新型IL-21前药及其使用方法与流程

新型il-21前药及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求以下申请的优先权：于2019年8月21日提交的美国临时申请第62/889,797号；于2020年5月19日提交的美国临时申请第63/027,138号；于2020年7月1日提交的美国临时申请第63/047,251号；以及于2020年7月19日提交的美国临时申请第63/053,663号，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
3.序列表
4.本技术含有已经以ascii格式电子提交的序列表，特此以全文引用的方式并入。创建于2020年8月18日的所述ascii副本命名为025471_w0006_sl.txt并且大小为401,040字节。


背景技术：

5.白介素-21(il-21)由激活的cd4
+
t细胞、滤泡辅助性t细胞和自然杀伤t(nkt)细胞产生(spolski和leonard,《免疫学年度评论(ann rev immunol.)》(2008)26:57008)。il-21已被证明对各种类型的淋巴样细胞的增殖、分化和细胞毒性发挥多效性效应。最近，il-21已被进一步证明在cd4
+
t细胞分化成辅助性t细胞17(th
17
)中起着关键作用，所述th
17
细胞是与炎性病状和自身免疫性疾病的发展相关的t细胞亚群(korn等人,《自然(nature)》(2007)448(7152):484-87；nurieva等人,《自然》(2007)448(7152):480-83)。
6.il-21的受体复合物由私有链il-21rα和公共链γc(或rγ)构成；所述公共链由五种其它细胞因子共享：il-2、il-4、il-7、il-9和il-15(spolski和leonard,同上)。人il-21以非常高的亲和力(kd～70pm；zhang等人,《生物化学与生物物理学研究通信(biochem biophys res commun.)》(2003)300(2):291-6)与il-21rα结合，而以相对低的亲和力(kd～160μm)与il-21rγ结合。
7.重组il-21已在若干治疗实体瘤的临床试验中进行了研究(zarkavelis等人,《癌症转化研究(transl cancer res.)》(2017)6(增刊2):s328-30)。在所述研究中的一项研究中，最大耐受剂量确定为200μg/kg(schmidt等人,《临床癌症研究(clin cancer res.)》(2010)16(21):5312-19)。因此，与其它细胞因子疗法一样，全身毒性可能严重限制il-21的治疗剂量。此外，il-21可能在体内遇到“pk沉降”(“pk sinks”)，因为其以非常高的亲和力(约70pm的kd)与其受体il-21rα结合(zhang等人,《生物化学与生物物理学研究通信》(2003)300(2):291-6)。因此，在癌症治疗中，il-21可能难以实现最佳的pk和暴露。已在美国专利8,211,420和kan等人,《生物化学杂志(j biol chem.)》(2010)285(16):12223-31中公开了il-21的类似物。然而，一些类似物选择性地降低了γc结合亲和力，并且是il-21拮抗剂。
8.仍然需要开发基于il-21的癌症治疗药物，所述癌症治疗药物对肿瘤部位更具选择性并且具有经改进的pk和疗效，同时引起更少的严重副作用。


技术实现要素：

9.本公开提供了一种il-21前药，其包括细胞因子部分、掩蔽部分和载体部分，其中所述细胞因子部分是il-21激动剂多肽，其中所述掩蔽部分包括抗体的抗原结合片段，其与人il-21激动剂多肽结合并抑制所述人il-21激动剂多肽的生物活性，其中所述il-21激动剂多肽与所述载体部分融合，所述掩蔽部分任选地通过肽接头与所述人il-21激动剂多肽或与所述载体部分融合。
10.在一些实施例中，所述细胞因子部分是野生型人il-21或其突变蛋白，例如人il-21激动剂多肽，如包括seq id no:1或与seq id no:1至少90％同源性的氨基酸序列的人il-21激动剂多肽。在其它实施例中，所述人il-21激动剂多肽具有选自seq id no:2、3、4和5的氨基酸序列。
11.在一些实施例中，本发明的前药的所述掩蔽部分包括与所述il-21激动剂多肽结合的抗体的结合片段；其中所述抗体抑制所述il-21激动剂多肽与il-21受体结合。在一些实施例中，所述抗原结合部分是针对人il-21的抗体的结合片段并包括重链可变结构域和轻链可变结构域，所述重链可变结构域的氨基酸序列与seq id no:97或99的氨基酸序列至少95％同源性，所述轻链可变结构域的氨基酸序列与seq id no:98或100的氨基酸序列至少95％同源性。
12.在一些实施例中，所述抗体片段是单链抗体(single chain fragment variable，scfv)，所述scfv包括具有如seq id no:97所示的氨基酸序列的重链可变结构域和具有如seq id no:98所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，或者具有如seq id no:99所示的氨基酸序列的重链可变结构域和具有如seq id no:100所示的氨基酸序列的轻链可变结构域。
13.在本发明的前药的一些实施例中，所述细胞因子部分通过选自seq id no:29-33和132的不可切割的肽接头与所述载体部分融合。在其它实施例中，所述掩蔽部分通过不可切割的肽接头，如选自seq id no:29-33和132的肽接头与所述载体部分或所述细胞因子部分融合。
14.在本发明的前药的一些实施例中，将所述掩蔽部分直接或间接(例如，通过所述细胞因子部分)与所述载体部分连接的可切割的肽接头包括尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)、蛋白裂解酶、基质金属肽酶(mmp)2或mmp9的底物序列。在另外的实施例中，所述可切割的肽接头包括以下的底物序列：(i)upa和mmp2两者；(ii)upa和mmp9两者；或(iii)蛋白裂解酶、mmp2和mmp9。在特定实施例中，所述可切割的肽接头包括选自seq id no:11-26的氨基酸序列。在某些实施例中，所述可切割的肽接头可被位于肿瘤部位或其周围环境的一种或多种蛋白酶切割，所述切割使所述前药在所述肿瘤部位或周围环境激活。
15.在本发明的前药的一些实施例中，所述载体部分为抗体fc结构域或其抗体或抗原结合片段。在特定实施例中，所述载体部分是igg1抗体fc结构域或包括突变l234a和l235a(“lala”)(eu编号)的抗体或包括突变s228p/l234a/l235a(paa)的igg4fc结构域。当所述fc结构域或抗体用作所述载体部分时，也可以引入导致fc功能性降低的其它突变，如tam s.h.等人,《抗体(antibodies)(2017),6(12):1-34所述的突变。
16.在特定实施例中，所述载体部分是抗体fc结构域或抗体，其中所述细胞因子部分和所述掩蔽部分与所述抗体fc结构域的不同多肽链融合或与所述抗体的不同重链融合。在一些实施例中，所述细胞因子部分和所述掩蔽部分与所述fc结构域的所述两条不同多肽链
的c端融合或与所述抗体的所述两条不同重链的c端融合。在其它实施例中，所述细胞因子部分和所述掩蔽部分与所述fc结构域的所述两条不同多肽链的n端融合或与所述抗体的所述两条不同重链的n端融合。在一些实施例中，所述载体部分是抗体fc结构域或包括杵臼突变的抗体。在某些实施例中，所述杵臼突变包括所述fc结构域的多肽链或所述抗体的重链上的t366y“杵”突变以及所述fc结构域的另一多肽或所述抗体的另一重链中的y407t“臼”突变(eu编号)。在某些实施例中，所述杵臼突变包括“杵链”的ch3结构域中的y349c和/或t366w突变以及“臼链”的ch3结构域中的e356c、t366s、l368a和/或y407v突变(eu编号)。
17.在特定实施例中，所述前药包括两条多肽链，所述两条多肽链的氨基酸序列分别包括：
18.seq id no:36和一条选自seq id no:101-104的氨基酸序列；
19.seq id no:37和一条选自seq id no:101-104的氨基酸序列；
20.seq id no:39和一条选自seq id no:105-108的氨基酸序列；或
21.seq id no:40和一条选自seq id no:105-108的氨基酸序列；
22.seq id no:42和一条选自seq id:113-116的氨基酸序列；或
23.seq id no:43和一条选自seq id no:113-116的氨基酸序列。
24.在一些实施例中，所述载体部分是与选自以下的一种或多种抗原特异性地结合的抗体或其抗原结合片段：鸟苷酸环化酶c(gcc)、糖类抗原19-9(ca19-9)、糖蛋白a33(gpa33)、粘蛋白1(muc1)、癌胚抗原(cea)、胰岛素样生长因子1受体(igf1-r)、人表皮生长因子受体2(her2)、人表皮生长因子受体3(her3)、δ样蛋白3(dll3)、δ样蛋白4(dll4)、表皮生长因子受体(egfr)、磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)、c-met、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、粘连蛋白-4、liv-1、糖蛋白nmb(gpnmb)、前列腺特异性膜抗原(psma)、trop-2、碳酸酐酶ix(ca9)、内皮素b受体(etbr)、前列腺六跨膜上皮抗原1(steap1)、叶酸受体α(fr-α)、slit和ntrk样蛋白6(slitrk6)、碳酸酐酶vi(ca6)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(enpp3)、间皮素、滋养层糖蛋白(tpbg)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd40、cd56、cd66e、cd70、cd74、cd79b、cd98、cd123、cd138、cd352、cd47、信号调节蛋白α(sirpα)、pd1、claudin 18.2、claudin 6、5t4、bcma、pd-l1、pd-1、成纤维细胞激活蛋白α(fapα)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)和上皮细胞粘附分子(epcam)。在特定实施例中，所述载体部分是与fapα或5t4结合的抗体或其片段。
25.在特定实施例中，所述载体部分是抗体，其中所述前药包括两条相同的轻链和两个重链多肽；其中所述轻链包括如seq id no:50或51所示的氨基酸序列；其中所述第一重链多肽链包括seq id no:48，所述第二重链多肽链包括选自seq id no:109-112的氨基酸序列。
26.在特定实施例中，所述载体部分是包括一个抗原结合结构域的抗体，其中所述前药包括一个fc融合多肽、一条轻链和一条重链多肽链；其中所述fc融合多肽包括选自seq id no:101-104的氨基酸序列；所述轻链包括如seq id no:50或51所示的氨基酸序列；所述重链多肽链包括seq id no:48。
27.在特定实施例中，所述载体部分是包括一个抗原结合结构域的抗体，其中所述前药包括一个fc融合多肽、一条轻链和一条重链多肽链；其中所述fc融合多肽包括选自seq id no:36和37的氨基酸序列；所述轻链包括如seq id no:50或51所示的氨基酸序列；所述
重链多肽链包括选自seq id no:109-112的氨基酸序列。
28.在一些实施例中，所述前药进一步包括il-21受体的胞外结构域(ecd)，其中所述ecd包括seq id no:128的氨基酸序列或与seq id no:128的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。
29.在一些实施例中，所述前药包括轻链、第一重链多肽链和第二重链多肽链；其中所述轻链包括seq id no:50的氨基酸序列或与seq id no:50至少95％同源性的氨基酸序列，所述第一重链多肽链包括seq id no:117或129的氨基酸序列或与seq id no:117或129的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列，所述第二重链多肽链具有选自seq id no:120、121、124、125、130和131的氨基酸序列或与选自seq id no:120、121、124、125、130和131的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。
30.在一些实施例中，所述前药包括轻链、第一重链多肽链和第二重链多肽链；其中所述轻链包括seq id no:50的氨基酸序列或与seq id no:50至少95％同源性的氨基酸序列，所述第一重链多肽链包括seq id no:118的氨基酸序列或与seq id no:118的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列，所述第二重链多肽链具有选自seq id no:122和126的氨基酸序列或与选自seq id no:122和126的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。
