用于修饰植物特征而不修饰植物基因组的组合物和方法与流程

用于修饰植物特征而不修饰植物基因组的组合物和方法
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2.根据37c.f.r.
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4.根据35u.s.c.
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119(e)，本技术主张2019年9月20日提交的第62/903,183号美国临时申请的权益，其全部内容通过引用并入本文。
发明领域
5.本发明涉及形成共生体的接种物和共生体，其包含编码一种或多种植物激素基因的多核苷酸和至少一种目的多核苷酸，所述接种物和共生体可用于修饰宿主植物的特征而不修饰宿主植物基因组。
6.发明背景
7.农杆菌属(agrobacterium)的细菌作为一种引起冠瘿病的植物病原体已经研究了几十年。该病导致在农杆菌属菌种感染的位点形成生长在植物上的植物团(或瘿瘤)。发生在成熟植物上的瘿瘤可导致很少或没有表型应答或对植物生长的影响，这取决于病原体和宿主基因型以及受感染宿主的龄期。然而，较幼小植物上的瘿瘤会对植物的生长和其他特性产生严重的不利影响。由于细菌能够进入植物中的伤口部位并将一部分dna(称为t-dna，或转移dna，位于称为ti质粒的农杆菌属质粒上)转移到邻近的植物细胞，结果诱导瘿瘤形成。一旦进入植物细胞，t-dna就会被导向细胞核，在那里它被插入植物的基因组中。
8.20世纪40年代，在已知农杆菌属菌种将dna转移到植物基因组中之前，研究人员发现这种细菌可以稳定地改变植物细胞，使其“永生”并且不需要植物激素在体外培养中生长。目前已知，肿瘤的形成是含有植物激素合成基因的t-dna插入植物细胞基因组时表达的结果。随后产生的植物激素使植物细胞启动不再受植物产生的细胞分裂信号控制的细胞分裂。
9.自20世纪80年代以来，由于农杆菌属菌种能够将t-dna插入目标植物的基因组，它已被用于研究和应用以转化整个植物。这样的t-dna可以被工程化，以将赋予所需性状的基因递送到目标植物中。为了实现转化，开发了不形成瘿瘤的农杆菌属菌种的“解除武装”菌株，因此产生的植物只实现投递的目的基因的直接作用，以产生所需的表型。
10.然而，由于几个原因，转基因和转化的植物并不总是所需的。首先，植物转化是一个费力的过程，成功转化植物种系组织的频率很低。植物中的成功转基因表达可能受到邻近基因表达和转基因插入植物基因组的拷贝数的影响。其次，传统的转基因过程不利于对环境应激、害虫或病原体的实时应答。相反，这个过程是在实验室环境中完成的，因此不能用作对时间刺激的动态应答。第三，具有异质dna的转化基因组可存在于从植物中收获的材料中(例如，在收获的水果或蔬菜中)，并且在大多数市场中，希望在产生的可食用食品中不存在这种转化dna。此外，希望环境中不要有来自转基因植物的花粉。
11.因此，需要一种能够将一个或多个期望性状引入目标植物而不将异质dna引入整个植物的方法。
12.发明概述
13.本发明的一个方面提供了一种形成共生体的接种物，其包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶。
14.第二个方面提供了一种包含植物细胞的共生体，该植物细胞包含并表达编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中所述植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶，并且所述共生体的植物细胞自发分裂。在某些方面，植物细胞包括至少两个细胞。
15.本发明的第三个方面提供了一种产生形成共生体的接种物的方法，该方法包括：将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸引入细胞或将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸引入包含目的多核苷酸的转基因细胞，其中植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶，由此产生形成共生体的接种物。
16.本发明的第四个方面提供了一种产生形成共生体的接种物的方法，该方法包括(a)(i)将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列引入植物(或其一部分(例如外植体))上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)之中/之上，或移植植物细胞或接种包含该多核苷酸的细菌细胞(例如，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列)到植物(或其一部分)上的至少一个位点上，或(ii)将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸引入植物(或其部分)上的至少一个位点之中/之上，或移植植物细胞或接种包含该多核苷酸的细菌细胞到植物(或其部分)上的至少一个位点上，其中(ii)中的植物(或其一部分)包含目的多核苷酸序列，其中(a)中的植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶，从而在植物(或其部分)上产生共生体，其包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列；和(b)从植物上的共生体中选择一个或多个细胞(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个细胞)，以提供包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列的一个或多个细胞，从而产生形成共生体的接种物。
17.本发明的第五个方面提供了一种修饰宿主植物特征而不修饰宿主植物基因组的方法，该方法包括将本发明的形成共生体的接种物或本发明的共生体移植到宿主植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位点)上；以及培养在宿主植物上的至少一个位点处的形成共生体的接种物或共生体以在宿主植物的至少一个位点处形成共生体，其中目的多核苷酸在宿主植物上的共生体中表达并且目的多核苷酸的表达产物和/或使用目的多核苷酸的表达产物制备的产物被运输到宿主植物中，从而改变宿主植物特征。
18.本发明的第六个方面提供了一种生产生物分子或生物活性分子的方法，包括提供本发明的共生体，其中目的多核苷酸编码所述生物活性分子，并收集由共生体生产的生物活性分子；和/或提供本发明的宿主植物，其中目的多核苷酸编码生物活性分子，并收集共生体和宿主植物中产生的生物活性分子。
19.本发明的第七个方面提供了一种向宿主植物递送目的化合物的方法，包括将本发
明的形成共生体的接种物或本发明的共生体移植到宿主植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位点)上，并培养在宿主植物上的至少一个位点处的形成共生体的接种物或共生体以在宿主植物上至少一个位点处形成共生体，其中目的多核苷酸在共生体中表达并且目的多核苷酸的表达产物和/或使用所述目的多核苷酸的表达产物制备的产物被运输到宿主植物中，从而将所述目的化合物递送到植物中。
20.本发明的第八个方面提供了一种生产包含经修饰特征(一种或多种)而不修饰宿主植物基因型的宿主植物的方法，包括：将本发明的形成共生体的接种物或本发明的共生体移植到宿主植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位点)上；以及培养在宿主植物上的至少一个位点处的形成共生体的接种物或共生体以在宿主植物上的至少一个位点处形成共生体，其中目的多核苷酸在共生体中表达并且目的多核苷酸的表达产物和/或使用目的多核苷酸的表达产物制成的产物被运输到宿主植物中，从而产生包含经修饰的表型而无经修饰的基因型的植物。
21.进一步提供通过本发明方法产生的形成共生体的接种物、共生体、宿主植物、植物和细胞和/或原生质体，以及用于实施所述方法的核酸、包含核酸的表达盒和载体。
22.本发明的这些和其他方面在下文对本发明的描述中更详细地阐述。
23.附图简要说明
24.图1.共生体形成的展现，其使用共接种和单菌株接种(农杆菌)以及基因枪方法将编码植物激素产生(ph)的基因和目的多核苷酸(poi)引入植物细胞。
25.图2.编码至少一种植物激素多肽(植物生长调节剂(pgr)表达盒)和目的多核苷酸(poi)的质粒图谱(“psym”)的示例。asci、xmai和spei是限制性位点，nost是胭脂碱合酶终止子，kan代表卡那霉素选择标记物。
26.图3.生成共生体的不同示例路径的说明。dna递送可以使用任何方法来完成，例如，细菌、轰击、电穿孔、whiskers、原生质体融合等。“活化组织”是指已经用植物激素(ph)基因永生化的组织；“混合培养物”是具有多种不同基因插入和表达的细胞的集合；“形成共生体的接种物”是可用于在植物上形成共生体的接种物(例如dna、细菌细胞、植物细胞等)；共生体是具有ph基因和目的多核苷酸(poi)的植物组织(例如，一个或多个植物细胞)，任选地位于植物上。
27.图4.接种60天后柑橘上的共生体形成。a图和b图显示了使用共接种(例如，超过一种的农杆菌菌株)形成的共生体。c图和d图显示了使用单一菌株接种形成的共生体。
28.图5.使用农杆菌属菌种的接种技术示例。a图展示了在柑橘上使用镊子。b图和c图展示了在番茄植株上使用两种针型，一种是纹身针(图b)，另一种是皮下注射用针(c图)。
29.图6.不同作物类型上共生体的示例。a图：山核桃；b图：番茄；c图：柑橘；d图：烟草(本氏烟草(nicotiana benthamiana))。
30.图7.形成共生体的接种物(以植物愈伤组织的形式)在固体培养基上生长，表现出高水平的mcherry产生。
31.图8.在固体培养基(a图和b图)和液体培养基(c图和d图)上生长的不同类型的形成共生体的接种物的示例。番茄(a图和c图)和柑橘(b图和d图)。
32.图9.共生体移植示例：1周和6周时在柑橘上(a图和b图)；2周和6周时在番茄上(d图和e图)。c图和f图展示了移植的柑橘共生体的维管化(c)和绿色荧光蛋白(gfp)的产生(f
图)。初始使用硅胶带(a图)或封口膜(d图)来控制移植位点处的湿度。
33.图10.具有多个(例如，“堆叠的”)编码目的产物(一种或多种)的目的多核苷酸(poi)的示例性psym质粒的质粒图谱。
34.图11.共生体堆叠和poi堆叠的示例。番茄上多个分别的小gfp psym的自体荧光(a图)和gfp荧光(b图)。c-e图显示了两个具有不同目的多核苷酸(poi)的psym质粒在单个植物上的堆叠：自体荧光(c图)、mcherry(d图)和gfp(e图)。f-h图显示了在单个psym中多个目的多核苷酸(poi)的堆叠，自体荧光(f图)、mcherry(g图)、gfp(h图)。
35.图12.番茄和柑橘共生体表达高水平的绿色荧光蛋白(gfp)。a图番茄共生体中gfp蛋白的积累达到肉眼可见的水平。b图和c图显示了用单一菌株接种(农杆菌属菌种)建立的柑橘共生体的横截面。箭头指示共生体内gfp高积累的区域。
36.图13.用western印迹检测法对使用单一菌株接种(农杆菌属菌种)在番茄上形成的共生体中产生的mcherry进行免疫检测。在原始蛋白质提取物的10-7
倍稀释度下可检测到mcherry。
37.图14.番茄植株上含有编码mcherry荧光蛋白的目的多核苷酸的共生体的显微镜图片。a图显示了开始延伸到共生体组织中的正在生长的植物维管组织的uv自发荧光。b图显示了共生体内部红色mcherry的产生和积累，以及在生长到共生体组织中的维管组织中的积累。c图显示共生体中形成的微管组织。d图显示了茎维管组织中的mcherry荧光检测，显示mcherry蛋白向共生体外部的输出。
38.图15.表达gfp的共生体上方1-2厘米处番茄茎的横截面，说明poi产物的输出。箭头表示gfp累积。
39.图16.具有两个附接的共生体的番茄宿主植物中不同部分的mcherry检测，两个共生体都含有编码mcherry蛋白产生的多核苷酸。a图：共生体1；b图：共生体1上方的茎；c图：共生体2；d图：共生体2上方的茎；e图：共生体1下方；f图：共生体2下方；g图：对照。
40.图17.共生体(“sym”)中相对于番茄宿主植物茎中的目的多核苷酸(gfp，gfp+)的pcr检测表明，只有共生体是遗传转化的。“gfp+”是gfp与分泌途径靶向序列(内质网(er)靶向序列)相连。
41.图18.与仅接种野生型农杆菌属菌种的番茄(b图)相比，柑橘flower locus t基因(ft3)在番茄共生体中的表达诱导宿主植株矮化(a图)。
42.图19.感染柑橘绿化的致病因子柑橘黄龙病菌亚洲种(candidatus liberibacter asiaticus)的柑橘植株。a、c和e图展示了具有产生抗菌肽的共生体的柑橘。b、d和f图为使用野生型农杆菌属菌种的柑橘，作为对照。
43.图20.与接种野生型农杆菌属菌种的柑橘相比，具有通过共同接种(见图19)在宿主柑橘植株上形成的并表达抗微生物肽癌素(oncocin)的4个月龄共生体的柑橘叶片中柑橘黄龙病菌亚洲种(clas)的相对减少百分比，其中癌素与er靶向序列可操作连接(癌素+)。
44.图21.显示目的产物的表达对柑橘黄龙病菌亚洲种(clas)的功效。与接种野生型农杆菌属物种的组织相比，表达带有(+)和不带有信号序列的抗微生物肽(癌素或tmof)的共生体组织中clas的相对减少百分比。gfp+是表达带有信号肽的绿色荧光蛋白且没有抗微生物肽的组织。tmof＝胰蛋白酶调节抑卵因子。
45.图22.本氏烟草(nicotiana benthamiana)与形成共生体的接种物共同接种，该接
种物包含编码细菌效应蛋白的目的多核苷酸，该蛋白先前显示可在本氏烟草中诱导效应物触发的免疫。a图：接种前健康植物。b图：接种后1周，底部箭头表示接种位点；c图：接种2周后的植物死亡。
46.发明描述
47.下面将参考附图和示例来描述本发明，其中示出了本发明的实施方案。该描述不意图成为可以执行本发明的所有不同方式或者可以添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施方案所示的特征可以并入其他实施方案，并且关于特定实施方案所示的特征可以从该实施方案中删除。因此，本发明涵盖在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。此外，对本文所建议的各种实施方案的许多变化和添加根据本发明将对本领域技术人员来说是明显的，这些变化和添加不脱离本发明。因此，以下描述旨在例示本发明的一些特定实施方案，而不是详尽地指定其所有置换、组合和变化。
48.如本文所用，“示例性”一词意指“用作示例、实例或说明”。本文描述的实施方案不是限制性的，而是仅为示例性的。应当理解，所描述的实施方案不一定被解释为比其他实施方案更优选或更有利。此外，术语“本发明的实施方案”、“实施方案”或“发明”不要求本发明的所有实施方案包括所讨论的特征、优点或操作模式。
49.除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中描述本发明时使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不旨在限制本发明。
50.本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用方式整体并入，用于与引用的句子和/或段落相关的教导。
51.本公开中提及商品名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部推荐或认可。
52.除非上下文另有指示，否则本文所述的本发明的各种特征可以以任何组合方式使用。此外，本发明还涵盖，在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。举例而言，如果说明书规定组合物包含组分a、b和c，则具体地意图为a、b或c中的任何一个或其组合都可以单独地或以任何组合方式省略和放弃。
53.如在本发明说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”也意在包括复数形式。
54.也如本文所用，“和/或”指且涵盖一个或多个相关列出项目的任何和所有可能的组合，以及在备选方案(“或”)中解释时缺少组合的情况。
55.在本文中，当提及可测量值例如量或浓度等时使用的术语“大约”意味着包括所述值的
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％或甚至
±
0.1％的变化以及所述值。例如，“大约x”，其中x是可测量值，意味着包括x以及x的
±
10％、
±
5％、
±
1％、
±
0.5％甚至
±
0.1％的变化。对于可测量值本文提供的范围可包括其中的任何其他范围和/或单个值。
56.如本文所用，诸如“在x和y之间”和“在大约x和y之间”之类的短语应被解释为包括x和y。如本文所用，诸如“在大约x和y之间”之类的短语意味着“在大约x和大约y之间”和诸如“从大约x到y”之类的短语意味着“从大约x到大约y”。
57.除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在作为单独指代该范围内
的每个单独数值的简写方法，并且每个单独数值并入本说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。例如，如果公开了范围10到15，则还公开了范围11、12、13和14。
58.本文使用的术语“包括”、“包含”和“含有”规定了所述特征、整数、步骤、操作、要素和/或组件的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组件和/或其组的存在或添加。
59.如本文所用，连接短语“基本上由
…
组成”意味着权利要求的范围将被解释为包括权利要求中记载的指定材料或步骤，以及那些不会实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的材料或步骤。因此，当在本发明的权利要求中使用术语“基本上由
…
组成”时，不旨在解释为等同于“包括”。
[0060]“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且说明书包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。例如，短语“任选地包含x”意味着该组合物可以包含或不包含x。
[0061]
如本文所用，术语“增加”、“增加的”、“增强”和“增强的”(及其语法变体)描述了与对照相比至少约5％、10％、15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。例如，具有经修饰的特征的宿主植物可以表现出对害虫增加的耐受性或增加的抗性，其中与对照植物相比，增加的耐受性或抗性是增加约5％至约500％。
[0062]
如本文所用，术语“减少”、“减少的”、“消除”和“降低”(及其语法变体)描述了例如与对照相比至少减少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％。在特定实施方案中，减少可导致没有或基本上没有(即不显著的量，例如小于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。
[0063]
如本文所使用的，关于核酸分子和/或核苷酸序列(例如，rna或dna)的术语“表达”、“表达的”或“的表达”等表示该核酸分子和/或核苷酸序列被转录和任选地翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达目的多肽或例如功能性的非翻译rna。
[0064]“异源”或“重组”核苷酸序列是与被引入的宿主细胞不天然相关的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝。因此，如本文所用，术语“异源”是指源自外来物种的核苷酸/多肽，或者如果来自同一物种，则通过故意的人类干预，在组成和/或基因组基因座上从其天然形式实质性地修饰。例如，异源多核苷酸可编码生物体天然的核苷酸序列，但该核苷酸序列可操作地连接至异源启动子，从而提供异源多核苷酸。
[0065]“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列指天然存在或内源性的核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。
[0066]
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”指的是线性或分支、单链或双链或其杂合体的rna或dna。该术语还包括rna/dna杂合体。当合成产生dsrna时，不太常见的碱基如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等也可用于反义、dsrna和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的c-5丙炔类似物的多核苷酸已被证明以高亲和力结合rna并且是基因表达的有效反义抑制剂。还可以进行其他修饰，例如对磷酸二酯主链或rna核糖糖基中的2'-羟基进行修饰。
[0067]
如本文所用，术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5'端到3'端的序列，包括dna或rna分子，包括cdna、dna片段或部分、基因组dna、合成(例如，
化学合成的)dna、质粒dna、mrna和反义rna，其中任何一种都可以是单链或双链的。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也可互换地用于指代核苷酸的杂聚物。本文中提供的核酸分子和/或核苷酸序列在5'至3'方向从左至右呈现，并使用美国序列规则37cfr
§§
1.821-1.825和世界知识产权组织(wipo)标准st.25中示出的用于表示核苷酸字符的标准代码表示。本文所用的“5'区域”可指最靠近多核苷酸5'端的多核苷酸区域。因此，例如，多核苷酸的5'区域中的元件可以位于从位于多核苷酸5'端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。本文所用的“3'区域”可指最靠近多核苷酸3'端的多核苷酸区域。因此，例如，多核苷酸的3'区域中的元件可以位于从位于多核苷酸3'端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。
[0068]
如本文关于核酸所用，术语“片段”或“部分”指相对于参考核酸长度减少的核酸(例如，减少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850或900或更多个核苷酸，或其中任何范围或数值)，并且包含与参考核酸的相应部分相同或几乎相同(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续核苷酸的核苷酸序列、基本上由其组成和/或由其组成。在适当的情况下，这种核酸片段可以包含在其作为组成部分的较大的多核苷酸中。
[0069]
如本文关于多肽所用，术语“片段”或“部分”可指长度相对于参考多肽长度减少的多肽，并且包含与参考多肽的相应部分相同或几乎相同(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列、基本上由其组成和/或由其组成。在适当的情况下，这种多肽片段可以作为较大多肽的组成部分包含在其中。在一些实施方案中，多肽片段包含参考多肽的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、260、270、280、290或更多个连续氨基酸、基本上由其组成或由其组成。现在将参考以下示例来描述本发明。应当理解，这些示例并不旨在限制权利要求的范围，而是旨在作为某些实施方案的示例。本领域技术人员想到的示例性方法中的任何变化旨在落入本发明的范围内。
[0070]
如本文关于核酸所用，术语“功能片段”指编码多肽的功能片段的核酸。
[0071]
如本文所使用的术语“基因”是指能够用于产生mrna、反义rna、mirna、抗microrna反义寡核苷酸(amo)等的核酸分子。基因可以能或者不能用来生产功能性蛋白质或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调控元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)。基因可以是“分离的”，也就是意指核酸实质上或基本上不含通常在其天然状态下与该核酸相关联的成分。这类成分包括其他细胞材料、重组生产的培养基和/或用于化学合成核酸的各种化学品。
[0072]
术语“突变”指点突变(例如，错义或无义，或导致框移位的单碱基对的插入或缺失)、插入、缺失和/或截短。当突变是氨基酸序列中的一个残基被另一个残基取代，或是序列中一个或多个残基的缺失或插入时，突变通常通过标识原始残基然后是该残基在序列中的位置，以及新取代残基的身份来描述。截短可以包括在多肽的c末端或在多肽的n末端的截短。多肽的截短可以是编码该多肽的基因的相应5'端或3'端缺失的结果。当一个或多个
碱基对的缺失或插入被引入基因时，可能会发生框移位突变。基因中的框移位突变可导致产生比野生型多肽更长、更短或相同长度的多肽，这取决于在基因突变区域之后何时出现第一个终止密码子。缺失可导致基因的非编码部分(如启动子)发生突变。
[0073]
本文使用的术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“a-g-t”(5'到3')与互补序列“t-c-a”(3'到5')结合。两个单链分子之间的互补可以是“部分的”，即只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补可以是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
[0074]“互补”，如本文所用，可以意味着与比较核苷酸序列100％互补，或者可能意味着与比较核苷酸序列不到100％互补(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等互补性)。
[0075]
具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中称为“同源物”。术语同源物包括来自同一物种和其他物种的同源序列，以及来自同一物种和其他物种的直系同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平，以位置同一性(即序列相似性或同一性)的百分比表示。同源性也指不同核酸或蛋白质之间具有相似功能特性的概念。因此，本发明的组合物和方法还包括本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。本文所用的“直系同源”是指在物种形成过程中由共同的祖先基因产生的不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列。本发明核苷酸序列的同源物与本发明所述核苷酸序列具有实质性序列同一性(例如，至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。
[0076]
如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳排列的多核苷酸或多肽序列在整个组分(例如核苷酸或氨基酸)比对窗口中保持不变的程度。“同一性”可以通过已知方法轻松计算，包括但不限于：computational molecular biology(lesk,a.m.,编)oxford university press,new york(1988)；biocomputing:informatics and genome projects(smith,d.w.,编)academic press,new york(1993)；computer analysis of sequence data,part i(griffin,a.m.和griffin,h.g.编)humana press,new jersey(1994)；sequence analysis in molecular biology(von heinje,g.,编)academic press(1987)；和sequence analysis primer(gribskov,m.和devereux,j.编)stockton press,new york(1991)中描述的那些。
[0077]
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)与测试(“对象”)多核苷酸分子(或其互补链)相比在线性多核苷酸序列中，当两个序列处于最佳比对时，相同核苷酸的百分比。在一些实施方案中，“序列同一性百分比”可指与参考多肽相比，氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。
[0078]
如本文所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或多肽序列的上下文中的短语“实质上相同”或“实质同一性”指当使用以下序列比较算法之一或通过目视检查进行测量来比较和比对以获得最大对应性时，至少具有约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列。在本发明的一些实施方案中，实质同一性存在于本发明核苷酸序列的连续核苷酸区域上，为约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约15个核苷酸至约25个核苷酸，约30个核苷酸至约40个核苷酸，约50个核苷酸至约60个核苷酸，约70个核苷酸至约80个核苷酸，约90个核苷酸至约100个核苷酸，约100个核苷酸至约200个核苷酸，约100个核苷酸至约300个核苷酸，约100个核苷酸至约400个核苷酸，约100个核苷酸至约500个核苷酸，约100个核苷酸至约600个核苷酸，约100个核苷酸至约800个核苷酸，约100个核苷酸至约900个核苷酸，或更长，或其中任何范围，直至序列的全长。
[0079]
对于序列比较，通常一个序列作为参考序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0080]
用于比对比较窗口的序列的最佳比对对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且可以通过诸如smith和waterman的局部同源算法、needleman和wunsch的同源比对算法、pearson和lipman的搜索相似性方法等工具，以及任选地通过计算机执行这些算法，如gap、bestfit、fasta和tfasta(作为wisconsin(accelrys inc.,san diego,ca)的部分提供)来进行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的相同组分的数量除以参考序列区段中的组分总数量，例如，整个参考序列或参考序列的较小限定部分。百分数序列同一性表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是对全长多核苷酸序列或其一部分，或是对更长的多核苷酸序列。对于本发明的目的，还可以使用blastx版本2.0来确定翻译的核苷酸序列和使用blastn版本2.0来确定多核苷酸序列的“百分比同一性”。
