一种使用蛋白A亲和层析法纯化生物活性肽的方法与流程

一种使用蛋白a亲和层析法纯化生物活性肽的方法
技术领域
1.本发明涉及一种使用蛋白a亲和层析法纯化含有fc的生物活性肽的方法，更具体地，涉及利用根据包含在含有fc的生物活性肽中的人vh3结构域的数量差异引起的与蛋白a的结合力差异，从肽20混合物中高纯度纯化特定肽的方法。


背景技术：

2.为分离特定肽，使用多种纯化方法。例如，使用离子交换层析法、疏水层析法、尺寸排阻层析法、亲和层析法等。
3.然而，如果是相似结构的肽，等电点、疏水性(hydrophobicity)、大小差异和亲和力差异不大，通过一般的纯化方法难以获得高纯度的特定肽。在这种情况下，已知许多通过人为改变序列引起所需的特定肽与除了该特定肽之外可能产生的肽之间的等电点和亲和力差异，并将其用于纯化方法的方法。在这两种情况下，根据人为改变序列以提高等电点或亲和力的差异，特定肽的理化性质会发生改变，并且由此可诱发无法预料的免疫原性等。


技术实现要素：

4.技术问题
5.本发明的一个目的在于，提供一种通过亲和层析法从肽混合物或抗体混合物中高纯度纯化含有fc的生物活性肽或抗体的方法，其利用根据生物活性肽混合物中包含的含有fc生物活性肽的人vh3结构域的数量差异引起的蛋白a的结合力差异。更具体地，在亲和力或等电点特质的差异不大，但在vh3结构域数量方面存在差异的肽一起被制备的情况下，根据肽中包含的vh3结构域的数量，与全域(full domain)蛋白a的亲和力会不同，因此，本发明的一个目的在于，提供一种获得高纯度的所需的肽的方法，其通过亲和层析法将肽根据vh3结构域的数量分离，其中，所述亲和层析法利用vh3结构域数量不同的肽与全域蛋白a的亲和力差异。
6.特别地，本发明的一个目的在于，提供一种在制备不对称异二聚体(asymmetric heterodimer)蛋白质的过程中同时产生了不需要的对称同型二聚体(symmetric homodimer)的情况下，根据包含在各个蛋白质的vh3结构域的数量差异分离纯化不对称异二聚体蛋白质和对称同型二聚体蛋白质的方法。
7.技术方案
8.本发明中公开的每个描述和实施例也可适用于各个不同的描述和实施例。即，本发明中公开的各种要素的所有组合都属于本发明的范围。
9.此外，不能认为本发明的范围受以下具体描述的限制。
10.本说明书中的第一、第二等术语可以用于说明各种组成元件，但所述组成元件不应该受所述术语的限制。所述各个术语仅用于区分一个组成元件与其他组成元件的目的。例如，在不脱离本发明的权利范围的情况下，第一组成元件可以被命名为第二组成元件，类似地，第二组成元件也可以被命名为第一组成元件。除非上下文另有明确规定，否则单数表
达包含复数表达。
11.除非另有定义，否则本说明书中使用的所有术语(包含技术术语和科学术语)与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。此外，诸如在常用词典中定义的术语之类的术语应该被解释为具有与其在相关技术领域中上下文中的含义一致的含义，并且本文中明确地如此定义，除非以理想化或过度正式的意义来进行解释。
12.应该理解为，诸如“包含”或“含有”之类的术语旨在指定说明书中描述的特征、数字、步骤、操作、组成元件或其组合的存在，并不预先排除存在或添加一个或多个其他特征或数字、步骤、操作、组成元件或其组合的可能性。
[0013]“和/或”包含任何相关组成可以定义的一个或多个组合。
[0014]
本发明所用术语“生物活性肽”是一个包含表现一种或多种生物活性的肽、多肽、蛋白质、蛋白质的一部分和融合蛋白等的概念，并且不受特定分子量至氨基酸的长度、种类等的限制。
[0015]
本发明所用术语“含有fc的生物活性肽”是指包含抗体中发现的fc区(fragment crystallizable region，可结晶片段区)的生物活性肽。例如，所述含有fc的生物活性肽是包含含有fc区的抗体的物质。
[0016]
本发明可以提供一种从含有fc的生物活性肽混合物中分离和/或纯化含有fc的生物活性肽的方法。
[0017]
如本文所用，生物活性肽是指传递到生物体并调节生物体功能的肽，例如，调节激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体等的生物体功能的肽可以被定义为生物活性物质，例如，上述的肽可以是连接于fc的n-末端或c-末端的形式。
[0018]
根据本发明的一实施例提供一种纯化含有fc的生物活性肽的方法，其包含以下步骤：(a)将含有fc的生物活性肽混合物装载到包含含有蛋白a配体的亲和基质的色谱柱上，所述生物活性肽混合物包含第一含有fc的生物活性肽和第二含有fc的生物活性肽，其中，与所述第一含有fc的生物活性肽相比，所述第二含有fc的生物活性肽还包含至少一个人vh3结构域；以及(b)将洗脱液装载到所述色谱柱上，根据包含在所述生物活性肽混合物中的所述含有fc的生物活性肽各自包含的人vh3结构域的数量，在彼此不同的ph下，分离和洗脱所述含有fc的生物活性肽。
[0019]
在一实施例中，与所述第一含有fc的生物活性肽相比，所述第二含有fc的生物活性肽还包含至少一个人vh3结构域，或者还可以包含至少一个与人vh3结构域具有大于或等于95％、大于或等于90％、大于或等于80％、或大于或等于70％同源性的氨基酸序列。人vh3结构域是位于vh3家族人类抗体的重链可变区的cdr2和cdr3之间的氨基酸序列，可以包含seq id no.23至seq id no.37中的任意一种序列，但不限于此，并且只要是本领域技术人员可以容易地确定蛋白质中包含的人vh3结构域序列。所述人vh3结构域主要位于vh3家族人类抗体中，但罕见的，可在小鼠等哺乳动物(或嵌合体)抗体框架中被发现。例如，本发明的实施例使用的hu11f11是包含人vh3结构域的抗体，ch1e4和抗bace(anti-bace)抗体是不包含人vh3结构域的抗体。只是，例外地，ch11f11虽然是一种嵌合抗体，但依然是包含人vh3结构域的抗体。