31.在一些实施例中，所述前药包括轻链、第一重链多肽链和第二重链多肽链；其中所述轻链包括seq id no:50的氨基酸序列或与seq id no:50至少95％同源性的氨基酸序列，所述第一重链多肽链包括seq id no:119的氨基酸序列或与seq id no:119的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列，所述第二重链多肽链具有选自seq id no:123和127的氨基酸序列或与选自seq id no:123和127的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。
32.在一些实施例中，所述前药包括轻链、第一重链多肽链和第二重链多肽链；其中所述轻链包括seq id no:50的氨基酸序列或与seq id no:50至少95％同源性的氨基酸序列，所述第一重链多肽链包括seq id no:117或129的氨基酸序列或与seq id no:117或129的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列，所述第二重链多肽链具有选自seq id no:120、121、124、125、130和131的氨基酸序列或与选自seq id no:120、121、124、125、130或131的氨基酸序列至少95％同源性的氨基酸序列。
33.在其它方面，本公开还提供：一种药物组合物，所述药物组合物包括本公开的il-21前药以及药学上可接受的赋形剂；一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述il-21前药；一种表达载体，所表达载体包括所述多核苷酸；以及包括所述载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述哺乳动物宿主细胞敲除了对upa、mmp-2和/或mmp-9进行编码的一个或多个基因(例如，含有这些基因中的一个或多个基因的无效突变)。因此，本公开还提供了一种制备所述il-21前药的方法，所述方法包括：在允许表达所述il-21前药的条件下培养所述宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞；以及分离所述il-21前药。
34.本公开还提供了一种治疗有需要的患者(例如，人类患者)的癌症或传染病或刺激所述患者的免疫系统的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的所述il-21前药或本公开的所述药物组合物。所述患者可能患有例如病毒感染(例如，hiv感染)或选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸癌、结直肠癌和胃癌。本文还提供：一种il-21前药在治疗癌症或传染病或刺激所述
il-21融合分子，所述抗pd-1抗体-il-21融合分子没有掩蔽剂并且具有带有r9e和r76a氨基酸取代的il-21突变蛋白(根据seq id no:1编号)。pw04-38 act.il21wt是其掩蔽剂已用蛋白酶切割的抗pd-1抗体-il-21野生型融合分子。
48.图12a和12b示出了pd-1-il-21前药在被蛋白酶mmp2和对照分子激活之前和之后的基于mino细胞的生物活性测定的结果。图12a示出了在分析之前细胞因子融合分子与mino细胞温育72小时之后的结果。图12b示出了在分析之前温育120小时之后的结果。
具体实施方式
49.如在本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个或一种(a)”、“或(or)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确指明。
50.本文中提及“约”值或参数包括(且描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约x”的描述包含对“x”的描述。此外，在任何数字系列之前使用“约”包含“约”所述系列中列举的每个数字。例如，提及“约x、y或z”的描述旨在描述“约x、约y或约z”。
51.术语“抗原结合部分”是指与抗原特异性地结合的多肽或一组相互作用的多肽，包含但不限于抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体(dual specific or bispecific antibody)、抗独特型抗体或双功能杂合抗体)或其抗原结合片段(例如，fab、fab'、f(ab')2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单结构域抗体(dab)或双功能抗体)、单链抗体和含有fc的多肽，如免疫粘附素。在一些实施例中，抗体可以属于任何重链同种型(例如，igg、iga、igm、ige或igd)或亚型(例如，igg1、igg2、igg3或igg4)。在一些实施例中，抗体可以属于任何轻链同种型(例如，κ或λ)。抗体可以是人、非人(例如，来自小鼠、大鼠、兔、山羊或另一个非人动物)、嵌合(例如，具有非人可变区和人恒定区)或人源化(例如，具有非人cdr和人框架和恒定区)。在一些实施例中，抗体是源性抗体。
52.术语“细胞因子激动剂多肽”是指野生型细胞因子或其类似物。野生型细胞因子的类似物具有与野生型细胞因子相同的生物学特异性(例如，与相同的受体结合并激活相同的靶细胞)，即使类似物的活性水平可能不同于野生型细胞因子的活性水平。类似物可以是例如野生型细胞因子的突变蛋白(即突变多肽)，可以包括相对于野生型细胞因子的至少一个突变、至少两个突变、至少三个突变、至少四个突变、至少五个突变、至少六个突变、至少七个突变、至少八个突变、至少九个突变或至少十个突变。
53.术语“细胞因子拮抗剂”或“细胞因子掩蔽剂(mask)”是指与细胞因子结合并由此抑制细胞因子与其在靶细胞表面上的受体结合和/或在被拮抗剂或掩蔽剂结合时发挥其生物学功能的部分(例如，多肽)。细胞因子拮抗剂或掩蔽剂的实例包含但不限于源自与细胞因子接触的细胞因子的天然受体的胞外结构域的多肽，或与细胞因子结合并抑制细胞因子与其受体结合的抗体的scfv或fab。
54.术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗具体病症、病状或疾病，如改善、缓和、减轻和/或延缓其症状中的一种或多种症状的化合物或组合物的量。对于如癌症等疾病，有效量可以是足以延缓癌症发展或进展(例如，降低肿瘤生长速率和/或延缓或预防肿瘤血管生成、转移或癌细胞浸润到外周器官中)、减少上皮样细胞的数量、导致癌症消退(例如，缩小或根除肿瘤)和/或预防或延缓癌症发生或复发的量。可以以一次或多次施用来施用有效量。
55.术语“功能类似物”是指具有与参考分子相同的生物学特异性(例如，与相同配体结合)和/或活性(例如，激活或抑制靶细胞)的分子。
56.关于两个多肽序列的术语“融合(fused)”或“融合(fusion)”是指两个多肽序列通过主链肽键接合。两个多肽可以直接融合或通过一个或多个氨基酸长的肽接头融合。融合多肽可以通过重组技术从含有两个融合配偶体的相应编码序列的编码序列制备，在其间具有或不具有肽接头的编码序列。在一些实施例中，融合涵盖化学缀合。
57.术语“药学上可接受的赋形剂”当用于指组合物中的成分时意指所述赋形剂适合施用于治疗受试者，所述受试者包含人类受试者，而不会对受试者产生过度有害的副作用并且不影响活性药物成分(api)的生物活性。
58.术语“受试者”是指哺乳动物，包含但不限于人、宠物(例如，犬科动物或猫科动物)、农场动物(例如，牛或马)、啮齿动物或灵长类动物。
59.如本文所使用的，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。有益或期望的临床结果包含但不限于以下中的一项或多项：缓解由疾病引起的一种或多种症状、减轻疾病程度、改善疾病状态、稳定疾病(例如，预防或延缓疾病的恶化或进展)、预防或延缓疾病的传播(例如，转移)、预防或延缓疾病的复发、提供疾病的部分或全部缓解、减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量、提高患者的生活质量和/或延长存活期。本公开的方法涵盖这些治疗方面中的任何一个或多个方面。
60.应理解，本文所描述的各个实施例中的一个、一些或所有特性可以组合以形成本发明的其它实施例。本文中使用的章节标题仅出于组织目的，而不应被解释为对下面所描述的主题进行限制。
61.il-21前药
62.本公开提供了在体内代谢成为活性细胞因子治疗药物的il-21前药。il-21前药具有更少的副作用、更好的体内pk特性(例如，更长的半衰期)和更好的靶向特异性，与现有技术的il-21治疗药物相比更有效。此外，当掩蔽部分和细胞因子与不同的多肽链融合时，掩蔽部分与细胞因子之间的相互作用提供了另外的驱动力以形成正确的异二聚体化。这将使前药的制备更加有效。
63.本发明的il-21前药包括与载体部分连接并被il-21拮抗剂(掩蔽部分或细胞因子掩蔽剂)掩蔽(结合)的il-21激动剂多肽(细胞因子部分)。il-21拮抗剂(可以是例如结合人il-21或其类似物的抗体的抗原结合片段)通过可切割的接头(例如，可切割的肽接头)与细胞因子部分或与载体部分连接。当掩蔽剂与细胞因子部分结合时，掩蔽剂会抑制细胞因子部分的生物功能。前药可以在患者的靶位点(例如，在肿瘤部位或周围环境)通过切割接头和随后从前药中释放细胞因子掩蔽剂而被激活，从而暴露先前经掩蔽的细胞因子部分并允许所述细胞因子部分与靶细胞上的其受体结合并在靶细胞上发挥其生物功能。在一些实施例中，il-21前药的载体是抗原结合部分，如在靶位点处结合抗原的抗体。
64.在一些实施例中，本发明的il-21前药被代谢以在载体所靶向的体内靶位点处变得有活性。在另外的实施例中，前药中的载体是靶向肿瘤抗原的抗体，使得il-21前药被递送到患者的肿瘤部位，通过切割将细胞因子掩蔽剂与载体或细胞因子部分连接的接头而局部代谢(例如，在肿瘤微环境内部或附近)，从而使细胞因子部分可与靶细胞上的其受体相互作用并局部刺激靶免疫细胞。
21受体α的胞外结构域(ecd)(il-21rαecd)的突变版本，所述突变版本具有在选自h49、d122、p147、w148、a149和v150中的一个或多个位置处的一个或多个突变(根据seq id no:128编号)。在一些实施例中，所述一个或多个突变选自以下：1)h49n；2)在选自d122a、d122i、d122w、d122f和d122y的位置d122处的突变；3)在选自p147g和p147n的位置p147处的突变；4)在选自w148g、w148n和w148s的位置w148处的突变；5)在选自a149g和a149s的位置a149处的突变；以及6)v150s。在一些实施例中，il-21r的胞外结构域包括中断il-21r与il-21rγ之间相互作用的一个或多个突变。
73.c.前药的载体部分
74.本发明的il-21前药的载体部分可以是抗原结合部分，或者不是抗原结合部分的部分。载体部分可以改善细胞因子激动剂多肽的pk特性，如血清半衰期，还可以将细胞因子激动剂多肽靶向身体中的靶位点，如肿瘤位点。
75.1.抗原结合载体部分
76.载体部分可以是抗体或其抗原结合片段，或免疫粘附素。在一些实施例中，抗原结合部分是具有以下的全长抗体：两条重链和两条轻链、fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fv片段、二硫键连接的fv片段、单域抗体、纳米抗体或单链可变片段(scfv)。在一些实施例中，抗原结合部分是双特异性抗原结合部分并且可以与两种不同的抗原或同一抗原上的两种不同的表位结合。抗原结合部分可以为细胞因子激动剂多肽提供另外的和潜在协同的治疗功效。
77.il-21激动剂多肽及其掩蔽剂可以与抗原结合部分的轻链和/或重链的n端或c端融合。举例来说，il-21激动剂多肽及其掩蔽剂可以与抗体重链或其抗原结合片段融合或与抗体轻链或其抗原结合片段融合。在一些实施例中，il-21激动剂多肽与抗体的一条或两条重链的c端融合，il-21掩蔽剂通过可切割的肽接头与il-21激动剂多肽的另一端融合。在一些实施例中，il-21激动剂多肽与抗体的重链之一的c端融合，il-21掩蔽剂通过可切割的肽接头与抗体的另一重链的c端融合，其中两条重链含有允许两条不同重链特异性配对的突变。
