技术特征：
1.合成具有预定序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供具有游离3'-羟基的起始子；和b)重复以下循环：(i)在延长条件下使具有游离3'-o-羟基的起始子或延长的片段与3'-o-封闭的核苷三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)变体接触，使得通过掺入3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长起始子或延长的片段以形成3'-o-封闭的延长的片段，和(ii)解封闭所述延长的片段以形成具有游离3'-羟基的延长的片段，直至合成多核苷酸，其中第一tdt变体用选自第一组3'-o-封闭的核苷三磷酸延长起始子或延长的片段，以及不同于第一tdt变体的第二tdt变体用选自第二组3'-o-封闭的核苷三磷酸的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长起始子或延长的片段，并且其中所述第一tdt变体以比所述第二tdt变体更高的效率用来自所述第一组的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，并且所述第二tdt变体以比所述第一tdt变体更高的效率用来自所述第二组的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段。2.如权利要求1所述的方法，其中不同于所述第一tdt变体和所述第二tdt变体的第三tdt变体用选自第三组3'-o-封闭的核苷三磷酸的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，并且其中所述第一tdt变体以比所述第二tdt变体或第三tdt变体更高的效率用来自所述第一组的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，第二tdt变体以比第一tdt变体或第三tdt变体更高的效率用来自第二组的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段，以及第三tdt变体以比第一tdt变体或第二tdt变体更高的效率用来自第三组的3'-o-封闭的核苷三磷酸来延长所述起始子或延长的片段。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一组包含3'-o-封闭的脱氧腺苷三磷酸、3'-o-封闭的脱氧胞苷三磷酸和3'-o-封闭的脱氧胸苷三磷酸，并且所述第一tdt变体包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含以下取代组合：a17v+l52f+g57e+m63r+a108v+k147r+c173g+r207l+m210q++r325v+e328k+n345e+r351k。4.如权利要求3所述的方法，其中所述第一tdt变体包含以下取代组合：a17v+q37e+d41r+l52f+g57e+m63r+s94r+g98e+a108v+s146e+k147r+q149r+c173g+m184t+r207l+k209h+m210q+g284l+e289a+r325v+e328k+n345e+r351k。5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第二组包含3'-o-封闭的脱氧鸟苷三磷酸，以及所述第二tdt变体包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且包含以下取代组合：a17v+l52f+g57e+m63r+i76v+a108v+c173g+r207l+f259e+q261r+k265g+r325v+e328n+r351k。6.如权利要求5所述的方法，其中所述第二tdt变体具有以下取代组合：a17v+q37e+d41r+l52f+g57e+m63r+i76v+s94r+g98e+a108v+s146e+q149r+c173g+m184t+r207l+k209h+f259e+q261r+k265g+g284l+e289a+r325v+e328n+r351k。7.末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)，其包含与seq id no:1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列，并且(ii)与seq id no:1相比，具有以下取代组合：a17v+l52f+g57e+m63r+a108v+k147r+c173g+r207l+m210q+r325v+e328k+n345e+r351k。8.如权利要求7所述的tdt，其与seq id no:1相比，包含以下取代组合：a17v+q37e+d41r+l52f+g57e+m63r+s94r+g98e+a108v+s146e+k147r+q149r+c173g+m184t+r207l+k209h
+m210q+g284l+e289a+r325v+e328k+n345e+r351k。9.末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)，其包含与seq id no:1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、99％同一性的氨基酸序列，并且(ii)与seq id no:1相比，具有以下取代组合：a17v+l52f+g57e+m63r+i76v+a108v+c173g+r207l+f259e+q261r+k265g+r325v+e328n+r351k。10.如权利要求9所述的tdt，其与seq id no:1相比，包含以下取代组合：a17v+q37e+d41r+l52f+g57e+m63r+i76v+s94r+g98e+a108v+s146e+q149r+c173g+m184t+r207l+k209h+f259e+q261r+k265g+g284l+e289a+r325v+e328n+r351k。11.用于实施合成具有预定序列的多核苷酸的方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含-根据权利要求7或8的第一tdt变体，-根据权利要求9或10的第二tdt变体，以及-第一组和第二组3'-o-封闭的核苷三磷酸，其中所述dntp是不重叠的。12.如权利要求11所述的试剂盒，其中第一组dntp包含3'-o-封闭的脱氧腺苷三磷酸、3'-o-封闭的脱氧胞苷三磷酸和3'-o-封闭的脱氧胸苷三磷酸，以及第二组包含3'-o-封闭的脱氧鸟苷三磷酸。
技术总结
本发明涉及多核苷酸的酶促无模板合成的组合物和方法，其中使用不同的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体将不同的3'-O-可逆封闭的脱氧核苷三磷酸(dNTP)掺入到生长链中。部分地，本发明认识和理解到，可以设计不同的TdT变体，以比单一“通用”TdT变体更高的效率优先掺入特异性dNTP，所述单一“通用”TdT变体用于掺入所有四种3'-O-可逆封闭的dNTP。可逆封闭的dNTP。
技术研发人员：伊莉斯
受保护的技术使用者：DNA斯克瑞普特公司
技术研发日：2020.11.09
技术公布日：2022/7/15