[0081]
当两个核苷酸序列在严格条件下相互杂交时，也可以认为这两个核苷酸序列基本上是互补的。在一些实施方案中，在高度严格的条件下彼此杂交的两个核苷酸序列被认为基本上互补。
[0082]
在核酸杂交实验例如southern和northern杂交的背景中，“严格的杂交条件”和“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖的，并且在不同的环境参数下是不同的。tijssen laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes第i部分第2章"overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays"elsevier,new york(1993)提供了核酸杂交的广泛指南。一般来说，在限定的离子强度和ph值下，高度严格的杂交和洗涤条件选择为比特定序列的热熔点(tm)低约5℃。
[0083]
tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和ph下)。选择非常严格的条件，使其与特定探针的tm相等。在southern或northern印迹中，对于在过滤器上具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列的杂交，严格的杂交条件的一个示例是在42℃用50％甲酰胺和1mg肝素进行杂交过夜。高度严格洗涤条件的示例是在72℃ 0.1 5m nacl，持续约15分钟。严格洗涤条件的示例是在65℃进行0.2x ssc洗涤15分钟(有关ssc缓冲液的说明，请参阅下文sambrook)。通常，在高严格度洗涤之前，先进行低严格度洗涤，以
去除背景探测信号。对于例如超过100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤的示例是1x ssc在45℃进行15分钟。对于例如超过100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的示例是4-6x ssc在40℃进行15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格的条件通常涉及小于约1.0m na离子，通常为约0.01至1.0m na离子浓度(或其他盐)的盐浓度，ph值为7.0至8.3，并且温度通常至少在30℃左右。添加甲酰胺等失稳剂也可以达到严格的条件。一般来说，在特定杂交分析中信号噪声比比对非相关探针观察到的信号噪声比高2倍(或更高)表明检测到特异性杂交。在严格条件下不能相互杂交的核苷酸序列，如果编码的蛋白质基本相同，则它们仍然基本相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并度创建核苷酸序列拷贝时，就可能会发生这种情况。
[0084]
本发明的任何多核苷酸和/或重组核酸分子可以为在任何目的物种中表达而优化密码子。密码子优化在本领域中是众所周知的并且涉及使用物种特异性密码子使用表针对密码子使用偏倚对核苷酸序列进行修饰。密码子使用表是基于对目的物种的最高表达基因的序列分析生成的。当核苷酸序列要在细胞核中表达时，密码子使用表是基于对目的物种的高表达核基因的序列分析生成的。通过比较物种特异性密码子使用表与天然多核苷酸序列中存在的密码子来确定核苷酸序列的修饰。如本领域所理解的，核苷酸序列的密码子优化导致核苷酸序列与天然核苷酸序列具有小于100％的同一性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等)，但仍编码与由原始天然核苷酸序列所编码的多肽具有相同功能的多肽。因此，在本发明的一些实施方案中，可以对目的多核苷酸和/或编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或包含其的核酸构建体进行密码子优化以在特定的目的物种中表达。
[0085]
在一些实施方案中，本发明的重组核酸分子、核苷酸序列和多肽是“分离的”。“分离的”核酸分子、“分离的”核苷酸序列或“分离的”多肽是通过人为存在于其天然环境之外并因此不是天然产物的核酸分子、核苷酸序列或多肽。分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可以以至少部分地与天然存在的生物体或病毒的至少一些其他组分(例如细胞或病毒结构组分或者通常发现与多核苷酸相关联的其他多肽或核酸)分离的纯化形式存在。在一些实施方案中，分离的核酸分子、分离的核苷酸序列和/或分离的多肽为至少约1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更纯。
[0086]
在一些实施方案中，分离的核酸分子、核苷酸序列或多肽可存在于非天然环境例如重组宿主细胞中。因此，例如就核苷酸序列而言，术语“分离的”意味着它与它天然存在于其中的染色体和/或细胞分离。如果多核苷酸与它天然存在其中的染色体和/或细胞分离并然后插入到其不天然存在的遗传环境、染色体和/或细胞(例如，不同的宿主细胞、不同的调节序列和/或基因组中与天然界所见的不同的位置)中，则所述多核苷酸也是分离的。因此，重组核酸构建体、多核苷酸及其编码的多肽是“分离”的，在于通过人为干预使它们存在于其天然环境之外，因此不是天然产物，然而在一些实施方案中，它们可以被引入并存在于重组宿主细胞中。
[0087]
在本文所述的任何实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可操作地与多种启动子和/或其他调控元件相关联，以在植物和/或植物细胞中表达。因此，在一些实施方案中，本发明的多核苷酸或核酸构建体可进一步包含可操作地连接至一个或多个核苷酸序列
的一个或多个启动子、内含子、增强子和/或终止子。
[0088]
本文中关于多核苷酸所使用的“可操作连接”或“可操作关联”指的是所示元件在功能上彼此相关，并且通常也在实体上相关。因此，本文使用的术语“可操作连接”或“可操作关联”指单个核酸分子上功能关联的核苷酸序列。因此，可操作地连接至第二核苷酸序列的第一核苷酸序列意味着第一核苷酸序列与第二核苷酸序列处于功能关系时的情况。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则启动子与所述核苷酸序列可操作地关联。本领域技术人员将理解，调控序列(例如，启动子)不需要与其可操作地关联的核苷酸序列相邻，只要调控序列起到引导其表达的作用。因此，例如，在启动子和核苷酸序列之间可以存在间隔的不翻译但转录的核酸序列，并且启动子仍然可以被认为与核苷酸序列“可操作地连接”。
[0089]
如本文所用，术语“连接”在涉及多肽时，指的是一种多肽与另一种多肽的附接。一个多肽可直接(例如通过肽键)或通过接头连接至另一个多肽(在n端和/或c端)。例如，多肽可以连接至靶向序列，任选地连接在n端或c端或两者。如本文所用，“接头”可指连接两个分子或部分的化学基团或分子。
[0090]“启动子”是控制或调节与启动子可操作地关联的核苷酸序列(例如编码序列)转录的核苷酸序列。由启动子控制或调节的编码序列可编码多肽和/或功能性rna。通常，“启动子”指包含rna聚合酶ii结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。一般来说，相对于相应编码序列的编码区起始点，启动子位于5'或上游。启动子可以包括作为基因表达调节子的其他元件；例如，启动子区域。这些包括tata盒共有序列，以及通常的caat盒共有序列(breathnach和chambon,(1981)ann.rev.biochem.50:349)。在植物中，caat盒可以被agga盒取代(messing等人，(1983)在genetic engineering of plants，t.kosuge，c.meredith和a.hollaender(eds)，plenum press,pp.211-227中)。
[0091]
可用于本发明的启动子可以包括，例如，组成型、诱导型、时间调节型、发育调节型、化学调节型启动子，用于制备重组核酸分子例如“合成核酸构建体”或“蛋白质rna复合物”。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。
[0092]
启动子的选择可以根据表达的时间和空间要求而异，也可以基于待转化的宿主细胞而异。用于许多不同生物体的启动子是本领域众所周知的。基于本领域现有的广泛知识，可以为目的特定宿主生物体选择合适的启动子。因此，例如，关于模式生物体中高组成性表达基因上游的启动子已经很多研究，并且这些知识可以容易获得和在其他系统中在适当的情况下实施。
[0093]
在一些实施方案中，在植物中具有功能的启动子可与本发明的构建体一起使用。用于在植物中驱动表达的启动子的非限制性示例包括rubisco小亚基基因1的启动子(prbcs1)、肌动蛋白基因的启动子(pactin)，硝酸还原酶基因的启动子(pnr)和重复碳酸酐酶基因1的启动子(pdca1)(见walker等人，plant cell rep.23:727-735(2005)；li等人，gene 403:132-142(2007)；li等人，mol biol.rep.37:1143-1154(2010))。prbcs1和pactin是组成型启动子，并且pnr和pdca1是诱导型启动子。pnr由硝酸盐诱导并被铵抑制(li等人，gene 403:132-142(2007))，pdca1由盐诱导(li等人，mol biol.rep.37:1143-1154(2010))。在一些实施方案中，可用于本发明的启动子是rna聚合酶ii(pol ii)启动子。在一些实施方案中，来自玉蜀黍的u6启动子或7sl启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方
案中，来自玉蜀黍的u6c启动子和/或7sl启动子可用于驱动引导核酸的表达。在一些实施方案中，来自大豆(glycine max)的u6c启动子、u6i启动子和/或7sl启动子可用于本发明的构建体。在一些实施方案中，来自大豆的u6c启动子、u6i启动子和/或7sl启动子可用于驱动引导核酸的表达。
[0094]
对植物有用的组成性启动子示例包括但不限于cestrum病毒启动子(cmp)(美国专利号7,166,770)、水稻肌动蛋白1启动子(wang等人(1992)mol.cell.biol.12:3399-3406；以及美国专利号5,641,876)、camv 35s启动子(odell等人(1985)nature 313:810-812)、camv 19s启动子(lawton等人(1987)plant mol.biol.9:315-324)，nos启动子(ebert等人(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:6624-6629)，adh启动子(walker等人(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:6624-6629)，蔗糖合酶启动子(yang&russell(1990)proc.natl.acad.sci.usa 87:4144-4148)，以及泛素启动子。来源于泛素的组成性启动子在许多细胞类型中积累。泛素启动子已从几种植物物种中克隆出来用于转基因植物，例如向日葵(binet等人,1991.plant science 79:87-94)、玉米(christensen等人，1989.plant molec.biol.12:619-632)和拟南芥(norris等人，1993.plant molec.biol.21:895-906)。玉米泛素启动子(ubip)已在转基因单子叶植物系统中开发，其用于单子叶植物转化的序列和载体已在专利出版物ep 0 342 926中公开。泛素启动子适于在转基因植物，尤其是单子叶植物中表达本发明的核苷酸序列。此外，可以容易地修饰mcelroy等人(mol.gen.genet.231:150-160(1991))所描述的启动子表达盒以表达本发明的核苷酸序列，并且特别适合在单子叶植物宿主中使用。
[0095]
此外，可以使用在叶绿体中发挥功能的启动子。此类启动子的非限制性示例包括噬菌体t3基因9 5’utr和美国专利号7,579,516中公开的其他启动子。可用于本发明的其他启动子包括但不限于s-e9小亚基rubp羧化酶启动子和kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(kti3)。
[0096]
可用于本发明的其他调控元件包括但不限于内含子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区。可用于本发明的内含子可以是在植物中鉴定并从植物中分离的内含子，然后插入表达盒中以用于植物转化的内含子。如本领域技术人员所理解的，内含子可包含自切除所需的序列，并被同框并入核酸构建体/表达盒中。内含子可以用作间隔子以分离一个核酸构建体中的多个蛋白质编码序列，或者内含子可以在一个蛋白质编码序列内部使用以例如稳定mrna。如果在蛋白质编码序列内使用它们，它们与所包括的切除位点“同框”插入。内含子也可能与启动子关联以改善或修饰表达。
[0097]
可用于本发明的内含子的非限制性示例包括来自以下基因的内含子：adhi基因(例如，adh1-s内含子1、2和6)、泛素基因(ubi1)、rubisco小亚基(rbcs)基因、rubisco大亚基(rbcl)基因、肌动蛋白基因(例如，肌动蛋白-1内含子)、丙酮酸脱氢酶激酶基因(pdk)，硝酸还原酶基因(nr)、重复碳酸酐酶基因1(tdca1)、psba基因、atpa基因或其任何组合。
[0098]
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”，或者可以包含在表达盒内。表达盒和/或载体可包含本发明的一个或多于一个多核苷酸和/或核酸构建体。当多于一个的多核苷酸和/或核酸构建体包含在表达盒或载体中时，可认为该一多于一个的多核苷酸和/或核酸构建体“堆叠”在表达盒/核酸构建体中。在一些实施方案中，宿主植物还可以具有多个附接的共生体，这些共生体以任何组合方式将表达盒的表达产物
递送到宿主植物，并且也可以被认为是“堆叠的”。这些可能包括使用表达盒，该表达盒具有一个或多个多核苷酸和/或核酸构建体，用于以堆叠配置的任何组合产生一个或多个表达产物至宿主植物。
[0099]
如本文所用，“表达盒”指包含目的核苷酸序列(例如，本发明的核酸构建体(例如，合成tracr核酸构建体、合成crispr核酸构建体、合成crispr阵列、嵌合核酸构建体；编码目的多肽的核苷酸序列、编码cas9核酸酶的核苷酸序列))的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列与至少一个调控序列(例如，启动子)可操作地关联。因此，本发明的一些方面提供了设计用于表达本发明的核苷酸序列的表达盒。
[0100]
包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着其至少一个组分相对于其至少一个其他组分是异源的。表达盒也可以是天然存在的但已经以可用于异源表达的重组形式获得的表达盒。
[0101]
表达盒还可任选地包括在所选宿主细胞中起作用的转录和/或翻译终止区(即终止区)。多种转录终止子可用于表达盒，并负责终止目的异源核苷酸序列以外的转录和正确的mrna多聚腺苷酸化。终止区可以是对于转录起始区天然的，可以是对于可操作连接的目的核苷酸序列天然的，可以是对于宿主细胞天然的，或者可以是来源于另一个来源(即，对启动子、对目的核苷酸序列、对宿主或其任何组合来说是外源或异源的)。
[0102]
表达盒还可包括可选择标志物的核苷酸序列，其可用于选择转化的宿主细胞。如本文所用，“可选择标志物”是指当表达时将不同表型赋予表达标志物的宿主细胞的核苷酸序列，从而允许将此类转化细胞与不具有标志物的细胞区分开来。这种核苷酸序列可以编码可选择或可筛选标志物，这取决于标志物是否赋予可通过化学手段(例如通过使用选择剂(例如抗生素等))选择的性状，或者取决于标志物是否仅仅是可通过观察或测试，例如通过筛选(例如荧光)来识别的性状。当然，本领域已知许多合适的可选择标志物的示例，并且可以在本文描述的表达盒中使用。
[0103]
除了表达盒之外，本文所述的核酸分子和核苷酸序列可结合载体使用。术语“载体”指用于将核酸(或多个核酸)转移、递送或引入细胞的组合物。载体包含核酸分子，该核酸分子包含待转移、递送或引入的核苷酸序列。用于宿主生物体转化的载体在本领域是众所周知的。一般类载体的非限制性示例包括但不限于病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、fosmid载体、噬菌体、人工染色体或双链或单链线性或圆形的农杆菌菌种二元载体，其可以是或不是自传播或可移动的。本文定义的载体可通过整合到细胞基因组或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。此外还包括穿梭载体，其指的是能够在两种不同宿主生物体中天然或通过设计复制的dna媒介物，所述宿主生物体可选自放线菌和相关物种、细菌和真核生物(例如高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。在一些代表性实施方案中，载体中的核酸受用于在宿主细胞中转录的适当启动子或其他调节元件控制，并可操作地连接至该启动子或其他调节元件。载体可以是在多个宿主中起作用的双功能表达载体。对于基因组dna而言，这可能包含其自身的启动子或其他调节元件，对于cdna而言，这可能受适当的启动子或其他调节元件的控制以便在宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸分子和/或表达盒可包含在本文所述和本领域已知的载体中。
[0104]
如本文所用，就宿主植物而言的“修饰”及其语法变体，指至少一种宿主植物特征
的改变，而不同时改变宿主植物基因组或基因型。
[0105]
本文使用的术语“接种”、“接种的”及其语法变体是指将生物实体(即植物)与具有生物活性的组合物(例如，形成共生体的接种物)接触的行为。具有生物活性的组合物可称为接种物(例如，形成共生体的接种物)。
[0106]
如本文所用，“接触”、“接触的”及其语法变体是指在适合于进行所需反应(例如，接种、引入、转化、转染、移植等)的条件下将所需反应的组分放置在一起。
[0107]
在多核苷酸(例如，编码植物激素生物合成基因的多核苷酸，目的多核苷酸)的上下文中，“引入”、“引入的”(及其语法变体)是指以使得多核苷酸进入细胞内部的方式将多核苷酸呈递给宿主生物体或所述生物体的细胞(例如，宿主细胞)。如果要引入多于一种多核苷酸，这些多核苷酸可以作为单个多核苷酸或核酸构建体的一部分组装，或者作为分开的多核苷酸或核酸构建体组装，并且可以位于相同的或不同的表达构建体或转化载体上。因此，这些多核苷酸可以在单个转化事件、分开的转化/转染事件中被引入细胞，或者，例如，它们可以通过常规的育种方案被引入生物体。因此，在本发明的一些方面中，可以将本发明的一个或多个多核苷酸或核酸构建体(例如，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸)引入细菌细胞或植物细胞中，用作形成共生体的接种物以生成共生体。
[0108]
本文使用的术语“移植”(及其语法变体)是指将至少一个植物细胞(例如，1、2、3、4、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000、5000、10,000、100,000或更多个细胞)插入宿主植物上的至少一个位点之中/或之上的过程，所述植物细胞包含一种或多种编码至少一种植物激素生物合成酶的多核苷酸和一种或多种目的多核苷酸。
[0109]
本文使用的术语“转化”或“转染”指将异源核酸引入细胞。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施方案中，用本发明的核酸分子稳定地转化宿主细胞或宿主生物体。在其他实施方案中，用本发明的重组核酸分子瞬时转化宿主细胞或宿主生物体。
[0110]
在多核苷酸的背景下，“瞬时转化”表示多核苷酸被引入细胞并且不整合到细胞基因组中。
[0111]
在引入细胞的多核苷酸的上下文中“稳定引入”或“稳定引入的”是指将引入的多核苷酸稳定地并入细胞的基因组中，并且由此用该多核苷酸稳定地转化细胞。
[0112]
本文所用的“稳定转化”或“稳定转化的”表示将核酸分子引入细胞并整合到细胞基因组中。因此，整合的核酸分子能够由其后代遗传，更具体地说，由多个连续世代的后代遗传。本文所用的“基因组”还包括细胞核基因组和质体基因组，因此包括将核酸整合到例如叶绿体或线粒体基因组中。本文所用的稳定转化也可指在染色体外维持的转基因，例如作为微染色体或质粒。
[0113]
可通过例如酶联免疫吸附试验(elisa)或western印迹或质谱法检测瞬时转化，这些方法可检测由引入生物体的一个或多个转基因编码的肽或多肽的存在。例如，可以通过对细胞基因组dna的southern印迹杂交测定法来检测细胞的稳定转化，所述southern印迹杂交分析使用与引入生物体(例如，植物、哺乳动物、昆虫、古细菌、细菌等)的转基因的核苷酸序列特异性杂交的核酸序列。例如，可以通过对细胞rna的northern印迹杂交测定法来检测细胞的稳定转化，所述northern印迹杂交分析使用与引入植物或其他生物体的转基因的核苷酸序列特异性杂交的核酸序列。细胞的稳定转化也可通过例如聚合酶链反应(pcr)或本领域已知的其他扩增反应来检测，使用与转基因的靶序列杂交的特定引物序列，从而扩
增转基因序列，其可根据标准方法检测。也可通过本领域公知的直接测序和/或杂交方案检测转化。
[0114]
如本文所述，本发明的多核苷酸、核酸构建体、表达盒稳定地并入共生体的基因组或形成共生体的接种物的细胞中。
[0115]
本发明的重组核酸分子/多核苷酸可通过本领域技术人员已知的任何方法引入细胞。本发明的方法不依赖于将一个或多个核苷酸序列引入生物体的特定方法，只需要它们能够进入生物体的至少一个细胞的内部。
[0116]
在本发明的一些实施方案中，细胞的转化包括细胞核转化。在其他实施方案中，细胞的转化包括质体转化(例如叶绿体转化)。
[0117]
转化原核生物和真核生物(包括植物和细菌细胞)的程序是本领域是众所周知的并在众多文献中进行了描述(例如，参见jiang等人，2013.nat.biotechnol.31:233-239；ran等人，nature protocols 8:2281
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2308(2013))。转化方法的非限制性示例包括通过以下的转化：细菌介导的核酸递送(例如，通过农杆菌)、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸whisker介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米粒子介导的转化、超声处理、渗透、peg介导的核酸摄取，以及导致核酸进入植物细胞的任何其他电、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任何组合。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括miki等人("procedures for introducing foreign dna into plants"于methods in plant molecular biology and biotechnology,glick,b.r.and thompson,j.e.,eds.(crc press,inc.,boca raton,1993),pages 67-88)和rakowoczy-trojaowska(cell.mol.biol.lett.7:849-858(2002))。酵母转化的一般指南包括guthrie和fink(1991)(guide to yeast genetics and molecular biology.于methods in enzymology,(academic press,san diego)194:1-932)和与细菌转化相关的方法指南包括aune和aachman(appl.microbiol biotechnol 85:1301-1313(2010))。
[0118]
如果要引入多于一种的多核苷酸，它们可以作为单个核酸构建体的一部分组装，或者作为分开的核酸构建体组装，并且可以位于相同的或不同的核酸构建体上。因此，核苷酸序列可以在单个转化事件中或在分开的转化事件中被引入目的细胞，或者可替换地，在相关的情况下，可以作为育种方案的一部分将核苷酸序列并入植物中。
[0119]
本发明中的术语“t-dna”指转移dna，其为本领域已知的要被转移到(转化到)受农杆菌感染的植物的基因组中的农杆菌菌种中的一种dna区段。
[0120]
如本文所用，术语“单一菌株接种”指用单一细菌菌株接种植物细胞，其中期望用于转化植物细胞的编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和至少一个目的多核苷酸存在于单一细菌菌株中。
[0121]
如本文所用，术语“共接种/共同接种”指用至少两种细菌菌株接种植物细胞，其中一种菌株携带编码植物激素生物合成酶的多核苷酸，而另外的菌株携带转化植物细胞所需的至少一种目的多核苷酸。
[0122]
本文所用的“形成共生体的接种物”指可用于接种宿主植物以产生本文所述共生体的组合物。在一些实施方案中，“形成共生体的接种物”可包含核酸构建体，其包含本文所述的编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和本文所述的目的多核苷酸。在一些实施方案
2.5.1.27)。可使用植物激素生物合成酶的任何组合，其可启动植物细胞的自发分裂以形成本文所述的形成共生体的接种物和共生体。在一些实施方案中，可与本发明一起使用的植物激素生物合成酶组合包括但不限于，seq id no:1/2和seq id no:3/4以及任选地，seq id no:5/6；seq id no:8和seq id no:9；seq id no:10和seq id no:11；和/或seq id no:12和seq id no:13。可启动植物细胞中的自主复制的编码生长素植物激素生物合成酶的多核苷酸和编码细胞分裂素植物激素生物合成酶的多核苷酸的任何组合可用于生成本文所述的共生体和形成共生体的接种物。
[0124]“目的多核苷酸”是指编码用于在共生体中表达并任选地从共生体运输到宿主植物(在所述宿主植物上的一个或多个位点处附着有共生体)中的分子(例如，一种或多于一种多肽、肽、编码rna或非编码rna；例如，生物活性分子)的多核苷酸。在一些实施方案中，目的多核苷酸可编码生物活性分子或可编码生物活性分子的生物合成酶(例如，参与生物活性分子生物合成的多肽)。
[0125]
本文所用的“修饰宿主植物特征”是指通过本发明的共生体在宿主植物上生长来改变宿主植物的至少一个方面或响应。这类方面可包括存在生物分子(在共生体中产生并运输至宿主植物)，该生物分子在宿主植物中未以其他方式发现或在宿主植物中以减少的量发现(例如，在不包含共生体的宿主植物中未发现或以减少的量存在)，包括但不限于：杀虫生物分子、抗微生物生物分子(抗细菌，抗真菌)、杀线虫生物分子、抗病毒生物分子、除草剂生物分子、赋予除草剂抗性/耐受性的生物分子、赋予疾病抗性/耐受性的生物分子、赋予非生物应激抗性/耐受性的生物分子、修饰植物结构和生长/形态的生物分子(例如，编码影响生长/形态、植物激素等的多肽和其他因子的核酸(例如，非编码核酸))、生物刺激剂、rna、适配体和/或药物。在一些实施方案中，“经修饰的宿主植物特征”包括超过通常在宿主植物中发现的量的生物分子的增加量(例如，增加约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％)。在一些实施方案中，“经修饰的宿主植物特征”包括对例如昆虫、除草剂、植物病原体(例如，植物病原性细菌、真菌和/或病毒)、线虫、环境因素(例如，热、冷、盐度等)的改变的应答。在一些实施方案中，具有经修饰的特征的宿主植物可包含共生体，其产生除草剂并将其运输到宿主植物，从而杀死宿主植物。因此，在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征可以是除草剂生物分子的存在和宿主植物的死亡。在一些实施方案中，“修饰宿主植物特征”可包括修饰宿主植物的两个或更多个特征(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个特征)。因此，包含本发明共生体的宿主植物的经修饰的特征可以是在不包含本发明共生体的宿主植物中不另外存在(或以减少的量存在)的两种或更多种生物分子(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)的存在，和/或包含本发明共生体的宿主植物的经修饰的特征可以包括在不包含本发明共生体的宿主植物中未另外观察到的两种或更多种经改变或修饰的应答。为了在包含本发明共生体的宿主植物中获得两种或更多种经修饰的特征(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多种经修饰的特征)，植物上的共生体可包含两种或多种poi和/或共生体可包含两种或更多种共生体(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多种共生体)，其中两种或更多种共生体中的至少两种各自包含至少一种不同于另一种共生体中包含的poi的poi。
[0126]
如本文所用，“共生体”指包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，至少一种编码一种或多种植物激素生物合成酶的多核苷酸)和目的多核苷酸的植物细胞或多个植
物细胞，其中一种或多种植物激素生物合成酶是细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶，其中共生体生长在宿主植物上。“共生体”的细胞由于编码植物激素生物合成酶的多核苷酸的表达而自发分裂。“共生体”可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000或更多个细胞。因此，在一些实施方案中，共生体可以是包含至少一种psym的单一植物细胞，所述psym是质粒，其包含至少一个编码一个或多个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个多核苷酸)和至少一个(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个)目的多核苷酸(poi)，或者它可以包含两个或更多个细胞，每个细胞都包含至少一种psym，所述psym是质粒，其包含至少一个编码一个或多个植物激素生物合成酶的多核苷酸和至少一个目的多核苷酸(poi)。共生体的细胞自发分裂，在植物上形成未分化的多细胞结构。在一些实施方案中，所形成的未分化多细胞结构(例如共生体)在视觉上可类似于例如节瘤、植物食物体、dormatia、花外蜜腺、结节、植物赘生物或瘿瘤，但至少通过共生体中表达的转基因在生物化学/遗传上不同。
[0127]
在一些实施方案中，共生体可从原始宿主植物中移出，在实验室环境中培养，和/或移植到另一植物上(例如，可用作形成共生体的接种物)。在培养共生体或来自共生体的至少一个细胞的情况下，“子共生体材料”可用于指从宿主植物移出的原始材料，随着时间的推移形成并从其繁殖的新共生体材料。
[0128]
本发明涉及一种宿主植物，其包含至少一种经修饰的特征而不修饰宿主植物的基因组。本发明进一步涉及用于制造宿主植物的方法和组合物，该宿主植物包括至少一种经修饰的特征，而不修饰宿主植物的基因组。