[0020]
所述蛋白a配体可以是全域蛋白a配体。即，蛋白a配体可以包含所有全域(e、d、a、b
和c结构域)。但是，实施例并不限于此，并且所述蛋白a配体可以包含选自e结构域和d结构域中的一个或多个结构域。例如，所述蛋白a配体可以包含e结构域和d结构域。
[0021]
所述用于支持亲和基质中的蛋白a配体的支持体可以是具有球(spherical)状等珠(bead)状形态的颗粒。所述亲和基质中所述支持体的平均粒径可以是例如约小于90μm，例如约小于或等于80μm或小于或等于75μm。此外，所述亲和基质中所述支持体的平均粒径，可以是例如约大于或等于1μm或者大于或等于5μm。在所述亲和基质中所述支持体的大小满足上述范围的情况下，生物活性肽的分辨率可能会更优异。
[0022]
所述步骤(b)可以包含以下步骤：(b1)将具有第一ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第一含有fc的生物活性肽；以及(b2)将具有比所述第一ph范围低的第二ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第二含有fc的生物活性肽。所述具有第一ph范围的洗脱液和所述具有第二ph范围的洗脱液可以分别单独或依次装载到色谱柱上，或者所述洗脱液可以连续被装载到色谱柱上，根据装载时间将浓度梯度从第一ph范围改变为第二ph范围。
[0023]
所述生物活性肽混合物还可以包含第三含有fc的生物活性肽，其与所述第二含有fc的生物活性肽相比，还包含至少一个人vh3结构域。
[0024]
根据本发明的纯化方法，可以分别将具有不同数量的vh3结构域的第一含有fc的生物活性肽、第二含有fc的生物活性肽和第三含有fc的生物活性肽彼此分离纯化，并且其中任何一种都具有可以高纯度纯化的优点，以达到纯化的目的。
[0025]
此外，本发明在待纯化物质组成中不排除fc，并且在纯化工序中也考虑fc与蛋白a之间的结合。由于fc本身具有对蛋白a的亲和力，因此，在利用fc与蛋白a之间亲和力的纯化方法中，通常要排除fc以外组成元件的亲和力，相反的情况通常是要排除fc的亲和力。另一方面，本发明旨在提供一种可以根据vh3结构域的数量纯化具有重链fc和vh3结构域都作为组成元件的含有fc的生物活性肽的方法。
[0026]
所述生物活性肽混合物可以包含：所述第一含有fc的生物活性肽，其包含n个(n为0以上的整数)人vh3结构域；所述第二含有fc生物活性肽，其包含n+1至n+9个人vh3结构域；所述第三含有fc生物活性肽，其包含n+2至n+10个人vh3结构域，例如，所述第一含有fc的生物活性肽包含n个(n为0以上的整数)人vh3结构域，所述第二含有fc的生物活性肽包含n+1个人vh3结构域，所述第三含有fc的生物活性肽包含n+2个人vh3结构域。
[0027]
n可以是例如大于或等于0且小于或等于10、大于或等于0且小于或等于8、大于或等于0且小于或等于6、大于或等于0且小于或等于5、大于或等于0且小于或等于3、大于或等于1且小于或等于10、大于或等于1且小于或等于8、大于或等于1且小于或等于6、大于或等于1且小于或等于5、大于或等于1且小于或等于3、大于或等于2且小于或等于10、大于或等于2且小于或等于8、大于或等于2且小于或等于6、或者大于或等于2且小于或等于5。n可以是例如0、1、2或3。
[0028]
所述步骤(b)还可以包含以下步骤：(b1)将具有第一ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第一含有fc的生物活性肽；(b2)将具有比所述第一ph范围低的第二ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述第二含有fc的生物活性肽；以及(b3)其使用具有低于所述第二ph范围的第三ph范围的洗脱液洗脱所述第三含有fc的生物活性肽。其中，所述步骤(b1)至(b3)可以连续执行(linear gradient，线性梯度)。即，所述第一至第三
ph范围包含在第一ph范围的起始值和第三ph范围的结束值之间的连续ph范围内，各自ph范围并不是断续性的，并且通过最初将具有第一ph范围的洗脱液装载到色谱柱上，然后逐渐降低连续被装载的洗脱液的ph，从而使洗脱液的ph逐渐向第二ph范围和第三ph范围过渡，来执行所述步骤(b1)至(b3)。此外，根据待纯化生物活性肽的种类，被洗脱的ph范围可能不同。
[0029]
或者，所述步骤(b1)至(b3)可以逐步执行(step gradient，分级梯度)。
[0030]
所述fc可以是未导入影响与野生型(wild type)蛋白a的结合力的突变的fc。所述突变是指与fc的多肽序列相比，在一个或多个氨基酸残基中发生插入、缺失、附加和/或取代的多肽。即，一实施例的fc可以是未导入阻碍与蛋白a的结合力的突变或提高与蛋白a的结合力的突变的fc。
[0031]
所述第一、第二和/或第三含有fc的生物活性肽可以包含结合至所述fc的肽类药物。在此，所述“肽类药物(peptide drug)”是指具有与所述生物活性肽相同或不同的生物活性，并且结合至所述生物活性肽的独立肽。
[0032]
在所述含有fc的生物活性肽中，所述肽类药物可以结合至所述fc的n-或c-末端。例如，在所述含有fc的生物活性肽中，所述肽类药物可以结合至选自所述fc的两条重链的两个n-末端和两个c-末端的一个或多个。