78.形成异二聚体的策略是众所周知的(参见例如spies等人,《分子免疫学(mol imm.)》(2015)67(2)(a):95-106)。例如，前药中的两条重链多肽可以通过“杵臼”突变形成稳定的异二聚体。进行“杵臼”突变以促进形成抗体重链的异二聚体，所述突变通常用于制备双特异性抗体(例如参见美国专利8,642,745)。例如，抗体的fc结构域可以包括“杵链”的ch3结构域中的t366w突变以及“臼链”的ch3结构域中的t366s、l368a和/或y407v突变。还可以使用ch3结构域之间的另外的链间二硫键，例如通过将y349c突变引入到“杵链”的ch3结构域中并且将e356c或s354c突变引入到“臼链”的ch3结构域中(参见例如merchant等人,《自然生物技术(nature biotech)》16:677-81(1998))。在其它实施例中，抗体部分可以包括两个ch3结构域之一中的y349c和/或t366w突变以及另一个ch3结构域中的e356c、t366s、l368a和/或y407v突变。在某些实施例中，抗体部分可以包括两个ch3结构域之一中的y349c和/或t366w突变以及另一个ch3结构域中的s354c(或e356c)、t366s、l368a和/或y407v突变，其中另外的y349c突变位于一个ch3结构域中并且另外的e356c或s354c突变位于另一个ch3结构域中，从而形成链间二硫键(始终根据kabat的eu指数编号；kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)》,第5版,马
里兰州贝塞斯达国立卫生研究院公共卫生署(public health service,national institutes of health,bethesda,md.)(1991))。可以可替代地或另外地使用其它杵臼技术，如在ep1870459a1中所述的杵臼技术。因此，抗体部分的杵臼突变的另一个实例是具有在“杵链”的ch3结构域中的r409d/k370e突变以及在“臼链”的ch3结构域中的d399k/e357k突变(eu编号)。
79.在一些实施例中，前药中的抗体部分在其fc结构域中包括l234a和l235a(“lala”)突变。lala突变消除了补体结合和固定以及fcγ依赖性adcc(参见例如hezareh等人,《病毒学杂志(j.virol.)》(2001)75(24):12161-8)。在另外的实施例中，除了杵臼突变之外，lala突变存在于抗体部分中。
80.在一些实施例中，抗体部分在其fc结构域中包括m252y/s254t/t256e(“yte”)突变。yte突变允许同时调节血清半衰期、组织分布和igg1的活性(参见dall'acqua等人,《生物化学杂志(j biol chem.)》(2006)281:23514-24；以及robbie等人,《抗微生物剂与化疗(antimicrob agents chemother.)》(2013)57(12):6147-53)。在另外的实施例中，除了杵臼突变之外，yte突变存在于抗体部分中。在特定实施例中，抗体部分具有yte、lala和杵臼突变或其任何组合。
81.抗原结合部分可以与细胞(如免疫细胞，例如t细胞、nk细胞和巨噬细胞)的表面上的抗原结合，或者与细胞因子结合。例如，抗原结合部分可以与pd-1、lag-3、tim-3、tigit、ctla-4或tgf-β结合，可以是抗体。所述抗体可能具有激活免疫细胞并增强其抗癌活性的能力。
82.抗原结合部分可以与肿瘤细胞表面上的抗原结合。例如，抗原结合部分可以与fapα、5t4、trop-2、pd-l1、her-2、egfr、claudin18.2、dll-3、gcp3或癌胚抗原(cea)结合，可以是抗体。抗体可能具有或可能不具有adcc活性。抗体还可以进一步与细胞毒性药物缀合。
83.在一些实施例中，抗原结合部分可以与以下结合：鸟苷酸环化酶c(gcc)、糖类抗原19-9(ca19-9)、糖蛋白a33(gpa33)、粘蛋白1(muc1)、胰岛素样生长因子1受体(igf1-r)、人表皮生长因子受体2(her2)、人表皮生长因子受体3(her3)、δ样蛋白3(dll3)、δ样蛋白4(dll4)、表皮生长因子受体(egfr)、磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)、c-met、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、粘连蛋白-4、liv-1、糖蛋白nmb(gpnmb)、前列腺特异性膜抗原(psma)、trop-2、碳酸酐酶ix(ca9)、内皮素b受体(etbr)、前列腺六跨膜上皮抗原1(steap1)、叶酸受体α(fr-α)、slit和ntrk样蛋白6(slitrk6)、碳酸酐酶vi(ca6)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(enpp3)、间皮素、滋养层糖蛋白(tpbg)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd40、cd56、cd66e、cd70、cd74、cd79b、cd98、cd123、cd138、cd352、cd47、信号调节蛋白α(sirpα)、claudin18.2、claudin6、bcma或epcam。在一些实施例中，抗原结合部分与dll3的表皮生长因子(egf)样结构域结合。在一些实施例中，抗原结合部分与dll3的δ/锯齿状/lag2(dsl)样结构域结合。在一些实施例中，抗原结合部分与位于gpc3的第374个氨基酸之后的表位结合。在一些实施例中，抗原结合部分与gpc3的硫酸肝素聚糖结合。在一些实施例中，抗原结合部分与claudin18.2结合而不与claudin18.1结合。在一些实施例中，抗原结合部分以比claudin18.2弱至少10倍的结合亲和力与claudin18.1结合。
84.示例性抗原结合部分包含曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、本妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、gc33(或其
人源化版本)、抗egfr抗体mab806(或其人源化版本)、抗dpnag抗体f598以及其抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合部分与以下具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性：曲妥珠单抗、利妥昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗或帕尼单抗、gc33(或其人源化版本)、抗egfr抗体mab806(或其人源化版本)、抗dpnag抗体f598或其片段。在一些实施例中，抗原结合部分具有与以下的抗体重链具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的抗体重链：曲妥珠单抗、利妥昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、gc33(或其人源化版本)、抗egfr抗体mab806(或其人源化版本)、抗dpnag抗体f598或其片段。在一些实施例中，抗原结合部分具有与以下的抗体轻链具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的抗体轻链：曲妥珠单抗、利妥昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、gc33(或其人源化版本)、抗egfr抗体mab806(或其人源化版本)、抗dpnag抗体f598或其片段。抗原结合部分与il-2激动剂多肽融合。在一些实施例中，抗原结合部分包括以下的六个互补决定区(cdr)：曲妥珠单抗、利妥昔单抗、本妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、gc33、抗egfr抗体mab806或抗dpnag抗体f598。
85.许多cdr描绘是本领域公知的并涵盖在本文中。本领域技术人员可以基于重链或轻链可变区的序列容易地确定给定描绘的cdr。“kabat”cdr基于序列可变性，并且是最常用的(kabat等人,《具有免疫学意义的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)》,第5版,马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院公共卫生署(public health service,national institutes of health,bethesda,md.)(1991))。“chothia”cdr是指结构环的位置(chothia和lesk,免疫球蛋白高变区的典型结构(canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins),《分子生物学杂志(j mol biol.)》(1987)196:901-17)。“abm”cdr表示kabat cdr与chothia结构环之间的折衷并且通过牛津分子公司(oxford molecular)的abm抗体建模软件使用。“接触”cdr是基于对可用的复杂晶体结构的分析。参考常见的抗体编号方案，来自这些cdr中的每一个的残基在下表1中注明。除非本文另有规定，否则抗体中的氨基酸编号是指在kabat等人,同上中所述的kabat编号方案，包含在参考kabat、chothia、abm或接触方案进行cdr描绘的情况。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有较少或另外的氨基酸，所述氨基酸对应于可变结构域的框架区(fr)或cdr的缩短或到其中的插入。例如，重链可变结构域可以包含在h2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82之后的插入残基(例如，根据kabat的残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列的同源区与“标准”kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的kabat残基编号。
86.表1.根据各种方案的cdr描绘
87.cdrkabatabmchothia接触vl-cdr1l24-l34l24-l34l26-l32l30-l36vl-cdr2l50-l56l50-l56l50-l52l46-l55vl-cdr3l89-l97l89-l97l91-l96l89-l96vh-cdr1(kabat编号)h31-h35bh26-h35bh26-h32h30-h35bvh-cdr1(chothia编号)h31-h35h26-h35h26-h32h30-h35vh-cdr2h50-h65h50-h58h53-h55h47-h58
vh-cdr3h95-h102h95-h102h95-h101h93-h101
88.在一些实施例中，cdr是“扩展cdr”，涵盖根据不同方案开始或终止的区域。例如，扩展cdr可以如下所示：l24-l36、l26-l34或l26-l36(vl-cdr1)；l46-l52、l46-l56或l50-l55(vl-cdr2)；l91-l97(vl-cdr3)；h47-h55、h47-h65、h50-h55、h53-h58或h53-h65(vh-cdr2)；和/或h93-h102(vh-cdr3)。
89.在一些实施例中，抗原结合部分与her2结合，并包括与seq id no:52具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:53具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:52的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:53的cdr1、cdr2和cdr3。
90.在一些实施例中，抗原结合部分与cd20结合，并包括与seq id no:54具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:55具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:54的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:55的cdr1、cdr2和cdr3。
91.在一些实施例中，抗原结合部分与cd30结合，并包括与seq id no:56具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:57具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:56的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:57的cdr1、cdr2和cdr3。
92.在一些实施例中，抗原结合部分与egfr结合，并包括与seq id no:58或60具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:59或61具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:58或60的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:59或61的cdr1、cdr2和cdr3。
93.在一些实施例中，抗原结合部分与c-met结合，并包括与seq id no:62具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:63具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:62的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:63的cdr1、cdr2和cdr3。
