CLEC12A抗体片段序列和方法

clec12a抗体片段序列和方法
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1.821(c)要求的纸件副本和
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技术实现要素：

3.在一个方面，本公开内容描述了抗-clec12a多肽。所述抗-clec12a多肽具有这样的氨基酸序列，其与seq id no:14具有至少90%氨基酸相似性。
4.在某些实施方案中，所述抗-clec12a多肽包括seq id no:1的氨基酸序列、seq id no:2的氨基酸序列、seq id no:3的氨基酸序列、seq id no:4的氨基酸序列、seq id no:5的氨基酸序列、seq id no:6的氨基酸序列、seq id no:7的氨基酸序列、seq id no:8的氨基酸序列、seq id no:9的氨基酸序列、seq id no:10的氨基酸序列、seq id no:11的氨基酸序列、seq id no:12的氨基酸序列或seq id no:13的氨基酸序列。
5.在某些实施方案中，所述抗-clec12a多肽包括seq id no:29的氨基酸序列、seq id no:30的氨基酸序列和seq id no:31的氨基酸序列。
6.在某些实施方案中，抗-clec12a多肽可以掺入抗-clec12a生物制品中。在这些实施方案中的一些中，所述抗-clec12a生物制品可以是双特异性的杀伤细胞衔接分子(bike, bi-specific killer engager molecule)、三特异性的杀伤细胞衔接分子(trike)、四特异性的杀伤细胞衔接分子(tetrake)、五特异性的杀伤细胞衔接分子(pentake)、双特异性的t细胞衔接分子(bite)、三特异性的t细胞衔接分子(trite)、四特异性的t细胞衔接分子(tetrate)、五特异性的t细胞衔接分子(pentate)、嵌合抗原受体、完整抗体、抗体-药物缀合物(adc)分子、靶向递送构建体或标记构建体。
7.在某些实施方案中，所述抗-clec12a生物制品可以与药学上可接受的载体组合以形成药物组合物。
8.以上发明内容无意描述本发明的每个公开的实施方案或每个实施方式。下面的描述更具体地举例说明了示例性实施方案。在贯穿本技术的几个地方，通过实例的列表提供了指导，所述实例可以以各种组合使用。在每种情况下，所列举的列表仅用作代表组，且不应被解释为排他性列表。
附图说明
9.图1. 通过噬菌体展示鉴定的13种独特抗-clec12a抗体变体克隆(seq id no:1-13)与抗-clec12a抗体共有序列(seq id no:14)的氨基酸序列比对。cdr1、cdr2和cdr3序列
标有下划线。
10.图2. 用于筛选的his-标记的人clec12a细胞外结构域的sds-page。
11.图3. 使用pbmc对含有人源化骆驼科(hucam)抗-clec12a抗体片段的双特异性化合物进行功能筛选。在含有不同克隆的指定双特异性化合物(seq id no:1-13)存在下，将外周血单核细胞(pbmc)与表达clec12a的早幼粒细胞性白血病细胞系hl60一起温育。将含有抗-clec12a scfv且已知靶向clec12a的三特异性化合物(seq id no:15)用作阳性对照，而无处理(nt)用作阴性对照。培养5小时以后，将细胞收获，进行表面抗原染色，固定，渗透化处理，并进行细胞内干扰素γ(ifnγ)染色。在流式细胞仪上运行细胞并通过评价cd56
+
cd3
‑ꢀ
nk细胞的去粒(cd107a)来测量nk细胞活化。
12.图4. 使用pbmc对含有人源化骆驼科(hucam)抗-clec12a抗体片段的双特异性化合物进行功能筛选。在含有不同克隆的指定双特异性化合物(seq id no:1-13)存在下，将外周血单核细胞(pbmc)与表达clec12a的早幼粒细胞性白血病细胞系hl60一起温育。将含有抗-clec12a scfv且已知靶向clec12a的三特异性化合物(seq id no:15)用作阳性对照，而无处理(nt)用作阴性对照。培养5小时以后，将细胞收获，进行表面抗原染色，固定，渗透化处理，并进行细胞内干扰素γ(ifnγ)染色。在流式细胞仪上运行细胞并通过评价cd56
+
cd3
‑ꢀ
nk细胞的ifnγ生产来测量nk细胞活化。
13.图5. 含有人源化骆驼科(hucam)抗-clec12a克隆33的双特异性化合物的评价。为了确定由克隆33双特异性化合物介导的背景活化，将富集的nk细胞与含有抗-clec12a克隆33(克隆33 hucam衔接物)的双特异性化合物、clec12a三特异性化合物(seq id no:15；scfv衔接物)或无化合物(nt)一起温育5小时。通过流式细胞计量术测量nk细胞去粒(cd107a，左)和细胞因子生产(ifnγ，右)。尽管scfv显示出在去粒方面的一些背景活化，但克隆33没有，突出了更好的特异性。