[0033]
如本文所用，术语“结合”被定义为包含两个对象体以物理或化学方式直接结合的含义，以及通过连接子结合或连接的含义。在一实施例中，在fc与肽类药物通过连接子连接的情况下，所述连接子可以是例如肽，但只要是本领域常用的连接肽的材料，则无特别限制。
[0034]
所述肽类药物可以是选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录调节因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组中的至少一种。例如，所述肽类药物可以是选自由人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、集落刺激因子类、如胰高血糖素样肽-1(glp-1)的胰高血糖素样肽、g蛋白偶联受体(g-protein-coupled receptor)、白细胞介素、白细胞介素受体、酶类、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、b细胞因子、t细胞因子、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制因子、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、载脂蛋白-e、促红细胞生成素、高糖基化促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、血液因子vii、viia、viii、ix和xiii、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白-结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白c、c-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生生长因子、上皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血管抑制素、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心房肽激素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制剂、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自分泌运动因子、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗剂、细胞表面抗原、病毒来源的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段组成的组中的至少一种。
[0035]
所述胰高血糖素样肽可以是选自艾塞那肽、利拉鲁肽(liraglutide)、他司鲁肽
(taspoglutide)、阿必鲁肽(albiglutide)、利西拉肽(lixisenatide)和胰高血糖素样肽-1(glp-1)中的至少一种，例如胰高血糖素样肽-1(glp-1)。
[0036]
在所述第一或第二含有fc的生物活性肽包含vh3结构域情况下，所述第一和第二含有fc的生物活性肽分别独立地可以包含以下任意一种的含有vh结构域的可变区序列：seq id no.1的重链可变序列和seq id no.2的轻链可变序列；seq id no.3的重链可变序列和seq id no.4的轻链可变序列；seq id no.5的重链可变序列和seq id no.6的轻链可变序列；seq id no.7的重链可变序列和seq id no.8的轻链可变序列；或者seq id no.9的重链可变序列和seq id no.10的轻链可变序列，例如，所述重链可变序列和轻链可变序列可以是scfv的重链可变序列和轻链可变序列。
[0037]
所述第三含有fc的生物活性肽可以包含以下任意一种的含有vh结构域的可变区序列：seq id no.1的重链可变序列和seq id no.2的轻链可变序列；seq id no.3的重链可变序列和seq id no.4的轻链可变序列；seq id no.5的重链可变序列和seq id no.6的轻链可变序列；seq id no.7的重链可变序列和seq id no.8的轻链可变序列；或者seq id no.9的重链可变序列和seq id no.10的轻链可变序列，例如，所述重链可变序列和轻链可变序列可以是scfv的重链可变序列和轻链可变序列。
[0038]
只是，由于vh3结构域包含在重链可变序列中，因此，由选自上述序列的重链可变序列和其他轻链可变序列组成的scfv，或仅由选自上述序列中的重链可变序列组成的单链抗体也可以包含在所述含有fc的生物活性肽中。
[0039]
所述含有fc的生物活性肽可以是包含免疫球蛋白g(以下称为igg)的抗体。
[0040]
如本文所用，“抗体”可以是指任何同种型的完整免疫球蛋白、可以与完整抗体竞争以结合至靶标抗原的抗原结合片段、或它们的组合。例如，可以包含小鼠、嵌合体、人源化、完全人类抗体、它们的抗原结合片段或它们的组合。抗体本身可以是抗原结合蛋白的一种。抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下，抗体也可以仅包含重链。所述抗体包含特异性结合至一个靶标的单特异性抗体和特异性结合至复数个靶标的多特异性抗体(例如，双特异性抗体和三特异性抗体)。
[0041]