[0129]
本发明利用对生长素和细胞分裂素基因在植物细胞中表达时可导致植物细胞自主分裂形成未分化的多细胞结构的理解。在自然界中，此类结构包括例如，由农杆菌属物种感染植物引发的瘿瘤。本发明者利用这种生成自主分裂细胞的能力以及在自主分裂细胞中表达目的多核苷酸(poi)，从而生成通过poi的表达产生产物的未分化多细胞结构(共生体)。了解到这种未分化的多细胞结构可生长在宿主植物上，本发明的发明人现在已经唯一地证明，表达poi的本发明的未分化多细胞结构(本发明的共生体)可用于向宿主植物递送产物，并修饰宿主植物的特征而不修饰宿主植物的基因组。此类植物(例如宿主植物)和相关产物(共生体和形成共生体的接种物)是使用本文所述方法和组合物的各种实施方案以及本文所提供的各种实施方案的众多变体和添加(对于本领域技术人员将是明显的不脱离本发明)来产生的。
[0130]
在一些实施方案中，本发明提供了一种形成共生体的接种物，该形成共生体的接种物包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶。
[0131]
在一些实施方案中，形成共生体的接种物可以是核酸组合物，其包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸(例如，psym)，其可递送到宿主植物以产生如本文所述的共生体。在一些实施方案中，形成共生体的接种物可以是细胞(例如，细菌细胞或植物细胞)，其包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸(例如，包含
psym)，其可移植到植物(例如，宿主植物)的至少一个位点上以产生如本文所述的共生体。
[0132]
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和至少一个目的多核苷酸，其中植物激素生物合成酶是细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶。如本文所述，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸可编码一种或多种植物激素生物合成酶。在一些实施方案中，一种或多种植物激素生物合成酶可由超过一种多核苷酸编码。也就是说，当超过一种的植物激素生物合成酶包含在核酸构建体中时，它可以编码在同一个多核苷酸或分开的多核苷酸上。
[0133]
可用于本发明的形成共生体的接种物的植物激素生物合成酶可以是可在植物细胞中表达的任何生长素或细胞分裂素生物合成酶，以产生自主分裂或复制的植物细胞，任选地产生愈伤组织培养物、悬浮培养物和/或未分化的多细胞结构。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶或编码该酶的多核苷酸可来自细菌物种，例如细菌生长素生物合成酶或细菌细胞分裂素生物合成酶。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶或编码该酶的多核苷酸可来自植物物种，例如植物生长素生物合成酶或植物细胞分裂素生物合成酶。编码可用于本发明的植物激素生物合成酶的示例多核苷酸包括但不限于seq id no:1、3、5或21的核苷酸序列中的任一个或与其具有至少约80％同一性的核苷酸序列(例如，80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)。在一些实施方案中，编码可用于本发明的植物激素生物合成酶的多核苷酸编码seq id no:2、4、6-20、22或23的氨基酸序列中的任一个或与其具有至少约80％同一性的氨基酸序列(例如，80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)。可用于本发明的示例植物激素生物合成多肽包括但不限于seq id no:2、4、6-20、22或23的氨基酸序列中的任一个或与其具有至少约80％同一性的氨基酸序列(例如，80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶是生长素生物合成酶。可用于本发明的生长素生物合成酶包括但不限于吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)(ec编号：ec 3.5.1.4)、酰胺酶1(ec 3.5.1.4)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)(ec 1.13.12.3)、吲哚-3-乳酸合酶(ec 1.1.1.110)、l-色氨酸-丙酮酸氨基转移酶1(ec 2.6.1.99)、色氨酸氨基转移酶相关蛋白1(ec 2.6.1.27)、吲哚-3-乙醛氧化酶(ec 1.2.3.7)和/或色氨酸脱羧酶1/色氨酸脱羧酶2(ec4.1.1.105)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶是细胞分裂素生物合成酶。一种可用于本发明的细胞分裂素生物合成酶包括但不限于：异戊烯基转移酶(ipt)(同义词：磷酸腺苷-异戊烯基转移酶；腺苷酸二甲基烯丙基转移酶；(二甲基烯丙基)腺苷-trna-甲基硫代转移酶)(e.c.编号：2.5.1.27或2.5.1.75或2.5.1.112)和/或tzs(同义词：二甲基转移酶、异戊烯基转移酶、反式玉米素产生蛋白、腺苷酸二甲基烯丙基转移酶)(ec 2.5.1.27)。
[0134]
在一些实施方案中，编码吲哚-3-乙酰胺水解酶(例如iaah、aux2、tms2)(e.c.编号：ec 3.5.1.4)的多核苷酸包括但不限于与seq id no:1具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的吲哚-3-乙酰胺水解酶多核苷酸可编码与seq id no:2、7、9、11或13中任何一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，吲哚-3-乙酰胺水解酶可包含与seq id no:2、7、9、11或13的任何一个氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。可用于本发明实施方案的进一步示例性吲哚-3-乙酰胺水解酶(以及编码该酶的多核苷酸)的登录号(uniprot/ncbi)包括但不限于p06618、aad30488.1、
wp_010974823.1、wp_1726911448.1、wp_172690897.1、wp_10891462.1、wp_1726911118.1、nsz87871.1、baa76345.1、caa39649.1wp_070167543.1、p25016.1、wp156536347.1、nsy72470.1、wp_156536347.1、wp_156638711.1、wp_045231698.1、wp_174183178.1和/或aab41868.1。
[0135]
在一些实施方案中，酰胺酶1(例如，ami1，atami1)(ec 3.5.1.4)可包含与seq id no:14(at1go8980)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的酰胺酶1多核苷酸编码与seq id no:14具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0136]
在一些实施方案中，编码色氨酸2-单加氧酶(例如iaam、tms1、aux1)(ec 1.13.12.3)的多核苷酸包括但不限于seq id no:3的核苷酸序列或与seq id no:3具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的色氨酸2-单加氧酶多核苷酸可编码与seq id no:4、8、10或12中的任何一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的色氨酸2-单加氧酶可包含与seq id no:4、8、10或12的任何一个氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。进一步示例性色氨酸2-单加氧酶(以及编码该酶的多核苷酸)的登录号(uniprot/ncbi)包括但不限于p25017、aad30489.1、baa76346.1、aym09598.1、aym14954.1、aym61129.1cab44640.1、cux71287.1、wp_040132230.1、aaf77123.1、wp_104680323.1、p25017.1、p0a3v2.1、mbb3947410.1、wp_162163087.1、nsy99416.1、akc10880.1、avh45197.1和/或aydo4913.1。
[0137]
在一些实施方案中，吲哚-3-乳酸合酶(ec 1.1.1.110)可包含与seq id no:6的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的吲哚-3-乳酸合酶多核苷酸可以是seq id no:5的核苷酸序列或与seq id no:5具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，吲哚-3-乳酸合酶多核苷酸编码与seq id no:6具有至少80％同一性的氨基酸序列。可用于本发明的进一步示例性吲哚-3-乳酸合成酶的登录号(uniprot)包括但不限于wp_052675630.1、wp_083212579.1、wp_172691447.1和/或wp_010891463.1。
[0138]
在一些实施方案中，可用于本发明的l-色氨酸-丙酮酸氨基转移酶1(例如，taa1、tir2、ckrc1、sav3、wei8)(ec 2.6.1.99)可包含与seq id no:15(uniprot q927n2)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，l-色氨酸-丙酮酸氨基转移酶1多核苷酸编码与seq id no:15具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0139]
在一些实施方案中，可用于本发明的色氨酸氨基转移酶相关蛋白1(例如tar1)(ec 2.6.1.27)可包含与seq id no:16(uniprot q9lr29)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，色氨酸氨基转移酶相关蛋白1多核苷酸编码与seq id no:16具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0140]
在一些实施方案中，可用于本发明的吲哚-3-乙醛氧化酶(例如，iaa氧化酶、ao-1、ao1、zmao1、ntao1、atao1、atao-1)(ec 1.2.3.7)可包含与seq id no:17(uniprot o23887)和/或seq id no:18(uniprot q7g193)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，吲哚-3-乙醛氧化酶多核苷酸编码与seq id no:17和/或seq id no:18具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0141]
在一些实施方案中，色氨酸脱羧酶1(例如tdc1)和/或色氨酸脱羧酶2(例如tdc2)
(ec4.1.1.105)可用于本发明用于启动植物细胞中的自主细胞分裂。可用于本发明的色氨酸脱羧酶1可包括但不限于包含与seq id no:19(uniprot q6zjk7)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的那些。在一些实施方案中，色氨酸脱羧酶1多核苷酸编码与seq id no:19具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，色氨酸脱羧酶2(例如tdc2)(ec4.1.1.105)可包括但不限于包含与seq id no:20(uniprot q7xhl3)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的那些。在一些实施方案中，色氨酸脱羧酶2多核苷酸编码与seq id no:20具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0142]
可用于在植物细胞中启动自主细胞分裂的细胞分裂素生物合成酶包括但不限于被称为异戊烯基转移酶(ipt)的细胞分裂素生物合成酶。ipt酶的同义词包括磷酸腺苷异戊烯基转移酶；腺苷酸二甲基烯丙基转移酶；(二甲基烯丙基)腺苷-trna甲基硫代转移酶(e.c.编号：2.5.1.27、2.5.1.75或2.5.1.112)。在一些实施方案中，编码ipt的多核苷酸包含seq id no:21的核苷酸序列或与seq id no:21具有至少80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的ipt多核苷酸可编码与seq id no:22中任何一个具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，可用于本发明的ipt可包含与seq id no:22具有至少80％同一性的氨基酸序列。进一步示例性ipt多肽的登录号(uniprot/ncbi)包括但不限于wp_010891460.1、nz87873.1；wp_172690592.1；cab44641.1、wp_172690722.1；baa76344.1；wp_156638720.1、wp_104680324.1、nta56762.1、wp_010892365.1、aab41870.1；wp_032488312.1、wp_156536348.1、wp_065657522.1；wp_0324488268.1；aaz50399.1、wp_080830665.1；aym20353.1、wp_174005331.1、wp_173994930.1、wp_111221726.1、wp032489582.1、wp_174156215.1、wp_17404522.5.1、wp_070167542.1、wp_172691205.1和/或caa54540.1。
[0143]
其他细胞分裂素生物合成酶包括腺苷酸二甲基烯丙基转移酶(例如tzs)(ec 2.5.1.27)。tzs酶的同义词包括二甲基转移酶、异戊烯基转移酶、反式玉米素产生蛋白和腺苷酸二甲基烯丙基转移酶。可用于本发明的tzs多肽可以包括但不限于包含与seq id no:23(uniprot p14011)的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列的那些。在一些实施方案中，tzs多核苷酸编码与seq id no:23具有至少80％同一性的氨基酸序列。
[0144]
生长素和细胞分裂素生物合成酶和/或编码生长素和细胞分裂素生物合成酶的多核苷酸(例如本文所述的那些)的任何组合可用于产生共生体和/或形成共生体的接种物。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中编码的植物激素生物合成酶可以是吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)和/或异戊烯基转移酶(ipt)。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸，该酶是吲哚-3-乳酸合酶。
[0145]
本发明人已经显示，如本文所述的在植物细胞中表达编码植物激素生物合成酶的多核苷酸可以在植物(例如，山核桃、柑橘、马铃薯、番茄和本氏烟草)上诱导未分化细胞生长和共生体形成。从与冠瘿病和其它类似病症相关的文献中可以了解到，细胞分裂素和生长素水平的升高是由植物基因组整合了含有植物激素生物合成酶(例如，iaah、iaam和ipt)的t-dna引起的，并且用t-dna转化的细胞产生的生长素和细胞分裂素的增加促进了细胞分裂。我们利用这一知识开发了本发明，从而产生了本发明的共生体和形成共生体的接种物，以及在不修饰宿主植物基因组的情况下具有修饰特征的宿主植物。未分化愈伤组织的生长
是生长素和细胞分裂素水平升高以及维持相对较高的细胞分裂素与生长素比值的结果。细胞分裂素和生长素的升高通常比在非致瘤性组织中观察到的高两倍至超过100倍。例如，在烟草细胞中，观察到细胞分裂素与生长素的比值约为40:1。一般来说，对于启动自主分裂和形成未分化生长，细胞分裂素与生长素的比值范围为约5:1至约50:1。如本领域所知，产生未分化生长所需的细胞分裂素与生长素的比值可以根据植物物种和用于检测不同植物激素水平的分析方法而变化。
[0146]
在一些实施方案中，一种包含本发明核酸构建体，但不包含如本文所述的目的多核苷酸的植物细胞，可称为“活化细胞”，所述核酸构建体包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸，其中该植物激素生物合成酶是细胞分裂素生物合成酶和生长素生物合成酶。因此，本文所用的“活化细胞”指的是包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸的植物细胞，其中该植物激素生物合成酶是可自主复制的细胞分裂素生物合成酶和生长素生物合成酶。这种活化细胞可用于产生“活化组织”。一旦将目的多核苷酸导入活化细胞或活化组织的细胞中，活化植物细胞或组织就可以被称为形成共生体的接种物。通过将形成共生体的接种物移植到宿主植物的至少一个位点上来产生共生体。由于可以出于各种目的从共生体中取得细胞(一个或多个细胞(例如，组织))，这些细胞(或组织)本身可以称为共生体，或者当移植到宿主植物的至少一个位点上时可以被视为形成共生体的接种物。
[0147]
在一些实施方案中，来自天然形成的瘿瘤、节瘤、植物食物体、dormatia、花外蜜腺、节结、植物赘生物和/或自主复制的胚乳的细胞可用于产生形成共生体的接种物。来自天然包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸的这种结构的细胞是自主复制的。这种细胞可用于通过用至少一种poi转化细胞来生成形成共生体的接种物，其中产生的形成共生体的接种物包含具有编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和至少一种poi的细胞。与其它形成共生体的接种物类似，以这种方式产生的形成共生体的接种物也可用于在宿主植物上产生共生体。
[0148]
对本发明的形成共生体的接种物有用的目的多核苷酸指的是编码本文所述分子(例如，一种或多于一种多肽、肽、编码rna或非编码rna；如，生物活性分子)的多核苷酸，用于在共生体中表达，并且任选地从共生体转运到宿主植物中，共生体在一个或多个位点附着在该宿主植物上，任选地，其中当转运到宿主植物中时，该分子可以赋予宿主植物新特征，而不改变宿主植物的基因型或基因组。在一些实施方案中，目的多核苷酸可以编码生物分子和/或生物活性分子，和/或可以编码用于本文所述的生物分子和/或生物活性分子的生物合成酶(例如，参与生物分子和/或生物活性分子生物合成的多肽)。包含在形成共生体的接种物中的“目的多核苷酸”可以是一种目的多核苷酸，或者可以是两种或更多种目的多核苷酸。当两种或更多种目的多核苷酸包含在形成共生体的接种物中时，该形成共生体的接种物可被称为“堆叠的(stacked)”形成共生体的接种物。堆叠的形成共生体的接种物可用于在宿主植物上形成一个或多个堆叠的共生体。作为堆叠的又一示例，当形成共生体的接种物包含细菌细胞时，该细菌细胞可包含一种质粒或至少两种不同质粒上的至少两种不同poi。
[0149]
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以包含编码质体(plast)多肽(例如，质体性(plasticity)多肽)的多核苷酸。可用于本发明的质体多肽可以是现在已知的或以后发现的任何质体多肽，其可以对使用本发明的核酸构建体形成的共生体的形态和结构
带来益处(参见，例如leon otten,curr topics microbiol immunol 418:375-419(2018))。对本发明核酸构建体有用的示例性质体多肽包括但不限于表1中提供的那些。在一些实施方案中，质体多肽可以是6b、rolb、rolc和/或orf13。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体中可包含超过一种编码质体多肽的多核苷酸。
[0150]
在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或形成共生体的接种物的目的多核苷酸可以可操作地连接到调控元件，包括但不限于启动子序列、终止子序列和/或内含子。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸都与启动子可操作地连接时，它们可以各自与同一个启动子或分别的启动子可操作地连接，以任何组合方式。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸都与终止子序列可操作地连接时，它们可以各自与同一个终止子或分别的终止子可操作地连接，以任何组合方式。
[0151]
包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸的本发明的核酸构建体可以编码超过一个植物激素生物合成酶。在一些实施方案中，所编码的超过一个植物激素生物合成酶可以可操作地连接到单一启动子或以任何组合方式的不同启动子。举例来说，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸包含编码吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)的多核苷酸、编码色氨酸2-单加氧酶(iaam)的多核苷酸和编码异戊烯基转移酶(ipt)的多核苷酸时，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸、编码ipt的多核苷酸(和/或编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)和目的多核苷酸可以各自可操作地连接到单一启动子或至少两个分开的启动子，以任何组合方式。在一些实施方案中，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸和编码ipt的多核苷酸(和/或编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)可以可操作地连接到单一启动子，并且至少一种目的多核苷酸可以可操作地连接到分开的启动子。在一些实施方案中，编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸可以可操作地连接到启动子，该启动子可以是与可操作地连接到编码植物激素生物合成酶的任何其它多核苷酸(例如，编码iaah、iaam和/或ipt的多核苷酸)的启动子同一个的启动子或分开的启动子。
[0152]
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体还可以包含编码质体多肽的多核苷酸，该多核苷酸可以可操作地连接到启动子上，其中该启动子可以是与可操作地连接到植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码iaah、iaam和/或ipt的多核苷酸，或编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)的启动子同一个的启动子或分开的启动子。正如本领域技术人员所理解的那样，本文所述的任何组合多核苷酸可以置于一种或多种调控元件(包括但不限于启动子和/或终止子)的控制之下(与之可操作地连接)，以分开的或相同调控元件的任何组合方式。
[0153]
在一些实施方案中，调控元件(例如，启动子、终止子、内含子)对于与其可操作地连接的多核苷酸或者共生体或形成共生体的接种物的细胞而言可以是内源性的。在一些实施方案中，调控元件(例如，启动子、终止子、内含子)对于与其可操作地连接的多核苷酸或者共生体或形成共生体的接种物的细胞而言可以是异源性的(例如，重组的；嵌合的)。
[0154]
在植物细胞中提供所需表达水平和表达位置且在植物中具有功能的任何启动子，都可以用于本发明。因此，例如，启动子可以是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。在一些实施方案中，可诱导的启动子可以诱导程序性细胞死亡。示例性启动子包括但不限于camv 35s启动子或植物泛素启动子(ubi，例如ubi-1)。上文公开了其
它启动子。
[0155]
在一些实施方案中，为了在形成共生体的接种物中使用，目的多核苷酸可以编码与靶向序列可操作地连接的多肽，从而使得该多肽可以在表达时从共生体中移位到宿主植物内和/或定位到宿主植物的所需部位。靶向序列的选择将取决于由目的多核苷酸编码的多肽的所需位置。在一些实施方案中，靶向序列可用于将蛋白质靶向膜、亚细胞位置或细胞外位置。在一些实施方案中，靶向序列是内质网靶向序列、线粒体靶向序列、叶绿体靶向序列、核靶向(核定位)序列、液泡靶向序列、过氧化物酶体靶向序列、溶酶体靶向序列、膜靶向序列或植物病毒的运动蛋白。在一些实施方案中，目的多核苷酸可以编码与多于一种(例如，1、2、3、4、5或更多种)靶向序列可操作地连接的多肽，从而使得该多肽在表达时可以从共生体移位出来和/或定位到例如宿主植物中的多于一个位置。
[0156]
在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸一起或分开包含在一个或多个核酸构建体(例如，一个或多个表达盒)中，以任何组合方式。在一些实施方案中，编码至少一种质体多肽的多核苷酸可以包含在核酸构建体中，任选地，其中编码至少一种质体多肽的多核苷酸包含在与编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸相同或分开的核酸构建体(例如，表达盒)中。本发明的核酸构建体可以包含在表达盒中，或者可以是表达盒。在一些实施方案中，本发明的表达盒可以包含在载体中。可以使用任何适于将核酸构建体导入细胞内的载体。举例来说，载体可以包括但不限于质粒、t-dna、细菌人工染色体、病毒载体或二元细菌人工染色体。
[0157]
在一些实施方案中，本发明的核酸构建体和/或包含该核酸构建体的表达盒和/或载体可以包含在细胞中，任选植物细胞或细菌细胞。相应地，本发明的形成共生体的接种物可以包含细胞中编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中该植物激素生物合成酶包括至少一种细胞分裂素生物合成酶和至少一种生长素生物合成酶，任选地，其中该细胞是植物细胞或细菌细胞。
[0158]
在一些实施方案中，形成共生体的接种物包含细胞，该细胞包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中该细胞可以是细菌细胞，任选包含iv型分泌系统(t4ss，例如t4ass，(如virb/d4系统)、t4bss)或iii型分泌系统(t3ss)的细菌细胞。在一些实施方案中，该细菌细胞可以是农杆菌属物种(agrobacterium spp.)、根瘤菌属物种(rhizobium spp.)、中慢生根瘤菌属物种(mesorhizobium spp.)、中华根瘤菌属物种(sinorhizobium spp.)、慢生根瘤菌属物种(bradyrhizobium spp.)、叶杆菌属物种(phyllobacterium spp.)、苍白杆菌属物种(ochrobactrum spp.)、固氮菌属物种(azobacter spp.)、新月藻属物种(closterium spp.)、克雷伯氏菌属物种(klebsiella spp.)、红螺菌属物种(rhodospirillum spp.)或黄单胞菌属物种(xanthomonas spp.)的细胞。在一些实施方案中，农杆菌属物种细胞可以是根癌农杆菌(例如，生物变型1)、发根农杆菌(例如，生物变型2)、葡萄农杆菌(例如，生物变型3)或a.fabrum(例如，c58菌株)的细胞。在一些实施方案中，假单胞菌属物种(pseudomonas spp.)细胞可以是萨氏假单胞菌萨氏致病变种(p.savastanoi pv.savastanoi)的细胞。
[0159]
在自然环境(例如冠瘿)和人工环境(植物转化)下，细菌将dna转移到植物细胞的能力都是众所周知的。世界各地的研究人员已经利用了农杆菌属物种将dna转移到植物细胞的天然能力，并利用这种能力扩展到远远超出该细菌的天然宿主范围。正如植物病害和
植物dna转移领域的技术人员所知，农杆菌属物种的天然宿主范围非常广泛。然而，至少自20世纪80年代初以来，通过人类干预，这些细菌将dna转移到植物的能力甚至已经进一步扩展到许多其它非天然宿主的物种。表2中提供了作为农杆菌属物种的天然宿主的植物和许多已被证明能够使用农杆菌属物种进行转化的植物的示例性列表。这些和其它植物属和种可用作宿主植物或用于产生本文所述的形成共生体的接种物。在一些实施方案中，可用作宿主植物的植物属和种以及可由其制备形成共生体的接种物的植物属和种包括但不限于表4中提供的那些植物或在下文实施例部分之前的段落中提供的植物列表。
[0160]
在一些实施方案中，形成共生体的接种物包含细胞，该细胞包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中该细胞可以是植物细胞，任选地，其中植物细胞可以来自任何植物，包括但不限于被子植物(例如，双子叶植物或单子叶植物)、裸子植物、藻类(例如，大型藻类，如红藻门(rhodophyta)(红藻类)、褐藻门(phaeophyta)(褐藻类)和绿藻门(chlorophyta)(绿藻类)、金藻纲(chrysophyceae)(金藻类))、苔藓植物、蕨类和/或拟蕨类(即蕨类植物)。
[0161]
当包含在植物细胞中时，包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸的形成共生体的接种物可以是植物愈伤组织或愈伤组织培养物或悬浮培养物的形式。
[0162]
本发明还提供了包含植物细胞的共生体，该植物细胞包含并表达编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸，其中该植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶，并且共生体的植物细胞自主分裂。在一些实施方案中，植物细胞包含至少两个植物细胞(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个细胞)。包含多个细胞的共生体可以形成植物愈伤组织或愈伤组织培养物或悬浮培养物。包含多个植物细胞的共生体可以形成未分化的多细胞结构。
[0163]
对本发明的共生体有用的目的多核苷酸指的是编码本文所述分子(例如，一种或多于一种多肽、肽、编码rna或非编码rna；如，生物分子、生物活性分子)的多核苷酸，用于在共生体中表达，并且任选地从共生体转运到宿主植物中，共生体在一个或多个位点附着在该宿主植物上，任选地其中当转运到宿主植物中时，该分子可以赋予宿主植物新特征，而不改变宿主植物的基因型或基因组。在一些实施方案中，目的多核苷酸可以编码生物分子和/或生物活性分子，和/或可以编码用于如本文所述的生物分子和/或生物活性分子的生物合成酶(例如，参与生物活性分子生物合成的多肽)。包含在共生体中的“目的多核苷酸”可以是一种目的多核苷酸，或者可以是两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或更多种)目的多核苷酸。当两种或更多种目的多核苷酸包含在一个共生体中时，该共生体可以被称为“堆叠的”共生体。此外，在宿主植物上形成的一个或多个共生体，其中至少两个共生体包含不同的poi，可以被称为“堆叠式共生体”。堆叠还可以包括在宿主植物上形成一个或多个共生体，其中所有共生体都包含相同的poi(一种或多种)。
