技术特征：
1.一种工程化系统，所述工程化系统包括：a.cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白或者编码所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白的核酸；以及b.cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4指导rna(grna)或者编码cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4 grna的核酸，其中所述grna和所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白并非天然一起存在，其中所述grna能够与靶标dna中的靶标序列杂合，并且所述grna能够与所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.45蛋白形成复合物。2.如权利要求1所述的系统，所述系统包括：a.cas9.1、cas9.2、cas9.3、cas9.4蛋白；以及b.cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4 grna。3.如权利要求1所述的系统，所述系统包括：a.编码所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白的核酸；以及b.编码所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4 grna的核酸。4.如权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述grna是单分子grna。5.如权利要求1至3中任一项所述的系统，其中所述grna是双分子grna。6.如权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述cas9.1蛋白包含seq id no:1的氨基酸序列或与seq id no:1有至少70％序列同一性的氨基酸序列。7.如权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述cas9.2蛋白包含seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2有至少70％序列同一性的氨基酸序列。8.如权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述cas9.3蛋白包含seq id no:10的氨基酸序列或与seq id no:10有至少70％序列同一性的氨基酸序列。9.如权利要求1至5中任一项所述的系统，其中所述cas9.4蛋白包含seq id no:11的氨基酸序列或与seq id no:11有至少70％序列同一性的氨基酸序列。10.如权利要求1至7中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是表6a至表6f的任一个中提供的靶标的序列。11.如权利要求1至7中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是人的序列。12.如权利要求1至7中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是非人灵长类动物的序列。13.如权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白是有催化活性的蛋白质。14.如权利要求13所述的系统，其中所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白在所述靶标序列远端的位点处切割。15.如权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白是催化失活的蛋白质。16.如权利要求1至12中任一项所述的系统，其中所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白包含切口酶活性。17.一种工程化系统，所述工程化系统包括：a.2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白；以及b.单一指导rna(grna)，
其中所述grna和所述2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白并非天然一起存在，其中所述grna能够与靶标dna中的靶标序列杂合，其中所述grna能够与所述2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白形成复合物，并且其中所述2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白具有旁切活性且能够在没有tracrrna的情况下旁切包含rna的单链多核苷酸。18.如权利要求17所述的系统，其中所述2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4有至少70％序列同一性的氨基酸序列。19.如权利要求17至18中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是表6a至表6f的任一个中提供的靶标的序列。20.如权利要求17至18中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是人的序列。21.如权利要求17至18中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是非人灵长类动物的序列。22.如权利要求17至18中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是细菌或病毒序列。23.如权利要求17至22中任一项所述的系统，其中所述2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白能够旁切单链rna。24.如权利要求17至22中任一项所述的系统，其中所述2类v型crispr-cas rna指导的内切核酸酶蛋白能够旁切单链dna/rna杂合体。25.一种工程化系统，所述工程化系统包括：a.cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白或者编码所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白的核酸；以及b.cas12a.1、cas12p或cas12q grna或者编码cas12a.1、cas12p或cas12q grna的核酸，其中所述grna和所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白并非天然一起存在，其中所述grna能够与靶标dna中的靶标序列杂合，并且所述grna能够与所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白形成复合物。26.如权利要求25所述的系统，所述系统包括：a.cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白；以及b.cas12a.1、cas12p或cas12q grna。27.如权利要求25所述的系统，所述系统包括：a.