94.在一些实施例中，抗原结合部分与gpc3结合，并包括与seq id no:64具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:65具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:64的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:65的cdr1、cdr2和cdr3。
95.在一些实施例中，抗原结合部分与claudin 18.2结合，并包括与seq id no:66具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:67具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:66的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:67的cdr1、cdr2和cdr3。
96.在一些实施例中，抗原结合部分与fapα结合，并包括与seq id no:80或81具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:82具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:80或81的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:82的cdr1、cdr2和cdr3。
97.在一些实施例中，抗原结合部分与fapα结合，并包括与seq id no:83具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链可变结构域，以及与seq id no:84具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:84的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:84的cdr1、cdr2和cdr3。
98.在一些实施例中，抗原结合部分与pdl1结合，并包括与seq id no:89具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:90具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:89的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:90的cdr1、cdr2和cdr3。
99.在一些实施例中，抗原结合部分与5t4结合，并包括与seq id no:87或88具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链可变结构域，以及与seq id no:85或86具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链可变结构域或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:87或88的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:85或86的cdr1、cdr2和cdr3。
100.在一些实施例中，抗原结合部分与trop-2结合，包括：轻链可变区，所述轻链可变区包括包含kasqdvsiava(seq id no:68)的氨基酸序列的cdr1、包括sasyryt(seq id no:69)的氨基酸序列的cdr2以及包括qqhyitplt(seq id no:70)的氨基酸序列的cdr3；以及重链可变区，所述重链可变区包括包含nygmn(seq id no:71)的氨基酸序列的cdr1、包括wintytgeptytddfkg(seq id no:72)的氨基酸序列的cdr2以及包括ggfgssywyfdv(seq id no:73)的氨基酸序列的cdr3。
101.在一些实施例中，抗原结合部分与间皮素结合，包括：轻链可变区，所述轻链可变区包括包含sasssvsymh(seq id no:74)的氨基酸序列的cdr1、包括dtsklas(seq id no:75)的氨基酸序列的cdr2以及包括qqwsgyplt(seq id no:76)的氨基酸序列的cdr3；以及重链可变区，所述重链可变区包括包含gytmn(seq id no:77)的氨基酸序列的cdr1、包括litpyngassynqkfrg(seq id no:78)的氨基酸序列的cdr2以及包括ggydgrgfdy(seq id no:79)的氨基酸序列的cdr3。
102.在一些实施例中，抗原结合部分与pd-1结合，并包括与seq id no:50具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:91具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自
seq id no:50的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:91的cdr1、cdr2和cdr3。
103.在一些实施例中，抗原结合部分与pd-1结合，并包括与seq id no:92具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的轻链或其片段，以及与seq id no:93具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列的重链或其片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包括来自seq id no:92的cdr1、cdr2和cdr3以及来自seq id no:93的cdr1、cdr2和cdr3。
104.在一些实施例中，抗原结合部分包括一个、两个或三个抗原结合域。例如，抗原结合部分是双特异性的并且与两种选自由以下组成的组的不同抗原结合：her2、her3、egfr、5t4、fapα、trop-2、gpc3、vegfr2、claudin 18.2和pd-l1。在一些实施例中，双特异性抗原结合部分与her2的两个不同表位结合。
105.2.其它载体部分
106.其它非抗原结合载体部分可以用于本发明的前药。例如，可以使用抗体fc结构域(例如，人igg1、igg2、igg3或igg
4 fc)、聚合物(例如，peg)、白蛋白(例如，人白蛋白)或其片段或纳米颗粒。举例来说，il-21激动剂多肽及其拮抗剂可以与抗体fc结构域融合，从而形成fc融合蛋白。在一些实施例中，il-21激动剂多肽(直接或通过肽接头)与fc结构域多肽链之一的c端或n端融合，细胞因子掩蔽剂通过可切割的肽接头与另一fc结构域多肽链的对应c端或n端融合，其中两条fc结构域多肽链含有允许两条不同fc链特异性配对的突变。在一些实施例中，fc结构域包括上述臼到臼突变。在另外的实施例中，fc结构域还可以包括上述yte和/或lala突变。
107.d.前药的接头组分
108.il-21激动剂多肽可以在具有或不具有肽接头的情况下与载体部分融合。肽接头可以是不可切割的。在一些实施例中，肽接头选自seq id no:29-33和132。在特定实施例中，肽接头包括氨基酸序列ggggsggggsggggs(seq id no:31)。
109.il-21掩蔽剂可以通过可切割的肽接头与细胞因子部分或载体融合。可切割的接头可以包含一个或多个(例如，两个或三个)可切割的部分(cm)。每个cm可以是选自以下的酶或蛋白酶的底物：豆荚蛋白、纤溶酶、tmprss-3/4、mmp-2、mmp-9、mt1-mmp、组织蛋白酶、胱天蛋白酶、人中性粒细胞弹性蛋白酶、β分泌酶、upa和psa。可切割的接头的实例包含但不限于包括选自seq id no:17-26的氨基酸序列的那些氨基酸序列。举例来说，可切割的肽接头用于将掩蔽部分与载体连接或与细胞因子部分连接。
110.在一些方面，本公开还提供了不含可切割的肽接头的前药。在一些实施例中，本公开的前药包括细胞因子部分、掩蔽部分和载体部分，其中：
111.a.所述掩蔽部分与所述细胞因子部分结合并抑制所述细胞因子部分的预期生物活性；
112.b.所述载体部分包括抗原结合部分；
113.c.所述掩蔽部分通过不可切割的肽接头与所述载体部分间接连接，或不用肽接头与所述载体部分直接连接；并且其中
114.d.与包括相同载体部分和相同细胞因子部分但没有所述掩蔽部分的经激活的融合分子的细胞因子部分相比，所述细胞因子部分具有较低的预期生物活性。
115.在一些实施例中，本公开的il-21掩蔽部分可以通过不可切割的肽接头与细胞因
子部分或载体融合。在一些实施例中，肽接头选自seq id no:29-33和132。在特定实施例中，肽接头包括氨基酸序列ggggsggggsggggs(seq id no:31)或ggggsggggsaaggggsggggs(seq id no:132)。
116.e.具有另外效应多肽的il-21前药
117.在具体实施例中，il-21前药进一步包括第二效应多肽，如第二细胞因子部分。在此类情况下，前药可以进一步包括第二掩蔽部分，所述第二掩蔽部分与第二效应多肽结合并抑制所述第二效应多肽的生物活性。
118.举例来说，il-21激动剂多肽及其掩蔽剂可以在fc结构域的一端与分离的fc链融合，而第二细胞因子部分及其掩蔽剂可以在fc结构域的另一端与分离的fc链融合，其中所述掩蔽剂通过可切割的肽接头与fc链融合。在某些实施例中，两条fc结构域多肽链含有允许两条不同fc链特异性配对的突变。
119.包括两个效应多肽和两个掩蔽部分的前药的实例包含包括两条多肽链的前药，所述两条多肽链的氨基酸序列分别包括：(i)seq id no:42和113；(ii)seq id no:42和114；(iii)seq id no:42和115；(iv)seq id no:42和116；(v)seq id no:43和113；(vi)seq id no:43和114；(vii)seq id no:43和115；或(viii)seq id no:43和116。图3a中示出了包括il-2激动剂多肽(第二效应多肽)及其对应掩蔽剂的il-21前药的示例性结构。图3b中示出了包括il-15激动剂多肽、sushi结构域及其对应掩蔽剂的il-21前药的示例性结构。
120.在一些实施例中，il-21前药进一步包括肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员的配体的胞外结构域的两个或三个拷贝。在一些实施例中，tnf超家族成员是4-1bb。图4展示了包括4-1bb配体(4-1bbl)胞外结构域的两个拷贝的示例性il-21前药的结构。il-21前药的载体可以是与在肿瘤中表达的抗原(例如，fap或5t4)结合的抗体。
121.在下文序列部分中示出了il-21激动剂多肽、细胞因子掩蔽剂、载体、肽接头和前药的具体的非限制性实例。此外，本公开的前药可以通过众所周知的重组技术制备。例如，包括前药的多肽链的编码序列的一个或多个表达载体可以转染到哺乳动物宿主细胞(例如，cho细胞)中，在允许表达编码序列并将经表达的多肽组装到前药复合物中的条件下培养细胞。为了使前药保持非活性，可以使用不表达或很少表达upa、蛋白裂解酶、mmp-2和/或mmp-9的宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞可以含有对这些蛋白酶进行编码的基因的无效突变(敲除)。
122.药物组合物
123.包括本公开的前药和突变蛋白(即活性药物成分或api)的药物组合物可以通过将具有期望纯度的api与一种或多种任选的药学上可接受的赋形剂以冻干调配物或水溶液的形式混合来制备(参见例如《雷明顿药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》,第16版,osol,a.编著(1980))。药学上可接受的赋形剂(或载体)通常在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒并且包含但不限于：含有例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、乙酸盐或另一种无机或有机酸或其盐的缓冲液；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸
或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含蔗糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(peg)。
124.缓冲液用于将ph控制在优化治疗效果的范围内，尤其是在稳定性取决于ph的情况下。缓冲液优选地以范围为约50mm到约250mm的浓度存在。与本发明一起使用的合适缓冲液包含有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、草酸盐、乳酸盐和乙酸盐。此外，缓冲液可以包括组氨酸和三甲胺盐，如tris。
