制剂。
[0155]
富集肉汤旨在促进目标生物的生长，而不是竞争的非目标生物。创建显著有利于特定目标生物的富集肉汤可能非常具有挑战性且成本高昂。例如，专为大肠杆菌0157:h7设计的富集肉汤在特异性和成本方面的差异很大。最不具有特异性的肉汤可能缺乏防止显著假阳性的特异性，而最具有特异性的肉汤可能被认为对于日常食品分析来说过于昂贵。此外，创建能够以足够特异性富集多种不同病原体的肉汤通常是不可能或不切实际的。在培养过程的指数生长期，细菌的数量可以每二十分钟翻一番。根据众多因素，可靠检测可能需要数百万、数十亿甚至数万亿个细胞。因此，培养过程可能需要长达一天或更长的时间，从而延迟分析。受到压力的细胞(例如暴露于氯、抗菌剂或低温等化学物质)可能需要更长的时间才能达到指数生长期。为所有病原体分析增加足够的培养时间以确保所有细胞的可靠生长通常是不切实际的。
[0156]
食品行业的样品量和收集方法是40年行业经验和数据分析的结果。非常希望病原体分析利用这些已建立的样品量和收集方法。环境样品可以使用3m sponge-stick等固定海绵获得，通常用10ml中和缓冲液预先润湿。收集后，将90ml缓冲液(通常为生长培养基)添加到过滤袋中，并将海绵在桨式搅拌机(例如seward stomacher)中处理2-3分钟，以将病原体细胞释放到缓冲液中。与食品工业使用的标准样品收集和桨式混合方法相比，所公开的方法使用了不同的桨式混合缓冲液组合物。与用作传统基于培养检测的缓冲液的富集肉汤相比，所公开的系统使用了成本较低的缓冲盐水。
[0157]
为了可靠地处理环境样品，所公开的系统确保了足够的过滤器负载能力，始终如一地捕获靶细胞，并去除可以干扰或抑制核酸扩增的物质，例如腐植酸和镁。
[0158]
使用过滤无法有效地从所有食品和环境样品中分离细菌。这些样品可能含有大量的生物体和物质，例如粘土颗粒，其大小可能与细菌相同。发明人开发了一种无需小颗粒过滤即可捕获细菌的流通式测定法。基于适体或基于抗体的细胞捕获中的捕获时间受细胞与捕获分子之间的距离的影响。减少距离会减少所有细胞被捕获的时间。流通式系统中的捕获时间是流道高度、流速和捕获表面沿流动路径的表面积的函数。所公开的表面化学作用于许多表面，包括但不限于珠子、载玻片和其他玻璃表面，例如任何含有钠钙玻璃的表面。钠钙玻璃是最便宜和最常用的玻璃类型之一。钠钙玻璃用于商品饮料瓶、窗玻璃和街道标
记涂料中以使其具有反光性。因此，人们可以在不显著增加成本的情况下大幅增加捕获表面尺寸。发明人已经证明在以每分钟10毫升或15毫升流动的原型流道中具有高结合效率。他们已经展示了通过简单地增加流道的直径来增加流速而不损失捕获效率的能力。通过推断实验结果，应该可以以每分钟升、每分钟数十升或更大的流速高效地捕获细胞。这对于水、土壤和食品测试等大样品量的应用非常有利。对于需要尺寸和便携性的应用，例如即时诊断，通道尺寸也可以减小。所公开的系统和方法被认为提供了用于快速、低成本地捕获食物、环境和其他样品中的病原体细胞的理想过程。
[0159]
在本公开之前，从未成功完成对满足所有关键食品工业要求的食源性病原体的培养独立分析。食源性病原体分析需要在难以处理的大型生物多样性样品中检测到少至每毫升1个病原体细胞。分析应仅检测活细胞，以验证“杀灭步骤”的有效性，例如卫生、巴氏杀菌或烹饪(通常不会实质性改变细胞rna或dna的步骤)。据推测，由于细菌转录本对细胞内和细胞外rnase的降解敏感，因此mrna水平应在死亡后迅速下降。因此，与基于dna的检测不同，mrna将仅限于群体中的活细胞和活跃细胞。已经发现，基于rna的检测不能用于准确计数活细胞(参见，例如，frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2016.00223/full#b32，其通过引用整体并入本文)。因此，需要一种新方法来仅检测活细胞。理想情况下，测试过程是自动化的，可由受过最少培训的人员使用，并且具有成本效益。所公开的系统和方法实现了所有这些要求，并在盲测中得到了100％正确结果的验证(参见实施例部分)。
[0160]
所公开的系统和方法还提供定量的结果；识别和隔离污染源时的关键信息。食品安全现代化法案(fsma)于2011年1月签署成为法律。其目的是通过将重点从应对食品污染转移到预防食品污染来确保美国食品供应安全。通过加速识别和确认病原体的存在，病原体的快速检测可以促进遵守fsma。所公开的系统和方法实现了主动预防和过程改变，允许在食品进入供应链之前采取纠正措施。
[0161]
相信所公开的系统和方法可以显著减少或消除食品工业的测试和保持周期，通过提高操作效率和减少劳动力、运输和储存需求来实现显著的成本节约。通过零售和食品服务渠道，公众可以看到更安全的产品更快地进入供应链，具有更长的保质期，以及更好、更完整的可追溯性的潜力。所公开的快速病原体检测平台可以帮助减轻食品加工商的经济负担并保护公众。缩短识别、鉴定和根除食源性病原体污染的反应时间可以减少受影响的人数。因此，所公开的系统和方法首次提供了定量结果以帮助食品安全专业人员测量食品安全过程的有效性。该技术还可以在现场进行测试，允许在种植区进行便携式分析，并在美国港口和边境进行病原体测试。
[0162]
三、用于检测和监测病原体的系统和方法
[0163]
本文公开了用于快速病原体检测、定量和监测，包括对细菌、真菌和病毒食源性病原体检测、定量和监测的系统/平台、试剂盒和方法。所公开的系统和方法具有仅分离活细胞而不是死细胞的能力，这是有利的。在实施方案中，所公开的系统不分离因热和暴露于某些抗微生物物质而被杀死的细胞。例如，在一些实施方案中，所公开的系统和方法导致检测到小于0.1％，例如小于0.01％、小于0.001％或更少的已被加热和暴露杀死的细胞。在实施方案中，所公开的系统和方法捕获、释放和处理足够的活细胞以能够从90毫升或更大的典型样品大小进行检测，而不需要细胞培养。
[0164]
在一些实施例中，分离条件包括降低钠浓度以排除死细胞的捕获和调整溶液的组
成和条件。在一些实例中，分离条件包括降低杂交温度。在一些实施例中，引入镁以在降低的温度下稳定适体的形成。在一些实施例中，降低温度以稳定适体结构的dna骨架。在一些实施例中，使用低于20摄氏度的温度，因为较低的温度与减少的死细胞结合相关联或与没有死细胞结合相关联。在一些实施例中，镁以足以提高适体熔化温度以导致所需二级结构形成的浓度存在，同时在小于100mm钠和小于20摄氏度的情况下存在。在一些实施例中，镁浓度大于0.1mm。在一些实施例中，活细胞的分离在以下一种或多种存在下进行：(1)超过0.1mm的镁，例如在0.1mm至100mm之间、在0.1mm至10mm之间、在0.1mm至5mm之间、在0.2mm至1mm之间，包括0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm；(2)在少于100mm na
+
(钠)的存在下，例如在100mm至1mm之间、在100mm至10mm之间，包括100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、5mm或1mm；和/或(3)低于20摄氏度，例如在20至0摄氏度之间、在20至2摄氏度之间、在12度至9度之间、11度至9度之间，包括20摄氏度、19摄氏度、18摄氏度、17摄氏度、16摄氏度、15摄氏度、14摄氏度、13摄氏度、12摄氏度、11摄氏度、10摄氏度、9摄氏度、8摄氏度、7摄氏度、6摄氏度、5摄氏度、4摄氏度、3摄氏度、2摄氏度、1摄氏度。在一些实施例中，镁以足以提高适体熔化温度以导致所需二级结构形成的浓度存在，同时在小于100mm钠和小于20摄氏度的情况下存在。在一些实施例中，分离条件在含有约150mm钠的1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液的存在下进行。在一些实施例中，分离条件是在含有大约30mm钠的0.2x pbs溶液存在下进行的。在一些实施例中，分离条件是在含有大约100mm钠的大约0.75x pbs溶液的存在下进行的。在一些实施例中，所公开的方法和系统利用包含珠子的病原体捕获柱，所述珠子用对目标病原体具有亲和力的适体官能化，并且样品流过所述珠子以结合到官能化珠子表面。在一些实施例中，珠子用一种以上的适体官能化。在一些实施例中，珠子通过过滤器保留在柱内，例如不锈钢网，其孔径小于珠子的尺寸。在一些实施例中，珠子容器包括具有均匀横截面的管。在一些实施例中，病原体捕获柱的横截面积是恒定的。在一些实施例中，病原体捕获柱的横截面积变化。在一些实施例中，捕获一种或多种活病原体包括将样品施加到包含一种或多种尺寸的多个珠子的病原体分离柱。在一些实施例中，病原体捕获柱具有统一的形状，例如圆形、椭圆形或多边形。在一些实施例中，病原体捕获的横截面是不均匀的形状。
[0165]