[0164]
在一些实施方案中，包含在共生体中的编码植物激素生物合成酶的多核苷酸可以编码一种或多于一种植物激素生物合成酶。在一些实施方案中，一种或多于一种植物激素生物合成酶可以由一种或多于一种多核苷酸编码。也就是说，当共生体包含编码多于一种植物激素生物合成酶的多核苷酸时，该多于一种植物激素生物合成酶可以编码在与另一种植物激素生物合成酶相同的多核苷酸上，或编码在以任何组合方式的分开的多核苷酸上。
[0165]
可用于本发明共生体的植物激素生物合成酶可以是任何生长素或细胞分裂素生
物合成酶，这些酶可在植物细胞中表达以产生自主分裂或复制的植物细胞，任选地产生未分化的多细胞结构。这些已在上文详细描述，并且包括生长素生物合成酶，其包括但不限于吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)(ec编号：ec 3.5.1.4)、酰胺酶1(ec 3.5.1.4)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)(ec 1.13.12.3)、吲哚-3-乳酸合酶(ec 1.1.1.110)、l-色氨酸-丙酮酸氨基转移酶1(ec 2.6.1.99)、色氨酸氨基转移酶相关蛋白1(ec 2.6.1.27)、吲哚-3-乙醛氧化酶(ec 1.2.3.7)和/或色氨酸脱羧酶1/色氨酸脱羧酶2(ec4.1.1.105)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶是一种细胞分裂素生物合成酶，其可以包括但不限于异戊烯基转移酶(ipt)(别名：磷酸腺苷异戊烯基转移酶；腺苷酸二甲基烯丙基转移酶；(二甲基烯丙基)腺苷trna甲硫基转移酶)(ec编号：2.5.1.27或2.5.1.75或2.5.1.112)和/或tzs(别名：二甲基转移酶、异戊烯基转移酶、反式玉米素产生蛋白、腺苷酸二甲基烯丙基转移酶)(ec 2.5.1.27)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶可以是吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)和/或异戊烯基转移酶(ipt)。在一些实施方案中，本发明的共生体还可以包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸，该酶是吲哚-3-乳酸合酶。
[0166]
在一些实施方案中，本发明的共生体还可以包含编码质体多肽(例如，质体性多肽)的多核苷酸。可用于本发明的质体多肽可以是现在已知的或以后发现的任何质体多肽，其可以对使用本发明的核酸构建体形成的共生体的结构带来益处。可用于本发明共生体的示例性质体多肽包括但不限于表1中提供的那些多肽。在一些实施方案中，质体多肽可以是6b、rolb、rolc和/或orf13。在一些实施方案中，本发明的共生体中可以包含多于一种编码质体多肽的多核苷酸。
[0167]
为了在共生体的细胞中表达，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸可以可操作地连接到调控元件，包括但不限于启动子序列、终止子序列和/或内含子。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸都与启动子可操作地连接时，它们可以各自与同一个启动子或与分开启动子可操作地连接，以任何组合方式。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸都与终止子序列可操作地连接时，它们可以各自与同一个终止子或与分开的终止子可操作地连接，以任何组合方式。
[0168]
举例来说，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸编码的是编码吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)的多核苷酸、编码色氨酸2-单加氧酶(iaam)的多核苷酸和编码异戊烯基转移酶(ipt)的多核苷酸时，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸、编码ipt的多核苷酸和目的多核苷酸可以可操作地连接到单一启动子或者可以可操作地连接到至少两个分开的启动子，以任何组合方式。在一些实施方案中，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸和编码ipt的多核苷酸可以可操作地连接到单一启动子，并且至少一种目的多核苷酸可以可操作地连接到分开的启动子。在一些实施方案中，编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸可以可操作地连接到启动子，该启动子可以是与可操作地连接到编码植物激素生物合成酶的任何其它多核苷酸(例如，编码iaah、iaam和/或ipt的多核苷酸)的启动子相同的启动子或分开的启动子。在一些实施方案中，编码质体多肽的多核苷酸可以可操作地连接到启动子，该启动子可以是与可操作地连接到编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码iaah、iaam和/或ipt的多核苷酸，或编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)的启动子相同的启动子或分开的启动子。正如本领域技术人员所理解的那样，本文所述的任何组合多核苷酸可以置
于一种或多种调控元件(包括但不限于启动子和/或终止子)的控制之下(与之可操作地连接)，以分开的或相同调控元件的任何组合方式。
[0169]
在一些实施方案中，调控元件(例如，启动子、终止子、内含子)对于与其可操作地连接的多核苷酸或共生体的一种或多种植物细胞而言可以是内源性的或异源性的(例如，重组的)。
[0170]
在植物细胞中提供所需表达水平和表达位置且在植物中具有功能的任何启动子，都可以用于本发明。因此，例如，启动子可以是组成型启动子。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子。在一些实施方案中，可诱导的启动子可以诱导程序性细胞死亡。示例性启动子包括但不限于camv 35s启动子或植物泛素启动子(ubi，例如ubi-1)。包括启动子在内的其它调控元件如上文公开的。
[0171]
在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸一起或分别包含在一个或多个核酸构建体(例如，一个或多个表达盒)中，以任何组合方式。在一些实施方案中，编码至少一种质体多肽的多核苷酸可以包含在核酸构建体中，任选地，其中编码至少一种质体多肽的多核苷酸包含在与编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸相同或分开的核酸构建体(例如，表达盒)中。本发明的核酸构建体可以包含在表达盒中，或者可以是表达盒。在一些实施方案中，本发明的表达盒可以包含在载体中。可以使用任何适于将核酸构建体导入细胞内的载体。举例来说，载体可以包括但不限于质粒、t-dna、细菌人工染色体、病毒载体或二元细菌人工染色体。
[0172]
在一些实施方案中，目的多核苷酸可以编码可操作地连接到靶向序列的多肽，从而使得该多肽在共生体中表达时可定位到宿主植物的所需部位。靶向序列的选择将取决于由目的多核苷酸编码的多肽的所需位置。在一些实施方案中，靶向序列可用于将蛋白质靶向膜、亚细胞位置或细胞外位置。在一些实施方案中，靶向序列是内质网靶向序列、线粒体靶向序列、叶绿体靶向序列、核靶向(核定位)序列、液泡靶向序列、过氧化物酶体靶向序列、溶酶体靶向序列或植物病毒的运动蛋白。在一些实施方案中，目的多核苷酸可编码可操作地连接到多于一种(例如，1、2、3、4、5或更多种)靶向序列的多肽，从而使得该多肽在表达时可定位到宿主植物的多于一处所需部位。在一些实施方案中，通过将多肽可操作地连接到多于一种靶向序列，可以将该多肽序贯导向多于一个位置。例如，可操作地连接到叶绿体靶向序列和膜靶向序列的多肽可以首先靶向叶绿体，然后再靶向膜。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸，和/或编码ipt和/或吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)和/或编码至少一种质体多肽的多核苷酸可以与核靶向序列可操作地连接。
[0173]
在一些实施方案中，一种包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸，和/或编码ipt和/或吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)和/或编码至少一种质体多肽的多核苷酸的共生体，该植物激素生物合成酶和/或编码质体多肽的多核苷酸可操作地连接到核靶向序列。
[0174]
在一些实施方案中，共生体可以包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸、编码ipt的多核苷酸)和目的多核苷酸，其中编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸可操作地连接到单一启动子或至少两个分开的启动子，以任何组合方式。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成酶的多核
苷酸编码iaah、iaam和ipt时，编码iaah、iaam和ipt的多核苷酸(一个或多个)可操作地连接到单一启动子，并且目的多核苷酸可操作地连接到分开的启动子。
[0175]
在一些实施方案中，共生体可以包含编码至少一种质体多肽的多核苷酸，该多核苷酸与启动子可操作地连接，任选地，其中编码至少一种质体多肽的多核苷酸可操作地连接到与编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸同一个的启动子或分开的启动子。在一些实施方案中，该启动子、单一启动子、分开的启动子和/或两个或更多个分开的启动子对于共生体的细胞而言是内源性的。在一些实施方案中，该启动子、单一启动子、分开的启动子和/或两个或更多个分开的启动子对于共生体的细胞而言是异源性的。在一些实施方案中，该启动子、单一启动子、分开的启动子和/或两个或更多个分开的启动子中的一种或多种对于共生体的细胞而言可以是内源性的，而该启动子、单一启动子、分开的启动子和/或两个或更多个分开的启动子中的至少一种对于共生体的细胞而言是异源性的。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸对于共生体的植物细胞而言可以是异源性的。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸对于共生体的植物细胞而言可以是内源性的。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸可以与异源启动子(例如，对于编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或对于共生体的植物细胞而言是异源性的)或内源启动子(例如，对于编码植物激素生物合成酶的多核苷酸或对于共生体的植物细胞而言是内源性的)可操作地连接。
[0176]
用作本发明共生体的植物细胞(例如，包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸的植物细胞)可以是任何植物细胞，包括但不限于被子植物细胞(例如，双子叶植物或单子叶植物)、裸子植物细胞、藻类细胞(例如，大型藻类，如红藻门(红藻类)、褐藻门(褐藻类)和绿藻门(绿藻类)、金藻纲(金藻类))、苔藓植物细胞、蕨类和/或拟蕨类细胞(即蕨类植物)。在一些实施方案中，可用于本发明的植物细胞包括但不限于表2或表4中列出的植物细胞，或在下文实施例部分之前的段落中提供的植物列表。在一些实施方案中，植物细胞包括但不限于柑橘类细胞、番茄细胞、玉米细胞、山核桃细胞和烟草细胞。
[0177]
可以将共生体在植物的一个或多个位置移植到植物(例如，宿主植物)上。相应地，本发明还提供了包含至少一种本发明共生体的宿主植物，其中该共生体位于植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位点)上。本发明的植物(例如宿主植物)可以包含位于植物或宿主植物不同位点上的超过一个共生体。如本文所用的，植物上的“位点”可以是植物上的任何位置或用于生长共生体的任何植物部分。共生体的示例性位点或位置包括但不限于外植体、胚、叶、芽、茎、枝、仁、穗、棒、壳、柄、表皮组织、顶端分生组织、花组织(例如，花粉、雌蕊、胚珠、花药、雄蕊、花冠、萼片、花瓣、花托、花丝、花柱、柱头等)、果实、种子、荚、蒴果、子叶、下胚轴、叶柄、块茎、球茎、根、根尖、共生体、节瘤、植物食物体、dormatia、花外蜜腺、节结、植物赘生物或瘿瘤。
[0178]
在一些实施方案中，当共生体包含在宿主植物的至少一个位点上时，包含在共生体中的目的多核苷酸在共生体中表达，并且目的多核苷酸的表达产物和/或使用目的多核苷酸的表达产物制备的产物被转运到宿主植物中。宿主植物可以是任何龄期或大小的野生型植物(例如，幼苗、幼年植物或成熟植物)。宿主植物包括但不限于如本文所述的被子植物(例如，双子叶植物或单子叶植物)、裸子植物、大型藻类(例如，红藻门(红藻类)、褐藻门(褐藻类)和绿藻门(绿藻类)、金藻纲(金藻类))、苔藓植物，和/或蕨类和/或拟蕨类(即蕨类植
物)。在一些实施方案中，可用于本发明的植物包括但不限于表2和/或表4中列出的植物，和/或在下文实施例部分之前的段落中提供的植物列表。在一些实施方案中，可用于本发明的示例性植物包括柑橘类植物(例如，葡萄柚、柑桔、柠檬、酸橙等)、番茄植物、玉米植物、山核桃植物和烟草植物。
[0179]
在一些实施方案中，可以从宿主植物中收获共生体，并且可以从收获的共生体中分离/收集产物，包括生物分子和/或生物活性分子(一种或多种)。任何生物分子或生物活性分子，如本文所述的那些分子，都可以在本发明的共生体中产生并从中收集/分离出来。从共生体和包含共生体的宿主植物中收集的产物可用于该产物适用的任何目的。这种用途的非限制性示例包括特殊化学品、药物、化妆品、润滑剂、染料/颜料、燃料、食物和/或营养制品等。
[0180]
本发明还提供了用于制备本发明组合物(包括形成共生体的接种物、共生体和包含本发明共生体的宿主植物)的方法。本发明的形成共生体的接种物可以是包含一种或多种核酸构建体(例如，1、2、3、4、5或更多种)的组合物，该核酸构建体包含至少一种目的多核苷酸和至少一种编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码一种或多种植物激素生物合成酶(例如，1、2、3、4、5或更多种)的一种或多种多核苷酸(例如，1、2、3、4、5或更多种))，其中该生物合成酶包括生长素生物合成酶和/或细胞分裂素生物合成酶。在一些实施方案中，本发明的形成共生体的接种物可以包含一种或多种细胞(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多种细胞)，这些细胞包含一种或多种核酸构建体，该核酸构建体包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸以及目的多核苷酸，其中该生物合成酶包括生长素生物合成酶和/或细胞分裂素生物合成酶。在一些实施方案中，该细胞是植物细胞。在一些实施方案中，该细胞是细菌细胞。
[0181]
相应地，提供了一种产生形成共生体的接种物的方法，该方法包括将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸导入细胞内，或者将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸导入包含目的多核苷酸的转基因细胞内，其中该植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合成酶和/或生长素生物合成酶，从而产生该形成共生体的接种物。在一些实施方案中，产生形成共生体的接种物的方法还包括培养细胞以产生包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸的细胞群体。
[0182]
本发明还提供了一种产生形成共生体的接种物的方法，该方法包括(a)(i)将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列导入到植物(或其一部分(例如，外植体、茎等))的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点)之中/之上，或将包含上述多核苷酸的植物细胞(例如，包含至少一种编码植物激素编码酶的多核苷酸的活化植物细胞)移植到植物(或其一部分)的至少一个位点上，或将包含上述多核苷酸的细菌细胞(例如，至少一种编码植物激素编码酶的多核苷酸)接种到植物(或其一部分)的至少一个位点上，或者(ii)将编码植物激素生物合成酶的多核苷酸导入到植物(或其一部分(例如，外植体、茎等))的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点)之中/之上，该植物(或其一部分)包含目的多核苷酸序列，或将包含该多核苷酸的植物细胞移植到植物(或其一部分)的至少一个位点上，或将包含该多核苷酸的细菌细胞接种到植物(或其一部分)的至少一个位点上，其中该植物激素生物合成酶是至少一种细胞分裂素生物合
成酶和/或生长素生物合成酶，从而在植物(或其一部分)上产生包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列的共生体；和(b)从植物上的共生体中选择一个或多个细胞(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、1000、2500、5000、10,000、50,000、100,000或更多个细胞；例如来自共生体的一部分，例如约0.005μg至约1g或更多组织)，以提供包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列的一种或多种细胞，从而产生该形成共生体的接种物。在一些实施方案中，当产生形成共生体的接种物的方法包括首先在植物的至少一个位点上产生共生体时，该植物上的至少一个位点位于植物的地上部分。在一些实施方案中，植物上的至少一个位点位于植物的地下部分。在一些实施方案中，产生形成共生体的接种物的方法还可以包括(c)培养来自(b)的一种或多种细胞，以产生包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列的植物细胞的群体(例如，愈伤组织、愈伤组织培养物和/或悬浮培养物)。
[0183]
当植物细胞通过将细胞移植到植物或其一部分上用于产生形成共生体的接种物时，或者当细菌细胞通过将细菌细胞接种到植物或其一部分上用于产生形成共生体的接种物时，该细胞可以是单细胞或者可以是两个或更多个细胞(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个细胞至约100,000个细胞或更多)。当细胞是植物细胞，并且用于产生形成共生体的接种物的植物细胞包含至少一种编码植物激素酶的多核苷酸(例如，编码生长素生物合成酶的多核苷酸和编码细胞分裂素生物合成酶的多核苷酸)，但不包含用于在不修饰宿主植物基因组的情况下改变宿主植物特征的目的多核苷酸时，该植物细胞可被称为“活化的”植物细胞。活化的植物细胞被至少一种编码植物激素酶的多核苷酸修饰，使该细胞可以自主繁殖，从而使活化细胞在移植到植物或其一部分上时能够形成未分化结构(瘿样结构)。当活化植物细胞自主分裂以形成组织时，该组织可被称为“活化组织”。只有当细胞或组织包含用于在不修饰宿主植物基因组的情况下改变宿主植物特征的目的多核苷酸时，才会从活化植物细胞或活化组织中生成形成共生体的接种物。
[0184]
可用在本发明的方法中用于制备本发明的组合物(包括形成共生体的接种物、共生体和包含本发明共生体的宿主植物)的目的多核苷酸包括任何目的多核苷酸，其可以用于改变宿主植物特性，或者用于从/由共生体和/或包含至少一种共生体的宿主植物产生生物分子。生物分子是由活生物体和/或其一部分(例如，细胞或无细胞系统)产生的任何分子。
[0185]
目的多核苷酸可以编码本文所述的任何分子(例如，一种或多种多肽、肽、编码rna或非编码rna；如，生物活性分子)，该分子可以在共生体中表达，并且任选地从共生体转运到宿主植物中，该共生体在一个或多个位点附着在该宿主植物上，任选地，其中当转运到宿主植物中时，该分子可以赋予宿主植物新特性，而不改变宿主植物的基因型或基因组。在一些实施方案中，目的多核苷酸可以编码生物分子和/或生物活性分子，和/或可以编码本文所述的生物分子和/或生物活性分子的生物合成酶(例如，参与生物活性分子生物合成的多肽)。如本文所述，用于制备本文所述的形成共生体的接种物的“目的多核苷酸”可以是一种目的多核苷酸，或者可以是两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或更多种)目的多核苷酸。当两种或更多种目的多核苷酸包含在形成共生体的接种物中时，该形成共生体的接种物可被称为“堆叠的”形成共生体的接种物。堆叠的形成共生体的接种物可用于在宿主植物上形成一个或多个共生体，其可被称为堆叠式共生体。作为堆叠的又一
示例，当形成共生体的接种物包含细菌细胞时，该细菌细胞可包含一种质粒或至少两种不同质粒上的至少两种不同poi。
[0186]
如本文所述，可在植物细胞中表达以产生如本文所述自主分裂或复制的植物细胞的任何生长素生物合成酶或细胞分裂素生物合成酶均可用于制备形成共生体的接种物。上文详细描述了示例性生长素和细胞分裂素生物合成酶以及编码它们的多核苷酸，并包括生长素生物合成酶，其包括但不限于吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)(ec编号：ec 3.5.1.4)、酰胺酶1(ec 3.5.1.4)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)(ec 1.13.12.3)、吲哚-3-乳酸合酶(ec 1.1.1.110)、l-色氨酸-丙酮酸氨基转移酶1(ec 2.6.1.99)、色氨酸氨基转移酶相关蛋白1(ec 2.6.1.27)、吲哚-3-乙醛氧化酶(ec 1.2.3.7)和/或色氨酸脱羧酶1/色氨酸脱羧酶2(ec4.1.1.105)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶是细胞分裂素生物合成酶。可用于本发明的细胞分裂素生物合成酶包括但不限于，异戊烯基转移酶(ipt)(别名：磷酸腺苷异戊烯基转移酶；腺苷酸二甲基烯丙基转移酶；(二甲基烯丙基)腺苷trna甲硫基转移酶)(ec编号：2.5.1.27或2.5.1.75或2.5.1.112)和/或tzs(别名：二甲基转移酶、异戊烯基转移酶、反式玉米素产生蛋白、腺苷酸二甲基烯丙基转移酶)(ec 2.5.1.27)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶可以是吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)和/或异戊烯基转移酶(ipt)，并且可以任选地包括吲哚-3-乳酸合酶，及其任意组合。
[0187]
在一些实施方案中，产生形成共生体的接种物的方法还可以包括将编码至少一种质体多肽(例如，质体性多肽)的多核苷酸导入细胞或植物上的至少一个位点，任选地，其中该质体多肽包括但不限于表1中提供的质体多肽。在一些实施方案中，质体多肽是6b、rolb、rolc和/或orf13。
[0188]
用于导入细胞内的编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸可以一起或分别包含在一个或多个核酸构建体(例如，一个或多个表达盒和/或载体)(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个构建体)中。在一些实施方案中，编码质体多肽(例如，至少一种质体多肽，例如1、2、3、4、5、6或更多种)的多核苷酸可以包含在一个或多个核酸构建体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个构建体)中，任选地，其中编码至少一种质体多肽的多核苷酸与编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸处于相同或不同的核酸构建体(例如，表达盒)中。在一些实施方案中，包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸、目的多核苷酸和/或编码质体多肽的多核苷酸的核酸构建体可以包含在表达盒中，该表达盒可以是相同的或不同的表达盒。在一些实施方案中，一种或多种核酸构建体(或包含其的表达盒)可以包含在一种或多种载体(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或更多种)中。任何可用于将多核苷酸转移至细胞的载体都可以用于本发明的核酸构建体。在一些实施方案中，用于本发明的多核苷酸、核酸构建体和/或表达盒的载体可以是质粒、t-dna、细菌人工染色体、病毒载体或二元细菌人工染色体，或其任意组合。
[0189]
在一些实施方案中，根据本发明的方法导入细胞内的目的多核苷酸可以编码与靶向序列可操作地连接的多肽。在一些实施方案中，靶向序列将蛋白质定位到膜、亚细胞位置或细胞外位置。在一些实施方案中，靶向序列可以是但不限于膜靶向序列、内质网靶向序列、线粒体靶向序列、叶绿体靶向序列或植物病毒的运动蛋白。
[0190]
在一些实施方案中，多核苷酸可以靶向细胞核。因此，编码如本文所述的植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或编码如本文所述的质体多肽的多核苷酸可以可操作地连接至
核定位序列，用于靶向细胞的细胞核。
[0191]
在一些实施方案中，编码植物激素生物合成基因的多核苷酸和/或目的多核苷酸可以可操作地连接至调控元件，包括但不限于启动子序列、终止子序列和/或内含子。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成基因的多核苷酸和/或目的多核苷酸都可操作地连接到启动子时，每一个均可操作地连接到同一启动子或分开的启动子，以任何组合方式。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成基因的多核苷酸和/或目的多核苷酸都可操作地连接到终止子序列时，每一个均可操作地连接到同一个终止子或分开的终止子，以任何组合方式。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸各自可操作地连接到单一启动子。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸可操作地连接到至少两个分开的启动子，以任何组合方式。在一些实施方案中，当编码植物激素生物合成酶的多核苷酸编码两种或更多种植物激素生物合成酶(例如iaah、iaam和ipt)时，编码两种或更多种植物激素生物合成酶的多核苷酸可操作地连接到单一启动子，并且目的多核苷酸可操作地连接到分开的启动子。
[0192]
在一些实施方案中，当导入多于一种编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸、编码ipt的多核苷酸和/或编码吲哚-3-乳酸合酶的多核苷酸)时，该多于一种编码植物激素生物合成酶的多核苷酸可以可操作地连接到同一个或分开的启动子，这些启动子可以是与可操作地连接到目的多核苷酸的启动子相同或分开的启动子。在一些实施方案中，编码iaah的多核苷酸、编码iaam的多核苷酸和编码ipt的多核苷酸可操作地连接到单一启动子，并且目的多核苷酸可操作地连接到分开的启动子。在一些实施方案中，编码植物激素生物合成酶(例如，iaah、iaam和ipt和/或吲哚-3-乳酸合酶)的多核苷酸可操作地连接到单一启动子，并且目的多核苷酸可操作地连接到同一个启动子。
[0193]
在一些实施方案中，编码至少一种质体多肽的多核苷酸可以可操作地连接到启动子。在一些实施方案中，编码至少一种质体多肽的多核苷酸可操作地连接到与可操作地连接到编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸的启动子同一个的启动子。在一些实施方案中，编码至少一种质体多肽的多核苷酸可操作地连接到与可操作地连接到编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸的启动子分开的启动子。
[0194]
可以使用允许编码植物激素酶的多核苷酸和/或目的多核苷酸表达的任何启动子。如本文所述，启动子的选择可以根据表达的时间和空间要求而变化，也可以根据待转化的宿主细胞而变化。用于许多不同生物体并具有不同表达模式的启动子在本领域中是众所周知的。可用于制备形成共生体的接种物的启动子对于形成共生体的接种物的一种或多种细胞而言可以是内源性的，或者对于形成共生体的接种物的一种或多种细胞而言可以是异源性的，或者是它们的任意组合。在一些实施方案中，该启动子对于与其可操作地连接的多核苷酸而言，可以是内源性的或可以是异源性的。
[0195]
在一些实施方案中，可用于制备形成共生体的接种物的启动子是组成型启动子。在一些实施方案中，可用于制备形成共生体的接种物的启动子是诱导型启动子。
[0196]
可用于产生形成共生体的接种物的细菌细胞可以是包含下列的任何细菌细胞，即iv型分泌系统(t4ss，例如t4ass，(如virb/d4系统)、t4bss)或iii型分泌系统(t3ss)。这种细菌系统在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于农杆菌属物种(例如，根癌农杆菌
(如生物变型1)、发根农杆菌(如生物变型2)、葡萄农杆菌(如生物变型3)、a.fabrum(如c58菌株))、根瘤菌属物种、中慢生根瘤菌属物种、中华根瘤菌属物种、慢生根瘤菌属物种、假单胞菌属物种(例如，萨氏假单胞菌萨氏致病变种)、叶杆菌属物种、苍白杆菌属物种、固氮菌属物种、新月藻属物种、克雷伯氏菌属物种、红螺菌属物种或黄单胞菌属物种的细菌系统。
[0197]
随后可用于在植物上形成共生体的任何植物细胞可用于产生形成共生体的接种物。这种植物细胞包括但不限于来自下列的细胞，即被子植物(例如，双子叶植物或单子叶植物)、裸子植物、藻类(例如，大型藻类，如红藻门(红藻类)、褐藻门(褐藻类)和绿藻门(绿藻类)、金藻纲(金藻类))、苔藓植物、蕨类和/或拟蕨类(即蕨类植物)。细胞可以来自任何龄期或大小的野生型植物或转基因植物(例如，幼苗、幼年植物或成熟植物)。在一些实施方案中，可用于本发明的植物细胞包括但不限于表2、表4中列出的植物细胞，或在下文实施例部分之前的段落中提供的植物列表。在一些实施方案中，可用于本发明的示例性植物细胞包括柑橘类细胞(例如，葡萄柚、柑桔、柠檬、酸橙等)、番茄细胞、玉米细胞、山核桃细胞和烟草细胞。
[0198]