编码所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白的核酸；以及b.编码cas12a.1、cas12p或cas12q grna的核酸。28.如权利要求25至27中任一项所述的系统，其中所述cas12a.1蛋白包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3有至少70％序列同一性的氨基酸序列。29.如权利要求25至27中任一项所述的系统，其中所述cas12p蛋白包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4有至少70％序列同一性的氨基酸序列。30.如权利要求25至27中任一项所述的系统，其中所述cas12q蛋白包含seq id no:222的氨基酸序列或与seq id no:222有至少70％序列同一性的氨基酸序列。31.如权利要求25至27中任一项所述的系统，其中所述cas12q蛋白包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5有至少70％序列同一性的氨基酸序列。32.如权利要求25至31中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是表6a至表6f的任一
个中提供的靶标的序列。33.如权利要求25至31中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是人的序列。34.如权利要求25至31中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是非人灵长类动物的序列。35.如权利要求25至31中任一项所述的系统，其中所述靶标序列是细菌或病毒序列。36.如权利要求25至34中任一项所述的系统，其中所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白是有催化活性的cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白。37.如权利要求36所述的系统，其中所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白在所述靶标序列远端的位点处切割。38.如权利要求25至34中任一项所述的系统，其中所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白是催化失活的cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白。39.如权利要求25至34中任一项所述的系统，其中所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白包含切口酶活性。40.一种工程化单分子grna，所述工程化单分子grna包含：a.包含能够与靶标dna中的靶标序列杂合的间隔子序列的标靶-rna；以及b.能够与所述标靶-rna杂合以形成双链的rna双链体的激活子-rna，所述激活子-rna包括以下的激活子-rna，其中所述标靶-rna和所述激活子-rna彼此共价连接，其中所述单分子grna能够与cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白形成复合物，并且其中所述间隔子序列与所述靶标序列的杂合能够将所述cas9.1、cas9.2、cas9.3或cas9.4蛋白靶向所述靶标dna。41.如权利要求40所述的grna，其中所述标靶-rna和所述激活子-rna以5'至3'取向排列。42.如权利要求40所述的grna，其中所述激活子-rna和所述标靶-rna以5'至3'取向排列。43.如权利要求40至42中任一项所述的grna，其中所述标靶-rna和所述激活子-rna通过接头彼此共价连接。44.如权利要求40至43中任一项所述的grna，其中与对应的野生型tracrrna和/或crrna的序列相比，所述单分子grna包含一种或多种序列修饰。45.如权利要求40至44中任一项所述的grna，其中所述标靶-rna包含与所述靶标dna中的序列具有100％互补性的约10-50个核苷酸的间隔子序列。46.如权利要求40至44中任一项所述的grna，其中所述标靶-rna包含与所述靶标dna中的序列具有小于100％互补性的约10-50个核苷酸的间隔子序列。47.如权利要求40至46中任一项所述的grna，其中所述靶标序列是表6a至表6f的任一个中提供的靶标的序列。48.如权利要求40至47中任一项所述的grna，其中所述cas9.1蛋白包含seq id no:1的序列或与seq id no:1有至少70％序列同一性的序列。49.如权利要求40至47中任一项所述的grna，其中所述cas9.2蛋白包含seq id no:2的序列或与seq id no:2有至少70％序列同一性的序列。50.如权利要求40至47中任一项所述的grna，其中所述cas9.3蛋白包含seq id no:10
grna；和iii.不与所述grna的所述间隔子序列杂合的经标记检测子；以及b.测量由所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白切割所述经标记检测子产生的可检测信号，从而检测所述靶标dna。72.如权利要求71所述的方法，其中所述经标记检测子包含经标记单链dna。73.如权利要求71所述的方法，其中所述经标记检测子包含经标记rna。74.如权利要求72所述的方法，其中所述经标记rna是单链rna。75.如权利要求71所述的方法，其中所述经标记检测子包含经标记单链dna/rna嵌合体。76.如权利要求71至75中任一项所述的方法，其中所述经标记检测子包含一个或多个经修饰核苷酸。77.如权利要求71至76中任一项所述的方法，所述方法包括将所述样品与前体grna阵列接触，其中所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白切割所述前体grna阵列以产生所述grna。78.如权利要求71至77中任一项所述的方法，其中所述靶标dna是单链的。79.如权利要求71至78中任一项所述的方法，其中所述靶标dna是双链的。80.如权利要求71至79中任一项所述的方法，其中所述靶标dna是病毒dna、植物dna、真菌dna或细菌dna。81.如权利要求80所述的方法，其中所述靶标序列是表6a至表6f的任一个中提供的靶标的序列。82.如权利要求81所述的方法，其中所述靶标是冠状病毒。83.如权利要求82所述的方法，其中所述靶标是sars-cov-2病毒。84.如权利要求71至83中任一项所述的方法，其中所述靶标dna是cdna，并且已通过逆转录获得。85.如权利要求71至79中任一项所述的方法，其中所述靶标dna来自人细胞。86.如权利要求85所述的方法，其中所述靶标dna是人胎儿或癌细胞dna。87.如权利要求71至86中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是包含seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3有至少70％序列同一性的氨基酸序列的cas12a.1。88.如权利要求71至86中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是包含seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4有至少70％序列同一性的氨基酸序列的cas12p。89.如权利要求71至86中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是包含seq id no:222的氨基酸序列或与seq id no:222有至少70％序列同一性的氨基酸序列的cas12p。90.如权利要求71至86中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是包含seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5有至少70％序列同一性的氨基酸序列的cas12q。91.如权利要求71至87中任一项所述的方法，其中所述样品包含来自细胞裂解物的dna。92.如权利要求71至87中任一项所述的方法，其中所述样品包含细胞。93.如权利要求71至87中任一项所述的方法，其中所述样品是尿液样品、血液样品、血清样品、血浆样品、淋巴液样品、脑脊液样品、唾液样品、鼻咽样品、口咽样品、鼻咽/口咽样品、抽吸物样品或活组织检查样品。