14.图6. 含有人源化骆驼科(hucam)抗-clec12a克隆33的双特异性化合物的评价。为了确定由含有抗-clec12a克隆33的双特异性化合物介导的针对表达clec12的靶标的活化，将富集的nk细胞与hl60细胞和含有抗-clec12a克隆33 (克隆33 hucam衔接物)的双特异性化合物(seq id no:34)、clec12a三特异性化合物(seq id no:15；scfv衔接物)或无化合物(nt)一起温育5小时。通过流式细胞计量术测量nk细胞去粒(cd107a，左)和细胞因子生产(ifnγ，右)。含有克隆33的三特异性化合物针对hl60靶标诱导nk细胞去粒，并诱导与含有scfv的阳性对照相同量的细胞因子生产。
15.图7. 含有人源化骆驼科(hucam)抗-clec12a克隆33的双特异性化合物的评价。为了确定由含有抗-clec12a克隆33的双特异性化合物介导的针对clec12阴性靶标的活化(非特异性活化)，将富集的nk细胞与raji (伯基特淋巴瘤)细胞和含有抗-clec12a克隆33 (克隆33 hucam衔接物)的双特异性化合物(seq id no:34)、clec12a三特异性化合物(seq id no:15；scfv衔接物)或无化合物(nt)一起温育5小时。通过流式细胞计量术测量nk细胞去粒(cd107a，左)和细胞因子生产(ifnγ，右)。与含有抗-clec12a scfv的三特异性化合物相比，含有克隆33的双特异性化合物针对clec12a阴性靶标诱导更少的非特异性去粒。
16.图8. 克隆33的结合特异性的评价。(a)含有克隆33的双特异性化合物(seq id no:34)和含有抗-clec12a scfv的三特异性化合物(seq id no:15)对clec12a
+ hl60细胞的结合。(b)含有克隆33的双特异性化合物(seq id no:34)和含有抗-clec12a scfv的三特
异性化合物(seq id no:15)对clec12a-阴性的raji细胞的结合。
具体实施方式
17.c-型凝集素结构域家族12成员a (clec12a)是人类中由clec12a基因编码的蛋白。clec12a是c-型凝集素/c-型凝集素-样结构域(ctl/ctld)超家族的一个成员。clec12a是一种抑制性的c-型凝集素-样受体。它在其细胞质尾巴中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)，该基序可以与信号传递磷酸酶例如shp-1和shp-2结合。
18.人clec12a是主要在髓系细胞例如粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞上表达的单体。clec12a是用于治疗髓系恶性肿瘤（例如急性髓样白血病(aml)或骨髓增生异常综合征(mds)）的免疫疗法的靶标，因为clec12a在大多数髓母细胞和白血病干细胞(lsc)髓系细胞上表达，但不在正常造血干细胞或正常组织的细胞上表达。
19.对人clec12进行噬菌体展示单结构域抗体(sdab)文库筛选。使用预制备的人clec12a的单结构域抗体文库进行了三轮文库淘选。如在图2中所示，sds-page结果表明重组人clec12a蛋白具有高质量。然后进行生物淘选以富集对目标人clec12a的特异性结合剂。如在表1中所示，经过三轮文库筛选，观察到对人clec12a的强富集效果，且在靶筛选组与无包被对照组之间发现了明显差异。
20.表1轮输入输出富集因子12.00
×
10
11
5.84
×
1043.42
×
1062-p2.44
×
10
11
2.13
×
1051.15
×
1062-n3.05
×
10
10
2.02
×
1031.51
×
1073-p2.54
×
10
11
4.51
×
1075.63
×
1033-n3.18
×
10
10
2.40
×
1031.33
×
107从第3轮-p洗出液选出96个克隆并进行单克隆噬菌体elisa。鉴定出82个阳性克隆并进行dna测序。77个克隆被成功测序，并发现13个独特序列(seq id no:1-13)。比对13个独特序列，从而产生共有序列(seq id no:14)并鉴定互补性决定区（cdr），如在图1中所示。
21.测序后，将13个独特序列克隆进可溶性vhh-ap表达载体中，并进行可溶性表达和可溶性elisa。如表2所示，所有13个克隆均与人clec12a阳性结合。
22.表2
ꢀ‑ꢀ
单克隆噬菌体elisa
图3和图4显示了使用pbmc对人源化骆驼科(hucam)抗-clec12a克隆的功能筛选。将人源化抗-clec12a骆驼科克隆变体(seq id no:1-13)作为靶向结构域克隆到含有骆驼科抗-cd16和接头的双特异性主链中。这些双特异性化合物通过在nk细胞（通过cd16的结合）和肿瘤细胞（通过clec12a的结合）之间细胞裂解桥的形成来活化天然杀伤(nk)细胞。先前试验并证实通过单链可变片段(scfv)靶向clec12a的三特异性的杀伤细胞衔接物(seq id no:15)用作阳性对照。数据显示，克隆33显示出最高活性。一些克隆以更小的量产生，并因此在比scfv (三特异性的阳性对照)或克隆33双特异性化合物更低的浓度进行试验。因