所公开的系统和方法不依赖于细胞培养并利用增加检测特异性的两阶段过程。具体而言，该方法涉及使用病原体分离，例如病原体细胞，作为第一步的分离和释放，随后作为第二步的核酸提取和检测。在一些实施例中，两步法包括病原体分离，例如病原体细胞分离，通过基于适体或抗体-抗原捕获完成。在一些实施例中，两步法包括通过抗体/抗原细胞捕获完成的细胞分离。在一些实施例中，两步法涉及通过多种方法进行核酸检测，包括但不限于聚合酶链式反应、等温扩增、杂交检测和测序。在一些实施例中，所公开的两步法包括在病原体分离过程中洗涤样品，例如细胞，以减少/消除在核酸水平上纯化的需要。在一些实施例中，两步法包括多个步骤以浓缩病原体，例如病原体细胞和/或核酸，包括在表面上例如在柱中的珠子上分离病原体、细胞洗涤、细胞释放、细胞捕获在过滤器上、细胞释放。预期的是，表面可以在珠子、纤维、棒状粉末或能够用作基底的其他材料上。在一些实施方案中，表面，例如珠子表面，主要由已经针对适体或抗体附着进行修饰的材料组成，例如通过反应性功能性表面基团或功能性表面基团的组合(包括但不限于醇、醛、环氧化物、胺、通过
点击化学官能化、环状二烯和/或共价键)。在一些实施方案中，采用非共价连接。预期的是，官能化分子的表面附着可以通过本领域技术人员已知的方法建立(参见例如www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/oligo-modifications,sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/technical-report/attaching-oligos-to-solid-supports.pdf？sfvrsn＝47483407_6或www.gelest.com/wp-content/uploads/hydrophobicity-hydrophilicity_and_silane_surface_modification.pdf，每一个都以引用的方式整体并入，于2020年7月16日提供)。不溶性底物，例如不溶性珠子，可以用与细胞捕获剂反应的化学基团进行表面官能化。这些官能团包括但不限于醇、卤化物、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、苯甲酰氟、碘乙酰胺、2-硫代吡啶、重氮盐、芳胺、磷酸酯、酮、酰肼、环炔烃、三烷基卤代硅烷、三甲氧基卤代硅烷、三烷氧基卤代硅烷醛、环氧化物、胺、叠氮化物、炔烃、四嗪、马来酰亚胺、酯、硫醇、二硫化物、磺酰卤或酯。在一些实施方案中，适体、抗体或其他细胞捕获剂被修饰以包括反应性官能团，包括但不限于醇、卤化物、醛、环氧化物、胺、叠氮化物、炔烃、四嗪、马来酰亚胺、酯、硫醇、二硫化物、磺酰卤或酯，这样形成的共价键在细胞捕获和识别过程的后续步骤中不会断裂。细胞捕获剂的适当修饰取决于表面修饰，例如珠表面修饰。例如，用醇官能化的不溶性底物，例如不溶性珠，可以与修饰为包括酯或环氧化物的细胞捕获剂反应。类似地，用叠氮化物官能化的不溶性珠子可以与修饰为炔烃的细胞捕获剂反应，反之亦然。在一些实施方案中，进行改性以添加或增加聚合物中的羟基。在一些实施例中，使用一种或多种接头，例如硫醇、生物素/链霉抗生物素或点击化学。
[0166]
在一些示例中，所公开的两步法包括流通法。在一些实施方案中，从适体或抗体释放一种或多种捕获的活病原体通过使用等于或高于用于捕获一种或多种病原体的流速的流速进行。在一些实施方案中，释放一种或多种捕获的活病原体的流速与病原体捕获的流速相同。在一些实施方案中，释放一种或多种捕获的活病原体的流速比捕获一种或多种病原体的流速高至少2倍，例如约2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施方案中，释放一种或多种捕获的活病原体的流速比捕获的流速高至少10％，
[0167]
在一些实施例中，所公开的两步法涉及核酸检测，其中所检测的核酸是dna或rna中的一种或多种。在一些实施例中，所公开的两步法允许分离一种或多种不同的细胞类型，其中不同的细胞可以结合适体或抗体，并且其中使用多种不同的适体或抗体来分离不同的细胞。在一些实施例中，所公开的两步法可以检测多个核酸序列。例如，核酸提取之前可以在核酸提取之前从适体或抗体释放细胞。在一些实施例中，所公开的系统和方法涉及分离、洗涤、释放、提取、核酸检测的不依赖培养的过程。预期的是，导致释放捕获的病原体的条件可能取决于病原体(例如，目标)和适体或抗体(例如，探针)。例如，条件可以在相对中性的ph值下进行，例如在6.8和7.2的ph值之间，导致结合亲和力降低，从而有助于在非常高或非常低的ph值下释放细胞。在实施例中，释放缓冲液包括1m nacl、100mm edta、0.1％tween 20、0.05％sds、30mm nahco3、ph 10.3-10.4的组合。预期的是，也可以使用已知的适体或抗体释放方法(参见，例如，美国专利公开us20120258870，zhu等人，iet nanobio technol.2014mar；8(1)：2-9；bellaperche和derosa,pharmaceuticals 2018,11,80；doi:10.3390/phl 1030080，每一个都通过引用整体并入本文)。例如，适体释放可以通过操纵各种因素或因素组合来实现，包括但不限于温度(参见bellaperche和derosa,
pharmaceuticals 2018,11,80；doi:10.3390/phl 1030080，其在此通过引用并入用于此教导)、溶液组合物，例如ph(参见，zhu等人，iet nanobiotechnol.2014mar；8(1):2-9，其在此通过引用并入用于这些教导)，表面活性剂例如但不限于triton、聚山梨醇酯和其他物质，例如但不限于螯合剂，例如但不限于edta。例如，适体设计和选择(例如，通过selex或类似过程)将在接近中性ph值下进行，导致结合亲和力降低，有利于在非常高或非常低的ph值下释放细胞。在实施方案中，可以通过本领域技术人员已知的方法以及通过使用各种试剂和改变温度，例如改变温度(热)和/或溶液组成(例如，edta；asian j transfus sci.2013jan-jun；7(1):29-32.doi:10.4103/0973-6247.106727，其通过引用并入本文)来完成从抗体释放细胞。类似地，可以通过使用表面活性剂和螯合剂(例如但不限于edta)来促进细胞从各种表面(包括本文公开的底物)的释放。
[0168]
在一些实施例中，所公开的方法和系统利用由珠柱组成的预过滤器以在细胞分离阶段之前去除大颗粒。例如，预过滤器中的珠子包含与细胞分离阶段中较大的珠子相似或更小的尺寸。在一些实施例中，预过滤器和/或细胞分离阶段包含多种尺寸的珠子。在一些实施例中，预过滤器中的珠子具有不结垢的表面特性。在一些实施例中，预过滤器具有漏斗形部件。在一些实施例中，预过滤器还充当气泡捕集器以防止空气到达病原体隔离容器。在一些实施方案中，释放的细胞可以在作为储存器的排气式气泡捕集器中收集在液体中，并且在液体中的细胞流过过滤器以收集细胞之前用于去除空气。在一些实施例中，过滤器允许浓缩细胞并允许用溶液洗涤细胞以(从释放溶液中)减少或去除可能干扰或可能不干扰后续过程的物质。用于洗涤浓缩细胞的溶液主要是水并且可以包括或不包括表面活性剂，例如但不限于聚山梨醇酯20(例如0.1％ps20)。
[0169]
在一些实施方案中，气泡捕集器可包括至少一个入口端口、至少一个出口端口和通向空气的排放口。在一些实施方案中，排放口在入口端口之外。在一些实施方案中，气泡捕集器包括多个端口，其中之一是通向空气的排放口。通向空气的排放口是必需的并且是有利的，因为它允许气泡捕集器从随后的细胞流过过滤器中消除超过气泡捕集器的体积容量的空气体积。在实施方案中，排放口可以包含传感器(实施例包括液位传感器和气泡传感器)，其允许对泵入气泡捕集器的液体体积进行反馈控制。具有气泡捕集器的现有系统(参见，例如，美国专利第10,232,369号)由于其对空气的容量有限而不适用于本系统。这些现有的系统无法直接从气泡捕集器中排出空气，因此功能性空气容量受到体积的限制。先前的气泡捕集器也没有任何手段来确定气泡捕集器何时充满液体和/或核酸，包括在柱中的珠子上分离细胞、细胞洗涤、细胞释放、过滤器上的细胞捕获、细胞释放。本系统中的气泡捕集器通过包括空气排放口和允许反馈控制的传感器克服了先前系统的这些限制。
[0170]
参考图8，显示了示例性系统，其包括样品输入室8500、预过滤器8402、细胞捕获过滤器8403、裂解过滤器8404、废物收集器8502和pcr样品收集管8503中的第一个。该系统被插入到仪器中，该仪器包括许多另外的流体组件。共同形成流体回路。
[0171]
如图所示，所公开的系统包括选择阀8202，例如三通阀。样品输入室8500连接到仪器上的泵8102，泵连接到仪器上的公共端口8202。在操作中，端口8202通常处于打开位置并连接到仪器上的洗涤缓冲液储存器8300和仪器上的卫生缓冲液储存器8301，并用于在卫生缓冲液储存器8301和洗涤缓冲液储存器8300之间进行选择。
[0172]
在公开的系统中，8501的输出连接到仪器上的泵8101，然后在进入装置上的预过
滤器8402之前连接到管式热交换器8501。预过滤器的输出连接到预过滤器旁通阀8200的公共端口。在运行中，端口8202通常处于关闭位置并连接到入口8401。在运行中，预过滤器旁通阀8200的端口连接到阀8201的常开端口。阀8201的常闭端口连接到蠕动泵8103。8103的入口连接到释放缓冲液储存器8302。阀8201的公共端口连接到细胞捕获过滤器8403。