可用于产生形成共生体的接种物的植物细胞可以来自任何植物部分，包括但不限于植物细胞培养物(愈伤组织、愈伤组织培养物或悬浮培养物)、原生质体、幼苗、外植体、胚、叶、芽、茎、枝、仁、穗、棒、壳、柄、表皮组织、顶端分生组织、花组织(例如，花粉、雌蕊、胚珠、花药、雄蕊、花冠、萼片、花瓣、花托、花丝、花柱、柱头等)、果实、种子、荚、蒴果、子叶、下胚轴、叶柄、块茎、球茎、根、根尖、共生体、节瘤、植物食物体、dormatia、花外蜜腺、节结、瘿瘤或植物赘生物。
[0199]
如本文所述，在一些实施方案中，当使用植物细胞产生形成共生体的接种物时，植物上的至少一个位点可以是植物上的任何位点，包括但不限于外植体、胚、叶、芽、茎、枝、仁、穗、棒、壳、柄、表皮组织、顶端分生组织、花组织(例如，花粉、雌蕊、胚珠、花药、雄蕊、花冠、萼片、花瓣、花托、花丝、花柱、柱头等)、果实、种子、荚、蒴果、子叶、下胚轴、叶柄、块茎、球茎、根、根尖、共生体、节瘤、植物食物体、dormatia、花外蜜腺、节结、植物赘生物或瘿瘤。
[0200]
可以通过任何本领域已知的方法将核酸构建体(例如，多核苷酸、表达盒和/或载体)导入细胞内。用于转化原核和真核生物体(包括植物)的程序在本领域中是众所周知且常规的，并且在众多文献中都有描述。在一些实施方案中，本发明的核酸构建体(例如，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸、目的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的表达盒和/或载体)可以通过包括但不限于下列的方法导入细胞内：细菌介导的转化、农杆菌渗入、病毒介导的转化、粒子轰击(生物弹击法)、电穿孔、显微注射、脂质转染(脂质体介导的转化)、超声处理、硅纤维介导的转化、化学刺激的dna摄取(例如，多聚转染；如聚乙二醇(peg)介导的转化)和/或激光微束(uv)诱导的转化。
[0201]
在一些实施方案中，当(i)编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列或(ii)编码植物激素生物合成酶的多核苷酸包含在至少一个植物细胞中时，可以将该至少一个植物细胞移植到植物的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位点)上。在一些实施方案中，将移植到至少一个位点的一个或多个细胞(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个细胞)在该位点培养，以产生包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸序列的植物细胞的群体并形成共生体，其中从植物上的共生体中选择一个或多个细胞，以提供包含编码植物激素生物合成酶的多核
苷酸和目的多核苷酸序列的一个或多个细胞，从而产生该形成共生体的接种物。
[0202]
在一些实施方案中，当使用植物产生形成共生体的接种物时，可以在导入到植物上至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点)的步骤之前、同时或之后，所述植物上的至少一个位点可以在接种位点处损伤。同样，当将共生体移植到宿主植物的至少一个位点上时，可以在移植步骤之前、同时或之后，损伤宿主植物上的至少一个位点。用于导入或移植的创伤可以以任何方式进行，只要在要导入或移植发生的位点处，造成植物或其一部分的外表面(表皮、角质层、树皮)破裂即可。这类工具可以包括但不限于镊子或钳子、刀、针(例如，皮下注射、解剖、刺绘、缝合等)、牙签和/或注射器。此外，任何标准的嫁接工具都可用于本文所述的导入或移植。
[0203]
在一些实施方案中，将本发明的多核苷酸(例如，编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(如编码至少一种植物激素生物合成酶的至少一种多核苷酸)、目的多核苷酸；包含上述核苷酸的表达盒或载体)导入植物细胞、植物或其一部分内，是通过细菌介导的转化来进行的，并且包括将植物细胞或植物(或其一部分，例如外植体)与至少一种细菌菌种或菌株(例如1、2、3、4、5或更多种)的细胞共同培养，该细菌细胞包含以下一种或多种：编码植物激素生物合成酶的多核苷酸、目的多核苷酸和/或编码至少一种质体多肽的至少一种多核苷酸。在一些实施方案中，可以在与至少一种细菌菌株的细胞共同培养之前或期间，在接种位点处损伤植物(或其一部分；例如外植体)。在一些实施方案中，所述至少一种细菌菌种或菌株的细胞包含至少两种细菌菌种或菌株的细胞，并且编码植物激素酶的多核苷酸包含在与包含至少一种目的多核苷酸的细菌菌株不同的细菌菌株中(例如，双重细菌转化)。如本文所述，用于产生形成共生体的接种物的细菌细胞可以是包含iv型分泌系统(t4ss，例如t4ass，(如virb/d4系统)、t4bss)或iii型分泌系统(t3ss)的任何细菌细胞，并且可以包括但不限于农杆菌属物种(例如，根癌农杆菌(如生物变型1)、发根农杆菌(如生物变型2)、葡萄农杆菌(如生物变型3)、a.fabrum(如c58菌株))、根瘤菌属物种、中慢生根瘤菌属物种、中华根瘤菌属物种、慢生根瘤菌属物种、假单胞菌属物种、叶杆菌属物种、苍白杆菌属物种、固氮菌属物种、新月藻属物种、克雷伯氏菌属物种、红螺菌属物种或黄单胞菌属物种的细菌细胞。在一些实施方案中，假单胞菌属物种(例如，萨氏假单胞菌萨氏致病变种)。在一些实施方案中，细菌细胞可以是萨氏假单胞菌萨氏致病变种的细胞。该方法可适用的植物物种不受限制。如上所述，至少自20世纪80年代初以来，通过人类干预，细菌将dna转移到植物的能力已经扩展到许多物种，超出了那些被细菌自然感染的物种。表2中提供了作为农杆菌属物种的天然宿主的植物和一些作为非天然宿主但已被证明能够使用农杆菌属物种进行转化的植物的非限制性示例。正如本领域技术人员易于理解的那样，表2中列出的植物属和种，以及任何其它植物属和种，都可以用作宿主植物或用于产生如本文所述的形成共生体的接种物。在一些实施方案中，可用作宿主植物的植物属和种以及可由其制备形成共生体的接种物的植物属和种包括但不限于表4中提供的那些植物或在下文实施例部分之前的段落中提供的植物列表。
[0204]
在一些实施方案中，用于产生形成共生体的接种物的方法还可以包括对形成共生体的接种物的至少一个细胞中的至少一种核酸进行编辑，以在该形成共生体的接种物中产生至少一种编辑过的核酸。可以使用任何已知的基因编辑技术，包括但不限于基于核酸酶的编辑系统，其包括但不限于crispr-cas技术、锌指核酸酶(zfn)技术；转录激活因子样效
应物核酸酶(talen)技术和工程化的兆核酸酶技术。在一些实施方案中，所述至少一种编辑过的核酸具有修饰的表达。在一些实施方案中，与不包含相同修饰的相同核酸相比，修饰的表达包括表达升高。在一些实施方案中，与不包含相同修饰的相同核酸相比，修饰的表达包括表达降低。
[0205]
本发明还提供了通过本发明的方法产生的形成共生体的接种物。在一些实施方案中，形成共生体的接种物是一种细菌培养物，其包括编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码一种或多种(例如1、2、3、4、5或更多种)植物激素生物合成酶的一种或多种(例如1、2、3、4、5或更多种)多核苷酸)和目的多核苷酸(例如，至少一种目的多核苷酸(例如，1、2、3、4、5或更多种))。在一些实施方案中，包含两种或更多种细胞的形成共生体的接种物是植物细胞培养物的形式(例如，愈伤组织或细胞悬液)，其包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸(例如，编码一种或多种植物激素生物合成酶的一种或多种多核苷酸)和目的多核苷酸(例如，至少一种目的多核苷酸)。
[0206]
在一些实施方案中，本发明提供了来自本发明的形成共生体的接种物的细胞或原生质体，其中该细胞或原生质体包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和目的多核苷酸。
[0207]
还提供了一种在不修饰植物基因组的情况下改变宿主植物特征的方法，该方法包括将本发明的形成共生体的接种物或本发明的共生体移植到宿主植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点)；和在宿主植物上的至少一个位点处培养形成共生体的接种物，以在宿主植物上的至少一个位点处形成共生体，其中目的多核苷酸在宿主植物上的共生体中表达，并且将目的多核苷酸的表达产物和/或使用目的多核苷酸的表达产物制备的产物转运到宿主植物中，从而改变宿主植物的特征。“在不修饰植物基因组的情况下改变宿主植物特征”指的是在不改变宿主植物基因型的情况下，宿主植物的形态学、代谢、生物化学和/或生理学的变化。
[0208]
可用于本发明的共生体以改变植物宿主特征的目的多核苷酸可以包括编码如本文所述的分子(例如，一种或多于一种多肽、肽、编码rna或非编码rna；例如生物分子、生物活性分子)的多核苷酸，用于在附着于宿主植物上的一个或多个位点的共生体中表达，当该分子转运到宿主植物中时，该分子可以赋予宿主植物新特征，而不改变宿主植物的基因型或基因组。在一些实施方案中，目的多核苷酸可以编码生物分子或生物活性分子，或者可以编码如本文所述的生物分子和/或生物活性分子的生物合成酶(例如，参与生物分子或生物活性分子生物合成的多肽)。如本文所述，在宿主植物上形成的共生体中包含的“目的多核苷酸”可以是一种目的多核苷酸，或者可以是两种或更多种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种或更多种)目的多核苷酸。当两种或更多种目的多核苷酸包含在一个共生体中时，该共生体可以被称为“堆叠式”共生体。此外，在宿主植物上形成的一个或多个共生体，其中至少两个共生体包含不同的poi，可以被称为“堆叠式共生体”。堆叠还可以包括在宿主植物上形成一个或多个共生体，其中所有共生体都包含相同的poi。
[0209]
在一些实施方案中，包含在用于赋予经修饰的宿主植物特征的共生体中的编码植物激素生物合成酶的多核苷酸可以编码一种或多于一种植物激素生物合成酶。在一些实施方案中，一种或多于一种植物激素生物合成酶可以由一种或多于一种多核苷酸编码。也就是说，当共生体包含编码多于一种植物激素生物合成酶的多核苷酸时，该多于一种植物激
素生物合成酶可以编码在与另一种植物激素生物合成酶相同的多核苷酸上或不同的多核苷酸上，以任何组合方式。
[0210]
将在本发明的共生体中表达的植物激素生物合成酶可以是可在植物细胞中表达的任何生长素或细胞分裂素生物合成酶，以产生自主分裂或复制的植物细胞，任选地产生未分化的多细胞结构。如本文所述，可在植物细胞中表达以产生如本文所述自主分裂或复制的植物细胞的任何生长素生物合成酶或细胞分裂素生物合成酶均可用于制备形成共生体的接种物。上文详细描述了示例性生长素和细胞分裂素生物合成酶以及编码它们的多核苷酸，并包括生长素生物合成酶，其包括但不限于吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)(ec编号：ec 3.5.1.4)、酰胺酶1(ec 3.5.1.4)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)(ec 1.13.12.3)、吲哚-3-乳酸合酶(ec 1.1.1.110)、l-色氨酸-丙酮酸氨基转移酶1(ec 2.6.1.99)、色氨酸氨基转移酶相关蛋白1(ec 2.6.1.27)、吲哚-3-乙醛氧化酶(ec 1.2.3.7)和/或色氨酸脱羧酶1/色氨酸脱羧酶2(ec4.1.1.105)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶是细胞分裂素生物合成酶。可用于本发明的细胞分裂素生物合成酶包括但不限于异戊烯基转移酶(ipt)(别名：磷酸腺苷异戊烯基转移酶；腺苷酸二甲基烯丙基转移酶；(二甲基烯丙基)腺苷trna甲硫基转移酶)(ec编号：2.5.1.27或2.5.1.75或2.5.1.112)和/或tzs(别名：二甲基转移酶、异戊烯基转移酶、反式玉米素产生蛋白、腺苷酸二甲基烯丙基转移酶)(ec 2.5.1.27)。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶可以是吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)和/或异戊烯基转移酶(ipt)，并且可以任选地包括吲哚-3-乳酸合酶及其任意组合。在一些实施方案中，植物激素生物合成酶可以是以任何组合方式的吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaah)、色氨酸2-单加氧酶(iaam)和/或异戊烯基转移酶(ipt)。在一些实施方案中，本发明的共生体还可以包含编码植物激素生物合成酶的多核苷酸，该酶是吲哚-3-乳酸合酶。
[0211]
在一些实施方案中，本发明的共生体还可以包含并表达编码质体多肽(例如，质体性多肽)的多核苷酸。可用于本发明的质体多肽可以是现在已知的或以后发现的任何质体多肽，其可以对使用本发明的核酸构建体形成的共生体的结构带来益处。可用于本发明共生体的示例性质体多肽包括但不限于表1中提供的那些多肽。在一些实施方案中，质体多肽可以是6b、rolb、rolc和/或orf13。在一些实施方案中，本发明的共生体中可以包含多于一个编码质体多肽的多核苷酸。
[0212]
在一些实施方案中，培养形成共生体的接种物，当其包含在宿主植物上的细菌细胞中时，还可以包括在乙酰丁香酮存在下培养，浓度范围为约10μm至约200μm或者其中的任何范围或值(例如，约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μm，或者其中的任何范围或值)(例如，约50μm至约150μm、约75μm至约125μm、约85μm至约100μm)。在一些实施方案中，当在乙酰丁香酮存在下培养时，乙酰丁香酮以约100μm的浓度存在。
[0213]
在一些实施方案中，包含细菌细胞的形成共生体的接种物可用于改变宿主植物特征，而不会修饰宿主植物基因组。在一些实施方案中，可将含有农杆菌属物种的形成共生体的接种物递送至例如第一植物。农杆菌属物种可以是一种或多种菌株的形式，其中至少一种菌株含有编码至少一种诱导共生体形成的植物激素生物合成酶的核酸(例如，其可以在t-dna中提供)，并且至少一种菌株含有包含目的多核苷酸的核酸(例如，其可以在t-dna中提供)，该目的多核苷酸编码将赋予宿主植物的所需性状。因此，接种物的递送可以引起在
第一植物上形成一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)共生体，并且共生体可以表达由农杆菌属物种递送的核酸。共生体在共生体组织中具有增加的维管形成，这本身支持快速生长、更快速的新陈代谢，以及有效的输出途径，并最终支持所需分子在整个植物中的系统性运动。在一些实施方案中，然后可以从第一植物中取出共生体，并将其附着/移植到第二植物(例如宿主植物)上，以便与宿主植物进行功能连通，从而形成植物组织，该植物组织为宿主植物提供所需性状，而不会转化或改变宿主植物的基因组，也不会将异源或异型生物质dna导入宿主植物内。在一些实施方案中，在移植到宿主植物之前，取出的共生体，即现在的形成共生体的接种物可以在没有农杆菌属物种的情况下培养，以形成不含细菌的形成共生体的接种物，之后可以将形成共生体的接种物移植到宿主植物中。
[0214]
关于将在本发明中使用的农杆菌属菌种菌株的选择，各种单一菌株或其组合可用于获得期望的结果。根据一个实施方案，接种物包括至少两种菌株，其中所用的至少一种菌株是“活化菌株”(例如，野生型菌株)，其包含至少一种编码植物激素生物合成酶的多核苷酸，并且至少一种其它菌株不是活化菌株(例如，“卸甲”、“性状诱导”菌株)，但包含在宿主植物中赋予所需性状(目的多核苷酸)的核酸(例如，t-dna)。活化菌株可以从自然界分离出来，例如本文所述的fl-f54菌株，因为已知野生型农杆菌属物种会形成瘿瘤。例如，所需性状可以是具有抗微生物或抗昆虫的特性、植物生理学的变化，或其它。该性状可由一种或多种分子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种分子)表达或实现，例如由性状诱导农杆菌属物种中的核酸(如t-dna)编码的分子。根据需要，这些分子可以是小分子、大分子、蛋白质、聚合物或其它。根据特定应用的需要，可以使用多种活化菌株和/或多种性状诱导菌株。备选地，可以使用单一菌株，其既能诱导共生体的形成，又能在共生体所附着的宿主植物中诱导所需性状，而不会修饰宿主植物基因组。该方法可适用的植物物种不受限制。如今，利用农杆菌属和其它细菌属物种将dna转移到植物中已成为常规。表2中提供了作为农杆菌属物种的天然宿主的植物和一些作为非天然宿主但已被证明能够使用农杆菌属物种进行转化的植物的非限制性示例。此表中所列的植物来自许多不同的植物家族，包括双子叶植物和单子叶植物，并且表明使用该方法的植物类型不受限制。在一些实施方案中，可用于本方法的植物属和种包括但不限于表4中提供的植物，或者在下文实施例部分之前的段落中提供的植物列表。
[0215]
根据需要，除了载剂和其它成分之外，接种物还可以含有一种或多种如上所述的农杆菌属菌种菌株(例如，1、2、3、4、5或更多种菌株)。如果使用多种菌株，可以根据需要使用不同比例的菌株，例如，活化菌株与性状诱导菌株的比例为1:10。农杆菌属物种递送接种物在本领域中是众所周知的，并且可以基于特定应用中的预期结果来选择合适的接种物。例如，接种物可以包含缓冲剂的水溶液，例如，mes(2-乙磺酸)、tris(三(羟甲基)氨基甲烷)、hepes(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)或盐基缓冲液，例如pbs(磷酸盐缓冲盐水)；一种或多种盐，例如氯化镁、转化促进剂，如乙酰丁香酮或其它可增强毒力的酚类物质和/或佐剂，包括但不限于润湿/渗透增强表面活性剂，包括但不限于阴离子、阳离子和非离子型表面活性剂。接种物的递送可以通过任何已知的方法来实现，例如通过针、穿刺创伤或其它直接递送系统，即，使用钻孔或空气射流，并且可以自动进行或手动进行。
[0216]
可以通过肉眼观察共生体的形成，并且可以任选地通过已知的手段控制共生体的
大小，例如化学控制(即(agbiochem inc.,los molinos,ca))。共生体的形成可能需要不同的时间，这取决于宿主植物物种和所用植物的龄期。例如，足够的共生体形成可能需要几天到几个月的时间才能形成。在一些实施方案中，可以从第一植物收集共生体或共生体组织，然后进行培养以用于增加体积或储存目的。在一些实施方案中，共生体可以直接从第一植物移至第二植物(例如，宿主植物)而无需培养。然而，可能期望首先培养形成共生体的接种物以(a)去除残留的细菌，例如通过损耗或通过主动灭菌，或(b)确定形成共生体的接种物表达期望的性状。去除残留的农杆菌属菌种可随着时间的推移通过损耗而发生，例如通过提供不支持细菌的培养物，因此细菌会死亡，或通过主动的手段，例如通过使用漂白剂和/或抗生素或其他主动杀死细菌培养物的方法进行灭菌。确定形成共生体的接种物或共生体是否表达所需性状可以通过简单的观察来完成，如果该性状在表型上是可见的(例如颜色)，或者通过分析培养基/宿主植物中的目标化合物(一种或多种)由共生体或形成共生体的接种物产生，或通过任何其他已知的手段。
[0217]
可以从植物移出共生体并用作形成共生体的接种物以通过任何已知和适用的方式附着(移植)到第二植物(例如宿主植物)。注意的是，作为共生体形成接种物使用的被移出的共生体的整体对于实现期望的结果可能不是必需的。例如，仅来自共生体的一些稳定材料(例如，一个或多个细胞)可以被移出并用于附着到/移植到宿主植物上。在这样的方法中，可以繁殖移出并放入培养物中的单个共生体的细胞以提供移植到多个宿主植物上的材料(例如，作为形成共生体的接种物)。用于将一种植物或植物部分例如共生体或形成共生体的接种物移植到另一种植物(例如宿主植物)上的技术在本领域中是众所周知的并且可以用于本发明。优选地，可以将形成共生体的接种物附着到宿主植物上，使得所形成的共生体与宿主植物的维管系统功能连通，或使得与宿主植物的维管系统功能连通是可实现的。移植方法可允许共生体组织在移植后形成必要的维管连接，即使那些连接不是与移植同时建立的。以这种方式，由共生体产生的所需性状/化合物可以穿过第二植物的维管系统。在一些实施方案中，由共生体产生的所需性状/化合物可以通过质外体和/或共质体运输至宿主植物。在一些实施方案中，由共生体产生的所需性状/化合物可以通过在宿主植物和共生体之间形成的质外体、共质体或维管系统，或通过它们的任何组合运输到宿主植物。
[0218]
第一植物(在其上或从其生长或形成共生体的初始植物)和第二植物(例如，可以将形成共生体的接种物移植到其上的宿主植物)可以是相同的物种或不同的物种，这取决于不同物种之间植物材料的特定的相互协同性(即移植相容性)。
[0219]
在一些实施方案中，活化的细胞/组织可以通过用至少一种农杆菌属菌种的活化菌株接种植物来形成。如上所述，活化的细胞/组织可以从第一植物中取出，然后在含有至少一种诱导性状的农杆菌属菌种菌株的溶液中培养。在从诱导性状的菌株充分摄取核酸(例如，t-dna)后，同时含有编码植物激素生物合成酶的多核苷酸和性状诱导核酸(poi)的植物细胞(例如，形成共生体的接种物)可存在于培养物中。这些细胞(例如，形成共生体的细胞或接种物)可以通过已知方法选择，然后根据需要使用。例如，可以选择、去除和培养细胞以产生更多具有感兴趣性状的形成共生体的接种物(例如，包含两个或更多个细胞的细菌细胞群、愈伤组织和/或悬浮培养物)。或者或另外地，然后可以如上所述(即，灭菌、移植到第二植物(例如宿主植物等)上)使用形成共生体的接种物的选定细胞。
[0220]
在一些实施方案中，可以将包含至少一种psym(例如，编码至少一种植物激素生物
合成酶和至少一种poi的多核苷酸)的细菌(例如，一种或多种包含至少一种psym的农杆菌属菌种细胞)直接递送到(接种到)宿主植物。在一些实施方案中，形成共生体的接种物可以包括如上所述的一种农杆菌属菌种菌株或多于一种农杆菌属菌种菌株(例如，一种菌株包含一种或多种编码至少一种植物激素生物合成酶的多核苷酸且一种菌株包含poi，或同时包含编码至少一种植物激素生物合成酶的一种或多种多核苷酸和poi的单一菌株)。以这种方式，在宿主植物上形成的所得共生组织将作为所需分子的有益生物工厂用于宿主植物或在宿主植物上，而无需转化宿主植物。根据一些实施方案，一些或所有的接种菌株可以被工程化为具有低活力，使得一旦在植物上形成有用的共生体(即，具有高维管性并产生所需性状的所需分子的共生体)，则细菌消亡且不再存在于共生体中。
[0221]
在一些实施方案中，在宿主植物上培养形成共生体的接种物可以进一步包括在增加湿度的条件下培养。例如，可以覆盖宿主植物上与形成共生体的接种物接触或在其上移植共生体的位点以增加共生体或形成共生体的接种物的紧邻区域的湿度。可以使用在移植到宿主植物上的共生体或形成共生体的接种物周围的区域中保持湿度的任何类型的覆盖物。例如，位于宿主植物的位点上的共生体或形成共生体的接种物可以用膜包装或覆盖以保持湿度。在一些实施例中，膜可以包括但不限于塑料膜、硅胶带和/或封口膜。在一些实施方案中，可以覆盖宿主植物上的共生体或形成共生体的接种物以在移植后(例如，在移植后立即或约15分钟至5小时内)增加共生体或形成共生体的接种物区域中的湿度达约1小时至约72小时或更长，约1小时至约48小时或更长，或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时至约11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36小时或更长或其中的任何范围或值。在一些实施方案中，可以覆盖宿主植物上的共生体或形成共生体的接种物以增加共生体或形成共生体的接种物区域中的湿度达约10小时至约30小时(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30小时)，任选地在移植(宿主植物)或接种(接种物形成)后约24小时。
[0222]
在一些实施方案中，在移植宿主植物的至少一个位点之前或同时，宿主植物可在所述至少一个位点处受到损伤。可以使用任何可用于在移植共生体或形成共生体的接种物的位点处破坏植物或植物部分的外表面(表皮、角质层、树皮)的工具以任何方式进行损伤。这类工具可以包括但不限于镊子或钳子、刀、针(例如，皮下注射、解剖、刺绘、缝合等)、牙签和/或注射器。此外，任何标准的嫁接工具都可用于本文所述的导入或移植。
[0223]
在一些实施方案中，宿主植物上的至少一个位点可以在宿主植物的地上部分和/或宿主植物的地下部分上。
[0224]
在一些实施方案中，将共生体移植到宿主植物上至少两次。在一些实施方案中，将形成共生体的接种物移植到宿主植物上至少两次。在一些实施方案中，将共生体和/或形成共生体的接种物移植到宿主植物上的至少两个位点上。
[0225]
在一些实施方案中，目的多核苷酸的表达产物可以是转录产物或翻译产物，或其修饰物。例如，目的多核苷酸的表达产物可以是转录产物的甲基化。在一些实施方案中，目的多核苷酸的表达产物可以是例如翻译产物的糖基化。翻译产物可以是蛋白质(多肽)或肽。转录产物是核糖核酸(rna)。在一些实施方案中，rna是编码rna(例如，mrna)。在一些实施方案中，rna是非编码rna，包括但不限于转移rna(trna)、核糖体rna(rrna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、piwi相互作用rna(pirna)、microrna(mirna)、长的非编码
rna(lncrna)和/或小干扰rna(sirna)。
[0226]
在一些实施方案中，目的多核苷酸的表达产物可以是生物合成酶，其可用于制备可包括但不限于化学品、蛋白质(多肽/肽)或多核苷酸的另一种产物。
[0227]
修饰的宿主植物特征可以包括任何植物特征的修饰，包括但不限于宿主植物代谢的改变、宿主植物的结构(例如形态)的改变和/或在宿主植物的代谢、生物化学和/或生理学中的改变。在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征可以是植物对例如引起疾病的生物体例如真菌、细菌、病毒和/或原生动物的应答的变化。因此，在一些实施方案中，与不包含共生体的植物相比，经修饰的宿主植物特征可导致对引起疾病的生物体的耐受性/抗性增加。引起疾病的生物可以包括但不限于真菌、细菌、病毒和/或原生动物。在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是增加的(诱导的)植物防御基因的表达，从而导致宿主植物具有增加的抗病性。在一些实施方案中，可增加的植物防御基因包括“w-box”防御基因。w-box防御基因可以包括但不限于cad1、npr1和/或pr2。在一些实施方案中，植物防御基因可以通过共生体中的化学物的产生通过共生体而在宿主植物中增加，所述化学物是例如被转运到宿主植物并且刺激宿主植物中的系统获得性抗性应答的化学物。在一些实施方案中，可以通过在宿主植物中产生刺激宿主植物中的系统获得性抗性应答的化学物来增加宿主植物中的植物防御基因，其中在宿主植物中产生该化学物的生化途径被转运到宿主植物的共生体中的目的多核苷酸的产物修饰。
[0228]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征可以是植物对例如昆虫或线虫的应答的变化。因此，在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是与不包含共生体的植物相比增加的昆虫耐受性/抗性。可以增加对其耐受性或抗性的昆虫包括但不限于鳞翅目昆虫，鞘翅目、半翅目、缨翅目和双翅目(lepidopteran,coleopteran,hemiptera,thysanoptera,and diptera)中的昆虫。在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是与不包含共生体的植物相比增加的线虫耐受性/抗性。可以增加对其耐受性或抗性的线虫包括但不限于根结线虫(根结线虫属(meloidogyne)物种)，胞囊线虫(异皮线虫属(heterodera)物种和球异皮线虫属(globodera)物种)、根部病变线虫(短体线虫属(pratylenchus)物种)、穴居线虫(radopholus similis)、肾形线虫(rotylenchulus reniformis)、葡萄线虫(xiphinema index)和柑橘线虫(tylenchulus semipenetrans)。
[0229]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征可以是植物对细菌病害的应答的变化。因此，在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是与不包含共生体的植物相比对细菌性病害的耐受性/抗性增加。本发明提供了可以增加对许多细菌病害的抗性或耐受性的方法和组合物，所述病害包括但不限于地毯草黄单胞菌(xanthomonas axonopodis)、油菜黄单胞菌(xanthomonas campestris)、解淀粉欧文氏菌(erwinia amylovora)、胡萝卜欧文氏菌(erwinia carotovora)、柑橘黄龙病菌亚洲种(candidatus liberibacter asiaticus)、青枯念珠菌(candidatus liberibacter solanacearum)、丁香假单胞菌(pseudomonas syringae)、苛养木霉(xylella fastidiosa)、dickeya solani、dickeya dadantii、pectobacterium carotovorum和/或ralstonia solanacearum。
[0230]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征可以是植物对除草剂的应答的变化。因此，在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是与不包含共生体的植物相比增加的除草剂耐受性/抗性。宿主植物特性可被修饰以对其具有抗性或耐受性的示例性除草剂包括
但不限于草甘膦、三嗪、麦草畏、2,4-d、二氯吡啶酸、丙炔氟草胺、carfentrozone-乙基、sulfentrozon、乳氟禾草灵、氟磺胺草醚、三氟羧草醚、硝磺草酮、磺草酮、tembotrione、topramezone、氟吡酰草胺(picolinafen)、异恶草酮、异恶唑草酮、苯噻草胺、氟灭草胺、灭草畏、灭草烟、咪草烟、嘧磺隆、甲基苯磺隆、三磺隆、烟嘧磺隆、磺酰磺隆、甲嘧磺隆、甲基二磺隆、阿齐磺隆、酰嘧磺隆、环磺隆、氟美舒兰、美托舒兰、氟舒兰、双氯磺草胺和/或噻酮磺隆(thiencarbazone-methyl)。因此，在一些实施方案中，与不包含共生体的植物相比，经修饰的宿主植物特征是增加的除草剂耐受性/抗性。宿主植物中增加的除草剂耐受性/抗性可以针对一种除草剂或可以针对两种或更多种不同的除草剂。
[0231]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征可以是植物对非生物应激的应答的变化。在一些实施方案中，与不包含本发明共生体的植物相比，经修饰的宿主植物特征是对非生物应激的耐受性增加。在一些实施方案中，宿主植物可显示对多于一种非生物应激耐受性(例如，1、2、3、4、5或更多种非生物应激)中的增加的耐受性。如本文所用，术语“非生物应激”是指可对植物造成有害影响的外部非生物因素。因此，如本文所用，非生物应激包括但不限于导致冷冻的低温、寒冷、热或高温、干旱、过量的水、高光强度、低光强度、高紫外线、盐度、臭氧和/或其组合。非生物应激因素的参数是物种特异性的，甚至是品种特异性的，因此根据暴露于非生物应激的物种/品种而变化很大。因此，虽然一个物种可能会受到23℃高温的严重影响，但另一个物种可能要到至少30℃才会受到影响，等等。高于30℃的温度会导致最重要作物的产量急剧下降。这是由于从大约20-25℃开始的光合作用减少，以及在较高温度下生长的作物对碳水化合物的需求增加。临界温度不是绝对的，而是根据作物对主要环境条件的适应等因素而变化。此外，由于大多数作物同时面临多种非生物应激，因此这些应激之间的相互作用会影响植物的应答。例如，随着温度升高超过光合作用的最佳值，在较低的光强度下会发生过度光照造成的损害。由于蒸腾作用减少，水分应激的植物冷却过热组织的能力降低，进一步加剧了过多(高)热量和/或过多(高)光强度的影响。因此，影响作物生产力的高/低温、光照强度、干旱等的特定参数将随着物种、品种、适应程度和暴露于环境条件的组合而变化。