toxicity)的可能性小得多。clec12a也在白血病干细胞中表达。因此，靶向clec12a可以限制复发的可能性和/或严重程度。由于sdab比scfv更稳定，本文描述的抗-clec12a多肽还可以提供优于scfv的形成构建体（例如，bike、trike、bite、car等）的优点。最后，本文描述的抗-clec12a序列均来自人源化文库，并因此不太可能在人患者中被排斥。
28.本公开内容描述了抗-clec12a多肽。示例性的抗-clec12a多肽包括这样的多肽，其包括seq id no:1-14或seq id no:29-31中任一个的氨基酸序列，或在结构上与其类似，或是其功能变体。seq id no:1-13是通过噬菌体展示筛选选择的变体单结构域抗体序列，因为它们特异性结合clec12a。seq id no:14是源自seq id no:1-13的比对分析(图1)的共有序列。seq id no：29是cdr1的共有序列，如从图1所示的比对分析确定的。seq id no：30是cdr2的共有序列，如从图1所示的比对分析确定的。seq id no：31是cdr3的共有序列，如从图1所示的比对分析确定的。
29.如本文中使用的，如果抗-clec12a多肽的氨基酸序列与参考多肽相比具有指定量的同一性，则抗-clec12a多肽与参考多肽“在结构上相似”或是参考多肽的“功能变体”。如果“功能片段”氨基酸序列含有少于参考氨基酸序列的全长氨基酸序列，则所述氨基酸序列是参考氨基酸序列的“功能片段”。与参考氨基酸序列相比，“功能片段”可以进一步具有指定量的序列同一性或序列特异性。
30.通过比对两个多肽（例如，候选抗-clec12a多肽和例如seq id no:1-14或seq id no:29-31中的任一个的多肽）的氨基酸残基以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数目，可以确定两个多肽的结构相似性和/或序列同一性。为了优化相同氨基酸的数目，在进行比对时允许在任一个或两个序列中的空位，尽管在每个序列中的氨基酸必须保持其适当顺序。候选抗-clec12a多肽是与参考多肽(例如，seq id no:1-14或seq id no:29-31中的任一个)进行对比的多肽。候选多肽可以例如从动物分离，或可以使用重组技术产生，或化学地或酶促地合成。
31.可以使用gcg包(10.2版, madison wi)中的bestfit算法进行氨基酸序列的成对对比分析。可替换地，可以使用blast 2搜索算法的blastp程序对比多肽，如tatiana等人, (fems microbiol lett, 174, 247-250 (1999))所述，并且可在国家生物技术信息中心(ncbi)网站上得到。可以使用所有blast 2搜索参数的默认值，包括矩阵= blosum62；开放空位罚分= 11，延伸空位罚分= 1，空位x_落下(dropoff)= 50，预期= 10，字长= 3，和过滤器开启。
32.在对比两个氨基酸序列时，结构相似性可以用“同一性”百分比来表示，或可以用“相似性”百分比来表示。“同一性”表示相同氨基酸的存在。“相似性”表示不仅存在相同的氨基酸，而且存在保守置换。抗-clec12a多肽中氨基酸的保守置换可以选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，在蛋白生物化学领域中众所周知，属于具有特定大小或特性（诸如电荷、疏水性和亲水性）的氨基酸组的氨基酸可以置换另一种氨基酸而不改变蛋白的活性，尤其是在与生物活性不直接相关的蛋白区域中。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的（碱性的）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的（酸性的）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守置换包括、例如，lys置换arg，反之亦然，以维持正电荷；glu置换asp，反之亦然，以维持负
电荷；ser置换thr，从而维持游离-oh；和gln置换asn以维持游离-nh2。同样地，还考虑了多肽的生物活性类似物，其含有不消除多肽的功能活性的一个或多个连续或非连续氨基酸的缺失或添加。
33.在某些实施方案中，如本文中所述的抗-clec12a多肽可以包括与参考氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% 氨基酸序列相似性的多肽。