所述抗体还包含单克隆抗体和多克隆抗体，并且所述单克隆抗体可以是特异性结合至igf1r的分离的抗体，其为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。所述单克隆抗体可以是特异性结合至igf1r的分离的抗体，其为igg1、igg2、igg3或igg4类型。
[0042]
在本技术中，“轻链”可以包含全长轻链及其片段，其具有足以提供对抗原或表位的特异性结合的可变区序列。全长轻链可以包含可变区结构域vl和恒定区结构域cl。轻链的可变区结构域可以位于轻链多肽的氨基末端。轻链的种类可以包含卡帕(κ)和拉姆达(λ)链。
[0043]
如本文所用，“互补决定区(complementarity-determining regions,cdr)”可以是指在抗体的可变区中赋予与抗原的特异性结合的区域。
[0044]
在本技术中，“重链”可以包含全长重链及其片段，其具有足以提供对抗原或表位的特异性结合的可变区序列。全长重链可以包含可变区结构域和三个恒定区结构域ch1、ch2和ch3。可变区(vh)结构域位于重链多肽的氨基末端，恒定区(ch)结构域位于羧基末端，并且ch3可以位于最靠近羧基末端的位置。重链可以包含igg(包含igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(包含iga1和iga2亚型)、igm和ige的同种型。
[0045]
所述抗体可以选自免疫球蛋白的所有亚型(例如，iga、igd、ige、igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm等)。所述igg类抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4亚型，例如，igg1或igg2亚型类型。所述igg类抗体包含两条重链和两条轻链，每条重链和轻链通过二硫键结合来结合并形成两条重链-轻链构建体(dimer，二聚体)，所述形成的两条重链-轻链可以具有在重链fc区通过二硫键结合来连接的形式。所述igg类抗体可以是单靶标抗体，其在两侧重链-轻链构建体中包含针对相同抗原的抗原结合点位以靶向一种抗原，或者可以是双特异性抗体，其在两侧重链-轻链构建体中包含针对彼此不同抗原的抗原结合点位以靶向两种抗原。
[0046]
根据本发明的抗体包含双特异性抗体、完整抗体(whole antibody)、微型抗体、结构域抗体、抗体模拟物(或合成抗体)、抗体融合物(或抗体缀合物)、其片段和它们的组合，但不限于此。下文进一步公开各种抗体的结构。
[0047]
在本发明中，例如，与其他肽序列相比，肽的“变体”如抗原结合片段、蛋白质或抗体是在一个或多个氨基酸残基中发生插入、缺失、附加和/或取代的肽，并且可以包含融合肽。例如，抗体的一部分可以在所述重链或轻链、可变区或cdr序列的一个或多个残基处包含保守(conservative)氨基酸取代。
[0048]
根据本发明的抗体可以通过使用杂交瘤技术从转基因动物(例如，转基因小鼠)中产生并选择靶抗体。这种抗体可以通过使用适当的载体和宿主细胞进行克隆和表达，或者所述抗体可以从培养的杂交瘤细胞中获得。此外，所述抗体可以来源于噬菌体展示文库(phage-display library)。噬菌体展示技术是一种模仿免疫选择(immune selection)的方法，其在丝状(filamentous)噬菌体表面展示抗体库以从中筛选出结合至靶抗原的噬菌体。一种这样的技术可以参见本发明的实施例或pct公开号wo99/10494。
[0049]
抗体或其抗原结合片段可以仅来源于单一来源(source)，或者可以是嵌合体。嵌合抗体包含来源于两种不同类型的抗体的部分，并且将在下文更详细地描述。抗体或其抗原结合片段可以通过杂交瘤、重组dna技术或完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，否则如本技术所用的术语“抗体”不仅包含包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体，还包含它们的衍生物、变体、免疫功能性免疫球蛋白片段、突变体和它们的组合，例如，所述“抗体”可以除了两条全长重链和两条全长轻链之外，还包含一个或两个scfv，其实例如下所述。
[0050]
如本文所用，“抗原结合片段”可以是指对抗原具有特异性结合能力的抗体的一部分或包含其的多肽。例如，抗原结合片段可以是抗体的一部分，其包含与抗原(例如，表位)相互作用以赋予抗体对抗原的特异性和/或亲和力的氨基酸残基，或者可以是包含其的多肽。这种片段包含位于全长轻链或重链中的至少一个cdr，并且在一些实施例中可以包含单条重链和/或轻链或其一部分。这种生物活性片段可以通过重组dna技术产生，或可以通过例如完整抗体的酶促或化学切割产生。
[0051]
免疫功能性免疫球蛋白片段包含但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、结构域抗体和单链抗体(例如，scfv、fc-scfv等)。此外，免疫功能性免疫球蛋白片段可以来源于包含人类、小鼠、大鼠、骆驼或兔子的任何哺乳动物，但不限于此。本说明书公开的抗体的功能部分，如一个或多个cdr，可以共价连接到第二蛋白质或小分子化合物以用作针对特定靶标的靶向治疗剂。
[0052]
如本技术所用，“单链抗体”是抗原结合区的单条多肽链，其重链和轻链可变区通
过柔性连接子连接。例如，所述单链抗体可以是选自由重链可变区和轻链可变区以单链形式连接的scfv、重链可变区、轻链可变区和fc以单链形式连接的fc-scfv等组成的组中的一种或多种。单链抗体可以参见例如美国专利号5,260,203。