[0173]
在一个实施方案中，8403的输出连接到阀8203的公共端口。8203的常开端口连接废物储存器8502。8203的常闭端口连接到裂解过滤器8404的底部。8404的顶部连接到阀8204的常开端口。8204的常闭端口连接到废物储存器8502。8204的常开端口连接到注射泵104。8104的出口也连接到阀8205的公共端口。阀8206的常开端口连接到裂解缓冲液储存器8303。阀8206的常闭端口对过滤空气入口8504打开。阀8205的常闭端口连接到阀8207。8207端口的出口连接到8404的出口。pcr样品收集管8503也连接到8404的底部。
[0174]
在使用中，所公开的系统可以在使用之前或作为第一次使用的一部分用缓冲液进行灌注。检测和监测的示例性方法包括在加载样品之前预过滤和捕获柱调节。阀8200、8201、8202和8203未通电。泵8102通电，从洗涤缓冲液储存器8300中抽取流体通过阀8202并进入样品储存器8500。泵8102继续泵送，从洗涤缓冲液储存器8300中抽取流体通过阀8202进入样品容器8500。泵8101继续泵送，从样品装载储存器8500抽取流体，并进入管道冷却热交换器8501、阀8200、阀8201、细胞捕获柱8403、阀8203和废物储存器8502。停止泵8102。
[0175]
在示例性实施方案中，该方法包括装载样品以及捕获细胞。例如，将样品装载到样品装载室8500中。阀8200、8201、8202和8203不通电。泵8101通电，从样品装载储存器8500抽取流体，并进入管道冷却热交换器8501、预过滤器8402、阀8200、阀8201、细胞捕获柱8403、阀8203和废物储存器8502。大颗粒被捕集在前置过滤器。靶细胞在细胞捕获柱8403中被捕获。
[0176]
在示例性实施方案中，该方法包括从样品装载室冲洗剩余样品。阀8200、8201、8202和8203未通电。泵8102通电，从洗涤缓冲液储存器8300抽吸流体通过阀8202并进入样品储存器8500。泵8101通电，从样品装载储存器8500抽吸流体，并进入管道冷却热交换器8501、预过滤器8402、阀8200、阀8201、细胞捕获柱8403、阀8203和废物储存器8502。
[0177]
在示例性实施方案中，该方法包括洗涤捕获的细胞以去除pcr抑制剂和引入气隙以防止缓冲液混合。在该方法的一些实施方案中，阀8201、8202和8203未通电。阀8200通电以绕过预过滤器。泵8102继续泵送，从洗涤缓冲液储存器8300抽吸流体通过阀8202并进入样品储存器8500。泵8101继续泵送，从样品装载储存器8500抽吸流体，并进入管道冷却热交换器8501、阀8200、阀8201、细胞捕获柱8403、阀8203和废物储存器8502。泵8102停止。泵8101继续泵送，样品装载储存器8500中的流体被去除，空气被拉过泵8101、管冷却热交换器8501、阀8200和阀8201以产生气隙。泵8101停止。该方法包括引入足以(1)防止或大大减少缓冲液组分的混合(因为当混合缓冲液时释放性能劣化)并促进从捕获柱中有效释放的气隙。在一些实施例中，创建小于5ml的气隙，例如在1ml至5ml之间、在2ml至4ml之间、在3ml至5ml之间、在1ml至3ml之间，包括大约1ml、2ml、3ml、4ml和5ml。预期的是，气隙可以随捕获柱的尺寸(直径和/或长度)缩放。例如，在一些实施方案中，系统和方法中使用的管道直径约为1/8英寸，并且引入的气隙小于5ml，例如在1ml至5ml之间、在2ml至4ml之间、在3ml至5ml之间、在1ml至3ml之间、在2ml至3ml之间，包括约1ml、2ml、3ml、4ml和5ml。在一些实施方案中，气隙足以产生大于10％、大于20％、大于30％，例如在10％至40％之间、在20％至40％之
间、在30％至40％之间、在30％至50％之间或更多的释放效率。
[0178]
在一些实施例中，将单个气隙引入系统中。在一些实施例中，多于一个气隙被引入到系统中，例如与一个较大气隙相比的几个较小气隙。
[0179]
在一个示例性实施方案中，该方法包括捕获释放的细胞并捕集在裂解过滤器中。阀8201、8203和8204通电并启动泵8103。泵8103从释放缓冲液储存器8302抽吸流体，通过阀8201、捕获柱8403、阀8203、裂解过滤器8404、阀8204，并进入废物储存器8502。泵8103停止。细胞被捕集在裂解过滤器8404中。
[0180]
在一个示例性实施方案中，该方法包括用裂解缓冲液交换缓冲液，然后除去缓冲液。阀8204通电，阀8203和8205不通电。抽出注射泵8104，将裂解缓冲液从裂解缓冲液储存器8303拉出，通过阀8206和阀8205进入注射泵8104。阀8204和8205通电，阀8207打开，阀8203不通电。注射泵8104被清洗，从注射泵8104推动裂解缓冲液，通过阀8205和8207，通过裂解过滤器的底部，通过阀8204并进入废物储存器8502。阀8205不通电。阀8204和8206通电。注射泵8104被抽出，从进气口8504抽出空气，通过阀8206和阀8205，并进入注射泵8104。阀8204、8205通电并且阀8207打开。注射泵8104被吹扫，从注射泵8104推动空气，通过阀8205和8207，通过裂解过滤器的底部，通过阀8204并进入废物储存器8502。
[0181]
在一个示例性实施方案中，该方法包括回流裂解缓冲液以将细胞释放到可移除的pcr管中。阀8205未通电。阀8204和8206通电。注射泵8104被抽出，从进气口8504抽出空气，例如大约950μl的空气从进气口8504通过阀8206和阀8205，并进入注射泵8104。阀8204被通电并且阀8203、8205、8206和8207未通电。抽出注射泵8104，从裂解缓冲液储存器8303中拉出裂解缓冲液，例如从裂解缓冲液储存器8303中拉出大约50μl的裂解缓冲液，通过阀8206和8205进入注射泵8104。阀8205通电并且阀8203、8204和8207未通电。注射泵8104被吹扫，推动裂解缓冲液，随后是空气通过阀8204，通过裂解过滤器8404的顶部并进入可移除的pcr管8503。
[0182]
在一些实施方案中，该方法包括任选的清洁过程。对于任选的清洁过程，插入清洁盒并为阀8200、8202通电。泵8101和8102通电，将卫生缓冲液从卫生容器8301吸入样品装载储存器8500和从样品装载储存器8500抽吸到管道冷却热交换器8501、预过滤器8402、阀8200、阀8201、细胞捕获柱8403、阀8203和废物储存器8502。
[0183]
参考图9，显示了示例性系统，其包括样品输入源，样品输入源可以是临时或永久袋或储存器9500、样品输入袋吸管9501、预过滤器9402、细胞捕获过滤器9403、裂解过滤器9404、废物收集器9503、气泡捕集器9504和pcr样品收集管9505。该系统被插入到仪器中，该仪器可以包括许多另外的流体部件。共同形成流体回路。
[0184]
如图所示，所公开的系统包括样品袋9500内的样品输入袋吸管9501，其连接到泵9102，泵9102连接到管式热交换器9502的输入端。使用选择阀9206(例如三通阀)在仪器上的清洗溶液储存器9300和仪器上的卫生溶液储存器9301之间进行选择。未通电时处于打开位置的选择阀通常处于打开位置以节省电力并减少热量。阀9206的公共端口连接到泵9101，泵9101在通过液体传感器9702之后与泵9102一起连接到管式换热器9502的输入端。
[0185]
在所公开的系统中，管式热交换器9502的输出连接到预过滤器9402的输入和阀9200的一个端口。阀9200用于在管式热交换器9502的输出和装置上的预过滤器9402的输出之间进行选择。阀9201用于在阀9200的公共端口和泵9103的输出之间进行选择。泵9103的
输入连接到阀9202的公共端口。阀9202在过滤空气供应源9601和阀9204的公共端口之间进行选择。阀9204在细胞释放溶液储存器9302和洗涤溶液储存器9303之间进行选择。阀9201的公共端口连接到细胞捕获过滤器9403。
[0186]
在一个实施方案中，9403的输出连接到阀9203的公共端口。9203的常开端口连接废液容器9503。9203的通常关闭端口连接到气泡收集器9504的输入。裂解溶液储存器9306连接到泵9105并且泵9105连接到气泡捕集器9504的输入。过滤空气供应源9602在通过液体传感器9701后连接到气泡捕集器9504的输入。气泡捕集器9504的输出连接到阀9208并由阀9208调节，该阀连接到裂解过滤器9404的底部。裂解过滤器9404的顶部连接到泵9104。泵9104连接到阀9205的公共端口。阀9205在裂解溶液储存器9304和阀9208的公共端口之间进行选择。阀9208在废物储存器9305和过滤空气供应源9603之间进行选择。
[0187]