125.添加防腐剂以减缓微生物生长，通常以0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。与本发明一起使用的合适的防腐剂包含：十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苄烷铵卤化物(例如氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟苯甲酸酯，如甲基或丙基对羟苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇、3-戊醇和间甲酚。
126.张力剂，有时称为“稳定剂”，的存在用以调节或维持组合物中液体的张力。当与如蛋白质和抗体等大的带电的生物分子一起使用时，张力剂通常被称为“稳定剂”，因为其可以与氨基酸侧链的带电的基团相互作用，由此降低分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其它成分的相对量，张力剂可以以介于0.1重量％到25重量％之间或更优选地介于1重量％到5重量％之间的任何量存在。优选的张力剂包含多元糖醇，优选地三元或更高的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。
127.存在非离子表面活性剂或去污剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂并保护治疗性蛋白免受搅动诱导的聚集，这也允许调配物暴露于剪切表面应力而不会造成活性治疗性蛋白或抗体的变性。非离子表面活性剂存在的范围为约0.05mg/ml到约1.0mg/ml，优选地约0.07mg/ml到约0.2mg/ml。
128.适合的非离子表面活性剂包含聚山梨酸酯(20、40、60、65、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(-20、-80等)、聚桂醇400、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60、单硬脂酸甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。可以使用的阴离子去污剂包含月桂基硫酸钠、十六烷磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。阳离子去污剂包含苯扎氯铵或苄索氯铵。
129.药物载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预期施用途径和标准药物实践进行选择。药物组合物可以另外地包括任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂或增溶剂。
130.根据不同的递送系统，可能有不同的组合物/制剂要求。举例来说，本发明中有用的药物组合物可以调配成使用微型泵或通过粘膜途径施用，例如作为用于吸入或可摄取溶液的鼻喷雾剂或气溶胶，或通过可注射的形式调配组合物以用于肠胃外递送，通过例如静脉内途径、肌肉内途径或皮下途径。
131.在一些实施例中，本公开的药物组合物是冻干蛋白制剂。在其它实施例中，药物组合物可以是水性液体制剂。
132.治疗方法
133.il-21前药可以用于治疗疾病，这取决于抗原结合结构域所结合的抗原。在一些实施例中，il-21前药用于治疗癌症。在一些实施例中，il-21前药用于治疗感染。
134.在一些实施例中，一种治疗受试者的疾病(如癌症、病毒感染或细菌感染)的方法
包括向受试者施用有效量的il-21前药。
135.在一些实施例中，癌症是实体瘤。在一些实施例中，癌症是血癌或实体瘤。可以治疗的示例性癌症包含但不限于白血病、淋巴瘤、肾癌、膀胱癌、泌尿道癌、宫颈癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、食道癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(如非小细胞肺癌)、胆管癌、乳腺癌和卵巢癌。
136.在一些实施例中，il-21前药用于治疗病毒感染。在一些实施例中，引起病毒感染的病毒是丙型肝炎(hcv)、乙型肝炎(hbv)、人免疫缺陷病毒(hiv)或人乳头状瘤病毒(hpv)。在一些实施例中，抗原结合部分与病毒抗原结合。
137.在一些实施例中，il-21前药用于治疗细菌感染，如败血症。在一些实施例中，引起细菌感染的细菌是耐药细菌。在一些实施例中，抗原结合部分与细菌抗原结合。
138.通常，本发明的药物组合物的施用剂量和途径是根据标准药学实践根据受试者的体型和病状测定的。在一些实施例中，药物组合物通过任何途径施用于受试者，包含口服施用、经皮施用、通过吸入施用、静脉内施用、动脉内施用、肌肉内施用、直接应用到伤口部位、应用到外科手术部位、腹膜内施用、通过栓剂施用、皮下施用、皮内施用、经皮施用、通过雾化施用、胸膜内施用、心室内施用、关节内施用、眼内施用、颅内施用或脊柱内施用。在一些实施例中，将组合物静脉内施用于受试者。
139.在一些实施例中，药物组合物的剂量是单个剂量或重复剂量。在一些实施例中，所述剂量每天一次、每天两次、每天三次、或每天四次或更多次向受试者给予。在一些实施例中，一周内给予约1个或更多个(例如，约2个、3个、4个、5个、6个或7个或更多个)剂量。在一些实施例中，药物组合物每周施用一次、每2周施用一次、每3周施用一次、每4周施用一次、3周中的两周每周施用一次或4周中的3周每周施用一次。在一些实施例中，在几天、几周、几个月或几年的过程中给予多剂量。在一些实施例中，一个疗程为约1个剂量或更多个剂量(如约2个剂量、3个剂量、4个剂量、5个剂量、7个剂量、10个剂量、15个剂量或20或更多个剂量)。
140.除非本文另外定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。下文描述了示例性方法和材料，但是与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本公开的实践或测试。在发生冲突的情况下，应以本说明书(包含定义)为准。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、分析化学、合成有机化学、药用和药物化学以及蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的术语表和技术是本领域众所周知和常用的术语表和技术。如本领域通常实现的或如本文所描述的来根据制造商的说明执行酶促反应和纯化技术。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包含复数含义并且复数术语应包含单数含义。贯穿本说明书和实施例，词语“具有(have)”“包括(comprise)”或如“具有(has)”、“具有(having)”“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。应当理解，本文所述的本发明的方面和变体包含“由方面和变体组成”和/或“基本上由方面和变体组成”。本文提及的所有出版物和其它参考文献以全文引用的方式并入。尽管本文引用了许多文件，但此引用并不构成承认这些文件中的任何文件形成本领域公知常识的一部分。
141.示例性实施例
142.本公开的另外的特定实施例描述如下。这些实施例旨在说明本公开中描述的组合物和方法，并不旨在限制本公开的范围。
143.1.一种前药，其包括人il-21多肽、掩蔽部分和载体部分，
144.其中
145.所述掩蔽部分与所述人il-21多肽结合并抑制所述人il-21多肽的生物活性，
146.所述人il-21多肽与所述载体部分融合，
147.所述掩蔽部分通过可切割或不可切割的肽接头与所述人il-21多肽或与所述载体部分融合，
148.所述掩蔽部分包括人il-21受体α的胞外结构域(ecd)(il-21rαecd)的突变版本，所述人il-21受体α具有在选自以下的一个或多个位置处的一个或多个突变：h49、s112、g113、q114、d122、p147、w148、a149、v150、r153、k155、l156、s158、d160、s161、r162、s163、s165和p168(根据seq id no:6编号)。
149.2.根据实施例1所述的前药，其中所述人il-21多肽包括seq id no:1、2、3、4或5或与seq id no:1、2、3、4或5至少90％同源性的氨基酸序列。
150.3.根据实施例2所述的前药，其中所述人il-21多肽包括在选自d18、q19、el09和k117的位置处的一个或多个突变(根据seq id no:1编号)。
151.4.根据实施例1到3中任一项所述的前药，其中所述掩蔽部分包括il-21rαecd的突变版本，其中所述突变的il-21rαecd包括选自以下的一个或多个突变：
152.h49n；
153.在位置d122处的一个选自d122a、d122i、d122w、d122f和d122y的的突变；
154.在位置p147处的选自p147g和p147n的的突变；
155.在位置w148处的选自w148g、w148n和w148s的的突变；
156.在位置a149处的选自a149g和a149s的的突变；以及
157.突变v150s。
158.5.根据实施例4中所述的前药，其中所述突变的il-21rαecd进一步包括在选自以下的在一个或多个位点处的一个或多个突变：s112、g113、q114、r153、s158、k155、l156、d160、s161、r162、s163、s165和p168。
159.6.根据实施例1到5中任一项所述的前药，其中所述il-21rαecd包括突变p147g、w148s和a149g；其中所述il-21rαecd突变蛋白进一步包括选自以下的一个或多个突变：
160.a.s112g或s112a；
161.b.q114e或q114d；
162.c.r153e或r153d；
163.d.k155e或k155d；
164.e.l156t或l156a；
165.f.s168g或s158a；
166.g.d160g或d160k；
167.h.s161g；
168.i.s163g或s163a；
169.j.s165g或s163a；以及
170.k.p168a或p168s。
171.7.根据实施例1到6中任一项所述的前药，其中所述il-21rαecd突变蛋白包括选自seq id no:98-108的氨基酸序列或与选自seq id no:98-108的氨基酸序列至少90％同源性的氨基酸序列。
172.8.根据实施例1到7中任一项所述的前药，其进一步包括第二细胞因子部分。
173.9.根据实施例8所述的前药，其中所述第二细胞因子部分是：
174.(i)人il-2激动剂多肽，所述人il-2激动剂多肽包括seq id no:8或与seq id no:8至少90％同源性的氨基酸序列；
175.(ii)人il-7激动剂多肽；
176.(iii)人il-9激动剂多肽；
177.(iv)人il-15激动剂多肽，所述人il-15激动剂多肽包括seq id no:9或与seq id no:9至少90％同源性的氨基酸序列；
178.(v)人il-15激动剂多肽和人il-15受体αsushi结构域；或
179.(vi)人ccl19多肽，所述人ccl19多肽包括seq id no:27或与seq id no:27至少90％同源性的氨基酸序列。
180.10.根据实施例8或9所述的前药，其进一步包括第二掩蔽部分，所述第二掩蔽部分与所述第二细胞因子部分结合并抑制所述第二细胞因子部分的生物活性，其中所述第二掩蔽部分通过可切割的肽接头与所述第二细胞因子部分或与所述载体部分融合。
181.11.根据实施例10所述的前药，其中所述第二掩蔽部分选自il-2受体β亚基的ecd或其功能类似物、il-7受体的ecd或其功能类似物以及il-9受体的ecd或其功能类似物。
182.12.根据前述实施例中任一项所述的前药，其中所述人il-21多肽和/或所述第二细胞因子部分通过不可切割的肽接头与所述载体部分融合。
183.13.根据实施例12所述的前药，其中所述不可切割的肽接头包括选自seq id no:29-33的氨基酸序列。
184.14.根据前述实施例中任一项所述的前药，其中所述可切割的肽接头包括尿激酶型纤溶酶原激活剂(upa)、基质金属肽酶(mmp)2或mmp9的底物序列。
185.15.根据实施例14所述的前药，其中所述可切割的肽接头包括以下的底物序列：(i)upa和mmp2两者；(ii)upa和mmp9两者；或(iii)upa、mmp2和mmp9。
186.16.根据实施例14所述的前药，其中所述可切割的肽接头包括选自seq id no:11-26的氨基酸序列。
187.17.根据前述实施例中任一项所述的前药，其中所述可切割的肽接头可被位于肿瘤部位或其周围环境的一种或多种蛋白酶切割，所述切割使所述前药在所述肿瘤部位或周围环境激活。
188.18.根据前述实施例中任一项所述的前药，其中所述载体部分是peg分子、白蛋白、白蛋白片段、抗体fc结构域或抗体或其抗原结合片段。
189.19.根据实施例18所述的前药，其中所述载体部分是抗体fc结构域或包括l234a和l235a(“lala”)突变的抗体(eu编号)。