[0232]
如本文所用，“增加的对非生物应激的耐受性”是指暴露于非生物应激的包含本发明共生体的植物或其部分比对照植物或其部分(即，已经暴露于相同非生物应激且不包含共生体的植物或其部分)更好地承受给定非生物应激的能力。可以使用多种参数来测量对非生物应激的增加的耐受性，包括但不限于植物或其部分的大小和数量等(例如果实的数量和大小)、细胞分裂的水平或量、花败量、晒伤量、作物产量等。因此，在本发明的一些实施方案中，包含本发明的共生体且具有对非生物应激的增加的耐受性的植物或其部分与暴露于相同的应激但不包含共生体的植物或其部分相比将具有例如减少的花败。因此，在一些实施方案中，目的多核苷酸在共生体中的表达可以赋予宿主植物增加的非生物应激耐受性。在一些实施方案中，由共生体产生并转运至宿主植物的生物分子和/或生物活性分子的存在可以赋予宿主植物增加的非生物应激耐受性，从而改变宿主植物的特征。
[0233]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是宿主植物形态的修饰。本文所述的包含并表达目的多核苷酸的共生体可用于改变任何植物结构，包括但不限于叶、茎、花、根、芽、种子、分生组织、果实、块茎等。在一些实施方案中，与不包含共生体的植物相比，改变的形态包括但不限于节间缩短、侧分枝增加和/或开花增加。
[0234]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是存在生物分子、生物活性分子和/或参与生物分子和/或生物活性分子的生物合成的多肽，其中生物分子、生物活性分子和/或参与生物分子和/或生物活性分子的生物合成的多肽由目的多核苷酸编码或由目的多核苷酸的表达引起(例如，目的多核苷酸编码影响生物活性分子在植物中的产生的多肽或调节核酸)，然后可以被转运到宿主植物中，从而改变宿主植物的特征，其中改变的宿主特征可以包括生物分子和/或生物活性分子的存在和/或可以是存在生物分子和/或生物活性分子的结果。如本文所述，在植物上形成的共生体形成连接宿主植物的维管系统的维管系统。在一些实施方案中，在共生体中产生的生物分子和/或生物活性分子(例如，由目的多核苷酸表达)可以通过连接的维管系统或组织运输到宿主植物。在一些实施方案中，生物分子和/或生物活性分子从共生体到宿主植物的运输可以是系统性运输。在一些实施方案中，在共生体中产生的生物分子和/或生物活性分子可以通过在共生体和宿主植物之间的连接组织的质外体和/或共质体运输到宿主植物。在一些实施方案中，生物分子和/或生物活性分子从共生体到宿主植物的运输可以通过共生体和宿主植物的连接的维管系统、质外体途径和/或共质体途径的任何组合。
[0235]
因此，在一些实施方案中，编码生物分子和/或生物活性分子的目的多核苷酸包含在移植到宿主植物上的本发明的共生体中，其中目的多核苷酸在共生体表达且生物分子和/或生物活性分子被运送到宿主植物。
[0236]
在一些实施方案中，生物分子和/或生物活性分子可以包括但不限于药物、生物刺激素、生物杀真菌剂、生物除草剂、杀虫蛋白/肽、胰蛋白酶调节抑卵因子(tmof)；苏云金芽孢杆菌毒素、植物性杀虫蛋白(vip)、营养物、植物生长调节剂、rnai、植物抗体、花柱鞘抑制蛋白、核酶、细菌素、植物脂质、植物脂肪酸、植物油、抗微生物肽、适体、crispr-cas系统多肽和相应的crispr引导核酸、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应核酸酶(talen)和/或工程化的兆核酸酶。“生物分子”是由活生物体和/或其部分(例如，细胞或无细胞系统)产生的任何分子。因此，生物分子包括由共生体产生的任何分子，该分子直接或间接地由包含在共生体中并在其中表达的目的多核苷酸产生，并且任选地运输到该共生体附着或附接的宿主植物。生物分子还可以指作为从共生体中的poi(例如，poi可以编码参与生物分子生物合成的酶，然后利用该生物合成酶在宿主植物中产生该生物分子)表达的不同生物分子(例如，第一生物分子)转运到宿主植物中的结果，在宿主植物中产生的生物分子(例如，第二生物分子)。“生物分子”包括但不限于“生物活性分子”。生物活性分子包括包含生物活性的任何生物分子，在本文中描述了其许多非限制性实例。
[0237]
如本文所用，“药物”包括但不限于治疗性蛋白质、治疗性多核苷酸和/或治疗性化学物。在一些实施方案中，药物可以包括但不限于疫苗、抗体、重组抗体、抗体片段、融合蛋白、抗体融合蛋白、人血清白蛋白、胃脂肪酶、胰岛素、葡糖脑苷脂酶、生长因子、细胞因子、乙型肝炎表面抗原(hbsag))、apo-a1、α-半乳糖苷酶(prx-102)、α-半乳糖苷酶(prx-102)、乙酰胆碱酯酶(prx-105)、抗肿瘤坏死因子(pr-抗-tnf)、igg、干扰素-α、纤溶酶、乳铁蛋白、溶菌酶和/或胶原蛋白。
[0238]
可以在目的多核苷酸中编码的示例性细菌素可以包括但不限于酸霉素、acidocin、actagardine、土壤杆菌素、阿维星(alveicin)、aureocin、aureocin a53、aureocin a70、bisin、明串珠菌素(carnocin)、carnocyclin、caseicin、蜡状菌素
(cerein)、circularin a、大肠杆菌素、弯曲乳杆菌素(curvaticin)、德沃星(divercin)、耐久霉素(duramycin)、肠道菌素(enterocin)、enterolysin、表皮素/gallidermin、erwiniocin、gardimycin、gassericin a、glycinecin、嗜盐菌素、haloduracin、klebicin、乳杆菌素s、乳球菌素、乳链球菌素(lacticin)、leucoccin、溶葡萄球菌素、macedocin、mersacidin、mesentericin、microbisporicin、小菌素(microcin)s、变链素(mutacin)、尼生素(nisin)、paenibacillin、planosporicin、pediocin、pentocin、plantaricin、pneumocyclicin、脓菌素、reutericin 6、sakacin、salivaricin、sublancin、枯草菌素、sulfolobicin、tasmancin、苏云金菌素17、trifolitoxin、variacin、弧菌素(vibriocin)、warnericin、和/或warnerin。
[0239]
可用于本发明的可由目的多核苷酸编码的另外的抗微生物肽包括短杆菌肽(avgalavvvwlwlwlw seq id no:35)、蛙皮素(magainin)2(gigkflhsakkfgkafvgeimns seq id no:36)、ll-37(抗菌肽(cathelicidin))(lgdffrkskekigkefkrivqrikflrnlvprtes seq id no:37)、pyrrhocoricin(pramp)(vdkgsylprptpprpiynrn seq id no:38)、尼生素a(羊毛硫细菌素(lantibiotic))(itsislctpgcktgalmgcnmktatchcsihvsk seq id no:39)、hnp1(α-防御素)(acycripaciagerrygtciyqgrlwafcc seq id no:40)、tap(β-防御素)npvscvrnk(gicvpircpgsmkqigtcvgravkccrkk seq id no:41)、菌丝霉素(plectasin)(gfgcngpwdeddmqchnhcksikgykggycakggfvckcy seq id no:42)、粘菌素(xtxxkllxxt seq id no:43)(x＝2,4-二氨基丁酸)、达托霉素(daptomycin)(wndtgkdadgsey seq id no:44)、小菌素j25(vgigtpifsygggaghvpeyf seq id no:45)、丙甲菌素(alamethicin)(peptaibol)(pbabaqbvbglbpvbbeq seq id no:46)(b＝α-氨基异丁酸)、短杆菌肽(svklfpvklfp seq id no:47)、subtilosin a(nkgcatcsigaaclvdgpipdfeiagatglfglwg seq id no:48)、kalata b1(大环寡肽(cyclotide))(glpvcgetcvggtcntpgctcswpvctrn seq id no:49)、恒河猴θ-防御素1(rtd-1)()(gfcrclcrrgvcrcictr seq id no:50)。
[0240]
可由目的多核苷酸编码的示例性生物杀虫剂包括jaburetox(例如，seq id no：24，多肽seq id no：25)、胰蛋白酶调节卵泡抑制因子(tmof)(例如，seq id no：26；多肽seq id no:27、28)、苏云金芽孢杆菌毒素(例如，δ内毒素，例如，cry(晶体)毒素、cyt(细胞毒性)毒素)(例如，seq id no:33；多肽seq id no:34)；花柱鞘抑制蛋白(例如，无花果蛋白酶(例如，seq id no:51)、菠萝蛋白酶)，和/或植物性杀虫蛋白(vip)。这些是众所周知的多肽。苏云金芽孢杆菌毒素包括，例如，cry(晶体)毒素(例如，cry i、cry ii、cry iii、cry iv)、cyt(细胞毒性)毒素、植物性杀虫蛋白(vip)，它们根据其氨基酸相似度分为四个家族vip1、vip2、vip3和vip4，以及分泌的杀虫蛋白(sip)毒素。这些蛋白质包括具有可宽可窄不同毒性范围的毒素(例如，仅对特定昆虫群有毒)。
[0241]
在一些实施方案中，由目的多核苷酸编码的生物活性分子是jaburetox(肽jbtx)、胰蛋白酶调节卵泡抑制因子(tmof)、苏云金芽孢杆菌δ内毒素、cry毒素、cyt毒素、豆血红蛋白、固氮酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、细菌素、尼生素、癌素和/或癌素类似物(例如，seq id no:29、seq id no:30、seq id no：31、seq id no：32)。
[0242]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是与不包含共生体的植物相比，存在生物活性分子(例如，杀生物分子)和增加的对植物病原体的抗性/耐受性，并且存在从共生体转运到植物中的生物活性分子。在一些实施方案中，杀生物剂是细菌素或抗微生物肽并
且植物病原体是细菌。在一些实施方案中，细菌素或抗微生物肽是癌素和/或尼生素。
[0243]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是与不包含共生体的植物相比存在杀虫蛋白(例如生物杀虫剂)和增加的昆虫耐受性或抗性以及存在从共生体转运到植物中的杀虫蛋白。在一些实施方案中，杀虫蛋白是jaburetox，胰蛋白酶调节卵泡抑制因子(tmof)，苏云金芽孢杆菌毒素(例如δ内毒素)，任选地cry(晶体)毒素、cyt(细胞毒性)毒素、植物性杀虫蛋白(vip)或分泌的杀虫蛋白(sip)毒素和/或花柱鞘抑制蛋白，任选地无花果蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。
[0244]
在一些实施方案中，可以由本发明共生体中的目的多核苷酸表达的花柱鞘抑制蛋白。此类抑制肽已知如美国专利申请号2018/0199577中所示例。可用于在共生体中表达的花柱鞘抑制肽的示例包括但不限于表3中列出的那些。
[0245]
表4提供了示例性植物和植物易受感染的示例性疾病或病害(例如昆虫和/或线虫害虫)的列表。在一些实施方案中，本发明可用于在植物中提供增加的对这些疾病和病害的耐受性/抗性。
[0246]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是植物脂质、植物脂肪酸和/或植物油的存在或产量增加或减少。
[0247]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是植物生长调节剂(例如，生长素、细胞分裂素、赤霉素、乙烯；生长抑制剂/延缓剂)的存在或增加或减少的产生和经修饰的生长。在一些实施方案中，经修饰的生长可以是由于生长调节剂从共生体转运到宿主植物中而导致宿主植物的生长增加或生长减少和/或宿主植物的一部分的生长增加或减少，或由于生物活性分子从共生体转运到宿主植物中，导致宿主植物中生长调节剂(例如植物激素生物合成酶)的产生增加或减少。植物生长调节剂的产生增加或减少和经修饰的生长是与对照植物(例如，不包含共生体和存在植物生长调节剂的植物和/或不包含共生体和植物生长调节剂产生增加或下降)相比的。
[0248]
在一些实施方案中，经修饰的宿主植物特征是rna的存在或增加的产生以及多核苷酸、肽或多肽的增加/减少的产生。可用于本发明的rna可以是可用于修饰植物特征的任何rna，例如用于rna干扰(rnai)的任何rna。在一些实施方案中，rna可以包括但不限于sirna、dsrna、mirna和/或shrna。示例性的rna包括dvsnf7、ccomt、dcs、asn1、phl、ri、pgas和/或ppo5。
[0249]
本发明进一步提供了通过本发明的方法产生的具有修饰特征的宿主植物。
[0250]
本文还提供了一种生产生物分子或生物活性分子的方法，该方法包括提供本发明的共生体，其中目的多核苷酸编码生物分子和/或生物活性分子，并收集在所述共生体或形成共生体的接种物中产生的生物分子和/或生物活性分子；和/或提供本发明的宿主植物，其中目的多核苷酸编码生物分子和/或生物活性分子，并收集在形成共生体的接种物和/或共生体和/或宿主植物中产生的生物分子和/或生物活性分子。
[0251]
另外提供了一种将目的化合物递送至宿主植物的方法，包括将本发明的形成共生体的接种物或本发明的共生体移植到宿主植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点)上；并在宿主植物的所述至少一个位点处培养形成共生体的接种物或共生体以在宿主植物的所述至少一个位点处形成共生体，其中目的多核苷酸在共生体中表达，并且目的多核苷酸的表达产物和/或使用目的多核苷酸的表达产物制备的产物被
转运到宿主植物中，从而将目的化合物递送至植物。
[0252]
还提供了一种在不改变植物基因型的情况下产生包含修饰特征的植物的方法，该方法包括：将本发明的形成共生体的接种物或本发明的共生体移植到宿主植物上的至少一个位点(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个位点)上；并在宿主植物上的至少一个位点培养形成共生体的接种物或共生体以在宿主植物的所述至少一个位点形成共生体，其中目的多核苷酸在共生体中表达，并且所述目的多核苷酸的表达产物和/或使用目的多核苷酸的表达产物制备的产物被转运到宿主植物中，从而产生包含修饰表型而没有修饰基因型的植物。还提供了通过本发明的方法产生的植物。
[0253]
如本文所述，由本发明的多核苷酸编码的多肽(例如，由目的多核苷酸编码的多肽、植物激素生物合成酶)可以与靶向序列有效连接。在一些实施方案中，多肽可以在其n末端或其c末端或两者处连接至靶向序列。可用于本发明的靶向序列可以是能将多肽或肽引导/定位到特定细胞器或植物部分的任何靶向序列。靶向序列可以在多核苷酸或核酸分子的n-或c-末端可操作地连接，任选地其中多核苷酸或核酸分子对于靶向序列是异源的。靶向(或信号)序列或靶向肽(和编码它们的核苷酸序列)在本领域中是众所周知的，并且可以在公共数据库中找到，例如“信号肽网站：信号序列和信号肽的信息平台”www.signalpeptide.de)；“信号肽数据库”(proline.bic.nus.edu.sg/spdb/index)(choo等人,bmc bioinformatics 6:249(2005)(可在biomedcentral.com/1471-2105/6/249/abstract获得)；chlorop(cbs.dtu.dk/services/chlorop/；预测蛋白质序列中叶绿体转运肽(ctp)的存在以及潜在ctp切割位点的位置)；lipop(cbs.dtu.dk/services/lipop/；预测革兰氏阴性菌中的脂蛋白和信号肽)；mitoprot(ihg2.helmholtz-muenchen.de/ihg/mitoprot；预测线粒体靶向序列)；plasmit(gecco.org.chemie.uni-frankfurt.de/plasmit/index；预测恶性疟原虫(plasmodium falciparum)中的线粒体转运肽)；predotar(urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html；预测线粒体和质体靶向序列)；pts1(mendel.imp.ac.at/mendeljsp/sat/pts1/pts1predictor.jsp；预测含有过氧化物酶体靶向信号1的蛋白质)；signalp(cbs.dtu.dk/services/signalp/；预测来自不同生物的氨基酸序列中信号肽切割位点的存在和位置：革兰氏阳性原核生物、革兰氏阴性原核生物和真核生物)。signalp方法结合了切割位点的预测和基于多个人工神经网络和隐马尔可夫模型的信号肽/非信号肽预测；和targetp(cbs.dtu.dk/services/targetp/)；预测真核蛋白的亚细胞位置—位置分配基于任何n末端前序列，叶绿体转运肽(ctp)、线粒体靶向肽(mtp)或分泌途径信号肽(sp)的预测存在)。(另见von heijne,g.,eur j biochem133(1)17-21(1983)；martoglio等人trends cell biol8(10):410-5(1998)；hegde等人trends biochem sci31(10)):563-71(2006)；dultz等人j biol chem 283(15):9966-76(2008)；emanuelsson等人nature protocols 2(4)953-971(2007)；zuegge等人280(1-2):19-26(2001)；和neuberger等人j mol biol.328(3):567-79(2003))。可用于本文所述多肽靶向的示例性靶向序列包括但不限于表5中提供的那些。在一些实施方案中，由poi编码的多肽可以可操作地连接至靶向分泌系统的序列(例如，内质网(er)，例如，er靶向序列)。
[0254]
如本文所述，可用于本发明实施方案的植物、植物部分或植物细胞可以是任何植物或来自任何植物，包括但不限于被子植物(例如，双子叶植物或单子叶植物)、裸子植物、藻类(例如，大型藻类，如红藻门(红藻类)、褐藻门(褐藻类)和绿藻门(绿藻类)、金藻纲(金
藻类))、苔藓植物、蕨类和/或拟蕨类(即蕨类植物)。
[0255]
可用于本发明的植物(例如用于如本文描述的形成共生体的接种物、共生体、植物或宿主植物)可包括但不限于，来自以下属的任何植物：abelia物种(abelia)，abelmoschus物种(okra)，abies物种(fir)，acacia物种(acacia)，acalypha物种(chenille)，acca物种(feijoa，pineapple guava，guavasteen)，acer物种(maple)，achillea物种(yarrow)，achlys物种(barberry)，acmella物种(paracress)，acoelorrhaphe物种(palm)，acorus物种(calamus)，acronychia物种(aspen)，acrostichum物种(fern)，acrotriche物种(currant)，actinidia物种(kiwifruit)，adansonia物种(baobab)，adiantum物种(maidenhair fern)，adonidia物种(palm)，aechmea物种(bromeliad)，aegle物种(bael)，aesculus物种(buckeye，horse-chestnut)，aframomum物种(false cardamon)，agapanthus物种(agapanthus)，agaricus物种(mushroom)，agastache物种(anise)，agathosma物种(buchu)，agave物种(agave)，ageratum物种(whiteweed)，aglaonema物种(chinese evergreens)，agrimonia物种(龙芽草)，ailanthus物种(tree-of-heaven)，ajuga物种(bugle)，albizia物种(合欢树)，alchemilla物种(lady's mantle)，aleurites物种(candlenut)，allamanda物种(黄蔓)，allium物种(chive，garlic，leek，onion，shallot)，alnus物种(桤木)，alocasia物种(elephant's ear)，aloe物种(芦荟)，aloysia物种(beebrushes)，alpinia物种(shell ginger)，alternanthera物种(joyweeds)，althaea物种(药属葵)，amaranthus物种(amaranth)，amelanchier物种(唐棣属植物，花楸果)，amomum物种(小豆蔻)，amphitecna物种(黑葫芦)，anacardium物种(腰果)，ananas物种(菠萝)，anaphalis物种(pearly everlasting)，andrographis物种(false waterwillows)，andromeda物种(bog rosemary)，anethum物种(dill)，angelica物种(angelica)，angelonia物种(angelonia)，angostura物种(安哥斯图拉树)，annona物种(番荔枝，sweetsop，sugar-apple，刺果番荔枝)，anogeissus物种(axlewood)，anthemis物种(甘菊)，anthoxanthum物种(grass)，anthriscus物种(蜡叶峨参)，anthurium物种(白星海)，antidesma物种(bignay)，antigonon物种(coralvine)，antirrhinum物种(snapdragon)，apium物种(celery)，aquilegia物种(columbine)，arabidopsis物种(thale cress，mouse-ear cress)，aralia物种(walkingstick，udo)，araucaria物种(pine)，arbutus物种(madrone，草莓树)，arctium物种(burdock)，arctostaphylos物种(bearberry，manzanita)，ardisia物种(marlberry)，armeria物种(thrift)，armoracia物种(horseradish)，aronia物种(aronia)，arracacia物种(arracacha)，artemisia物种(wormwood)，artocarpus物种(breadfruit，jackfruit，monkeyfruit)，aruncus物种(goat's beard)，arundinaria物种(bamboo)，asarum物种(ginger)，asclepias物种(乳草)，ascophyllum物种(feamainn bhu
í
，rockweed，norwegian kelp，knotted kelp，knotted wrack或egg wrack)，asimina物种(木瓜)，aspalathus物种(rooibos)，asparagus物种(asparagus，asparagus fern)，aspidistra物种(cast iron plant)，aspidosperma物种(破斧树)，asplenium物种(nest fern)，aster物种(aster)，astragalus物种(milkvetch)，asystasia物种(asystasia)，athyrium物种(lady fern)，atriplex物种(滨藜属植物)，auriculari物种(edible fungi)，avena物种(燕麦)，averrhoa物种(starfruit)，baccaurea物种(lotkon)，baccharis物种(saltbush)，backhousia物种(ironwood)，
bactris物种(peach palm)，balanites物种(torchwood)，baleria物种(violet)，bambusa物种(竹)，baptisia物种(indigo)，barbarea物种(水芹)，basella物种(菠菜)，bauhinia物种(兰花树)，beaucarnea物种(棕榈)，begonia物种(秋海棠)，belamcanda物种(百合)，benincasa物种(waxgourd)，berberis物种(伏牛花)，bertholletia物种(巴西坚果)，beta物种(beet，swiss chard)，betula物种(桦树)，bidens物种(beggarticks)，billardiera物种(appleberry)，bischofia物种(重阳木)，bismarckia物种(palm)，bixa物种(胭脂树)，blighia物种(ackee)，boesenbergia物种(fingerroot)，borago物种(琉璃苣)，borassus物种(palm)，borojoa物种(boroj
ó
)，borrichia物种(sea oxeye)，boscia物种(hanza)，boswellia物种(frankincense)，bouea物种(plum mango)，brahea物种(palms)，芸苔属(brassica)物种(椰菜，swiss chard，卷心菜，cauliflower，choy sum，kale，mustard，mustard greens，rapeseed，rutabaga，brussel sprout)，breynia物种(snowbush)，brosimum物种(breadnut)，browallia物种(amethyst flower)，brunfelsia物种(raintree)，buchanania物种(chirauli-nut)，bucida物种(巴拉塔树)，bumelia物种(chittamwood)，bunchosia物种(peanut butter fruit)，bursera物种(limbo)，butia物种(jelly palm)，buxus物种(boxwood)，byrsonima物种(locustberry)，caesalpinia物种(caesalpinia)，cajanus物种(pigeon pea)，caladium物种(caladium)，calamagrostis物种(reed grass，smallweed)，calathea物种(calatheas，巴西条纹竹芋(prayer植物)，leren)，calendula物种(marigold)，calliandra物种(powder puff plant，fairy duster)，callicarpa物种(beautyberry)，callistemon物种(bottlebrushes)，calocedrus物种(incense cedar)，calophyllum物种(calophyllum)，calycanthus物种(sweetshrub)，calyptranthes物种(lidflowers，spicewoods，mountainbays)，camassia物种(camas，wild hyacinth)，camelina物种(false flax，camellia)，campanula物种(bellflower)，campomanesia物种(guabiroba)，campsis物种(trumpet creeper，hummingbird vine)，canarium物种(pacific almond)，canavalia物种(jackbeans)，canella物种(cinnamon bark)，canna物种(canna lily，indian shot)，cannabis物种(cannabis)，capparis物种(caperbushes)，capsella物种(shepherd’s purse)，capsicum物种(bell peppers，cayenne pepper，chilepepper)，carex物种(true sedges)，carica物种(papaya)，carissa物种(natal plum，num-num)，carnegiea物种(saguaro)，carpentaria物种(carpentaria palm)，carpinus物种(hornbeams)，carpobrotus物种(pigface，ice plant，sour fig，hottentot fig)，carthamus物种(红花)，carum物种(caraway)，carya物种(hickory坚果，山核桃)，caryocar物种(pequi，souari-nut)，caryota物种(fishtail palms)，casasia物种(casasia，seven-year apple)，casimiroa物种(sapote)，cassia物种(cassia)，castanea物种(chestnut，chinquapin)，casuarina物种(澳大利亚松)，casuarinaceae物种(sheoak)，catalpa物种(梓树属，catawba)，catharanthus物种(periwinkles)，ceanothus物种(ceanothus，buckbrush，soap bush)，cedrus物种(雪松)，ceiba物种(silk-floss术)，celosia物种(鸡冠花，woolflowers)，celtis物种(hackberries，nettle trees)，centaurium物种(矢车菊)，centella物种(pennywort)，centratherum物种(brazilian button，lark daisy)，cephalanthus物种(buttonbush)，cerastium物种(mouse-ear chickweed)，ceratonia物种(角豆树)，cercidiphyllum物种