94.如权利要求71至93中任一项所述的方法，所述方法包括确定所述样品中存在的所述靶标dna的量。95.如权利要求94所述的方法，其中所述测量可检测信号包括以下一项或多项：基于视觉的检测、基于传感器的检测、颜色检测、基于金纳米粒子的检测、荧光极化、胶体相变/分散、电化学检测和基于半导体的感测。96.如权利要求71至95中任一项所述的方法，其中所述经标记检测子包含经修饰核碱基、经修饰糖部分和/或经修饰核酸连接。97.如权利要求71至96中任一项所述的方法，所述方法还包括在阳性对照样品中检测阳性对照靶标dna，所述检测包括：a.将所述阳性对照样品与以下项接触：i.cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白；ii.包含以下项的阳性对照grna：结合所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白的区域以及与所述阳性对照靶标dna杂合的阳性对照间隔子序列；和iii.不与所述阳性对照grna的所述阳性对照间隔子序列杂合的经标记检测子；以及b.测量由所述cas12a.1、cas12p或cas12q蛋白切割所述经标记检测子产生的可检测信号，从而检测所述阳性对照靶标dna。98.如权利要求71至97中任一项所述的方法，其中所述可检测信号在少于15、30、45、60、90、120、150、180、210或240分钟内是可检测到的。99.如权利要求71至98中任一项所述的方法，所述方法还包括通过以下项扩增所述样品中的所述靶标dna：环介导的等温扩增(lamp)、螺旋酶依赖性扩增(hda)、重组酶聚合酶扩增(rpa)、链置换扩增(sda)、基于核酸序列的扩增(nasba)、转录介导的扩增(tma)、切口酶扩增反应(near)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda)、分枝(ram)、环状解旋酶依赖性扩增(chda)、单引物等温扩增(spia)、信号介导的rna扩增技术(smart)、自我持续序列复制(3sr)、基因组指数扩增反应(gear)、或等温多重置换扩增(imda)。100.如权利要求71至99中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述靶标dna以小于100um的浓度存在。101.一种蛋白质，所述蛋白质包含与seq id no:1、2、3、4、5、10、11或222有70％-99.5％同源性的氨基酸序列。102.如权利要求101所述的蛋白质，其中所述蛋白质的序列已经通过生物信息学方式推导出来。103.一种组合物，所述组合物包含权利要求101所述的蛋白质中的任一种以及任选地药学上可接受的载剂。104.一种组合物，所述组合物包含权利要求101所述的蛋白质中的任一种，任选地包含药学上可接受的载剂、核酸稳定缓冲液和/或蛋白质稳定缓冲液。105.一种组合物，所述组合物包含权利要求101所述的蛋白质中的任一种，其中所述蛋白质是冻干的，并且任选地还包含以下任一项或多项：经标记检测子、逆转录酶和用于环介导的等温扩增的试剂。106.一种dna多核苷酸，所述dna多核苷酸包含编码权利要求101所述的蛋白质中的任一种的核苷酸序列。
107.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求106所述的dna多核苷酸。108.如权利要求107所述的重组表达载体，其中编码单一蛋白质的所述核苷酸序列与启动子可操作地连接。109.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求106至108中任一项所述的dna多核苷酸。110.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至39所述的工程化系统中的任一种，以及任选地药学上可接受的载剂。111.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至39所述的工程化系统中的任一种，并且任选地包含核酸稳定缓冲液和/或蛋白质稳定缓冲液。112.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求40至57所述的单分子grna中的任一种，以及任选地药学上可接受的载剂。113.一种组合物，所述组合物包含权利要求40至51所述的单分子grna中的任一种，以及任选地核酸稳定缓冲液和/或蛋白质稳定缓冲液。114.一种dna多核苷酸，所述dna多核苷酸包含编码以下任一项的核苷酸序列：权利要求3、27所述的核酸，或权利要求40至51所述的grna。115.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求114所述的dna多核苷酸。116.如权利要求115所述的重组表达载体，其中所述编码单grna的核苷酸序列与启动子可操作地连接。117.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求114至116中任一项所述的dna多核苷酸。118.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至39所述的工程化系统中的任一种的一个或多个组分。119.如权利要求118所述的试剂盒，其中一个或多个组分是冻干的。120.如权利要求118至119中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个组分包括cas12p、经标记rna报告子和指向sars-cov-2的grna。121.一种从宏基因组学样品分离2类ii型或2类v型crispr-cas蛋白的方法，所述方法包括使用基于生物信息学的方法。122.如权利要求121所述的方法，其中所述2类ii型或2类v型crispr-cas蛋白选自由以下组成的组：seq id no:1、2、3、4、5、10、11和222。
技术总结
本文提供了新的2类II型和V型CRISPR-Cas RNA指导的内切核酸酶如Cas9和Cas12内切核酸酶以及包含所述内切核酸酶的系统。还提供了其制备方法和使用方法。示例性使用方法包括修饰靶标DNA并检测靶向DNA，可用于治疗和诊断应用。一些诊断应用可利用结合到靶标序列的酶的旁切核酸酶活性。旁切核酸酶活性。旁切核酸酶活性。
技术研发人员：卡拉
受保护的技术使用者：国家科学和技术研究委员会
技术研发日：2020.09.10
技术公布日：2022/7/10