190.20.根据实施例18或19所述的前药，其中所述载体部分是抗体fc结构域或包括杵臼突变的抗体，其中
191.所述人il-21多肽及其掩蔽部分与所述抗体fc结构域的不同肽链或与所述抗体的不同重链融合，任选地
192.所述第二细胞因子部分和所述第二掩蔽部分还与所述抗体fc结构域的不同多肽链或与所述抗体的不同重链融合。
193.21.根据实施例20所述的前药，其中所述人il-21多肽及其掩蔽部分与所述fc结构域的所述两条不同多肽链的c端融合或与所述抗体的所述两条不同重链的c端融合。
194.22.根据实施例20所述的前药，其中所述人il-21多肽及其掩蔽部分与所述fc结构域的所述两条不同多肽链的n端融合或与所述抗体的所述两条不同重链的n端融合。
195.根据实施例21和22所述的前药，其中所述第二细胞因子部分和所述第二掩蔽部分与来自所述人il-21多肽及其掩蔽部分的所述fc结构域的所述两条不同多肽链的相反末端融合，或与所述抗体的所述两条不同重链的相反末端融合。
196.23.根据实施例20到23中任一项所述的前药，其中所述杵臼突变包括所述fc结构域的多肽链或所述抗体的重链上的t366y“杵”突变以及所述fc结构域的另一多肽或所述抗体的另一重链中的y407t“臼”突变(eu编号)。
197.24.根据实施例20到23中任一项所述的前药，其中所述杵臼突变包括在“杵链”的ch3结构域中的y349c和/或t366w突变以及在“臼链”的ch3结构域中的e356c、t366s、l368a和/或y407v突变(eu编号)。
198.25.根据实施例18到25中任一项所述的前药，其中所述载体部分是与选自以下的一种或多种抗原特异性地结合的抗体或其抗原结合片段：鸟苷酸环化酶c(gcc)、糖类抗原19-9(ca19-9)、糖蛋白a33(gpa33)、粘蛋白1(muc1)、癌胚抗原(cea)、胰岛素样生长因子1受体(igf1-r)、人表皮生长因子受体2(her2)、人表皮生长因子受体3(her3)、δ样蛋白3(dll3)、δ样蛋白4(dll4)、表皮生长因子受体(egfr)、磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)、c-met、血管内皮生长因子受体1(vegfr1)、血管内皮生长因子受体2(vegfr2)、粘连蛋白-4、liv-1、糖蛋白nmb(gpnmb)、前列腺特异性膜抗原(psma)、trop-2、碳酸酐酶ix(ca9)、内皮素b受体(etbr)、前列腺六跨膜上皮抗原1(steap1)、叶酸受体α(fr-α)、slit和ntrk样蛋白6(slitrk6)、碳酸酐酶vi(ca6)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(enpp3)、间皮素、滋养层糖蛋白(tpbg)、cd19、cd20、cd22、cd33、cd40、cd56、cd66e、cd70、cd74、cd79b、cd98、cd123、cd138、cd352、cd47、信号调节蛋白α(sirpα)、pd1、claudin 18.2、claudin 6、5t4、bcma、pd-l1、pd-1、成纤维细胞激活蛋白α(fapα)、黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(mcsp)和epcam。
199.26.根据实施例20所述的前药，其中所述前药包括两条多肽链，所述多肽链的氨基酸序列分别包括：
200.seq id no:36和38；
201.seq id no:37和38；
202.seq id no:39和41；
203.seq id no:40和41；
204.seq id no:42和44；
205.seq id no:43和44；
206.seq id no:45和47；或
207.seq id no:46和47。
208.27.根据实施例18所述的前药，其包括两个重链多肽，所述重链多肽的氨基酸序列分别包括seq id no:48和49；轻链包括seq id no:50或51。
209.28.根据实施例18所述的前药，其包括两个重链多肽，所述重链多肽的氨基酸序列分别包括seq id no:109和110；轻链包括seq id no:50。
210.29.根据实施例18所述的前药，其包括两个重链多肽，所述重链多肽的氨基酸序列分别包括seq id no:111和112；轻链包括seq id no:92。
211.30.根据实施例18所述的前药，其中所述载体部分是与fapα或5t4结合的抗体或其抗原结合片段；任选地所述前药进一步包括肿瘤坏死因子(tnf)配体家族成员或4-1bb配体或其片段的两个或三个胞外结构域。
212.31.根据实施例18所述的前药，其中所述载体部分是与ctla4结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括源自seq id no:113的轻链cdr结构域序列和源自seq id no:114的重链cdr结构域序列。
213.32.根据实施例18所述的前药，其中所述载体部分是与egfr和cmet两者结合的双特异性抗体。
214.33.一种药物组合物，其包括根据实施例1到33中任一项所述的前药以及药学上可接受的赋形剂。
215.34.一种多核苷酸，其编码实施例1到33中任一项所述的前药。
216.35.一种表达载体，其包括根据实施例35所述的多核苷酸。
217.36.一种宿主细胞，其包括根据实施例36所述的载体。
218.37.根据实施例37所述的宿主细胞，其中敲除宿主细胞中对upa、mmp2和/或mmp9进行编码的基因。
219.38.一种制备根据实施例1到33中任一项所述的前药的方法，所述方法包括：
220.在允许表达所述前药的条件下培养根据实施例37或38所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞；以及
221.分离所述前药。
222.39.一种治疗有需要的患者的癌症或传染病或刺激所述患者的免疫系统的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据实施例34所述的药物组合物。
223.40.根据实施例1到33中任一项所述的前药在治疗有需要的患者的癌症或传染病或刺激所述患者的免疫系统中的应用。
224.41.一种根据实施例1到33中任一项所述的前药在制备用于治疗有需要的患者的癌症或传染病或刺激所述患者的免疫系统的药物中的应用。
225.42.根据实施例40的方法、根据实施例41所述的供使用的前药或根据实施例38所述的用途，其中所述患者患有以下：hiv、hbv、hcv或hpv感染；或选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、甲状腺髓样癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、睾丸癌、结直肠癌和胃癌。
226.为了更好地理解本发明，阐述以下实例。这些实例仅出于说明目的并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
227.实例
228.实例1：使用hek293细胞瞬时转染il-21前药
229.使用pei(聚乙烯亚胺)以2.5-3μ/ml将表达质粒共转染到3
×
106个细胞/ml的自由式hek293细胞中。对于基于fc的il-21前药(a和b)，fc-il-21融合多肽与fc掩蔽部分融合多肽的比率为1:2。对于基于抗体的il-21前药，杵重链(含有il-21激动剂多肽)与臼重链(含有掩蔽部分)与轻链dna的摩尔比为2:1:2。转染后6天，通过以9,000rpm离心持续45分钟，随后进行0.22μm过滤，采集细胞培养物。
230.表达了两种il-21前药(a和b)。还表达了其对应对照，即没有掩蔽部分的fc-il-21融合分子。表2中列出了序列id no。
231.表2.样品的序列信息。
[0232][0233][0234]
实例2：expicho-s细胞的瞬时转染
[0235]
使用expifectamine cho试剂以1-2μg/ml将表达质粒共转染到6
×
106个细胞/ml的expicho-s细胞中。对于pd-1抗体-il-21融合分子，杵重链:轻链:臼轻链的比率为1:2:2.转染后7天，通过以12,000rpm离心持续40分钟，随后进行0.45μm过滤，采集细胞培养物。
[0236]
实例3：基于fc的il-21前药的纯化
[0237]
通过使用以下三个色谱法步骤进行基于fc的il-21前药a和b的蛋白质的纯化：蛋白a亲和力、capto adhere(流通模式)和capto sp impres。简而言之，将瞬时表达细胞培养物的上清液装载到蛋白a柱上，在施加样品之前，用ph为7.8的25mm tris-hcl、30mm nacl(缓冲液a)平衡所述蛋白a柱。用5柱体积的缓冲液a洗涤柱，并用ph为3.6的50mm乙酸洗脱结合蛋白。使用1m tris碱将经洗脱的蛋白质的ph调节至5.2并将其装载到capto adhere柱上，用ph为5.2的50mm乙酸、30mm nacl(缓冲液b)平衡所述柱。收集流通液并将其进一步装载到缓冲液b平衡的capto sp impres柱上。用5柱体积的缓冲液b洗涤柱，并用30柱体积梯度从0％到100％的ph为5.2的50mm乙酸、1m nacl(缓冲液c)洗脱结合蛋白。通过hplc-sec分析每个步骤的经洗脱的样品。聚集率小于10％的capto sp impres步骤的级分被汇集以供进一步分析。
[0238]
实例4：sec-hplc分析
[0239]
使用从东曹生物科学公司(tosoh bioscience)订购的tskgel g3000swxl柱(7.8mm idx 30cm，5μm粒径)的安捷伦(agilent)1100系列的hplc系统进行sec-hplc。装载至多100μl的样品。通过含有ph为6.5的200mm k3po4、250mm kc1的缓冲液运行柱。流速为0.5毫升/分钟。在室温下运行柱。在220nm和280nm处监测蛋白质洗脱。通过sec-hplc分析il-21前药a的过程中池。图5a示出了蛋白a柱池的测定结果；图5b示出了capto adhere柱池的测定结果；图5c示出了capto sp impres柱池的测定结果。数据示出，经蛋白a柱纯化的前药包括具有一些聚集体的主峰(图5a)。如通过sec-hplc分析的，其主峰纯度为约80％。通过随后的色谱法步骤使聚集体显著减少，如通过sec-hplc测试的，capto sp impres池示出的产品
纯度超过98％(图5c)。
[0240]
实例5：sds-page分析
[0241]
将10μl的培养上清液或10-20μg的经纯化的蛋白样品与具有或不具有还原试剂的bolt
tm lds样品缓冲液(诺威克公司(novex))混合。将样品在70℃下加热持续3分钟，然后将其装载到nupage
tm 4-12％的bistris凝胶(英杰公司(invitrogen))中。将凝胶在nupage
tm mops sds运行缓冲液(英杰公司)中以200伏特运行持续40分钟，然后用考马斯染色。前药a和b的经纯化的样品以及用蛋白酶mmp-2处理的经纯化的样品(见下文)一起通过sds-page分析进行分析，如在图6中示出的。数据示出，前药a和前药b两者的掩蔽部分通过蛋白酶消化完全去除，经激活的分子以预期的分子量迁移。
[0242]
实例6：蛋白水解处理
[0243]
蛋白酶、人mmp2、人mmp9、小鼠mmp2和小鼠mmp9购自r&d系统公司(r&d systems)。通过将10μg-50μg的前药与1μg的人mmp2、人mmp9、小鼠mmp2或小鼠mmp9在含有2mm cac12和10μm zncl2的hbs缓冲液(20mm hepes，150mm nacl2，ph 7.4)中在37℃下温育持续12小时进行蛋白酶消化。通过sds-page(图6)和基于细胞的活性测定(见下文)分析消化前后的前药。
[0244]
实例7：基于细胞的活性测定
[0245]
通过基于细胞的活性测定测试蛋白酶消化前的前药以及对照样品。简而言之，使nk92细胞在补充有l-谷氨酰胺、10％胎牛血清、10％非必需氨基酸、10％丙酮酸钠和55μmβ-巯基乙醇的rpmi 1640培养基中生长。nk92细胞是非贴壁细胞，并在具有100ng/ml的il-2的培养基中维持在1
×
10
5-1
×
106个细胞/ml。通常，细胞每周分裂两次。对于生物测定，最好在传代后不少于48小时使用细胞。通过在存在恒定量的il-2的情况下连续稀释样品以5
×
104个细胞/孔培养nk92细胞持续2天来确定il-21功能活性。然后通过elisa测定上清液中的干扰素-γ。结果示出于图7a和7b中。数据示出，蛋白酶mmp-2处理显著增强了前药的生物测定活性。
[0246]
经蛋白酶处理(或激活)的前药示出了与对照fc-il-21融合分子类似的活性，即使未从经蛋白酶处理的样品中去除掩蔽部分，即il-21rαecd。令人惊讶的是，考虑到il-21以非常高的亲和力(约70pm的kd)与il-21ra结合，通过蛋白酶消化释放的掩蔽部分的存在似乎不会干扰il-21生物测定。
[0247]
实例8：抗pd-1抗体-il-21前药融合分子
[0248]