在初次使用之前，在使用之间的系统存储之前，或在使用之后，公开的系统可以在后续使用之前用溶液消毒。示例性方法涉及使用清洁盒、样品袋和吸管以及卫生溶液以允许清洁盒部件之间的所有连接并清洁气泡捕集器而不会对分析盒产生不利影响。阀9200、9201、9203和9207未通电。阀9206通电。泵9101和泵9102通电，从卫生溶液储存器9301抽取流体通过阀9206并经由吸管9501进入样品袋或储存器9500。泵9102停止。泵9101继续泵送，将流体从卫生溶液储存器9301抽吸通过阀9206，抽吸到管道冷却热交换器9502中，进入清洁盒预过滤器9402，通过阀9200、阀9201、细胞捕获柱9403、阀9203并进入废物储存器9503。泵9101停止。阀9200和9203通电(对预过滤器旁路备用路径进行消毒)。泵9101继续，移动卫生溶液通过卫生试剂盒交替路径，通过常闭阀9200端口，通过常闭阀9203端口到达气泡捕集器9207，直到传感器9701检测到气泡捕集器已满。泵9101停止。阀9203、9206和9207通电。阀9200未通电。
[0188]
在系统中卫生溶液的规定接触时间之后，使用对细胞不具有杀菌或其他致死特性并且不会对系统造成污染风险的溶液冲洗卫生溶液以从系统中完全去除。这些溶液包括洗涤缓冲液、裂解溶液和水。
[0189]
在示例性方法中，使用泵9104从气泡捕集器中去除卫生溶液。通过相同的流动路径冲洗来自储存器9300的洗涤缓冲液以去除卫生溶液，包括两次完全填充气泡捕集器9504并通过阀9207和清洁盒“裂解过滤器”路径排出。示例性的冲洗方法涉及使用清洁盒、样品袋和吸管以及洗涤缓冲液以允许冲洗盒部件之间的所有连接并冲洗气泡捕集器而不会对分析盒产生不利影响。阀9200、9201、9203、9206和9207未通电。泵9101和泵9102被供电，通过阀9206从洗涤缓冲液储存器9300抽出流体并经由吸管9501进入样品袋或储存器9500。泵9102停止。泵9101继续泵送，将流体从洗涤缓冲液储存器9300抽吸通过阀9206，进入管道冷却热交换器9502中，进入清洁盒预过滤器9402，通过阀9200、阀9201、细胞捕获柱9403、阀9203并进入废物储存器9503。泵9101停止。阀9200和9203通电(冲洗预过滤器旁路备用路径)。泵9101继续，移动洗涤缓冲液通过清洁盒备用路径，通过常闭阀9200端口，通过常闭阀9203端口到气泡捕集器9207，直到传感器9701检测到气泡捕集器已满。泵9101停止。阀9203、9206和9207通电。阀9200未通电。
[0190]
监测废物储存器以在废物储存器超过容量之前及时清空废物储存器。在消毒和消毒后冲洗后，可以使用不是分析试剂盒的卫生试剂盒对系统进行灌注。
[0191]
在示例性实施方案中，泵9103能够以细胞释放流速泵送，细胞释放流速是比泵
9102提供的细胞捕获流速更高的流速。
[0192]
灌注
[0193]
在使用中，公开的系统可以在使用之前或作为第一次使用的一部分用溶液灌注。示例性方法涉及使用不同的试剂盒和不同的样品袋和吸管进行灌注，例如用于消毒的试剂盒、样品袋和吸管，以允许对细胞释放溶液进行灌注，同时对细胞捕获过滤器产生不利影响，并灌注气泡捕集器和裂解过滤器之间的连接，而不会对裂解过滤器产生不利影响。
[0194]
安装合适的试剂盒后，对系统进行灌注可包括使用泵9103从阀9204通过阀9202直至阀9201的常闭端口冲洗细胞释放缓冲液。泵9103通过阀9204、阀9202、阀9201、阀9203和废物储存器9503从清洗溶液储存器9303抽取流体。在灌注其余管线之前进行此灌注步骤是有利的，以允许后续灌注步骤将细胞释放溶液完全冲出系统并改为用细胞分离溶液填充管线。阀9200、9201、9203和9206未通电。泵9101和泵9102通电，通过阀9206从清洗溶液储存器9300抽取流体并经由吸管9501进入样品储存器9500。泵9102停止。泵9101继续泵送，通过阀9206从清洗溶液储存器9300抽取流体，并进入管道冷却热交换器9502，进入预过滤器9402、阀9200、阀9201、细胞捕获柱9403、阀9203和废物储存器9503。泵9101停止。阀9201、9202、9204通电。阀9203未通电。泵9103通过阀9204、阀9202、阀9201、阀9203和废物储存器9503从清洗溶液储存器9303抽吸流体。在示例性实施方案中，泵9103能够以细胞捕获流速泵送，该细胞捕获流速是比由泵9102提供的细胞捕获流速高的流速。
[0195]
分析试剂盒调节
[0196]
在系统灌注之后，检测和监测的示例性方法包括安装未使用的分析试剂盒，并且包括在装载样品之前进行预过滤器和捕获柱调节。
[0197]
分析试剂盒的安装
[0198]
在移除用于安装分析试剂盒的清洁/灌注盒之前，为阀9207通电以维持阀9207和裂解过滤器9404之间的系统灌注。正确的分析试剂盒从外包装中取出并安装到正确的、灌注好的系统托架中，并提示系统验证正确的试剂盒。安装正确的试剂盒后，所有阀均未通电。安装样品袋并附上样品吸管。在分析之前，系统会验证舱室温度和所有试剂溶液储存器的就绪状态。如果系统未准备好，则中继适当的消息。
[0199]
调节
[0200]
在实施方案中，使用泵9101在低流速下的前半部分用于调节预过滤器和细胞分离过滤器。阀9200、9201、9203和9206未通电。泵9101通电以使15ml流体以10ml/min从洗涤溶液储存器9300流过预过滤器9402和细胞分离过滤器9403，并且流过液被收集在废物储存器9503中。泵9101停止。第二步使用泵9103以大约两倍或三倍的流速仅通过细胞分离过滤器(不包括预过滤器)。在示例性实施方案中，泵9103能够以作为通常比泵9102提供的细胞捕获流速更高的流速的细胞释放流速(可能小于或大于30ml/min)泵送。在实施方案中，细胞分离过滤器9403的第二调节步骤的流速与用于预期细胞释放的流速相同。在一些实施方案中，细胞分离过滤器9403的第二调节步骤，流动的液体与用于细胞捕获的液体相同。在实施方案中，用于调节细胞分离过滤器和用于细胞释放的流速可以高于用于细胞分离的流速(例如，以930ml/min流动15ml流体)。阀9201、9202和9204通电。为了调节细胞分离过滤器9403，泵9204(其可以是蠕动的、注射器的、隔膜的或其他的)将细胞分离溶液从储存器9303通过阀9201和细胞分离过滤器9403通过阀9203移动到废物储存器9503。
[0201]
样品装载：
[0202]
在示例性实施方案中，在分析试剂盒安装之后，该方法包括装载样品并仅捕获活细胞。例如，将样品作为样品袋装载到样品装载室9500中。样品吸管9501安装在阀9200中，9201和9203未通电。泵9101通电。用于食品病原体分析等应用的样品量可能太大而无法实际放入一次性试剂盒中。因此，在分析从外部样品储存器装载的样品后，必须对仪器进行消毒。
[0203]
在一些实施例中，创建了气隙。在实施方案中，产生气隙以减少和/或防止缓冲剂组分的混合，因为当缓冲剂混合时释放性能恶化(例如，释放效率下降到小于13％而没有间隙相对于大于40％而具有大约3ml气隙)。其次，气隙允许细胞从捕获柱中高效释放，因为气隙“机械地”有助于从捕获柱中高效释放。在实施方案中，气隙由一系列小间隙产生。在实施方案中，气隙是连续气隙。在一些实施例中，创建小于5ml的气隙，例如单个气隙，例如在1ml至5ml之间、在2ml至4ml之间、在3ml至5ml之间、在1ml至3ml之间，包括约1ml、2ml、3ml、4ml和5ml。预期的是，气隙可以随捕获柱的尺寸(直径和/或长度)缩放。例如，在一些实施方案中，系统和方法中使用的管道直径约为1/8英寸，并且引入的气隙小于5ml，例如在1ml至5ml之间、在2ml至4ml之间、在3ml至5ml之间、在lml至3ml之间、在2ml至3ml之间，包括约1ml、2ml、3ml、4ml和5ml。在一些实施方案中，气隙足以产生大于10％、大于20％、大于30％，例如在10％至40％之间、在20％至40％之间、在30％至40％之间、在30％至50％之间或更多的释放效率。
[0204]
在示例性实施方案中，该方法包括用裂解缓冲液交换缓冲液，然后除去缓冲液。
[0205]
在示例性实施方案中，该方法包括回流裂解缓冲液以将细胞释放到可移除的pcr管中。泵9104从气泡捕集器9504抽出空气。抽出注射泵9104，从裂解缓冲液储存器9303抽出裂解缓冲液，例如从裂解缓冲液储存器9303抽出大约50pl的裂解缓冲液，通过阀9206和9205进入注射泵9104。阀9205通电，阀9203、9204和9207未通电。注射泵9104被吹扫，推动裂解缓冲液，随后是空气通过阀9204，通过裂解过滤器9404的顶部并进入可移除的pcr管9503。
[0206]
在一些实施方案中，该方法包括任选的清洁过程。对于任选的清洁过程，插入清洁盒并为阀9200、9202通电。为泵9101和9102通电，将清洁缓冲液从清洁储存器9301吸入样品装载储存器9500并且从样品装载储存器9500抽吸到管道冷却热交换器9501、预过滤器9402、阀9200、阀9201、细胞捕获柱9403、阀9203和废物储存器9502。
[0207]
适体的二级结构参与结合靶标，因为各种折叠允许适体利用各种结合机制，例如疏水性、分子形状互补性、静电、电荷-偶极子或氢键合。解链温度(tm)定义为50％的互补碱基以双链状态杂交且50％的碱基以单链状态解离的温度。为了使靶细胞与适体特异性结合，测定温度应低于解链温度，以确保适当形成、稳定的适体结构。许多因素影响核酸链的解链温度，包括链的长度和gc含量、一价离子(钠、钾、tris)、镁离子和常用的变性剂，如甲酰胺和dmso。