34.在某些实施方案中，如本文中所述的抗-clec12a多肽可以包括与参考氨基酸序列的至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% 氨基酸序列同一性。
35.在某些实施方案中，如本文中所述的抗-clec12a多肽还可以设计为提供额外的序列，例如，向抗-clec12a多肽的c-端或n-端的氨基酸添加。这样的额外氨基酸可以包括例如信号序列(例如，seq id no:32)或通过将标记的抗-clec12a多肽捕获在柱上或通过使用抗体来促进纯化的标签。示例性标签包括，例如，允许在镍柱上纯化多肽的富含组氨酸的标签(例如，seq id no:33)。
36.本公开内容还描述了编码抗-clec12a多肽的多核苷酸。编码抗-clec12a多肽的示例性多核苷酸包括包含seq id no:16-28中任一个的核苷酸序列的多核苷酸。但是，seq id no:16-28仅仅是示例性的。由于遗传密码是众所周知的，因此本公开内容描述了编码如本文中所述的抗-clec12a多肽的任何多核苷酸。
37.如本文中所述的抗-clec12a多肽可以掺入生物制品中，然后将其与药学上可接受的载体一起配制。本文中使用的“抗-clec12a生物制品”是包括抗-clec12a多肽的生物化合物。抗-clec12a生物制品可能包括额外的功能部分，取决于生物制品的基本结构平台（例如，bike、trike、car等）。本文中使用的“载体”包括任何溶剂、分散介质、媒介物、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和/或抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等。这样的介质和/或试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除了任何常规介质或试剂与活性成分不相容外，预见到其在治疗组合物中的应用。补充性活性成分也可以掺入组合物中。本文中使用的“药学上可接受的”表示在生物学上或在其它方面不是不合需要的材料，即该材料可以与抗-clec12a生物制品一起施用给个体，而不造成任何不希望的生物学效应或不以有害方式与包含该材料的药物组合物的任何其它组分相互作用。
38.因此，可以将抗-clec12a生物制品配制成药物组合物。可以将所述药物组合物配制成适合优选施用途径的多种形式。因此，可以通过已知途径施用组合物，包括例如口服、胃肠外(例如，真皮内、经皮、皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内等)或局部(例如，鼻内、肺内、乳房内、阴道内、子宫内、真皮内、经皮、直肠等)。可以将药物组合物施用至粘膜表面，诸如通过施用至例如鼻或呼吸道粘膜(例如，通过喷雾剂或气雾剂)。也可以通过持续或延迟释放来施用组合物。
39.因此，抗-clec12a生物制品可以以任何合适的形式提供，包括但不限于溶液、悬浮液、乳剂、喷雾剂、气雾剂或混合物的任何形式。所述组合物可以与任何药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物一起在制剂中递送。例如，可以在常规的局部剂型中递送制剂，例如乳膏剂、软膏剂、气雾剂制剂、非气溶胶喷雾剂、凝胶、洗剂等。所述制剂可以进一步包括一种或多种添加剂，包括例如助剂、皮肤穿透促进剂、着色剂、香料、调味剂、湿润剂、增稠剂等。
40.制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域众所周知的方法制备。用药学上可接受的载体制备组合物的方法包括使抗-clec12a生物制品与构成一种或多种助剂的载体结合的步骤。一般而言，可以如下制备制剂：使活性化合物与液体载体、精细粉碎的固体载体或二者均匀地和/或紧密地结合，并然后，如果必要的话，将产品成型为期望的制剂。
41.因而，在另一个方面，本公开内容描述了一种治疗其中靶向过表达clec12a的细胞具有治疗益处的任何病症的方法。在许多实施方案中，所述病症可以是髓系恶性肿瘤。但是，在其它实施方案中，所述病症可以是自身免疫病症——例如，其中髓系细胞浸润中枢神经系统的病症。通常，所述方法包括向所述受试者施用对治疗该病症有效量的抗-clec12a生物制品。“治疗”或其变体表示在任何程度上减少与病症相关的症状或征象，限制与病症相关的症状或征象的进展，改善或消退与病症相关的症状或征象。本文中使用的“改善”表示特定病症特有的症状或临床征象的程度、严重程度、频率和/或可能性的任何降低；“症状”表示疾病或患者状况的任何主观证据；且“征象”或“临床征象”表示与患者以外的其它人能够发现的特定状况相关的客观身体发现。