(katsura)，cercis物种(紫荆)，chaenomeles物种(温柏)，chaerophyllum物种(细叶芹属)，chamaecyparis物种(falsecypress)，chamaedorea物种(棕竹，parlor palm)，chamaemelum物种(chamomile)，chamaerops物种(european fan palm)，chelidonium物种(celandine)，chenopodium物种(goosefoots)，chilopsis物种(desert willow)，chimaphila物种(prince's pine)，chimonobambusa物种(竹)，chiococca物种(milkberry，snowberry)，chionanthus物种(fringetree)，chrysanthemum物种(菊花)，chrysobalanus物种(cocoplum)，chrysophyllum物种(star apple，satinleaf)，cicer物种(鹰嘴豆)，cichorium物种(chicory，endive，escarole)，cinchona物种(quina)，cinnamomum物种(肉桂，樟脑树，cassia)，cirsium物种(thistle)，citharexylum物种(fiddlewood，zitherwood)，citrillus物种(西瓜)，柑橘属物种(柑橘、柚子、柠檬、酸橙、橙子、文旦、橘子)，cladrastis物种(yellowwood)，clarkia物种(godetia)，clausena物种(wampi)，claytonia物种(purslane)，cleome物种(吊兰，蜜源植物，cat’s whiskers)，clerodendron物种(glorybower，bagflower，bleeding-heart)，clinopodium物种(calamint)，clusiarosea物种(clusia，pitch apple)，coccoloba物种(seagrape)，coccothrinax物种(silverpalm)，椰子属(cocos)物种(椰子)，咖啡属(coffea)物种(coffee)，coleus物种(coleus)，colocasia物种(taro)，colubrina物种(nakedwood，snakewood，greenheart，hogplum)，combretum物种(bushwillows，combretum)，commiphora物种(myrrh)，conocarpus物种(buttonwood)，conradina物种(false rosemary)，conringia物种(hare's ear mustard)，convallaria物种(lily-of-the-valley)，copaifera物种(copaiba)，coptis物种(goldthread)，corchorus物种(jute)，cordia物种(manjack，bocote)，cordyline物种(ti plant，palm lily)，coreopsis物种(calliopsis，tickseed)，coriandrum物种(coriander，cilantro)，cornus物种(dogwood)，coronilla物种(crownvetch)，corydalis物种(corydalis)，corylus物种(filbert，hazel，hazelnut)，cosmos物种(cosmos，mexican aster，kenikir)，costus物种(spiral ginger)，cotinus物种(smoketree)，crambe物种(crambe)，crassocephalum物种(ragleaf，thickhead，bologi，ebolo)，crassula物种(jade plant，pygmyweed)，crataegus物种(hawthorn，quickthorn，thornapple，may-tree，hawberry)，crescentia物种(calabash tree，huingo，krabasi，kalebas)，crinum物种(swamplily，crinum)，crocus物种(saffron)，crotalaria物种(chipilin)，cryptotaenia物种(honewort，japanese cedar)，cucumis物种(cantaloupe，cucumber，melon，gherkin，muskmelon，honeydew)，cucurbita物种(pumpkin，summer squash，winter squash)，cuminum物种(cumin)，cunninghamia物种(cunninghamia，china-fir)，cupaniopsis物种(tuckeroo，soapberry)，cuphea物种(cuphea，cigar plant，heather)，cupressocyparis物种(leylandii，leyland cypress)，cupressus物种(cypress)，curcuma物种(turmeric)，cyamopsis物种(guar)，cycas物种(cycas)，cyclopia物种(honeybush)，cydonia物种(quince)，cymbopogon物种(lemongrass)，cynara物种(cardoon，artichoke，thistle)，cyperus物种(chufa，papyrus sedges，flatsedges，nutsedges，umbrella-sedges，galingale)，dahlia物种(dahlia)，dalbergia物种(kingwood，indian rosewood，african blackwood，tulipwood)，daucus物种(carrot)，davidsonia物种(ooray)，delonix物种(poinciana)，dendranthema物种(mums)，
dendrocalamus物种(bamboo)，deparia物种(fern)，dermatophyllum物种(mescalbean)，deschampsia物种(hair grass，tussock grass)，dialium物种(tamarind)，dianthus物种(carnation，pink，sweet william，dianthus)，dicentra物种(bleeding-hearts)，dictyophora物种(stinkhorn)，dietes物种(wood iris，fortnight lily，african iris，japanese iris，butterfly iris)，dimocarpus物种(longan)，dioscorea物种(yam)，diospyros物种(persimmon，black sapote)，diplazium物种(fern)，diplotaxis物种(wild rocket)，dizygotheca物种(false aralia，dizygotheca)，dodonaea物种(hop-bush)，doellingeria物种(cham-chwi)，dombeya物种(dombeya，dikbas，pinkball)，dovyalis物种(gooseberry，kei-apples)，dracaena物种(dragon tree，dracaena)，dryopteris物种(fern)，durio物种(durian)，dypsis物种(butterfly palm)，dyschoriste物种(snakeherb)，dysphania物种(epazote)，echinacea物种(echinacea，coneflowers)，echium物种(paterson's curse)，ecklonia物种(ecklonia cava)，elaeagnus物种(silverberry，oleaster)，elaeocarpus物种(ceylon olive)，elettaria物种(cardamom)，elwendia物种(black cumin)，elymus物种(couch grass，wildrye，wheatgrass)，epilobium物种(willowherbs)，epimedium物种(barrenwort)，epipremnum物种(centipede tongavine，pothos，devil's ivy)，eremocitrus物种(desert lime)，erigeron物种(fleabane，erigeron)，eriobotrya物种(loquat)，eriodictyon物种(yerba santa)，ernodea物种(beech creeper，coughbush)，eruca物种(arugula)，eryngium物种(eryngo，sea holly，culantro)，erythrina物种(coral tree，flame tree，bucar
é
，kafferboom)，eucalyptus物种(gums，eucalypts，mallee)，eucharis物种(amazon lily)，eucommia物种(chinese rubber tree)，eugenia物种(dune myrtle，rainforest plum，mountain cherry，pitanga，araza)，euodia物种(euodia)，eupatorium物种(boneset，thoroughworts，snakeroot)，euphorbia物种(spurge)，euryops物种(euryops)，eustoma物种(lisianthus，prairie gentian)，euterpe物种(palm)，exacum物种(persian violet)，fagopyrum物种(buckwheat)，fagus物种(beech)，fatshedera物种(tree ivy，aralia ivy)，ferula物种(fennel，muskroot，sumbul)，festuca物种(fescue)，ficaria物种(celandine)，ficus物种(fig)，filipendula物种(meadowsweet)，firmiana物种(parasol tree)，flacourtia物种(batoko plum)，flammulina物种(enokitake)，foeniculum物种(fennel)，forestiera物种(swampprivets)，fortunella物种(kumquat)，fothergilla物种(witch alder)，fragaria物种(strawberry)，frangula物种(cascara)，franklinia物种(franklin tree)，fraxinus物种(ash)，fritillaria物种(fritillaries)，fucus物种(rockweed)，fumaria物种(fumitory)，gaillardia物种(blanket flower)，galium物种(sweetscented bedstraw)，ganoderma物种(reishi mushroom)，garberia物种(garberia，garber's scrub starts)，garcinia物种(mangosteen，saptrees，garcinias)，gardenia物种(gardenia)，gaultheria物种(wintergreen，waxberry，snowberry，shallon)，gaylussacia物种(huckleberry)，gazania物种(gazania，trailing gazania，clumping gazania)，geijera物种(geijera，wilga，oilbush，sheepbush)，genipa物种(genip)，gentiana物种(gentian)，geranium物种(geranium，cranesbill)，gigantochloa物种(竹)，ginkgo物种(银杏，铁线蕨树)，
glebionis物种(chrysanthemum，corn marigold，crown daisy)，gleditsia物种(honey locust)，glinus物种(sweetjuice)，glycine物种(大豆)，gomphrena物种(globe amaranth)，goodyera物种(rattlesnake plantain，jade orchids，ladies'tresses)，gordonia物种(gordonia，loblolly-bay)，gossypium物种(棉籽)，grevillea物种(grevillea，spider flower，silky oak，toothbrush植物)，grewia物种(phalsa)，grifola物种(maitake)，grindelia物种(gumweed)，guaiacum物种(guaiac)，guizotia物种(niger seed)，gymnema物种(gymnema)，gymnocarpium物种(oak fern)，gymnocladus物种(coffeetree，soap tree)，hakonechloa物种(hakone grass，japanese forest grass)，halesia物种(silverbell，snowdrop树)，hamamelis物种(witch-hazel)，hamelia物种(firebush，hummingbird bush，scarlet bush，redhead)，hancornia物种(mangaba)，harpephyllum物种(kaffir-plum)，hedychium物种(garland flower，ginger lily，kahili ginger)，helianthus物种(sunflower，jerusalem artichoke)，helichrysum物种(curry plant)，heliconia物种(lobster-claws，toucan beak，wild plantains，false bird-of-paradise)，helictotrichon物种(blue oat grass)，hemerocallis物种(daylily)，heracleum物种(hogweed，cow parsnip)，hericium物种(pom pom，edible mushroom)，hesperis物种(dame's rocket)，heuchera物种(coral bell，alumroot)，hibiscus物种(hibiscus，rose mallow，rose of sharon)，hierochloe物种(grass)，hippeastrum物种(amaryllis)，hippophae物种(sea buckthorn)，holodiscus物种(oceanspray，creambush)，hordeum物种(barley)，hosta物种(hosta，giboshi，plantain lilies)，houttuynia物种(dokudami)，hovenia物种(japanese raisintree)，howea物种(kentia palm，thatch palm，curly palm)，hoya物种(waxplant，waxvine，waxflower，球兰)，hybrid物种(astilbe)，hydrangea物种(hydrangea，hortensia)，hydrophyllum物种(waterleaf)，hylocereus物种(dragonfruit，pitahaya)，hymenaea物种(courbaril)，hymenocallis物种(spider lily)，hypericum物种(st.john's wort，goatweed)，hyphaene物种(doum palm)，hypsizygus物种(beech mushroom)，hyssopus物种(herb hyssop)，ilex物种(holly，winterberry)，illicium物种(star anise，anisetree)，impatiens物种(impatiens，凤仙花，touch-me-not，snapweed，patience，balsam，busy lizzie)，imperata物种(satintails)，indigofera物种(indigo)，inga物种(inga)，ipomoea物种(sweet potato，morning glories，water convolvulus，kangkung，bindweed，moonflower，jalap)，iris物种(iris)，irvingia物种(dika)，iva物种(marsh elder)，ixora物种(west indian jasmine，viruchi，rangan，kheme，ponna，chann tanea，techi，pan，siantan，jarum-jarum，jejarum，jungle flame，jungle geranium，cruz de malta)，jacaranda物种(jacaranda)，jasminum物种(jasmine)，jatropha物种(physic nut，nettlespurge)，jubaea物种(palm)，juglans物种(walnut)，juncus物种(rush)，juniperus物种(juniper)，justicia物种(water-willow，shrimp plant，malabar nut)，kalanchoe物种(kalanchoe，panda plant，mother of thousands，felt plant)，kalimeris物种(indian aster，kalimeris aster)，kalmia物种(sheep-laurel，lamb-kill，calf-kill，kill-kid，sheep-poison，spoonwood)，kalopanax物种(castor aralia，tree aralia，prickly castor oil tree)，kniphofia物种(tritoma，red hot poker，torch lily，knofflers，poker plant)，koelreuteria物种
(goldenrain树，flamegold，chinese flame-tree)，kunzea物种(kunzea，kanuka，manuka，muntries)，lablab物种(hyacinth bean，lablab bean，bataw，indian bean)，laburnum物种(golden chain，golden rain，laburnum)，lactuca物种(lettuce，celtuce)，lagenaria物种(calabash，gourd)，lagerstroemia物种(crepe myrtle，crape myrtle)，laminaria物种(kelp，tangle)，lansium物种(lanzones，langsat)，latania物种(latan palm，latania palm)，launaea物种(launaea)，laurus物种(bay laurel，sweet bay)，lavandula物种(lavender)，lecythis物种(paradise nut，monkey pot，cream nut，sapucaia nut)，leea物种(leea，talyantan)，lens物种(lentil)，lentinula物种(shiitake)，leonurus物种(motherwort)，lepidium物种(peppercress，peppergrass，pepperwort，tumbleweed)，lepista物种(blewitt，mushroom-forming fungi)，lespedeza物种(bush clover，japanese clover)，lesquerella物种(gaslight bladderpod)，lessertia物种(balloon pea)，leucaena物种(leadtrees)，leucanthemum物种(max chrysanthemum，creeping daisy，oxeye daisy，shasta daisy)，leucothoe物种(leucothoe，sweetbells，doghobble，black laurel)，leucothrinax物种(palm)，levisticum物种(lovage)，lewisia物种(lewisia)，liatris物种(blazing star)，licania物种(gopher apple，sansapote，merecure，oiticica)，ligustrum物种(privet)，lilium物种(true lily，lily)，limnanthes物种(meadowfoam)，limnophila物种(marshweeds)，limonia物种(wood-apple)，limonium物种(sea-lavender，statice，caspia，marsh-rosemary)，lindera物种(spicewood，spicebush，benjamin bush)，linnaea物种(beauty bush，twinflower)，linum物种(flax)，lippia物种(lippia，mexican oregano，licorice verbena)，liquidambar物种(american storax，satin-walnut，redgum，sweetgum，star gum)，liriodendron物种(tuliptree，tulip poplar，yellow poplar)，liriope物种(lilyturf，monkey grass，spider grass)，litchi物种(lychee)，livistona物种(fan palm)，lobelia物种(lobelia)，lobularia物种(sweet alyssum)，lonicera物种(honeysuckle)，loropetalum物种(loropetalum，chinese fringe flower)，lotus物种(lotus，deervetch，bird's-foot trefoil，trefoil)，luffa物种(gourd，loofah)，lunaria物种(honesty)，lupinus物种(lupin，lupine)，lychnis物种(campion，catchfly)，lycium物种(goji berry，box-thorn，desert-thorn)，lycopersicon物种(tomato，wild tomato)，lycopus物种(gypsywort，bugleweed，waterhorehound)，lyonia物种(staggerbush，poor-grub，maleberry，he-huckleberry，hurrahbush)，lysichiton物种(skunk cabbage，swamp lantern)，lysiloma物种(false tamarind，sabicu)，lysimachia物种(loosestrife)，maackia物种(maackia)，macadamia物种(macadamia)，maclura物种(cockspur thorn，osage orange，dyer's mulberry，mandarin melon berry.che)，macrocystis物种(giant kelp，giant bladder kelp)，magnolia物种(magnolia)，mahonia物种(oregon grape，fr
é
mont's mahonia，agarita，chaparral berry)，maianthemum物种(false solomon's seal)，malcolmia物种(virginia stock，african mustard)，mallotonia物种(sea lavender)，malpighia物种(acerola，barbados cherry，dwarf holly)，malus物种(apple，crabapples，crabtrees，wild apples)，mammea物种(mammee apple，tropical apricot，salapee)，mandevilla物种(rocktrumpet，allamanda)，mangifera物种(mango，white mango，jack，pahutan，paho)，
ironwood，ironwood，east african olive，elgon teak)，onobrychis物种(sainfoin)，oplopanax物种(devil's club，alaskan ginseng)，opuntia物种(prickly pear，tuna，nopal)，origanum物种(oregano，marjoram，cretan dittany，bible hyssop)，oryza物种(rice，wild rice，african rice，longstamen rice，red rice，asian rice)，osmanthus物种(fragrant tea olive，holly osmanthus)，osmunda物种(royal fern，flowering fern)，osmundastrum物种(cinnamon fern)，ostrya物种(hop-hornbeam，hophornbeam)，oxalis物种(wood sorrel，yellow sorrel，pink sorrel，false shamrock，sourgrass，oxalise)，oxydendrum物种(sourwood，sorrel tree)，pachira物种(guiana chestnut，money tree，malabar chestnut，french peanut，provision tree，saba nut，monguba，pochote)，pachyrhizus物种(jicama，yam bean，nupe，ahipa)，pachystachys物种(cardinals guard，lollipop plant，golden shrimp plant)，paeonia物种(peony，polish rose)，panax物种(ginseng，notoginseng，three-seven root，mountain plant，pseudoginseng)，pandanus物种(pandan，screw palm，screw pine，nicobar-breadfruit，karuka)，pandorea物种(wonga vine，bower of beauty，pandoras vine，boat vine)，panicum物种(panicgrass，millet，panicum，witchgrass，tumbleweed，maidencane)，papaver物种(poppy)，parkia物种(bitter bean，african locust bean)，parkinsonia物种(palo verde，brea，verde olivo)，parrotia物种(persian ironwood，chinese ironwood)，parthenocissus物种(virginia creeper，woodbine，sevenleaf creeper，boston ivy)，passiflora物种(passionfruit，passion flowers，passion vine，maypop，granadilla)，pastinaca物种(parsnip)，paullinia物种(guarana，yoco)，paulownia物种(pprincess tree，kiri，korean paulownia，dragontree)，paxistima物种(oregon boxleaf，canby's mountain-love)，pelargonium物种(geranium，storksbills，pelargonium)，peltophorum物种(weeping wattle，copperpod，yellow-flamboyant，yellow flametree，yellow poinciana)，pennisetum物种(fountaingrasses，pearl millet，kikuyu grass，feathertop grass)，penstemon物种(beardtongue)，pentalinon物种(wild allamanda)，pentas物种(egyptian starcluster，penta)，peperomia物种(radiator plant，peperomia)，perilla物种(perilla，japanese basil)，persea物种(avocado，bay tree，coyo，redbay，swampbay)，persicaria物种(waterpepper，knotweed，smartweed，hot mint)，petasites物种(butterbur，coltsfoots)，petroselinum物种(parsley)，petunia物种(petunia)，peucedanum物种(masterwort)，peumus物种(boldo)，phaseolus物种(bean，wild bean)，phellodendron物种(cork-tree，phellodendron)，philadelphus物种(mock-orange)，philodendron物种(philodendron，rascagarganta，vilevine，treelover)，phlox物种(phlox，wild sweet william)，phoenix物种(date palm，date)，pholiota物种(nameko，mushroom)，photinia物种(photinia)，phyllanthus物种(gooseberry，leafflower，scrubby spurge，red root floater，sand reverchonia，gripeweed，shatterstone)，phyllostachys物种(golden bamboo，fishpole bamboo，yellow groove bamboo，madake，timber bamboo，moso bamboo)，physalis物种(groundcherry，tomatillo，husk tomatoes，inca berry，poha berries，golden berries，cape gooseberry)，physocarpus物种(ninebark)，picea物种(spruce)，pilea物种
(aluminum plant，artillery plant，silver sprinkles，friendship plant，creeping charlie)，pimenta物种(allspice，bay rum tree，ciliment)，pimpinella物种(anise，aniseed，pimpinella，chamnamul，saxifrage)，pinckneya物种(georgia bark，pinckneya)，pinus物种(pine)，piper物种(pepper，pariparoba，mexican pepperleaf，betel vine)，pipturus物种(mamaki)，pistacia物种(pistachio，mastic)，pisum spp(pea)，pithecellobium物种(madras-thorn)，pittosporum物种(pittosporum，petroleum nut，cheesewood)，plantago物种(plantain)，platanus物种(planetree，sycamores)，platonia物种(bacury)，platycladus物种(chinese arborvitae，biota)，platycodon物种(balloon flower)，plectranthus物种(spurflower)，pleurotus物种(oyster mushroom)，plinia物种(brazilian grapetree，jaboticaba，cambuc
á