[0208]
适体选择通常使用一种称为指数富集配体系统进化(selex)的技术来完成。通过选择和复制的循环获得目标特异性序列。包含具有特定长度的序列的库与靶分子一起温育。这种温育导致具有最高亲和力的适体与靶分子结合。在此过程中，仅选择与目标化合物结合的核酸并进行复制，而其他核苷酸则从序列库中移除。可以为分子、细菌、病毒和细胞
生成特定的适体。selex过程通常在室温下使用lxpbs(磷酸盐缓冲盐水)缓冲液进行，例如含有137mm nacl、2.7mm kcl、8.1mm na2hpo4、1.76mmkh2po4的缓冲液。预期的是，可以使用其他缓冲液，例如由50mm tris、150mm nacl、5mm mgcl2、1mm edta组成的tris-hcl。选择缓冲液组合物以确保适当的适体杂交，这通常会产生大约160mm的单价阳离子的当量。在一些实施方案中，用于结合细胞的缓冲液与selex过程中使用的缓冲液相同，以使特异性结合最大化。例如，所有适体过程都在如上所述的lxpbs缓冲液或tris-hcl缓冲液中进行。
[0209]
发明人已经发现，通过改变缓冲溶液，适体结合可以偏向于有利于活细菌细胞而不是死细菌细胞。例如，在一个实施方案中，该方法使用0.2xpbs，然后将2mm镁添加到缓冲液中，并将温度降低到11摄氏度。这些条件有利于适体结合活细胞，而不是死细胞。检测到死细胞将被视为假阳性。在一些实施方案中，少于1％的检测到的细胞是死的，例如在1％至0.5％、0.5％、0.1％、0.01％和0％之间，包括0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％检测到的细胞是死的。
[0210]
在一个具体实施方案中，该系统利用样品处理、靶向适体细胞捕获、rrna提取和rt-pcr或等温扩增来满足包括样品大小、样品收集方法、活细胞分析、敏感性和特异性在内的行业需求。
[0211]
在其他实施方案中，细胞分离通过抗体/抗原细胞捕获来完成。
[0212]
所公开的系统和方法能够对多种介质中的细菌、病毒和真菌细胞进行多重分析，包括但不限于食品工业样品、饮用水、废料、工业液体、土壤样品、水生生物群落样品以及临床和兽医样品，这可能包括血液、痰液、粪便、肠道和器官。从食品工业的环境样品等复杂基质中分离靶细胞可能具有挑战性。过滤不能有效分离许多非临床样品基质中的少量靶细胞。与靶细胞(例如粘土)大小基本相同的颗粒以及大量非靶细胞可能会淹没过滤器。此外，基于大小的分离缺乏确保给定核酸扩增区域对目标生物体唯一所需的特异性。在许多应用中，样品量可能会有很大差异。需要一种在存在大量非靶细胞和其他类似大小的物质的情况下从不同体积的样品中分离靶细胞的新方法。所公开的系统被设计成通过使样品流过靶细胞结合表面的曲折路径来最大化靶细胞的捕获效率。这允许样品中不受欢迎的小颗粒不受阻碍地通过，并最大限度地增加靶细胞与表面结合的机会。它还允许在大样品中快速捕获少量细胞，并且无需人工干预即可廉价执行。在实施方案中，所公开的系统使用与用于分离靶细菌的适体亲和纯化不同的捕获柱。适体亲和纯化的应用于1999年首次报道用于l-选择素-免疫球蛋白融合蛋白(romig等人，j.chromatogr.b.1999；731(2)：275-284)。所公开的系统使用包含直径大约为100微米的玻璃珠的捕获柱。所公开方法的一些优点包括通过洗涤柱中的细胞去除扩增过程的抑制剂、释放细胞以及使用过滤器进一步浓缩细胞以将液体体积减少至20-50ul。此外，实施方案中公开的系统和方法在捕获柱之前添加过滤柱，该过滤柱包含与捕获柱尺寸相似的珠子以从样品中去除大颗粒。尽管使用小颗粒(例如sio2)作为过滤器的概念至少可以追溯到印度的3世纪或4世纪，当sushruta samhita建议通过沙子和粗砾石过滤水时，但所公开的系统却截然不同。以前的系统用于水净化，因此旨在阻止所有颗粒的通过，包括细菌细胞。所公开的系统被设计成允许特定物质(例如细菌)通过。它在过滤柱中使用珠子的独特组合，然后是珠子捕获柱，其中过滤柱中的珠子包含与捕获柱中的珠子相似或更小的尺寸。应该注意的是，过滤柱和捕获柱都可以包含多种尺寸的珠子。
在一些实施方案中，过滤柱中的最小珠子与捕获柱中的捕获珠子尺寸相同或更小。过滤柱珠具有不结垢的表面化学性质。在一些实施方案中，所公开的系统在过滤珠上使用与捕获柱珠相似或相同的表面化学性质。在一些实施方案中，所公开的系统和方法允许绕过过滤柱以实现捕获柱中细胞的有效洗涤和释放。在一些实施方案中，所公开的系统包括过滤柱，该过滤柱为漏斗形以最大化输入处非常大颗粒的过滤负载能力并提供长过滤路径以捕获较小颗粒。在食品安全测试中，经常使用过滤混合袋，例如nasco whirl-pak b01385w，它具有孔径为330微米的大膜过滤器。然后使用过滤柱过滤掉小于330μm但足够大以免通过捕获柱中100μm珠子之间的间隙的颗粒。过滤柱中的珠子必须不大于过滤柱中的珠子，以确保通过过滤柱的任何物质都可以通过捕获柱。
[0213]
所公开的流通过程用诸如dna适体或抗体之类的适体捕获食源性病原体。例如，该系统包含高效过程，可快速分离、洗涤、释放和浓缩细胞，提取核糖体rna(rrna)，并提供约40μl的无抑制剂样品体积，用于核酸扩增分析，无需纯化提取后的rna。大多数核酸扩增过程依赖于核酸提取后的纯化以去除抑制剂。由于纯化过程中的稀释和/或损失，核酸纯化导致特异性丧失。所公开的系统设计用于检测少量细胞和非常少的核酸拷贝。所公开的系统在细胞水平上纯化测定以消除对核酸纯化的需要。
[0214]
为了使转移损失最小化，在一些实施方案中，所公开的系统和方法在用于核酸扩增的相同容器中从细胞中提取核酸。腔室在装载细胞之前密封，因此扩增试剂和裂解珠在运输过程中不会丢失，并且腔室在核酸扩增之前再次密封，以最小化或避免容器转移到扩增装置时和核酸扩增期间溢出造成的损失以尽量减少或避免蒸发损失。在一些实施例中，为了将细胞引入腔室，所公开的系统使用隔膜中的非取芯针和用于空气的任选的第二非取芯针以在液体被引入腔室时释放压力。
[0215]
在一些实施方案中，所公开的系统和方法使用优选由钇稳定的氧化锆制成的珠子，通过使用超声处理进行的机械裂解来进行核酸提取。钇稳定的氧化锆非常坚硬，具有大约6g/cm3的高密度。核酸扩增通常使用20ul至40ul的液体体积进行。可以使用更大的体积，但会增加试剂的成本。为了激发珠子，所公开的系统和方法使用与腔室机械连接的超声换能器。
[0216]
在一些实施方案中，该方法和系统允许确定与活细胞结合与死细胞结合相关的适体/表位组合。在一些实施例中，该方法和系统在适体选择过程中考虑了活细胞捕获与死细胞捕获。例如，所公开的方法和系统在具有活细胞和死细胞的selex过程中利用所公开的缓冲条件来找到所需的适体/表位组合。在其他实施例中，所公开的方法和系统在selex过程中使用两种或更多种不同的缓冲条件。预期的是，其他过程可用于适体选择。
[0217]
在一些实施方案中，提供了用于将来自食品工业样品的样品收集袋上的机器可读代码自动链接到样品分析结果的系统和方法。在一些实施方案中，机器可读代码是光学条形码。在一些实施方案中，该方法包括样品收集袋上的机器可读代码；用于桨式混合样品的袋子上的机器可读代码；用于样品分析的试剂盒上的机器可读代码；确定样品分析结果的方法；以及数据库，用于将样品收集袋上的机器可读代码自动链接到样品分析。在一些实施方案中，样品收集袋和用于桨式混合样品的袋是同一袋。在一些实施方案中，样品收集袋上的机器可读代码可以与样品收集位置、样品收集时间、样品类型和其他样品细节中的一个或多个相关联。在一些实施方案中，试剂盒上的机器可读代码可以与该试剂盒的分析类型
以及试剂盒类型、唯一标识符、制造数据(例如日期和位置)以及有效期中的一项或多项相关联。在一些实施方案中，可以从数据库获得特定的试剂盒细节，例如用于分析的使用数据可行性。在一些实施方案中，该信息确认所选试剂盒是否可以处理所需样品。在一些实施方案中，试剂盒上的机器可读代码是电子的并且可以由诸如诊断试剂盒分析系统的多个装置读取和写入。
[0218]
在一些实施方案中，链接样品收集袋上的机器可读代码的数据库驻留在本地计算机上或可从计算机网络访问的服务器上。在一些实施方案中，样品收集信息与试剂盒上的机器可读代码相关联。在一些实施方案中，样品收集信息与试剂盒上的机器可读代码相关联，以确认试剂盒能够执行分析，包括确定试剂盒已被配置为分析的病原体或传染性试剂的类型；以及确定试剂盒的生存能力，例如使用年限和试剂盒之前是否已使用过。在一些实施方案中，食品工业样品是食品或食品加工环境样品中的一种或多种。在一些实施方案中，食品工业样品在分析之前与超过25毫升的水溶液进行桨式混合。
[0219]
在一些实施方案中，将吸管放置在样品收集袋中，并在负压下从样品收集袋中取出样品，例如使用蠕动泵。泵从袋子中抽取样品。在一些实施方案中，液位传感器感测何时检测到液体的末端。在一些实施方案中，样品收集袋包含过滤器以去除大颗粒。在一些实施例中，从袋子中抽取的液体的体积可以基于诸如流速和时间等因素来确定。在一些实施方案中，从袋中抽出的液体量可用于确定是否从袋中抽出足够体积的液体。