[0042]“治疗”可以是治疗性的或预防性的。“治疗性的”及其变体表示改善与病症相关的一种或多种现有症状或临床征象的治疗。“预防性的”及其变体表示在任何程度上限制病症的症状或临床征象的发展和/或出现的治疗。通常，“治疗性的”治疗是在受试者出现病症后开始，而“预防性的”治疗是在受试者出现病症之前开始。因此，在某些实施方案中，所述方法可以涉及对处于发生病症的风险中的受试者进行预防性治疗。“处于风险中”表示可能实际上具有或可能实际上没有所述风险的受试者。因此，例如，与缺乏一种或多种标志的个体相比，具有发生特定病症的“风险”的受试者是具有一种或多种标志的受试者，所述标志指示增加的具有或发生特定病症的风险，无论受试者是否表现出具有或发生该病症的任何症状或临床征象。病症的示例性标志可以包括例如遗传倾向、血统、年龄、性别、地理位置、生活方式或医疗史。在症状已经消退后也可以继续治疗，例如预防或延迟其复发。
[0043]
在某些实施方案中，“预防性的”治疗还包括在复发情况下的治疗。换而言之，受试者可能曾经表现出病症的症状或临床征象，但接受了成功的治疗，从而认为该病症处于缓解中。这样的受试者在缓解时可能不再表现出病症的症状或临床征象，而是处于复发的“风险”中。在这种情况下，包括抗-clec12a生物制品的治疗可能被认为是“预防性的”，以降低复发的可能性和/或严重程度。
[0044]
因此，可以在受试者首次表现出病症的症状或临床征象之前、期间或之后将抗-clec12a生物制品施用给受试者。在受试者首次表现出与该病症相关的症状或临床征象之前开始的治疗可能导致与未施用抗-clec12a生物制品的受试者相比降低受试者经历该病症的临床证据的可能性，降低病症的症状和/或临床征象的严重程度，和/或完全消退病症。在受试者首次表现出与病症复发相关的症状或临床征象之前开始的治疗可能导致与未施用抗-clec12a生物制品的受试者相比降低受试者经历复发临床证据的可能性，降低复发的症状和/或临床征象的严重程度，和/或完全消退病症。在受试者表现出与病症相关的症状或临床征象的同时开始的治疗可能导致与未施用抗-clec12a生物制品的受试者相比降低病症的症状和/或临床征象的严重程度，和/或完全消退病症。
[0045]
施用的抗-clec12a生物制品的量可以根据各种因素而变化，包括但不限于所施用
的特定抗-clec12a生物制品，受试者的体重、身体状况和/或年龄，和/或施用途径。因此，被包含在给定单位剂型中的抗-clec12a生物制品的绝对重量可以宽泛变化，并且取决于因素诸如受试者的物种、年龄、体重和身体状况和/或施用方法。因此，一般性地列出构成对所有可能应用有效的量的抗-clec12a生物制品的量是不切实际的。但是，本领域普通技术人员在适当考虑这样的因素的情况下可以容易地确定合适的量。
[0046]
在某些实施方案中，所述方法可以包括施用足够的抗-clec12a生物制品以给受试者提供例如从约100 ng/kg/天至约50 mg/kg/天的剂量，尽管在某些实施方案中，可以通过以超出此范围的剂量施用抗-clec12a生物制品来执行所述方法。
[0047]
在某些实施方案中，所述方法可以包括施用足够的抗-clec12a生物制品以提供至少100 ng/kg/天的最小剂量，例如至少1 μg/kg/天、至少5 μg/kg/天、至少10 μg/kg/天、至少25 μg/kg/天、至少50 μg/kg/天、至少100 μg/kg/天、至少200 μg/kg/天、至少300 μg/kg/天、至少400 μg/kg/天、至少500 μg/kg/天、至少600 μg/kg/天、至少700 μg/kg/天、至少800 μg/kg/天、至少900 μg/kg/天或至少1 mg/kg/天。
[0048]
在某些实施方案中，所述方法包括施用足够的抗-clec12a生物制品以提供不超过10 mg/kg/天的最大剂量，例如不超过5 mg/kg/天、不超过4 mg/kg/天、不超过3 mg/kg/天、不超过2 mg/kg/天、不超过1 mg/kg/天、不超过900 μg/kg/天、不超过800 μg/kg/天、不超过700 μg/kg/天、不超过600 μg/kg/天、不超过500 μg/kg/天、不超过400 μg/kg/天、不超过300 μg/kg/天、不超过200 μg/kg/天、不超过100 μg/kg/天、不超过90 μg/kg/天、不超过80 μg/kg/天、不超过70 μg/kg/天、不超过60 μg/kg/天、不超过50 μg/kg/天、不超过40 μg/kg/天、不超过30 μg/kg/天、不超过20 μg/kg/天或不超过10 μg/kg/天。当抗-clec12a生物制品并非不存在但以至多且包括指定量的量存在时，抗-clec12a生物制品提供“不大于”指定量的剂量。
[0049]
在某些实施方案中，所述方法包括施用足够的抗-clec12a生物制品以提供特征在于一定范围的剂量，所述范围具有由以上确定的任何最小剂量和大于所选最小剂量的任何最大剂量限定的端点。例如，在某些实施方案中，所述方法可以包括施用足够的抗-clec12a生物制品以给受试者提供从约10
µ
g/kg/天至约10 mg/kg/天的剂量，从约100 μg/kg/天至约1 mg/kg/天的剂量，从5 μg/kg/天至100 μg/kg/天的剂量，等。
[0050]