[0053]
如本文所用，“亲和性或亲和力(affinity)”是指抗体或其抗原结合片段与抗原之间相互作用的强度，并且可以取决于抗体或抗原结合片段的cdr序列和/或抗体或抗原结合片段的物理化学特质(亲水性/疏水性、静电特性等)、抗原的特征，如抗原的大小、形状和/或电荷等。确定这种亲和力的方法是本领域已知的，并且通常可以表示位解离常数(dissociation constant，kd)，但不限于此。
[0054]
在本技术中，“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向两种或更多种抗原或表位。
[0055]
在本技术中，“双特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同的抗原结合点位的杂合抗原结合蛋白或抗体。这种双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，可以通过各种已知的方法产生，例如，杂交瘤融合或fab'片段或scfv片段的连接。例如，可以参见songsivilai和lachmann,clin.exp.immunol.79:315-321(1990)；kostelny等，j.immunol.148:1547-1553(1992)等。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个抗原结合点位结合的两个彼此不同的表位可以位于相同或不同的蛋白质靶标上。
[0056]
所述含有fc的生物活性肽可以包含重链fc和抗原结合片段结合的抗体蛋白，例如，所述重链fc可以包含在igg中，并且所述抗原结合片段作为包含重链可变区的scfv或单链抗体，可以连接于所述重链fc的c-末端。
[0057]
例如，所述含有fc的生物活性肽可以是igg和scfv结合的igg-scfv双抗体。所述igg-scfv双抗体可以是与igg结合一个scfv的单价双特异性抗体或与igg结合两个scfv的二价双特异性抗体。
[0058]
所述含有fc的生物活性肽可以包含结合至fc的肽类药物。在此，所述肽类药物的定义可以与上述肽类药物相同。所述肽类药物可以结合至所述含有fc的生物活性肽的fc的n-末端或c-末端。所述肽类药物可以结合至所述含有fc的生物活性肽的fc的两条重链中至少一条的n-末端。
[0059]
所述第一含有fc的生物活性肽是包含免疫球蛋白g(以下称为igg)的抗体，所述第二含有fc的生物活性肽可以是igg-scfv双抗体。所述第一含有fc的生物活性肽不包含scfv，所述第二含有fc的生物活性肽可以包含一个由seq id no.11组成的scfv，其连接到fc的两条重链中任意一条的c-末端。
[0060]
所述第一含有fc的生物活性肽可以是包含买免疫球蛋白g(以下称为igg)的抗体，所述第二含有fc的生物活性肽是igg-scfv单价双特异性抗体，第三含有fc的生物活性肽可以是igg-scfv二价双特异性抗体。所述第一含有fc的生物活性肽不包含scfv，所述第二含有fc的生物活性肽可以包含一个由seq id no.11组成的scfv，其连接到fc的两条重链中任意一条的c-末端，所述第三含有fc的生物活性肽可以包含两个由seq id no.11组成的scfv，其各自连接到fc的两条重链的c-末端。
[0061]
所述第一至第三含有fc的生物活性肽是igg，所述igg抗体的可变区可以包含人vh3结构域。例如，在这种情况下，所述第一至第三含有fc的生物活性肽在igg中均各自具有两个vh3结构域(可变区的重链中)，但是在igg部分之外的区中，可以具有不同数量的vh3结
构域。
[0062]
所述第一至第三含有fc的生物活性肽是igg，所述igg抗体的可变区可以不包含人vh3结构域。例如，在这种情况下，所述第一至第三含有fc的生物活性肽在igg中均不具有vh3结构域，在igg部分之外的区中，可以具有不同数量的vh3结构域。
[0063]
在所述含有fc的生物活性肽包含人vh3结构域的情况下，所述人vh3结构域可以包含在所述含有fc的生物活性肽的重链可变区中。
[0064]
在所述含有fc的生物活性肽包含人vh3结构域的情况下，至少一种或多种包含人vh3结构域的抗体或其片段可以结合至所述含有fc的生物活性肽。例如，包含人vh3结构域的scfv可以结合至所述含有fc的生物活性肽。
[0065]
在所述第一或第二含有fc的生物活性肽包含人vh3结构域的情况下，所述人vh3结构域包含在所述第一和第二含有fc的生物活性肽的重链可变区中，并且至少一种或多种包含人vh3结构域的抗体或其片段可以结合至所述生物活性肽。
[0066]
在上述的igg-scfv双抗体中，igg和scfv中至少一个可以包含人vh3结构域。在igg和scfv均包含人vh3结构域的情况下，igg的人vh3结构域和scfv的人vh3结构域的序列可以彼此相同或不同。上述的igg-scfv双抗体可以具有一种或多种生物活性。
[0067]
在所述含有fc的生物活性肽包含igg抗体的情况下，所述igg抗体可以包含选自第一重链和第二重链的一种或多种。在此，所述第一重链可以由vh-ch1-ch2-ch3-scfv组成，所述第二重链可以由vh-ch1-ch2-ch3组成。
[0068]
为了提高所述第一重链和第二重链的二聚化概率以容易制备单价双特异性抗体，一条重链的重链恒定区的特定位置被孔突变(hole mutation)(例如，t366s、l368a或y406v)，另一条重链的重链恒定区的特定位置可能被旋钮突变(knob mutation)(例如，t366w)。所述含有fc的生物活性肽可以包含抗α-突触核蛋白igg抗体或抗-bace抗体。