基于抗pd-1抗体的il-21前药由两条相同的轻链(具有如seq id no:50所示的氨基酸序列)、第一重链多肽链(具有如seq id no:48所示的氨基酸序列)和第二重链多肽链(具有如seq id no:49所示的氨基酸序列)构建。对所述分子进行表达和纯化。作为对照，也表达并纯化了没有掩蔽剂的抗pd-1抗体-il-21融合分子。使用与上述相同的方法测试激活前后细胞因子前药的基于细胞的活性测定。图8中示出了数据。结果示出激活前il-21活性最低。激活后，il-21活性与在pd-1-il-21融合分子中的il-21活性类似。
[0249]
也在激活前后使用pd1/pd-l1阻断报告基因测定测试抗pd-1抗体的活性。使用两种工程化细胞系测量抗pd-1抗体阻断pd-l1介导的pd1信号转导的能力。第一种是表达人pd-l1和t细胞受体激活剂两者的cho-k1细胞系(cho-k1/tcra/pd-l1，bps生物科学公司(bps bioscience)目录号60536)。第二细胞系(pd1/nfat，bps生物科学公司目录号60535)是表达pd-1和nfat萤火虫荧光素酶报告基因的jurkat t细胞系。cho-k1细胞上的t细胞受
体激活剂将激活jurkat细胞，从而导致nfat荧光素酶报告基因的表达。然而，由于cho-k1细胞也表达pd-l1，通过pd-1的信号转导导致nfat激活的抑制。阻断pd-l1/pd-1相互作用将恢复nfat激活和荧光素酶活性。
[0250]
为了进行测定，将cho-k1/tcra/pd-l1细胞以35,000个细胞/孔接种于50μl测定培养基(rpmi-1640，10％胎牛血清，非必需氨基酸，2-巯基乙醇和庆大霉素)，接种于96孔平底板中，即96孔白壁平底板中。过夜培养后，去除培养基，并将样品和标准品
[0251]
以2
×
浓度添加在50μl/孔中。将板温育20分钟，并将40,000个pd1/nfat细胞以50μ添加到每个孔中。将板在37℃下温育6小时。将板冷却至室温持续5分钟，并添加100μl/孔的荧光素酶试剂(pierce萤火虫荧光素酶一步发光测定试剂盒，赛默飞世尔科技公司(thermo scientific)目录号16197)。将板温育持续15分钟，然后在光度计上测量发光。
[0252]
测定结果(图9)表明，融合分子中的抗pd-1抗体保留了其生物功能。
[0253]
实例9：另外的抗pd-1抗体-il-21前药融合分子
[0254]
基于抗pd-1抗体的il-21前药由两条相同的轻链(具有如seq id no:50所示的氨基酸序列)、第一重链多肽链(具有如seq id no:48所示的氨基酸序列)和第二重链多肽链(具有如seq id no:49所示的氨基酸序列)构建。所述分子被瞬时表达和纯化(批号pw04-38)。还表达并纯化了以scfv作为掩蔽部分的第二基于pd-1抗体的il-21前药(批号pw05-68)。所述第二基于pd-1抗体包括两条相同的轻链(具有如seq id no:50所示的氨基酸序列)、第一重链多肽链(具有如seq id no:48所示的氨基酸序列)和第二重链多肽链(具有如seq id no:133所示的氨基酸序列)。此外，作为对照，也表达并纯化了没有掩蔽剂的抗pd-1抗体-il-21融合分子(批号pw05-67)。所述抗pd-1抗体-il-21融合分子包括两条相同的轻链(具有如seq id no:50所示的氨基酸序列)、第一重链多肽链(具有如seq id no:48所示的氨基酸序列)和第二重链多肽链(具有如seq id no:134所示的氨基酸序列)。另外地，还表达并纯化了第二对照，即没有掩蔽剂的抗pd-1抗体-il-21突变蛋白(r9er76a)融合分子(批号pw09-02)，所述抗pd-1抗体-il-21突变蛋白包括两条相同的轻链(具有如seq id no:50所示的氨基酸序列)、第一重链多肽链(具有如seq id no:135所示的氨基酸序列)和第二重链多肽链(具有如seq id no:134所示的氨基酸序列)。
[0255]
此外，还表达并纯化了不具有可切割的肽接头的基于pd-1抗体的il-21前药。批号pw09-44的前药包括两条相同的轻链(具有如seq id no:50所示的氨基酸序列)、第一重链多肽链(具有如seq id no:117所示的氨基酸序列)和第二重链多肽链(具有如seq id no:130所示的氨基酸序列)。
[0256]
实例10：结合测定
[0257]
通过facs测试前药分子和若干对照分子与mino细胞的结合。图10上的结果示出，pd-1抗体和fc-il-21融合分子两者能够与mino细胞结合，表明mino细胞表达pd-1和il-21受体两者。结果示出，两种基于fc的il-21前药分子未与细胞结合，表明il-21细胞因子部分已经由对应的掩蔽部分掩蔽。然而，基于pd-1抗体的il-21前药分子和融合分子均能够与mino细胞结合。
[0258]
实例11：基于pd-1抗体的前药的基于nk92细胞的活性测定
[0259]
通过基于细胞的活性测定测试蛋白酶消化前的基于抗体的前药以及对照样品。简而言之，使nk92细胞在补充有l-谷氨酰胺、10％胎牛血清、10％非必需氨基酸、10％丙酮酸
钠和55μmβ-巯基乙醇的rpmi-1640培养基中生长。nk92细胞是非贴壁细胞，并在具有100ng/ml的il-2的培养基中维持在1
×
10
5-1
×
106个细胞/ml。通常，细胞每周分裂两次。对于生物测定，最好在传代后不少于48小时使用细胞。通过在存在恒定量的il-2的情况下连续稀释样品以5
×
104个细胞/孔培养nk92细胞持续2天来确定il-21功能活性。然后通过elisa测定上清液中的干扰素-γ。结果在图11中示出。数据示出，在没有激活的情况下，具有il-21α-ecd(批号pw04-38)的前药分子的活性最低；而scfv作为掩蔽部分的前药(批号pw05-68)的活性是没有掩蔽部分的前药(pw04-67)的活性的约1/1000。数据示出，蛋白酶mmp2处理显著增强了前药的生物测定活性。
[0260]
实例12：mino il-21活力测定
[0261]
mino细胞活力测定按照以下方案进行：
[0262]
a)在96孔组织培养板中，在50μl测定培养基(rpmi 1640，10％胎牛血清，neaa，丙酮酸钠，55μm b-巯基乙醇)中连续稀释测试制品。
[0263]
b)在50μl测定培养基中添加20,000个mino细胞/孔。
[0264]
c)培养持续2天或3天。
[0265]
d)添加100μl/孔细胞滴度glo(普洛麦格公司(promega))。细胞滴度glo通过提供atp的定量评估提供细胞活力的量度。
[0266]
e)测量发光。
[0267]
mino活力测定结果示出于图12a和12b中。令人惊讶的是，前药(批号pw04-38和pw05-68)在激活前具有显著活性，而对照分子(pd-1抗体-il-21r9e/r76a融合分子，批号pw09-02)没有或几乎没有活性。mino细胞表达pd-1。虽然不希望受理论的约束，但假设mino细胞表达pd-1和il-21受体两者，并且前药通过“顺式结合”激活，即通过与pd-1和il-21受体两者结合而激活。pd-1抗体与细胞表面上的pd-1抗原的顺式结合以及细胞因子与其在同一细胞表面上的受体的顺式结合可能已经揭示了掩蔽部分的掩蔽效应。因此，不具有可切割的肽接头的前药可能在疾病部位(如肿瘤)被“激活”，因为局部免疫细胞可以表达载体靶向的抗原和结合细胞因子部分(il-21)的受体两者。
[0268]
实例13：使用同基因肿瘤模型的体内功效研究
[0269]
向6周龄大的balb/c小鼠(泰康利生物科学公司(taconic biosciences))皮下注射1
×
106ct26/18.2细胞。7天后，使用数显卡尺测量肿瘤，并计算肿瘤体积(v＝(ab2)p/6，其中b是所测量的两个维度中较短的一个)。然后将小鼠随机分为处理组，使得所有组的平均肿瘤尺寸大致相同(约100mm3)。然后通过腹膜内注射以0.5-5mg/kg在100μl中用安慰剂或测试制品处理小鼠。在第7天、第9天、第11天、第13天、第15天和18天进行给药。每2-3天测量一次肿瘤，当肿瘤达到2000mm3时处死小鼠。
[0270]
提供上述非限制性实例仅用于说明目的，以便促进对所公开主题的更完整理解。这些实例不应被解释为限制本说明书中描述的任何实施例，包含与抗体、药物组合物或用于治疗癌症、神经退行性病变或传染病的方法和用途有关的实施例。
[0271]
序列表
[0272]
在下面的序列中，加框的残基表示突变。可切割接头中的下划线表示蛋白酶底物序列。斜体残基代表信号肽。
[0273]
seq id no:1-人il-21
[0274][0275]
seq id no:2-il-21突变蛋白a
[0276][0277]
seq id no:3-il-21突变蛋白b
[0278][0279]
seq id no:4-il-21突变蛋白c
[0280][0281]
seq id no:5-il-21突变蛋白d
[0282][0283]
seq id no:6-il-21受体胞外结构域(来源：uniprot.org/uniprot/q9hbe5)
[0284][0285]
seq id no:7-人il-21受体γ亚基胞外结构域
[0286][0287]
seq id no:8-人il-2氨基酸序列
[0288][0289]
seq id no:9-人il-15氨基酸序列
[0290][0291]
seq id no:10-人il-15受体α亚基sushi结构域
[0292][0293]
seq id no:11-17-mmp-2/mmp-9可切割的肽接头
[0294]
gplgvr(seq id no:11)
[0295]
plgmwsr(seq id no:12)
[0296]
plglwar(seq id no:13)
[0297]
pqgiagqr(seq id no:14)
[0298]
plglag(seq id no:15)
[0299]
lalgpr(seq id no:16)
[0300]
ggplgmlsqs(seq id no:17)
[0301]
seq id no:18-26-尿激酶纤溶酶原激活剂(upa)可切割的肽接头
[0302]
ggggrrggs(seq id no:18)
[0303]
tgrgpswv(seq id no:19)
[0304]
sargpsrw(seq id no:20)
[0305]
targpsfk(seq id no:21)
[0306]
targpsw(seq id no:22)
[0307]
ggwhtgrn(seq id no:23)
[0308]
htgrsgal(seq id no:24)
[0309]
pltgrsgg(seq id no:25)
[0310]
ltgrsga(seq id no:26)
[0311]
seq id no:27-人ccl19氨基酸序列
[0312][0313]
seq id no:28-人il-7氨基酸序列
[0314][0315]
seq id no:29-33肽接头
[0316]
ggggs(seq id no:29)
[0317]
ggggsggggs(seq id no:30)
[0318]
ggggsggggs ggggs(seq id no:31)
[0319]
ggggsggggx ggggsggggs(seq id no:32)，x＝a或n
[0320]
ggggsggggx ggggyggggs(seq id no:33)，x＝s、a或n，y＝a或n
[0321]
seq id no:34-igg1 fc
[0322][0323]
seq id no:35-igg4 fc
[0324]
[0325]
seq id no:36-具有杵突变的fc-il-21
[0326][0327]
；其中n＝0、1、2、3、4或5。
[0328]
seq id no:37-具有杵突变的fc-il-21突变蛋白
[0329][0330]
；其中n＝0、1、2、3、4或5。
[0331]
seq id no:38-具有臼突变的fc-il-21受体
[0332][0333]
seq id no:39-具有杵突变的il-21-fc
[0334][0335]
；其中n＝0、1、2、3、4或5。
[0336]
seq id no:40-具有杵突变的il-2-fc突变蛋白
[0337][0338]
；其中n＝0、1、2、3、4或5。
[0339]
seq id no:41-具有臼突变的il-21rαecd-fc
[0340][0341]
seq id no:42-具有杵突变的il-15-sushi-fc-il-21
[0342][0343]
；其中n1＝0、1、2、3、4或5；n2＝0、1、2、3、4或5；n3＝0、1、2、3、4或5；x是选自q和e的氨基酸残基。
[0344]
seq id no:43-具有杵突变的il2类似物-il-21突变蛋白
[0345][0346]
；其中n1＝0、1、2、3、4或5；n2＝0、1、2、3、4或5；x是选自q、a、w、h和e的氨基酸残基。
[0347]
seq id no:44-具有臼突变的il-2rβecd-fc-il-21rαecd
[0348][0349]
seq id no:45-il-21-具有杵突变的fc
‑‑
sushi-il-15
[0350][0351]
；其中n1＝0、1、2、3、4或5；n2＝0、1、2、3、4或5；n3＝0、1、2、3、4或5。
[0352]
seq id no:46-il-21突变蛋白-具有杵突变的fc