在某些实施方案中，所述方法包括施用足够的抗-clec12a生物制品以提供等于上面列出的任何最小剂量或任何最大剂量的剂量。因而，例如，在某些实施方案中，所述方法可以包括施用足够的抗-clec12a生物制品以提供1 μg/kg/天、5
µ
g/kg/天、10
µ
g/kg/天、25
µ
g/kg/天、50
µ
g/kg/天、100
µ
g/kg/天、200
µ
g/kg/天、500
µ
g/kg/天、1 mg/kg/天、5 mg/kg/天等的剂量。
[0051]
在某些实施方案中，可以施用抗-clec12a生物制品，例如，每周从单剂量至多剂量，尽管在某些实施方案中，可以通过以超出该范围的频率施用抗-clec12a生物制品，执行所述方法。在某些实施方案中，可以从大约每月一次到大约每周五次施用抗-clec12a生物制品。在某些实施方案中，以4天治疗和3天休息的7天周期施用以上指示的剂量，其描述为在24-小时时段内施用的抗-clec12a生物制品的量。
[0052]
在某些实施方案中，可以施用抗-clec12a生物制品，例如，从单剂量到多个治疗周期，尽管在某些实施方案中，可以通过在超出该范围的持续时间内施用抗-clec12a生物制
品，执行所述方法。在某些实施方案中，可以施用抗-clec12a生物制品三周。在这样的实施方案中，每周可以是一个治疗周期，诸如前段中描述的示例性治疗周期。在其它实施方案中，可以施用抗-clec12a生物制品持续更大数目的治疗周期，在一组治疗周期和随后的一组治疗周期之间没有间隙。一组治疗周期和随后的一组治疗周期之间的间隙可以是一周或多周、一个月或多个月、或一年或多年的间隙。
[0053]
在某些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种另外的治疗剂。可以在施用抗-clec12a生物制品之前、之后和/或同时施用一种或多种另外的治疗剂（例如，化学治疗剂）。可以共同施用抗-clec12a生物制品和另外的治疗剂。本文中使用的“共同施用”表示施用的组合的两种或更多种组分，使得组合的治疗或预防效果可以大于单独施用的任一种组分的治疗或预防效果。两种组分可以同时或依次共同施用。可以在一种或多种药物组合物中提供同时共同施用的组分。两种或多种组分的依次共同施用包括这样的情况，其中施用组分使得每种组分可以同时存在于治疗部位。可替换地，两种组分的依次共同施用可以包括这样的情况，其中至少一种组分已经从治疗部位清除，但是施用所述组分的至少一种细胞效应（例如，细胞因子产生、特定细胞群的活化等）在治疗部位持续存在，直到将一种或多种另外组分施用至治疗部位。因此，在某些情况下，共同施用的组合可以包括彼此之间永远不会一起存在于化学混合物中的组分。在其它实施方案中，抗-clec12a生物制品和另外的治疗剂可以作为混合物或混合液的一部分施用。在某些方面，与单独施用一种或多种其它治疗剂相比，抗-clec12a生物制品的施用可以允许更低剂量的其它治疗方式的有效性，从而降低当施用更高剂量的其它一种或多种治疗剂时观察到的毒性的可能性、严重程度和/或程度。
[0054]
示例性的另外的治疗剂包括六甲蜜胺、安吖啶、l-天门冬酰胺酶、门冬酰胺酶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、环磷酰胺(cytophosphane)、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、福莫司汀、更昔洛韦、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、美法仑、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、丝裂霉素c、尼莫司汀、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、丙卡巴肼、雷替曲塞、替莫唑胺、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
[0055]
在前面的描述和所附的权利要求中，术语“和/或”是指一个或所有列出的要素或任何两个或更多个列出的要素的组合；术语“包括”、“包含”及其变体应被解释为开放式的—即，另外的要素或步骤是任选的，并且可能存在或可能不存在；除非另外指出，否则“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个/种”可互换使用，并且是指一个/种或超过一个/种；并且通过端点对数值范围的列举包括被包含在该范围内的所有数字（例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。
[0056]
在前面的描述中，为了清楚起见，可以单独描述特定实施方案。除非另外明确规定特定实施方案的特征与另一个实施方案的特征不相容，否则某些实施方案可以包括本文结合一个或多个实施方案描述的相容特征的组合。
[0057]