[0069]
所述抗α-突触核蛋白抗体可以包含第一重链或第二重链中的至少一个。例如，所述第一重链可以包含抗α-突触核蛋白抗体的重链可变区、人重链恒定区和结合至所述重链恒定区的c-末端的抗igf1r抗体或其片段(例如，抗igf1rscfv)，所述第二重链包含抗α-突触核蛋白抗体的重链可变区和人重链恒定区，并且可以不包含上述抗igf1r抗体。
[0070]
所述抗α-突触核蛋白抗体可以包含两条所述第一重链或两条所述第二重链。或者，所述α-突触核蛋白抗体可以分别包含一条所述第一重链和一条所述第二重链。
[0071]
所述第二含有fc的生物活性肽分别包含一条所述第一重链和一条所述第二重链，所述第三含有fc的生物活性肽可以包含两条所述第一重链，所述第一含有fc的生物活性肽可以包含两条所述第二重链。
[0072]
所述含有fc的生物活性肽混合物可以包含：第一含有fc的生物活性肽，其在所述抗α-突触核蛋白抗体的两条重链的每条的c-末端不与所述抗igf1r抗体或其片段结合；第二含有fc的生物活性肽，其在所述抗α-突触核蛋白抗体的两条重链中任意一条的c-末端与所述抗igf1r抗体或其片段结合；以及第三含有fc的生物活性肽，其在所述抗α-突触核蛋白抗体的两条重链的每条的c-末端与所述抗igf1r抗体或其片段结合。
[0073]
如本文所用，pct公开号wo2019-117684中对ch11f11的描述除非在此矛盾，否则同样适用于本文的ch11f11，并且pct公开号wo2019/117684中对hu11f11的描述除非在此矛盾，否则同样适用于本文的hu11f11。针对ch11f11和hu11f11的序列可以参见上述pct公开
号。
[0074]
所述生物活性肽可以是抗α-突触核蛋白抗体，其包含选自由ch11f11、ch1e4、抗bace(anti-bace)和hu11f11组成的组中的任意一种抗α-突触核蛋白抗体的重链可变区，所述抗igf1r抗体或其片段可以包含由seq id no.1的重链可变序列和seq id no.2的轻链可变序列；seq id no.3的重链可变序列和seq id no.4的轻链可变序列；seq id no.5的重链可变序列和seq id no.6的轻链可变序列；seq id no.7的重链可变序列和seq id no.8的轻链可变序列；或者seq id no.9的重链可变序列和seq id no.10的轻链可变序列所示的氨基酸序列。
[0075]
根据一实施例的含有fc的生物活性肽的分离方法，使用亲和层析法可以容易地从含有fc的生物活性肽混合物中分离所需的含有fc的生物活性肽。特别地，根据一实施例的含有fc的生物活性肽的纯化方法，可以实现简化工序，也可以高纯度精确分离具有相同或相似结构的生物活性肽。
[0076]
此外，根据一实施例的含有fc的生物活性肽的分离方法，无需通过向fc导入特定突变以人工控制与蛋白a配体的亲和力，也可以高纯度精确分离具有相同或相似结构的生物活性肽。此外，根据一实施例的含有fc的生物活性肽的分离方法，可以在使用未导入突变的野生型蛋白a配体或现有的蛋白a配体的同时分离生物活性肽。因此，根据一实施例的制备方法，无需使用导入突变以提升与fc区的亲和力的昂贵的蛋白a配体，也可以高纯度精确分离含有fc的生物活性肽。
[0077]
根据本发明的另一实施例，可以提供一种从抗体混合物中纯化抗体的方法。当然，只要不矛盾，对于生物活性肽纯化方法的实施例的描述，也可以适用于下述抗体的纯化方法的实施例。
[0078]
根据本发明的一实施例可以提供一种纯化抗体的方法，其包含以下步骤：(a-1)将抗体混合物装载到包含含有蛋白a配体的亲和基质的色谱柱上，其中，所述抗体混合物包含单特异性抗体、单价双特异性抗体以及二价双特异性抗体，其中，所述单价双特异性抗体为一个包含人vh3结构域的抗原结合片段结合至所述单特异抗体的两个重链恒定区之一的c-末端，而所述二价双特异性抗体为一个所述抗原结合片段各自结合至所述单特异性抗体的两个重链恒定区的c-末端；(b-1)将具有第一ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述单特异性抗体；(c-1)将具有比所述第一ph范围低的第二ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱所述单价双特异性抗体；以及(d-1)将具有比所述第二ph范围低的第三ph范围的洗脱液装载到所述色谱柱上以洗脱二价双特异性抗体。
[0079]
所述单特异性抗体的可变区可以包含人vh3结构域，也可以不包含人vh3结构域。
[0080]
所述抗原结合片段可以是scfv。所述抗原结合片段可以是包含seq id no.11的氨基酸序列的scfv。
[0081]
即，根据本发明的示例性双特异性抗体可以包含重链组合物(heavy component)和抗α-突触核蛋白抗体的轻链，其中，所述重链组合物可以包含(1)抗α-突触核蛋白抗体的重链和(2)抗igf1r抗体的重链和轻链。换言之，根据本发明的双特异性抗体可以是scfv形式的抗igf1r抗体结合至igg形式的抗α-突触核蛋白抗体的一个或两个c-末端(分别称为单价(monovalent)或二价(bivalent))的形式。
[0082]
所述第一ph范围可以是大于或等于3.4且小于或等于5.0，所述第二ph范围可以是
大于或等于3.3且小于或等于4.1，所述第三ph范围可以是大于或等于3.0且小于或等于4.0。例如，所述第一ph范围可以是大于或等于3.4且小于或等于4.5，所述第二ph范围可以是大于或等于3.3且小于或等于4.1，所述第三ph范围可以是大于或等于3.0且小于或等于4.0。