‑‑
il-2类似物-[0353][0354]
；其中n1＝0、1、2、3、4或5；n2＝0、1、2、3、4或5。
[0355]
seq id no:47-il-2rαecd-具有臼突变的fc-的il-21rβecd
[0356][0357]
seq id no:48-pd1-hc-il21杵突变
[0358][0359]
seq id no:49-具有臼突变的pd1-hc-il21ra ecd
[0360][0361]
seq id no:50-pd1-lc
[0362][0363]
seq id no:51-pd1-lc-il2基(pd1-lc-il2basal)
[0364][0365]
；其中x
aa
88是选自n和a的氨基酸，x
aa
126是选自q、h、w或a的氨基酸。
[0366]
seq id no:52-曲妥珠单抗轻链
[0367][0368]
seq id no:53-曲妥珠单抗重链
[0369][0370]
seq id no:54-利妥昔单抗轻链
[0371][0372]
seq id no:55-利妥昔单抗重链
[0373][0374]
seq id no:56-本妥昔单抗轻链
[0375][0376]
seq id no:57-本妥昔单抗重链
[0377][0378]
seq id no:58-西妥昔单抗轻链
[0379][0380]
seq id no:59-西妥昔单抗重链
[0381][0382]
seq id no:60-帕尼单抗轻链
[0383][0384]
seq id no:61-帕尼单抗重链
[0385][0386]
seq id no:62-抗c-met抗体轻链
[0387][0388]
seq id no:63-抗c-met抗体重链
[0389][0390]
seq id no:64-抗gpc3抗体轻链
[0391][0392]
seq id no:65-抗gpc3抗体重链
[0393][0394]
seq id no:66-claudin 18.2抗体轻链
[0395][0396]
seq id no:67-claudin 18.2抗体重链
[0397][0398]
seq id no:68-抗trop-2抗体轻链cdr1
[0399]
kasqdvsiav a
[0400]
seq id no:69-抗trop-2抗体轻链cdr2
[0401]
sasyryt
[0402]
seq id no:70-抗trop-2抗体轻链cdr3
[0403]
qqhyitplt
[0404]
seq id no:71-抗trop-2抗体重链cdr1
[0405]
nygmn
[0406]
seq id no:72-抗trop-2抗体重链cdr2
[0407]
wintytgept ytddfkg
[0408]
seq id no:73-抗trop-2抗体重链cdr3
[0409]
ggfgssywyf dv
[0410]
seq id no:74-抗间皮素抗体轻链cdr1
[0411]
sasssvsymh
[0412]
seq id no:75-抗间皮素抗体轻链cdr2
[0413]
dtsklas
[0414]
seq id no:76-抗间皮素抗体轻链cdr3
[0415]
qqwsgyplt
[0416]
seq id no:77-抗间皮素抗体重链cdr1
[0417]
gytmn
[0418]
seq id no:78-抗间皮素抗体重链cdr2
[0419]
litpyngass ynqkfrg
[0420]
seq id no:79-抗间皮素抗体重链cdr3
[0421]
ggydgrgfdy
[0422]
seq id no:80-抗fap lc版本1(蛋白质序列)
[0423][0424]
seq id no:81-抗fap lc版本2(蛋白质序列)
[0425][0426]
seq id no:82-抗fap vh(蛋白质序列)
[0427][0428]
seq id no:83-fapα抗体bibh1的人源化轻链可变结构域
[0429][0430]
seq id no:84-fapα抗体bibh1的人源化重链可变结构域
[0431][0432]
seq id no:85-人源化h8抗5t4 vh版本1(蛋白质序列)
[0433][0434]
seq id no:86-人源化h8抗5t4 vh版本2(蛋白质序列)
[0435][0436]
seq id no:87-人源化h8抗5t4 vl版本1(蛋白质序列)
[0437][0438]
seq id no:88-人源化h8抗5t4 vl版本2(蛋白质序列)
[0439][0440]
seq id no:89-抗pdl1阿特珠单抗lc
[0441][0442]
seq id no:90-抗pdl1阿特珠单抗hc(蛋白质序列)
[0443][0444]
seq id no:91-抗pd-1纳武单抗hc(蛋白质序列)
[0445][0446]
seq id no:92-抗pd-1派姆单抗lc(蛋白质序列)
[0447][0448]
seq id no:93-抗pd-1派姆单抗hc(蛋白质序列)
[0449][0450]
seq id no:94-具有杵突变的fc-il-21
[0451][0452]
seq id no:95-fc杵-il-21突变蛋白q19k/e109r
[0453]
[0454]
seq id no:96-具有臼突变的igg1 fc
[0455][0456]
seq id no:97-人抗人il-21抗体克隆366.552.11.31hc可变结构域
[0457][0458]
seq id no:98-人抗人il-21抗体克隆366.552.11.31lc可变结构域
[0459][0460]
seq id no:99-人抗人il-21抗体克隆362.78.1.44hc可变结构域
[0461][0462]
seq id no:100-人抗人il-21抗体克隆362.78.1.44lc可变结构域
[0463][0464]
seq id no:101-具有臼突变的fc-scfv-vh/vl 366
[0465][0466]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0467]
seq id no:102-具有臼突变的fc-scfv-vl/vh366
[0468][0469]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0470]
seq id no:103-具有臼突变的fc-scfv-vh/vl 362
[0471][0472]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0473]
seq id no:104-具有臼突变的fc-scfv-vl/vh 362
[0474][0475]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0476]
seq id no:105-具有臼突变的scfv-fc vh/vl 366
[0477][0478]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0479]
seq id no:106-具有臼突变的scfv-fc vl/vh 366
[0480][0481]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0482]
seq id no:107-具有臼突变的scfv-fc vh/vl 362
[0483][0484]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0485]
seq id no:108-具有臼突变的scfv-fc vl/vh 362
[0486][0487]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0488]
seq id no:109-具有臼突变的pd1-hc-scfv-vh/vl 366
[0489][0490]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0491]
seq id no:110-具有臼突变的pd1-hc-scfv-vl/vh 366
[0492]
[0493]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0494]
seq id no:111-具有臼突变的pd1-hc-scfv-vh/vl362
[0495][0496]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0497]
seq id no:112-具有臼突变的pd1-hc-scfv-vl/vh 362
[0498][0499]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0500]
seq id no:113-具有臼突变的il-2rβecd-fc-scfv-vh/vl 366
[0501][0502]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0503]
seq id no:114-具有臼突变的il-2rβecd-fc-scfv-vl/vh 366
[0504][0505]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0506]
seq id no:115-具有臼突变的il-2rβecd-fc-scfv-vh/vl 362
[0507][0508]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0509]
seq id no:116-具有臼突变的il-2rβecd il-2rβecd-fc-scfv-vl/vh 362
[0510][0511]
；其中n＝1、2、3、4或5。
[0512]
seq id no:117pd1-hc-il21wt
[0513][0514]
seq id no:118pd1-hc-il21wt-可切割的接头-scfv
[0515][0516]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5
[0517]
seq id no:119pd1-hc-il21wt-可切割的接头-il21r-ecd
[0518][0519]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5
[0520]
seq id no:120pd1-hc-可切割的接头-il21rα-可切割的接头-scfv
[0521][0522]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5
[0523]
seq id no:121pd1-hc-可切割的接头-scfv-可切割的接头-il21rα
[0524][0525]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5；n3＝1、2、3、4或5；n4＝1、2、3、4或5。
[0526]
seq id no:122pd1-hc-可切割的接头-il21rα
[0527][0528]
seq id no:123pd1-hc-可切割的接头-scfv
[0529][0530]
seq id no:124pd1-hc-可切割的接头-il21rα-可切割的接头-scfv
[0531][0532]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5
[0533]
seq id no:125pd1-hc-可切割的接头-scfv-可切割的接头-il21rα
[0534][0535]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5；n3＝1、2、3、4或5；n4＝1、2、3、4或5。
[0536]
seq id no:126pd1-hc-可切割的接头-il21rα
[0537][0538]
seq id no:127pd1-hc-可切割的接头-scfv
[0539][0540]
seq id no:128-il-21受体ecd(来源：uniprot.org/uniprot/q9hbe5)
[0541][0542]
seq id no:129pd1-hc-il-21k73a
[0543][0544]
seq id no:130-pd1抗体-hc-不可切割的接头-抗il-21的scfv
[0545][0546]
seq id no:131pd1抗体-hc-可切割的接头-scfv
[0547][0548]
；其中n1＝1、2、3、4或5；n2＝1、2、3、4或5
[0549]
seq id no:132
[0550]
ggggsggggs aaggggsggg gs
[0551]
seq id no:133pd1抗体hc-il21臼-scfv-lvhv
[0552]
[0553]
seq id no:134pd1抗体hc臼
[0554][0555]
seq id no:135pd1抗体hc-杵-hil21v1(r9e，r76a)
[0556]