对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，可以以任何可行的顺序执行所述步骤。并且，视情况而定，可以同时进行两个或更多个步骤的任意组合。
实施例
[0058]
cd16-hucamclec12a双特异性化合物(seq id no:34)的构建如前所述，使用pcr和hifi克隆技术合成编码cd16-hucamclec12a双特异性化合物的构建体(vallera等人, 2016, clin cancer res 22:3440-3450)。每个完全组装的片段包括ecori限制位点、atg起始密码子、人源化骆驼科抗-cd16 sdab的编码序列(vincke等人, 2007, protein eng des sel 21:1-10)、hucamclec12a sdab的编码序列(seq id no:16-28之一)、以及编码10x his标签的序列。将组装的片段克隆进minicircle dna载体(system biosciences, llc, palo alto, ca)中，其在cmv启动子的控制下。验证dna序列以确认基因插入的序列和位置(biomedical genomics center, university of minnesota, minneapolis, mn)。
[0059]
cd16-hucamclec12a三特异性化合物(seq id no:35)的构建如前所述，使用pcr和hifi克隆技术合成编码cd16-hucamclec12a三特异性化合物的构建体(vallera等人, 2016, clin cancer res 22:3440-3450)。每个完全组装的片段包括ecori限制位点、atg起始密码子、人源化骆驼科抗-cd16 sdab的编码序列(vincke等人, 2007, protein eng des sel 21:1-10)、接头、人il-15片段的编码序列（seq id no:35的氨基酸162-175）、whitlow氨基酸接头(gstsgsgkpgsgegstkg；seq id no:36)的编码序列、hucamclec12a sdab的编码序列（seq id no:16-28之一)，以及编码10x his标签的序列。将组装的片段克隆进minicircle dna载体(system biosciences, llc, palo alto, ca)中，其在cmv启动子的控制下。验证dna序列以确认基因插入的序列和位置(biomedical genomics center, university of minnesota, minneapolis, mn)。
[0060]
cd16-hucamclec12a双特异性化合物和cd16-hucamclec12a三特异性化合物的生产和分离根据生产商的方案，将所有克隆的质粒转染进expi293细胞(thermo fisher scientific, inc., waltham, ma)中。收集上清液，并使用hispur钴树脂(thermo fisher scientific, inc., waltham, ma)和pierce离心柱(thermo fisher scientific, inc., waltham, ma)纯化蛋白。使用250 mm咪唑溶液洗脱蛋白，并使用预包装的一次用弃的pd-10柱(ge healthcare systems, chicago, il)脱盐。通过使用simply blue life stain (invitrogen, carlsbad, ca)运行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳来确定纯度和大小。
[0061]
癌细胞系(hl60和raji)从atcc获得hl60早幼粒细胞(atcc ccl-240, 美国典型培养物保藏中心, manassas, va)并用作clec12a表达系。也从atcc得到raji伯基特淋巴瘤淋巴母细胞(atcc ccl-86, 美国典型培养物保藏中心, manassas, va)并用作clec12a-阴性系。
[0062]
针对clec12a-阳性的hl60细胞使用pbmc对不同克隆的功能评价从纪念血库（memorial blood bank）(minneapolis, mn)获得健康供体血液，并使用密度梯度ficoll-paque (ge healthcare systems, chicago, il)进行处理以获得外周血单核细胞(pbmc)。如前所述，通过流式细胞计量术评估nk细胞功能(vallera等人, 2016, clin cancer res 22:3440-3450)。将pbmc、hl60细胞和处理剂(30 nm)共培养，并用fitc缀合的抗-cd107a (h4a3, biolegend, san diego, ca)染色。在添加抗-cd107a后一小时，给