[0083]
只是，所述第一至第三ph范围仅是示例性的，只要是本领域普通技术人员都可以参考本技术的描述，容易推导出根据生物活性肽的种类而变化的所述第一至第三ph范围。
[0084]
特别地，如果是不对称异二聚体(asymmetric hetero dimer)形式的蛋白质，很难在纯化工序去除制备过程中发生的同型二聚体(homo dimer)。这是因为异二聚体和同型二聚体之间的亲和力(affinity)和等电点(pi)的差异并不大，不适合使用蛋白质纯化过程中通常使用的亲和色谱柱或离子交换色谱柱进行纯化。
[0085]
关于异二聚体抗体的分离，美国专利申请公开号us8586713 b2等中已经尝试了一种人工取代fc序列以提高亲和力和等电点的差异的方法，但是在人工取代氨基酸的情况下，存在发生免疫原性(immunogenicity)的问题。此外，在vh3序列同时存在的情况下，必须使用两次亲和树脂，并且只有先去除二价双特异性抗体，才可以分离单价双特异性抗体和单特异性抗体。因此，工序复杂，分离需花费大量的时间和费用。
[0086]
然而，根据一实施例的抗体纯化方法，由于与异二聚体和同型二聚体一样，等电点差异非常小(例如，小于或等于0.1)，无需对难以通过通常的亲和层析法或离子交换层析法纯化的肽进行人工氨基酸取代，也可以以85％至90％或更高纯度纯化异二聚体。此外，根据一实施例的分离方法，不仅是抗体的片段，也可以有效分离包含fc区的整个抗体，并且根据vh3的数量可以进行精确分离。
[0087]
有益效果
[0088]
根据一实施例的用于纯化含有fc的生物活性肽或抗体的方法，可以高纯度纯化肽或抗体，其利用根据肽的vh3结构域数量差异引起的全域蛋白a配体的结合力差异，所述肽包含于含有fc的生物活性肽或抗体混合物中。此外，根据一实施例的用于纯化含有fc的生物活性肽或抗体的方法，无需导入单独的突变到fc或蛋白a配体以控制fc和蛋白a配体的结合力，因此，可以降低工序成本，简化工序的同时高纯度纯化蛋白质。
附图说明
[0089]
图1显示了对包含单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体的生物活性肽混合物使用单抗纯化凝胶(mabselet sure)树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0090]
图2显示了对包含单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体的生物活性肽混合物使用抗体纯化凝胶(mabselect prisma)树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0091]
图3显示了对包含单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体的生物活性肽混合物使用蛋白a ff(protein a ff)树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0092]
图4显示了对包含单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体的生物活性肽混合物使用mabselect xtra树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0093]
图5显示了通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)确认的对包含单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体的生物活性肽混合物使用mabselect xtra树脂纯化的结果。
mabcapture a select树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0109]
图21显示了对包含抗-bace(anti-bace)和抗-bace-f06(anti-bace-f06)的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0110]
图22显示了通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)确认的对包含ch1e4和ch1e4-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0111]
图23显示了通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)确认的对包含抗-bace(anti-bace)和抗-bace-f06(anti-bace-f06)的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0112]
图24显示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)确认的对包含ch1e4和ch1e4-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0113]
图25显示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)确认的对包含抗-bace(anti-bace)和抗-bace-f06(anti-bace-f06)的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0114]