[0220]
在一些实施方案中，病原体分离发生在低于或高于样品温度的温度下，例如在9℃至12℃之间，以便仅分离活细胞。在一些实施方案中，将样品施加到管道热交换器以在病原体分离之前冷却或加热样品温度。在一些实施方案中，热交换器包含一个或多个具有导热特性的流动路径，例如不锈钢，其中通过管的样品被冷却或加热到周围温度。在一些实施方案中，热交换器由诸如热电装置的热连接装置加热或冷却。在一些实施方案中，热交换器在绝热的空气或液体容器内，并且容器内的温度通过制冷或加热系统加热或冷却。在一些实施例中，该系统包括一个或多个恒温器以实现和维持期望的操作温度。在一些实施例中，系统在温度受控环境中运行。在一些实施方案中，热交换器具有足够的热容量以在捕获流速下将样品体积平衡到指定温度范围内以仅捕获活细胞。
[0221]
四、示例性计算机环境
[0222]
i.示例云计算环境
[0223]
图10描绘了其中可以实现所描述的技术的示例云计算环境1000。云计算环境1000包括包含资源和提供服务的计算云1090。计算云1090可以包括各种类型的云计算资源，例如计算机服务器、数据存储库、网络资源等等。计算云1090可以位于中央(例如，由企业或组织的数据中心提供)或分布式(例如，由位于不同位置的各种计算资源提供，例如不同的数据中心、实验室、机构和/或位于在不同的城市或国家)。
[0224]
计算云1090可以可操作地连接到各种类型的计算装置，例如计算装置1012、1014和1016，并且可以向其提供一系列计算服务。计算装置1012、1014和1016中的一个或多个可以是计算机(例如，服务器、虚拟机、嵌入式系统、台式机或膝上型计算机)、移动装置(例如，平板计算机、智能手机或可穿戴装置)或其他类型的计算装置。计算云1090与计算装置1012、1014和1016之间的连接可以通过有线、无线或光链路或其任何组合进行，并且可以是短暂的或持久的。这些连接可以是静止的，也可以随时间移动，在不同的路径上实现，并且
在每一端具有不同的连接点。计算装置1012、1014和1016也可以相互连接。
[0225]
计算装置1012、1014和1016可以利用计算云1090来获得计算服务并执行计算操作(例如，数据处理、数据存储等)。特别地，用于执行所描述的创新技术的软件1080可以驻留在计算云1090中、计算装置1012、1014和1016中，或者云和计算装置的分布式组合中或在其中执行。
[0226]
ii.广义计算机环境
[0227]
图11图示了合适的计算系统1100的一般化实施例，其中可以根据所公开的技术来实现所描述的实施例、方法和技术，包括所公开系统的构造、部署、操作和维护。计算系统1100并非旨在暗示对本公开的使用范围或功能的任何限制，因为这些创新可以在不同的通用或专用计算系统中实现。
[0228]
参考图11，计算环境1110包括一个或多个处理单元1122和存储器1124。在图11中，该基本配置1120包括在虚线内。处理单元1122执行计算机可执行指令，例如用于实施本文描述的用于对本文描述的病原体进行识别、监测和定量的任何方法或对象。处理单元1122可以是通用中央处理单元(cpu)、专用集成电路(asic)中的处理器或任何其他类型的处理器。在多处理系统中，多个处理单元执行计算机可执行指令以增加处理能力。计算环境1110还可以包括图形处理单元或协处理单元1130。有形存储器1124可以是易失性存储器(例如，寄存器、高速缓存或ram)、非易失性存储器(例如，rom、eeprom或闪存)或它们的某种组合，可由处理单元1122、1130访问。存储器1124以适合由处理单元1122、1130执行的计算机可执行指令的形式存储实现本文描述的一个或多个创新的软件1180。存储器1124还可以存储配置数据、树结构信息、包括结构表、数据表、工作表、改变日志、输出结构、输入向量、输出向量、索引或标志的表，以及其他配置和操作数据。
[0229]
计算系统1110可以具有附加特征，例如存储装置1140、输入装置1150、输出装置1160或通信端口1170中的一个或多个。诸如总线、控制器或网络的互连机制(未示出)将计算环境1110的组件互连。典型地，操作系统软件(未示出)为在计算环境1110中执行的其他软件提供操作环境，并协调计算环境1110的组件的活动。
[0230]
有形存储装置1140可以是可移动的或不可移动的，并且包括磁盘、磁带或盒式磁带、cd-rom、dvd或任何其他可以用于以非临时方式存储信息并且可以在计算环境1110内访问的介质。存储装置1140存储实现这里描述的一个或多个创新的软件1180的指令(包括指令和/或数据)。
[0231]
输入装置1150可以是机械的、触摸感应的或接近感应的输入装置，例如键盘、鼠标、笔、触摸屏、轨迹球、语音输入装置、扫描装置或提供输入到计算环境1110的其他装置。输出装置1160可以是显示器、打印机、扬声器、光盘刻录机或从计算环境1110提供输出的另一装置。
[0232]
通信端口1170能够通过通信介质与另一个计算装置进行通信。通信介质传送信息，例如计算机可执行指令或已调制数据信号中的其他数据。已调制数据信号是这样一种信号，它的一个或多个特征被设置或改变的方式是在信号中编码信息。作为示例而非限制，通信介质可以使用电、光、rf、声学或其他载体。
[0233]
在一些实施例中，计算机系统1100还可以包括计算云1190，其中执行实现所公开技术的全部或部分的指令。存储器1124、存储装置1140和计算云1190的任何组合可以用于
存储所公开技术的软件指令和数据。
[0234]
本发明可以在计算机可执行指令的一般上下文中描述，例如包括在程序模块中的指令，在目标真实或虚拟处理器上的计算系统中执行。通常，程序模块或组件包括执行任务或实现特定抽象数据类型的例程、程序、库、软件对象、类、组件、数据结构等。在各种实施方案中，程序模块的功能可以根据需要在程序模块之间进行组合或拆分。程序模块的计算机可执行指令可以在本地或分布式计算系统内执行。
[0235]
术语“系统”、“环境”和“装置”在本文中可互换使用。除非上下文另有明确指示，否则这些术语均不暗示对计算系统、计算环境或计算装置类型的任何限制。通常，计算系统、计算环境或计算装置可以是本地的或分布式的，并且可以包括专用硬件和/或通用硬件和/或虚拟化硬件的任何组合，以及实现本文所述功能的软件。虚拟处理器、虚拟硬件和虚拟化装置最终体现在硬件处理器或其他形式的物理计算机硬件中。
[0236]
在一些具体实施方案中，智能手机、平板电脑、膝上型计算机或其他计算装置具有扫描或输入链接到样品收集袋的条形码信息的能力。在一些实施方案中，可以以光学或电子方式扫描条形码。在一些实施方案中，计算装置将条形码数据传输到样品收集数据库，包括与样品和/或样品收集有关的元数据，例如样品收集位置、样品收集时间、样品类型和环境条件。
[0237]
在一些实施方案中，样品在收集之后被进一步处理，例如使用桨式搅拌器，并且计算装置将样品收集袋上的条形码数据传输到样品数据库，样品数据库包括与样品处理相关的数据。
[0238]
在一些实施方案中，与具有机器可读代码的试剂盒的制造有关的试剂盒数据被提供给试剂盒数据库。在一些实施方案中，试剂盒数据可以与试剂盒能够分析的病原体和样品类型相关联。在一些实施方案中，试剂盒数据可以与试剂盒制造信息、试剂盒存储信息、试剂盒生存力或试剂盒寿命中的一项或多项相关联。在一些实施方案中，试剂盒数据可以与与先前试剂盒使用的类型的数量有关的数据相关联。
[0239]
在一些实施方案中，在分析样品之前比较样品收集数据库和试剂盒数据库。在一些实施方案中，在比较样品收集数据库和试剂盒数据库之后，可以改变分析参数或者可以阻止分析。在一些实施方案中，分析样品并提供分析数据。在一些实施方案中，分析数据被上传到分析数据库。在一些实施方案中，分析数据库与样品收集数据库和试剂盒数据库相链接并进行比较。
[0240]
在一些实施方案中，分析数据以图形方式表示。在一些实施方案中，分析数据的图形表示包含坐标轴，其中每个数据点的第一轴和第二轴可以与收集样品的位置相关，例如加工、制备、储存、分发、销售和/或消费食物的位置。在一些实施方案中，每个数据点的第一轴和第二轴可以与人们存在的位置相关，例如人们聚集或工作的位置。在一些实施方案中，每个数据点的第一轴和第二轴可以与农场、田野或存在动物的地方的一个位置相关。在一些实施方案中，每个位置处的一种或多种病原体的数量由第三轴表示，例如xyz坐标图上的z轴。在一些实施方案中，每个位置的一种或多种病原体的数量由颜色、色调或强度的一种或多种差异表示，例如颜色或灰度热图。在一些实施方案中，每个位置的一种或多种病原体的数量由数据的连续表示来表示，例如内插、曲线拟合和/或估计的数据。在一些实施方案中，每个位置的一种或多种病原体的数量由分析数据的图形表示上的值表示。在一些实施
方案中，每个位置的一种或多种病原体的数量包括历史数据。
[0241]
一般考虑
[0242]
尽管为了方便呈现以特定的顺序顺序描述了一些公开的方法的操作，但是应当理解，这种描述方式包括重新排列，除非下面阐述的特定语言需要特定的顺序。例如，顺序描述的操作在某些情况下可以重新安排或同时执行。此外，为简单起见，附图可能未显示所公开的事物和方法可以与其他事物和方法结合使用的各种方式。