)，plumbago物种(plumbago，leadwort)，plumeria物种(plumeria，frangipani)，podocarpus物种(yellowwood，pine，illawarra plum)，polygonatum物种(solomon's seal)，polypodium物种(polypodies，rockcap fern)，polyscias物种(ming aralia，'ohe)，polystichum物种(fern)，poncirus物种(trifoliate orange)，pontederia物种(pickerel weeds)，populus物种(poplar，aspen，cottonwood)，porophyllum物种(coriander)，portulaca物种(purslane)，potentilla物种(cinquefoils，tormentils，barren strawberries)，pouteria物种(abiu，canistel，l
ú
cuma，sapote)，primula物种(primrose)，proboscidea物种(unicorn plant)，prosopis物种(mesquite)，prostanthera物种(mintbush)，prunella物种(heal-all)，prunus物种(almond，apricot，cherry，chokecherry，nectarine，peach，plum，plumcot，prune，sloe)，pseudanamomis物种(monos plum)，pseudolarix物种(golden larch)，pseudotsuga物种(douglas fir)，psidium物种(guava)，psychotria物种(wild coffee)，ptelea物种(hoptrees)，pteridium物种(fern)，pterocarpus物种(saunders)，pterocarya物种(wingnuts)，pterostyrax物种(epaulette tree)，ptychosperma物种(cabbage palm)，pueraria物种(kudzu)，punica物种(pomegranate)，pycnanthemum物种(mountainmint)，pyrostegia物种(flamevine)，pyrus物种(pear)，quararibea物种(guayabillo)，quassia物种(amargo)，quercus物种(oak)，quillaja物种(soapbark)，randia物种(indigoberry)，raphanus物种(daikon，radish)，raphia物种(wine palm)，ravenala物种(traveller's palm)，rehmannia物种(chinese foxglove)，rhamnus物种(buckthorn)，rhapis物种(lady palms)，rheum物种(rhubarb)，rhizophora物种(true mangroves)，rhododendron物种(azalea，labrador tea，rhododendron)，rhus物种(sumac)，ribes物种(currant，gooseberry，jostaberry)，ricinodendron物种(african nut)，ricinus物种(castor oil)，robinia物种(locust)，rorippa物种(cress)，rosa物种(rose)，rosemarinus物种(rosemary)，roystonea物种(royal palm)，rubus物种(raspberry，blackberry，cloudberry，tayberry，youngberry)，rudbeckia物种(coneflowers，black-eyed-susan)，ruellia物种(wild petunias)，rumex物种(sorrel，dock)，ruta物种(rue)，sabal物种(palmetto，sabal)，sagittaria物种(wapato)，salacca物种(salak palm)，salix物种(willow)，salvia物种(sage，clary，rosemary，chia)，sambucus物种(elderberry，elder)，sandoricum物种(santol)，sanguisorba物种(burnet)，santalum物种(quandong)，sanvitalia物种(creeping zinnia)，sargassum物种
(gulfweed，sea holly)，sassafras物种(sassafras)，satureja物种(savory)，savia物种(savia)，scabiosa物种(pincushion flowers)，scaevola物种(scaevolas，fan-flowers，half-flowers，naupaka，gullfeed)，schinus物种(peppertree)，schinziophyton物种(mongongo)，schisandra物种(magnolia berry)，schizonepeta物种(japanese catnip)，scolymus物种(golden thistle)，scorzonera物种(black salsify)，secale物种(rye)，sechium物种(chayote)，sedum物种(stonecrops)，senecio物种(ragworts，groundsels)，senegalia物种(gum arabic，catechu)，senna物种(candlebush，avarum)，sequoia物种(coastal redwood)，sequoiadendron物种(giant sequoia)，serenoa物种(saw palmetto)，sesamum物种(sesame)，sesuvium物种(sea-purslanes)，shepherdia物种(buffaloberry)，sidalcea物种(checkermallows)，silybum物种(milk thistle)，simarouba物种(simaruba)，simmondsia物种(jojoba)，sinapis物种(mustard)，sisyrinchium物种(blue-eyed grasses)，sium物种(skirret，water parsnips)，solanum物种(tomato，potato，cocona，sunberry，pepino，naranjilla，garden huckleberry，eggplant)，solidago物种(goldenrod)，sophora物种(kowhai)，sorbus物种(mountain-ash，serviceberry)，sorghastrum物种(indiangrass)，sorghum物种(sorghum)，spartina物种(cordgrass)，spathiphyllum物种(spath，peace lilies)，spathodea物种(african tulip tree)，sphaeropteris物种(tree fern)，spinacia物种(spinach)，spiraea物种(spirea)，spondias物种(mombin)，stachys物种(betony，hedgenettle)，stachytarpheta物种(porterweeds)，stenochlaena物种(fern)，sterculia物种(tropical chestnuts)，stevia物种(stevia)，stewartia物种(stewartia)，stokesia物种(stokes aster)，strelitzia物种(bird of paradise)，stropharia物种(mushroom)，struthiopteris物种(deer fern)，styphnolobium物种(necklacepod)，styrax物种(snowbell)，suriana物种(bay cedar)，sutera物种(sutera)，swietenia物种(mahogany)，syagrus物种(overtop palm，licuri palm，queen palm)，symphoricarpos物种(snowberry)，synsepalum物种(miracle fruit)，syringa物种(lilac)，syzygium物种(brush cherries，waterberry，clove)，tabebuia物种(trumpet tree)，tabernaemontana物种(milkwood)，tagetes物种(marigold)，talinum物种(fameflower)，tamarindus物种(tamarind)，tanacetum物种(tansy)，taraxacum物种(dandelion)，tasmannia物种(pepperbush)，taxodium物种(baldcypress，pondcypress)，taxus物种(yew)，tecoma物种(trumpetbush)，tellima物种(fringecups)，terminalia物种(indian almond，terminalia，kakadu plum)，ternstroemia物种(ternstroemia)，tetragonai物种(spinach)，tetrazygia物种(clover ash)，teucrium物种(germander)，theobroma物种(cacao)，thlaspi物种(pennycress)，thuja物种(arborvitaes，thujas，cedars)，thymus物种(thyme)，thyrsostachys物种(竹)，tiarella物种(foamflower)，tibouchina物种(tibouchina)，tilia物种(linden)，tolmiea物种(piggyback plant)，toona物种(redcedar)，torreya物种(nutmeg yew，torreya)，trachycarpus物种(palm)，trachyspermum物种(ajowan)，tradescantia物种(spiderwort)，tragopogon物种(salsify)，tremella物种(真菌)，triadica物种(chinese tallowtree)，tribulus物种(caltrop)，tricholoma物种(fungus)，trientalis物种(starflowers)，trifolium物种(clover)，trigonella物种(fenugreek)，trillium物种
(trillium)，triticum物种(wheat)，tropaeolum物种(nasturtium)，tsuga物种(hemlock tree)，tuber物种(truffle)，turbinaria物种(disc coral，scroll coral，cup coral，vase coral，pagoda coral，ruffled ridge coral)，turnera物种(damiana)，typha物种(cattail，bulrush，reedmace，reed，punks，raupo)，uapaca物种(sugar plum)，ugni物种(chilean guava)，ulmus物种(elm)，uncaria物种(cat's claw，gambir)，ungnadia物种(mexican buckeye)，uniola物种(sea oats)，urtica物种(nettle)，vaccinium物种(blueberry，cranberry，huckleberry，lingonberry)，valerianella物种(corn salad)，vancouveria物种(inside-out花)，vangueria物种(spanish-tamarind)，vanilla物种(vanilla)，vasconcellea物种(mountain papaya，babaco)，verbascum物种(mullein)，verbena物种(verbena)，vernonia物种(ironweed)，veronica物种(speedwell)，viburnum物种(cranberry，荚蒾)，vicia物种(vetch)，vigna物种(bean)，viola物种(pansy，violet)，vitex物种(plum，chastetree)，vitis物种(grape)，volvariella物种(mushroom)，washingtonia物种(palm)，wedelia物种(creeping-oxeye)，wisteria物种(wisteria)，withania物种(ashwagandha)，xanthoceras物种(yellowhorn)，xanthosoma物种(tanier)，ximenia物种(tallowwood)，xylopia物种(grains of selim)，yucca物种(yucca)，zamia物种(cycad)，zanthoxylum物种(pepper)，玉蜀黍物种(玉米，墨西哥玉蜀黍)，zelkova物种(zelkova)，zephyranthes物种(lily)，zingiber物种(ginger)，zinnia物种(zinnia)，zizania物种(wild rice)，和/或ziziphus物种(jujube，zizafun)。
[0256]
在一些实施方案中，可用于本发明的植物包括但不限于表2或表4或上段提供的列表中列出的那些。在一些实施方案中，可用于本发明的示例性植物包括柑橘类植物(例如葡萄柚、橙子、柠檬、酸橙等)、番茄植物、玉米植物、山核桃植物和烟草植物。
[0257]
表1.质体蛋白
[0258]
[0259][0260]
表2.农杆菌属物种的天然宿主或其中已将农杆菌属物种用于dna转移过程的示例植物
[0261]
[0262]
[0263]
[0264][0265]
表3.花柱鞘抑制肽示例
[0266][0267]
表4.植物及其疾病和病害的示例
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
[0278][0279]
表5.代表性靶向肽的氨基酸序列
[0280]
[0281][0282]
x5意指任何5个氨基酸可以存在于序列中以将蛋白质靶向至过氧化物酶体(例如rlavavahl，seq id no:65)。
[0283]
现在将参考以下实施例描述本发明。应当理解，这些实施例并非旨在将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在作为某些实施例的示例。本领域技术人员想到的示例性方法的任何变化都旨在落入本发明的范围内。
实施例
[0284]
实施例1.形成共生体的接种物和共生体的接种/产生
[0285]
可以使用多种不同的方法产生形成共生体的接种物和共生体，这些方法包括：i)共同接种、ii)单一接种和iii)直接dna接种，如图1所示。
[0286]
i.共同接种方法采用了两种农杆菌属菌株。一种菌株是卸甲的农杆菌属物种，其包含用于表达目的多核苷酸(poi)的二元载体(例如，根癌农杆菌eha105菌株)和用于将植物激素基因(phg)转移至植物细胞的第二野生型(wt)农杆菌属菌株。以这种方式共接种的同时具有poi和ph基因(phg)的植物细胞可被称为形成共生体的接种物或称为共生体，这取决于预期用途。在某些情况下，这些细胞可用作形成共生体的接种物，以在宿主植物上形成共生体，或者当位于植物(或其一部分)上的细胞以这种方式接种细菌细胞时，它们可直接在植物上形成共生体。
[0287]
使用本领域中的常规程序培养携带二元载体的卸甲农杆菌属菌株(在本实施例中是根癌农杆菌eha105菌株)和wt菌株，然后将每种菌株离心以回收细菌沉淀，再重新悬浮在接种缓冲液(10mm mgcl2、10mm mes[ph 5.6]、100μm乙酰丁香酮)中，分别达到od
600
下的终浓度为1和0.1。然后将它们在室温保持1-3小时，随后在接种植物组织之前混合在一起，之后形成共生体的接种物或共生体形成了。
[0288]
ii.对于单一接种方法，仅使用单一农杆菌属物种来接种植物细胞或植物(例如，宿主植物)。在本实施例中，使用携带同时包含poi和phg的二元载体(例如，psym质粒，参见图2)的卸甲根癌农杆菌eha105菌株来接种植物细胞。psym质粒含有大约7.5kb的植物生长调节剂(吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸2-单加氧酶、异戊烯基转移酶、吲哚-3-乳酸合酶)的盒，和与组成型或诱导型启动子可操作地连接的poi。psym质粒还含有可筛选标志物基因(卡那霉素)，以允许选择携带psym质粒的农杆菌属物种细胞。用含有psym的农杆菌属物种悬浮液来接种植物组织，以形成形成共生体的接种物或共生体。
[0289]
iii.对于直接dna接种，可以使用生物弹击递送系统将dna递送至植物细胞或组织中。这是使用包被有poi和phg基因的金属颗粒来完成的，这些金属颗粒被直接推进到宿主植物细胞内，而不使用农杆菌属物种作为基因载体。然后细胞将poi和phg基因并入到基因组中，之后植物组织可以形成形成共生体的接种物或共生体。许多其它直接dna递送的方法是已知的，并且可以用来代替生物弹击法，包括，例如电穿孔、显微注射、脂质转染(脂质体
介导的转化)、超声处理、硅纤维介导的转化、化学刺激的dna摄取(例如，多聚转染；如聚乙二醇(peg)介导的转化)和/或激光微束(uv)诱导的转化，这些都获得了类似的良好表现。
[0290]
一旦将dna递送至宿主植物细胞基因组中，phg的表达就会诱导和刺激植物组织以生长出混合培养的共生体(参见图3)，该共生体含有具有不同基因插入和poi和phg表达水平的细胞的集合。混合培养的共生体可以自主生长，并通过与韧皮部和木质部中之一或二者的连接而经由维管形成与宿主植物连接，在韧皮部和/或木质部中，poi产物可以被转运至宿主植物。由共生体产生的poi产物可以从共生体经由质外体和/或共质体和/或通过韧皮部和/或木质部进行转移，以分散在整个宿主植物中。
[0291]
随后，可以将混合培养的共生体切掉并置于无激素培养中生长，其中可选择具有所需性状和表达水平的细胞，在这种情况下，就允许分离出均一性的形成共生体的接种物。对纯培养形成共生体的接种物的选择可以包括但不限于使用抗生素筛选(例如，使用poi的抗生素抗性标志物，其只会允许转化的细胞(即，具有poi和phg的细胞)生长)、系列稀释/分离培养物，或者可以转化为原生质体和单一原生质体细胞，它们可以分离出来并生长为纯培养物。可以选择那些除了表达poi和phg之外，还表达期望属性的形成共生体的接种物。
[0292]
此外，当在共生体形成过程中使用农杆菌时，使用抗生素的过程也可用于从混合培养的形成共生体的接种物中清除农杆菌细胞。
[0293]
最终步骤包括将选定的形成共生体的接种物移植到宿主植物上，在那里它可以附着并提供poi表达产物或poi表达产物的产物(例如，poi表达产物可以是参与共生体中产物生物合成的酶，并且该产物是被转运出共生体并转入宿主植物的产物)，用于分散到植物中和/或遍及整个植物。一旦形成共生体的接种物附着在植物宿主上，它就形成了所谓的共生体。图4中示出了共生体的一个示例，其中小图a和小图b显示了使用共同接种方法接种后60天后形成的柑橘共生体。小图c和d显示了使用单一菌株接种方法在柑橘上形成的共生体(参见，例如图1的共同接种和单一菌株接种的图形表征)。
[0294]
在本实施例中，使用携带psym的农杆菌属物种来接种植物宿主并诱导共生体的形成。为此，将农杆菌属物种在补充有适当抗生素(50μg卡那霉素)的10ml luria bertani培养液中在28℃培养过夜。将两种菌株离心以回收细菌细胞沉淀，然后将其重新悬浮于接种缓冲液中(如前所述)。不同的技术可用于接种宿主植物。例如，茎上具有坚硬外部结构的木本植物(如柑橘类)需要一种方法来刺穿木本茎组织以渗透到植物中。在此处，浸在农杆菌属物种接种溶液中的用于柑橘的齿镊(参见图5，小图a)可用于刺穿柑橘树皮组织，以将溶液递送至植物。在本实施例中，使用纹身针(图5，小图b)或注射针(图5，小图c)，通过简易地将针浸入农杆菌属物种溶液中并刺穿组织，以将农杆菌属物种溶液注射或传递到植物组织内，来接种具有柔软茎的草本植物如番茄(图5，小图b和图5，小图c)。
[0295]
共生体组织可以在一系列不同类型的宿主植物上生长。在图6中，我们展示了在山核桃(图6，小图a)、番茄(图6，小图b)、柑橘(图6，小图c)和本氏烟草(图6，小图d)上共生体的形成和生长。通过使用上述方法之一进行接种形成了这些共生体。
[0296]
实施例2.形成共生体的接种物的体外培养
[0297]
可以产生形成共生体的接种物(例如图7)，并将其用于接种其它宿主植物。本实施例描述了清除共生体组织的微生物污染的过程，包括去除农杆菌属物种或用于生成共生体的其它细菌，以及可能污染琼脂或液体培养物的任何微生物杂质(例如图8)。这个过程允许
在体外培养中产生和维持形成共生体的接种物。
[0298]
一旦共生体在宿主植物上形成，它就可以用于产生形成共生体的接种物(图7和图8)。为此，从宿主植物中取出共生体组织，并用流动的自来水冲洗约30分钟。然后用乙醇来清洗冲洗过的组织。随后，用10％的漂白剂溶液来洗涤组织，然后用无菌水溶液清洗。采用无菌技术在无菌条件下并在层流净化罩中完成灭菌步骤，以避免细菌或真菌的外部污染。
[0299]
灭菌步骤完成后，将组织置于无菌纸上干燥(例如，无菌滤纸)，然后放在用于番茄和柑橘的基于murashige和skoog(ms)的固体琼脂培养基上(图8，小图a和b)，或者放在用于番茄和柑橘的液体琼脂培养基中(图8，小图c和d)。
[0300]
在细胞培养中使用包含抗生素的生长培养基来去除农杆菌属物种细胞，并仅提供形成共生体的接种物细胞。在培养基上进行多次组织培养分裂和传代后，提供了如图7所示的poi的同质性表达。图7示出了在选择性培养基上表达mcherry的形成共生体的接种物，其在紫外光和mcherry滤光器下显示荧光标志物的高表达。
[0301]
实施例3.将形成共生体的接种物移植到宿主植物上
[0302]
从不同的作物中分离出共生体组织(图6)，并在选择性琼脂培养基上生长以去除如实施例2中描述的细菌，从而在培养基上产生形成共生体的接种物。将用mcherry(图7)或绿色荧光蛋白(gfp)转化的形成共生体的接种物组织用于优化组织选择，其通过采用带有紫外灯的mcherry/gfp滤光器筛选荧光强度，并通过多次仅将荧光细胞转移到新的选择性琼脂培养基中(如实施例2中所述)。在选择性固体琼脂培养基条件(图8，小图a(番茄)；图8，小图b(柑橘))下和选择性液体琼脂培养基条件(图8，小图c(番茄)；图8，小图d(柑橘))下，对来自番茄和柑橘的形成共生体的接种物组织进行培养。
[0303]
从培养基中取出准备好移植的形成共生体的接种物组织，然后在含有植物激素的移植溶液(含有生长素和细胞分裂素的无菌蒸馏水)中洗涤。移植溶液用于辅助形成共生体的接种物和宿主植物相互作用的移植功效。洗涤之后，将移植溶液中形成共生体的接种物(来自柑橘的组织)施加到柑橘植物茎上之前已经除去茎表皮层的位置。为了确保形成共生体的接种物的移植/嫁接粘附以形成共生体，将硅胶带牢固地贴在形成共生体的接种物/共生体组织和茎的周围(图9，小图a)。如可很好理解地，可以使用其它方法来代替硅胶带，以将形成共生体的接种物/共生体组织保持在宿主植物上的适当位置。大约6周后，从共生体上取下硅胶带(图9，小图b)，并切下组织以评估粘附、维管形成(图9，小图c)和gfp表达(图9，小图f)，对其中每一项都进行了观察。
[0304]
对于番茄，首先在含有植物激素(生长素和细胞分裂素)的移植溶液中洗涤从番茄制备的形成共生体的接种物组织。将来自番茄的形成共生体的接种物组织施加到去除了茎表皮层的番茄植物茎上。与柑橘的实施例类似，为了确保共生体组织粘附到茎上，应用塑料薄膜(例如，m)来协助维持形成共生体的接种物和茎之间的湿度和接触(图9，小图d)。六周后，共生体组织已经与番茄宿主植物整合，并且大小增加(图9，小图e)，证明移植成功。
[0305]
实施例4.共生体多功能性
[0306]
共生体细胞可以表达使用一种或两种或更多种载体/表达盒导入的一种或两种或更多种poi，这些载体/表达盒可以通过一个或两个或更多个步骤提供给细胞(例如，一次或两次或更多次接种(如，一种或多于一种农杆菌属菌株)；使用任何已知的递送dna的系统进
行的一次或多于一次导入)。这些方法在图1中进行了举例说明。除了将不同类型的共生体移植到宿主植物上之外(即，具有一种类型的poi的一个共生体和包括一种或多种不同poi的一个或多个其它共生体)，还可能产生在相同载体/表达盒/t-dna区域上具有多种目的多核苷酸的psym质粒-有效地将多种poi
‘
堆叠’在待递送的单一psym上以形成共生体(如之前在实施例1-3中所述)。这种poi各自可以由特定的启动子调节(图10)，或者可以由分开的启动子调节，这些启动子可以是相同的启动子或不同的启动子。也可以使用不同的农杆菌属物种(或其它活菌系统)，每一种都携带独特的psym，每种psym都仅具有一种poi(图2)。具有多种poi的psym是
‘
基因堆叠’的一个示例(图10)，这也可以采用。在同一宿主植物上使用不同的形成共生体的接种物(具有相同或不同的poi)的情况是“共生体堆叠”的一个示例，以使植物受益于每株植物多种poi。
[0307]
在本实施例中，我们使用了农杆菌介导的转化，共接种不同的农杆菌形成共生体的接种物，其中一个具有编码gfp的独特psym质粒，另一个具有编码mcherry的psym质粒。通过荧光显微镜检查来完成对gfp和mcherrry积累的检测(图11)。利用共生体活细胞来追踪蛋白质的定位和动态，并在显微镜下分析共生体的切片以检测表达gfp的细胞、表达mcherry的细胞和同时表达gfp和mcherry的细胞。本实施例证明了在不同细胞中表达独特poi(图11，小图b-e)或在相同细胞中表达多种poi(图11，小图g-h)的共生体细胞的多功能性，以及它们在同一宿主植物上得到支持的能力。
[0308]
实施例5.poi产物的产生和输出
[0309]
共生体可以产生和积累大量所需的poi产物(例如，蛋白质，图12)。初步评估表明，多达30％的共生体组织可以是poi产物(图13)。使用农杆菌属物种单一接种(例如单一菌株)在番茄和柑橘类宿主植物上产生表达gfp的共生体(图12)。gfp和mcherry的组合允许通过使用western印迹测量荧光强度和蛋白质积累来实现对基因表达的可视化和量化(图13)。为了从共生体中提取总蛋白质，使用了1g共生体材料，并通过用液氮冷冻和粉碎组织将其变成粉状物。然后将其悬浮在蛋白质提取缓冲液中(例如，150mm tris-hcl，ph 7.5；150mm nacl；5mm edta；1％ca-630；和1％(体积/体积)蛋白酶抑制剂混合物1片100ml)。为了提取，按照每g组织粉状物2ml的比例，加入缓冲液。通过在4℃离心20分钟来澄清样品。收集上清液，进行几次稀释直至10-7
的稀释度用于在还原条件下在sds-page凝胶上进行加样和分析。然后将样品转印到硝酸纤维素膜上，并按照制造商的方案与抗体一起孵育。使用化学发光底物对膜进行孵育，并进行成像和数据采集(图13)。
[0310]
共生体可以诱导与宿主植物形成精密的维管网状连接，该网状连接由水分运输导管和同化物转运筛管要素组成(图14，小图a和b)。共生体细胞通过发挥功能的胞间连丝紧密相连。甲苯胺蓝用于区分韧皮部和木质部细胞，因为在韧皮部中发现的细胞仅具有初生细胞壁，而在木质部中发现的细胞同时具有初生和次生细胞壁(图14，小图c)。共生体细胞中poi的高水平表达与大量的维管化组织相结合，有利于poi转移进入宿主植物的维管组织。荧光蛋白gfp和mcherry用于使用荧光显微镜检测和监测蛋白质在番茄植物中从共生体细胞到植物维管系统的积累和移动。采集共生体上方1-2cm的宿主植物组织，并进行纵向切片(图14，小图d)和横截面切片(图15)分析，以确认gfp/mcherry的移动(通过荧光显微镜)。western印迹技术也用于检测和分析共生体和植物宿主茎中的蛋白质积累，以验证显微镜分析的结果(图16)。
[0311]
溶质通过维管组织进入共生体，该维管组织与宿主植物的维管组织相连，其由运输同化物的韧皮部和运输水分和矿物质的木质部组成，同样，共生体的产物也从共生体运输到宿主植物。虽然产物能够从共生体细胞移动到宿主植物，但是没有遗传物质从共生体移动到宿主植物细胞。我们通过使用针对poi的特异性引物进行pcr检测，验证了poi的dna仅限于共生体中，并且我们检查了共生体和邻近的茎段。对共生体和宿主植物组织的pcr分析显示，只有共生体细胞被poi遗传转化(图17)，这表明宿主植物没有被poi转化。这为宿主植物提供了一种新特征，但没有发生基因修饰。
[0312]
实施例6.poi对宿主植物的效应
[0313]
共生体组织具有高度的多样性，它可以适应或使其适应许多不同的功能或活动。例如，成花素(flowering lucus t)(ft3)蛋白在叶中合成，并通过韧皮部和嫁接结合部转运以控制植物的开花，其过表达通常与植物矮化有关。我们使用带有psym的根癌农杆菌在番茄植物上产生了共生体，以将phg和ft3产物递送至植物(图18，小图a)，并且还使用野生型根癌农杆菌(即，缺少psym)作为对照在番茄上产生了共生体(图18，小图b)。
[0314]
与对照相比，具有表达ft3的共生体的番茄植物长势茂盛，具有许多分枝和叶片结构(比较图18，小图a和b)。表达ft3的共生体增加了改变番茄叶序的分枝数(图18，小图a)，而如对照番茄植物上所示其中每个茎节上只有一片叶，并且植物的主茎比其它侧茎占优势(图18，小图b)。
[0315]
共生体还可以用于改变和调节植物表型，增强对特定病原体的抗性以改善防御机制，并提高植物适应性。图19示出了增强植物对特定病原体抗性的一个示例。此处，使用包含具有phg和癌素(一种抗微生物肽)的psym的根癌农杆菌在柑橘上产生共生体，从而产生包含phg和癌素的共生体(图19，小图a)。作为对照，在柑橘上产生了具有野生型根癌农杆菌的共生体(图19b)，作为“无癌素”对照。产生癌素的共生体被设计成转移癌素来处理/杀伤柑橘黄龙病病原亚洲种(clas)。clas是黄龙病(又名柑橘青果病)的致病因子，该病在世界范围内造成柑橘的毁灭性产量损失。迄今为止，这种疾病还没有确定的治疗方法。我们利用高度维管化的共生体结构来产生这种抗菌肽，并将其递送到宿主植物并对抗clas细菌。为了提高肽的输出，将其融合到信号/靶序列肽(ss或+)。信号序列存在于靶向例如内质网并最终注定分泌到细胞外的蛋白质中。通过qpcr测定，表达“癌素”和“癌素+”的共生体都随着时间的推移降低了clas的滴度(图20)，并且与对照相比，典型hlb植物症状的减少(图19，小图c和e)，包括斑点花叶的减少(图19，小图d和f)，也表明植物健康状况有所改善。
[0316]
如所示的，共生体可用于表达和转移产物，以直接干预感染或杀伤宿主植物中存在的病原体。表达癌素和癌素+的共生体之前被鉴定为改善柑橘健康状况和降低clas细菌滴度(如前所述，图19和图20)。为了进一步研究这一点，我们研究了具有表达不同poi(gfp+、tmof、tmof+、癌素和癌素+)的不同共生体的clas阳性柑橘宿主植物，并通过对clas滴度效应的qpcr分析来监测clas滴度和这些不同poi的功效(图21)。将表达“gfp+”(带有信号序列的gfp)的共生体用作对照。结果表明，tmof、tmof+、癌素和癌素+均通过降低clas的滴度对clas具有抗菌效应(图21)。
[0317]
如所示的，本发明共生体的多功能性提供了改善宿主植物特征和控制植物害虫的能力。作为另一个示例，共生体可用于产生不良的植物效应，例如，通过触发植物的超敏反应和细胞死亡，其可以用作除草剂。举例来说，对本氏烟(nicotiana benthamiana)注射具
有针对来自clas的效应蛋白的poi的形成共生体的接种物，该效应蛋白被植物核苷酸结合的富含亮氨酸重复序列(nlr)的免疫受体识别，引起活性氧种类(ros)的过量产生，这导致细胞死亡过程的激活并杀伤宿主植物(图22)。
[0318]
前述内容是对本发明的说明，不应理解为对本发明的限制。本领域技术人员会理解上述实施方案的其它变化。因此，上文描述的实施方案应被视为说明性的，而不是限制性的。相应地，应当理解的是，本领域技术人员可以在不偏离以下权利要求所定义的本发明范围的情况下对这些实施方案进行修改，其中包括权利要求的等同形式。