细胞施用golgi stop和golgi plug (bd biosciences, san jose, ca)，并温育三小时。在温育结束时，将细胞用live/dead fixable aqua staining kit (thermo fisher scientific, inc., waltham, ma)、pe-cy7-缀合的抗-cd56、pe-cf594-缀合的抗-cd3和pe-缀合的抗-cd69 (fn50, biolegend, san diego, ca)染色，固定和渗透化处理。将渗透化处理的细胞用bv650缀合的ifnγ(4s.b3, biolegend, san diego, ca)染色，并通过流式细胞计量术评价表达。
[0063]
针对空白、clec12a-阳性的hl60细胞或clec12a-阴性的raji细胞使用nk细胞评价克隆33的功能特异性从纪念血库（memorial blood bank）(minneapolis, mn)获得健康供体血液，并使用密度梯度ficoll-paque (ge healthcare systems, chicago, il)进行处理以获得外周血单核细胞(pbmc)。将pbmc用于使用easysep人nk细胞富集试剂盒（stemcell technologies, inc., vancouver, bc）对nk细胞进行磁性富集。如前所述，通过流式细胞计量术评估nk细胞功能(vallera等人, 2016, clin cancer res 22:3440-3450)。将富集的nk细胞单独温育，与hl60细胞一起温育，或与raji细胞和指定的处理剂(30 nm)一起温育。将细胞和处理剂共培养，并用fitc缀合的抗-cd107a (h4a3, biolegend, san diego, ca)染色。在添加抗-cd107a后一小时，给细胞施用golgi stop和golgi plug (bd biosciences, san jose, ca)并温育三小时。在温育结束时，将细胞用live/dead fixable aqua staining kit (thermo fisher scientific, inc., waltham, ma)、pe-cy7-缀合的抗-cd56、pe-cf594-缀合的抗-cd3和pe-缀合的抗-cd69 (biolegend, san diego, ca)染色，固定和渗透化处理。将渗透化处理的细胞用bv650-缀合的ifnγ(biolegend, san diego, ca)染色，并通过流式细胞计量术评价表达。
[0064]
结合特异性的确定为了确定结合特异性，将30 nm的克隆33双特异性化合物或含有抗-clec12a scfv的三特异性化合物与clec12a-阳性的hl60细胞或clec12a-阴性的raji细胞一起在37℃温育30分钟。将细胞离心并洗涤两次。添加抗-his、藻红蛋白(pe)-标记的抗体(origene technologies, inc., rockville, md)，并在4℃与细胞一起温育20分钟。将细胞洗涤两次，用2% 低聚甲醛固定，并在流式细胞计上运行以评价与指定构建体结合的细胞百分比。
[0065]
在本文中引用的所有专利、专利申请和出版物的整个公开内容以及电子地可得到的材料(包括，例如，在例如genbank和refseq中提交的核苷酸序列，和在例如swissprot、pir、prf、pdb中提交的氨基酸序列，以及来自在genbank和refseq中的注解编码区的翻译)都通过引用整体并入。如果在本技术的公开内容与通过引用并入本文的任何文件的公开内容之间存在任何不一致，则以本技术的公开内容为准。前述详细描述和实施例仅仅为了理解清楚的目的而给出。从其中不应理解不必要的限制。本发明不限于显示的和描述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变体将被包括在由权利要求限定的发明内。
[0066]
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的所有表示组分量、分子量等的数字在所有情况下应理解为由术语“约”修饰。因此，除非另外相反指出，否则在说明书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的期望性能而变化。至少，而不是试图将等同原则限制在权利要求的范围内，每个数值参数应该至少根据记录的有效数字的个数且通过应用普通的舍入技术来解释。
[0067]
尽管阐述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是尽可能精确地报道具体实施例中给出的数值。但是，所有数值都固有地包含一个范围，该范围必然来自在它们各自的试验测量中发现的标准偏差。
[0068]
所有标题都是为了方便读者，并且不应该用来限制标题后面的文本的含义，除非另有说明。
[0069]
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