[0243]
参考本公开的系统或方法在此呈现的操作理论、科学原理或其他理论描述是为了更好地理解的目的而提供的，并且不旨在限制范围。所附权利要求中的系统和方法不限于以这种操作理论所描述的方式起作用的那些设备和方法。
[0244]
所公开的任何方法都可以实现为计算机可执行指令或计算机程序产品，该计算机可执行指令或计算机程序产品存储在一个或多个计算机可读存储介质上，例如有形的非暂时性计算机可读存储介质，并在计算装置(例如，任何可用的计算装置，包括平板电脑、智能手机或其他包含计算硬件的移动装置)上执行。有形计算机可读存储介质是可在计算环境中访问的任何可用有形介质(例如，一个或多个光盘，例如dvd或cd、易失性存储器组件(例如dram或sram)或非易失性存储器组件(例如闪存或硬盘驱动器))。举例来说，并参考图11，计算机可读存储介质包括存储器1124和存储装置1140。术语计算机可读存储介质不包括信号和载波。此外，术语计算机可读存储介质不包括通信端口(例如，1170)或通信介质。
[0245]
用于实施所公开技术的任何计算机可执行指令以及在实施所公开实施方案期间创建和使用的任何数据都可以存储在一个或多个计算机可读存储介质上。计算机可执行指令可以是例如专用软件应用程序或经由网络浏览器或其他软件应用程序(例如远程计算应用程序)访问或下载的软件应用程序的部分。这样的软件可以例如使用一台或多台网络计算机在单个本地计算机(例如，任何合适的市售计算机)上或在网络环境中(例如，通过因特网、广域网、局域网、客户端-服务器网络、云计算网络或其他此类网络)上执行。
[0246]
为了清楚起见，仅描述了基于软件的实现的某些选定方面。省略了本领域公知的其他细节。例如，应当理解，所公开的技术不限于任何特定的计算机语言或程序。例如，所公开的技术可以由用abap、adobe flash、c、c++、c#、curl、dart、fortran、java、javascript、julia、lisp、matlab、octave、perl、python、r、ruby、sas、spss、sql、webassembly、它们的任何衍生物，或任何其他合适的编程语言或者在一些实施例中使用标记语言(例如html或xml)或者合适的语言、库和包的任何组合编写的软件来实现。同样，所公开的技术不限于任何特定的计算机或硬件类型。合适的计算机和硬件的某些细节是众所周知的并且不需要在本公开中详细阐述。
[0247]
此外，任何基于软件的实施方案(例如，包括用于使计算机执行任何公开的方法的计算机可执行指令)都可以通过合适的通信方式上传、下载或远程访问。这种合适的通信手段包括例如因特网、万维网、内联网、软件应用程序、电缆(包括光纤电缆)、磁通信、电磁通信(包括rf、微波、红外和光通信)、电子通信或其他此类通信手段。
[0248]
所公开的方法和系统不应被解释为以任何方式进行限制。相反，本公开针对各种公开的实施方案的所有新颖且非显而易见的特征和方面，单独地以及以彼此的各种组合和子组合。所公开的方法和系统不限于任何特定方面或特征或其组合，所公开的实施方案也不要求存在任何一个或多个特定优点或解决问题。来自任何实施例的技术可以与任何一个
pathogens，2014，biomol detect quantif 1:3-7。
[0261]
suh sh,jaykus la，nucleic acid aptamers for capture and detection of listeria spp.j biotechnol，2013，167:454-461。
[0262]
teng j等人，aptamer-based technologies in foodborne pathogen detection，2016，front microbiol 7：1426。
[0263]
实施例2
[0264]
材料和方法
[0265]
一、设备
[0266]
·
光学显微镜
[0267]
·
neubauer血细胞计数器
[0268]
·
热水浴或热板
[0269]
·
温度计
[0270]
·
磁力搅拌器热板，例如thermolyne nuova搅拌/热板或类似物
[0271]
·
环境室，例如tenney junior型号tljr温度控制室
[0272]
·
蠕动泵，例如masterflex 7550-60型
[0273]
·
台式微量离心机，例如eppendorf 5415c或5415d型或类似型号
[0274]
·
涡流混合器，例如台式vwr mini vortex、vwr scientific vortex-genie 2或类似装置，设置为设置7
[0275]
二、材料
[0276]
新鲜的李斯特菌培养物，在适当的生长培养基中生长，例如通过接种10ml管的脑心浸液(bhi)肉汤制备，例如hardy diagnostics bhi broth part no.k25，并在温暖的环境(～25-37℃)中生长过夜(》12小时)。
[0277]
500ml捕获缓冲液(0.2x pbs,2mm mgcl2,0.2％triton x-100)，例如通过混合以下来制备：470ml高纯度水、10ml 10x pbs溶液，ph 7.4(例如teknova 10x pbs溶液，ph 7.4，cat no.p0916)、10ml 100mm mgcl2(例如使用sigma氯化镁六水合物制备，sigma ultra cat.no.,m-2670)、10ml 10％v/v triton x-100溶液(例如使用emd triton x-100制备，cat.no.tx1568-1，按体积稀释，并彻底溶解在高纯度水中，例如使用带有搅拌磁铁的玻璃烧杯，并在温和的设置下使用搅拌板(例如thermolyne nuova搅拌/热板)或类似物充分搅拌，直到充分混合)；100ml释放缓冲液(1m nacl,100mm edta,0.1％tween 20,0.05％sds,30mm nahco3,ph 10.3-10.4)，例如通过混合以下来制备：大约20ml高纯度水，20ml 500mm edta ph 8(例如sigma-aldrich cat.no.431788或类似物，溶解在高纯度水中并使用5m naoh(例如fisher scientific naoh、cat no s318或溶解在高纯度水中的类似物滴定至ph 8))、33ml 3m nacl(例如使用sigma-aldrich cat no.s7653或类似物制备)、3ml 1m nahco
3 ph 10.3(例如通过溶解nahco3制备,sigma-aldrich cat.no.s697或类似物，在高纯度水中使用5m naoh(例如fisher scientific naoh、cat no s318或类似物滴定至ph 10.3，溶于高纯度水中))，1ml 10％v/v tween 20(如通过将tween 20、sigma-aldrich cat no.p1379或类似物溶解在高纯度水中制备)、5ml 1％m/v sds(如使用sigma cat no.l3771或类似物制备，溶解在高纯水中)，并用5m naoh(如fisher scientific naoh、cat no s318或类似物溶解在高纯水中)将ph值调节至10.3，并用高纯水调至100ml的最终总体积。
[0278]
100ml裂解缓冲液(0.1％tween 20，例如通过在高纯度水中稀释tween 20、sigma-aldrich cat no.p1379或类似物而制备)。
[0279]
台盼蓝(trypan blue)染料，例如sigma t8154或类似染料。
[0280]
捕获珠：100μm玻璃珠(例如biospec钠钙珠cat.no.11079101或类似物)，例如经过表面改性处理以用于硅烷附着，例如在gelest.com/wp-content/uploads/goods-pdf-couplingagents.pdf中描述的，其于2019年7月23日可用，特此通过引用并入，以及使用诸如sfvideo.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/technical-report/at taching-oligos-to-solid-supports.pdf？sfvrsn＝47483407_6中描述的过程附加的dna适子，其于2019年7月23日可用，特此通过引用并入，表面使用封闭剂(如arrayit.com/products/microarray_buffers/blocking_solutions/b lockit_blocking_buffer/blockit_blocking_buffer.html)封闭，其于2019年7月23日可用，特此通过引用并入。
[0281]
预滤珠：100μm玻璃珠(例如biospec钠钙珠cat.no.11079101或类似物)，例如使用诸如arrayit.com/products/microarray_buffers/blockit_solutions/blockit_block_b uffer/blockit_blocking_buffer.html之类的封闭剂封闭的表面制备，其于2019年7月23日可用，特此通过引用并入，或类似物。
[0282]
裂解过滤器，例如使用支持的过滤器支架组装，例如millipore swinnex,cat.no.sx0001300或类似物，以及可润湿的0.2μm孔径过滤膜，例如聚碳酸酯、纤维素、pes或类似物，例如sterlitech聚碳酸酯膜过滤器，cat.no.pct0213100或类似物。
[0283]
50ml锥形管(诸如corning、vwr、becton dickinson)。
[0284]
微量离心管，例如eppendorf lobind,cat.no.022431048或类似物。
[0285]
pcr管和盖，例如molecular bioproducts，cat.no.3418，或类似物。
[0286]
裂解缓冲液，具有0.1％v/v tween 20成分，例如通过将tween 20、sigma-aldrich cat no.p1379或类似物溶解在高纯度水中制备的)。
[0287]
缓冲液中的活细胞悬浮样品。使用过夜细胞悬浮液制备用于分析的样品，使用血细胞计数器测定其浓度，并按如下制备稀释细胞的光学计数。通过如下过程来洗涤细胞：将1-2ml等分的过夜细胞悬浮液转移到2ml微量离心管(eppendorf lobind，cat.no.022431048或类似物)并离心(使用台式微量离心机，例如eppendorf 5415c或5415d型或类似物)设定以》12000rpm的速度2-10分钟成为沉淀细胞，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于捕获缓冲液或约0.2x至1x pbs(通过稀释10x pbs(如teknova10x pbs溶液，ph 7.4，cat.no.p0916或类似物)在高纯度水中进行体积测定。通过使用设置为设置7的台式vwr mini vortexer、vwr scientific vortex-genie 2或类似物(或足以在约30秒后完全重新悬浮颗粒的设置)进行涡旋来实现细胞的再悬浮。按照与上述相同的程序第二次洗涤细胞悬浮液。
[0288]
样品缓冲液中的环境样品，例如过滤后的能吃样品，是通过在300μm过滤胃袋(如whirl-pak、b01547wa或类似产品)中的90ml样品缓冲液中将环境海绵样品(例如使用3m sponge stick、cat.no.ssl10nb或类似产品产生)装入达3分钟(手动或使用自动胃袋(stomacher)，如seward胃袋或类似产品)来产生的。
[0289]
一个或多个包含捕获珠的捕获柱，例如使用具有足够长度的3/16英寸id惰性或1/
8英寸id惰性管(例如versilontminert tubing se-200)制备，使得所得珠床是使用一种或多种机制保留以防止珠子损失，例如使用插入捕获柱的一端或多端的不锈钢筛板。
[0290]
一个或多个预过滤器，例如由聚丙烯等惰性材料组成的无泄漏容器，其入口端口连接到漏斗形开口，出口端口连接到10-40毫米长、1/8英寸内径的管，这样的容器包含预过滤珠，具有防止珠损失的机制，例如使用插入输出端口的不锈钢筛板。
[0291]
氧化锆珠，例如biospec氧化锆珠，cat.no.11079110zx，或类似物。
[0292]
生物相容性蠕动泵管道，例如saint-gobainbpt部件号：ay242002。
[0293]
生物相容性系统管道，例如versilontminert tubing se-200或类似物。
[0294]
管道热交换器，例如浸没在水浴中的管道。
[0295]
超声波换能器，例如潮汐棒(tide wand)或类似产品。
[0296]
pcr仪器，例如applied biosystems 7500或类似产品。
[0297]
实施例3
[0298]
活细胞捕获分析
[0299]
一、调节系统
[0300]
将捕获柱放置在大约10℃至12℃的环境室中。通过使用蠕动泵使大约30ml捕获缓冲液以15ml/min流过捕获柱并丢弃流通缓冲液来调节系统。
[0301]
二、活细胞捕获分析
[0302]
使用在捕获缓冲液中稀释的细胞产生10ml活细胞参考缓冲液，并从10ml样品中取出5μl参考计数等分试样。取第二份5μl等分试样进行台盼蓝测试，以确认所有细胞都是活的。在活细胞参考缓冲液样品之前将气隙引入捕获柱以防止调节缓冲液稀释，并且在样品之后引入气隙以确保收集整个10ml活细胞参考。使10ml样品流过捕获柱并收集流出物。
[0303]
使用以下计算计算与捕获柱中珠子结合的细胞百分比：
[0304][0305]
三、死细胞捕获分析
[0306]
通过将管中捕获缓冲液中的10ml活细胞加热至72℃持续5分钟，例如在热板上的水浴中，产生10ml死细胞参考样品。使用10ml死细胞参考样品重复活细胞捕获分析程序。
[0307]
将活细胞分析与死细胞分析进行比较，以确认仅捕获了活细胞。
[0308]
四、确认
[0309]
对于使用neubauer hemocytometer和光学显微镜上的40x透镜进行光学细胞计数，将等份洗涤过的细胞充分稀释(例如，15倍)，然后将5ul等分试样放在血细胞计数器的盖唇下，得到大约15每平方平均计数细胞。该计数为已制备细胞的已知(例如15倍)稀释度建立了参考计数。
[0310]
五、运行和数据
[0311]
所有研究都遵循标准过程来测量细胞捕获效率，如下所示：
[0312]
1.使用血细胞计数器稀释李斯特菌细胞培养物，使细胞计数达到每平方约14-18个计数。
[0313]
2.取10ml参考样品的5μl等分试样并对细胞进行计数。
[0314]
3.使参考样品流过捕获柱并收集整个流过物。
[0315]
4.对流过物的细胞进行计数。
[0316]
5.要确定死细胞的百分比，将等份参考悬浮液和等体积的台盼蓝混合。计算所有细胞的数量和蓝色(死)细胞的数量。
[0317]
使用稀释的捕获缓冲液，平均14.8的参考计数。没有细胞吸收台盼蓝，这与新鲜培养物中的所有活细胞一致。活细胞悬浮液流过捕获柱，流过计数平均为每平方3.3个细胞，相当于78％的捕获效率。
[0318]
第二天，将来自同一培养物的李斯特菌细胞加热至大约72℃至少2分钟。用台盼蓝染料确认细胞死亡(所有细胞都是蓝色的，没有记录单个计数)。死细胞悬浮液流过捕获柱，流过计数平均为17.2，表明没有死细胞结合。
[0319][0320]
数据表明，活的李斯特菌细胞结合效率很高(78％)，而热处理(死)细胞则完全不结合。这表明所公开的细胞捕获系统/过程不结合死的李斯特菌细胞。
[0321]
实施例4
[0322]
通过公开的系统处理刺入样品中的培养的李斯特菌细胞并使用rt-pcr
[0323]
进行分析
[0324]
一、设置
[0325]
如图8所示的装置包括样品输入室8500、热交换器8501、预过滤器8402、细胞捕获柱8403、裂解过滤器8404、废物收集装置8502和pcr样品收集管8503中的第一个。该装置插入到仪器中，该仪器包括多个进一步的流体组件。总的来说，流体回路是使用生物相容系统管道形成的。
[0326]
样品输入室、热交换器、预过滤器、细胞捕获柱、裂解过滤器、废物收集装置和pcr样品收集管都使用连接到生物相容系统管道的生物相容蠕动泵管道连接到蠕动泵，而裂解过滤器的输出使用生物相容性系统管道连接到注射泵，并将系统放置在大约10℃至12℃的环境室中。
[0327]
二、调节系统
[0328]
通过使用蠕动泵使大约15ml捕获缓冲液以10ml/min流过预过滤器和捕获柱并丢弃流通缓冲液然后通过使大约15ml捕获缓冲液以30ml/min流过捕获柱来调节系统。
[0329]
三、活细胞捕获和释放
[0330]
使用在捕获缓冲液或环境样品中稀释的细胞产生10至100ml的活细胞加标样品，并从样品中取出5μl参考计数等分试样以确定近似的细胞浓度。取第二个5μl等分试样进行台盼蓝测试，以确认所有细胞都是活的。在最后一次样品缓冲液洗涤后引入气隙，以防止释放缓冲液与捕获缓冲液稀释和混合。10至100ml样品以大约15ml/min的流速流过捕获柱，并丢弃流过物。紧接样品后，大约5ml的捕获缓冲液流过预过滤器和捕获柱，流过物被丢弃。大约5ml样品缓冲液的第二体积流过捕获柱，流过物被丢弃。释放缓冲液流过系统，绕过预过滤器，并通过捕获柱和裂解过滤器，流过物被丢弃。裂解过滤器流过裂解过滤器并丢弃流过物。空气流过裂解过滤器以从系统管道中清除多余的液体，这些液体被丢弃。
[0331]
将50μl裂解缓冲液等分试样回流通过裂解过滤器，并收集在pcr管中，pcr管中包
含用于pcr扩增和李斯特菌检测的引物、探针和酶。
[0332]
回流的样品和pcr试剂在pcr管中经过超声波珠子敲打以提取核酸，例如使用氧化锆珠子和声波换能器两分钟以产生pcr。将提取样品的pcr管置于pcr仪器中进行分析。
[0333]
鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施方案，应该认识到，所示实施方案仅是本发明的优选实施例并且不应被视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由以下权利要求限定。因此，我们将所有落入这些权利要求的范围和精神内的内容作为我们的发明。