图26显示了对包含fc和fc-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0115]
图27显示了通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)确认的对包含fc和fc-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0116]
图28显示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)确认的对包含fc和fc-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0117]
图29显示了对包含glp-1-fc和glp-1-fc-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0118]
图30显示了通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)确认的对包含glp-1-fc和glp-1-fc-f06的生物活性肽混合物使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0119]
图31显示了对包含抗-bace(anti-bace)、抗-bace-f06(anti-bace-f06)、hu11f11和hu11f11-f06的样品使用poros mabcapture a select树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
[0120]
图32显示了通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)确认的对包含抗bace(anti-bace)、抗bace-f06(anti-bace-f06)、hu11f11和hu11f11-f06的样品使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0121]
图33显示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)确认的对包含抗-bace(anti-bace)、抗-bace-f06(anti-bace-f06)、hu11f11和hu11f11-f06的样品使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0122]
图34显示了通过液相色谱-质谱联用仪(lc/ms)确认的对包含抗-bace(anti-bace)、抗-bace-f06(anti-bace-f06)、hu11f11和hu11f11-f06的样品使用poros mabcapture a select树脂纯化的结果。
[0123]
图35显示了对包含ch1e4、ch1e4-f06、hu11f11和hu11f11-f06的样品使用poros mabcapture a select树脂进行亲和层析法的纯化曲线。
具体实施方式
[0124]
下面将参考以下实施例详细描述本发明的优点和特征以及实现其的方法。然而，
本发明不限于以下公开的实施例，并且可以以各种不同形式实现。这些实施例仅仅是为了使本发明的公开更加完整，并且为了向本发明所属技术领域的普通技术人员提供完整的发明范畴而提供，且基于本发明的权利要求而定义。
[0125]
实施例1：单价双特异性抗体的制备
[0126]
(1)单价双特异性抗体表达载体的构建
[0127]
为了构建单价双特异性抗体(monovalent bispecific antibody)表达载体，pcdna3.4(invitrogen，英杰)载体的多克隆点位(multi cloning site，mcs)中插入包含信号序列(signal sequence)的抗体的核苷酸序列。所使用的表达载体是单顺反子载体，分别制备重链表达载体和轻链表达载体。
[0128]
作为重链表达载体，制备具有第一重链序列的重链表达载体1和具有第二重链序列的重链表达载体2。
[0129]
重链表达载体1是抗igf1r scfv(1564、f06、vh5、vh9、vh16，参见表2)通过连接子连接到免疫球蛋白的c-末端的形式，其中，所述免疫球蛋白的c-末端是作为抗α-突触核蛋白(antiα-synuclein)抗体的ch11f11(参见国际专利公开号wo2019/117684的序列表)、ch1e4(参见重链seq id no.18和轻链seq id no.19)、或hu11f11(参见国际专利公开号wo2019/117684的序列表)、抗-bace(anti-bace)(参见国际专利公开号wo2019/094608中hu2h8v29的序列)抗体的重链可变区和人重链恒定区连接的，并且在重链恒定区的特定位置发生了序列取代(hole mutation，孔突变：t366s、l368a、y406v)。
[0130]
重链表达载体2中，仅是编码抗α-突触核蛋白抗体或抗-bace(anti-bace)抗体的重链可变区与人重链恒定区连接的形式，并且在重链恒定区的特定位置发生了序列取代(knob mutation，旋钮突变：t366w)。
[0131]
在轻链序列插入轻链表达载体的情况下，编码抗α-突触核蛋白抗体或抗-bace(anti-bace)抗体的轻链可变区与人轻链恒定区连接。
[0132]
在实施例1中，重链表达载体1、重链表达载体2和轻链表达载体中编码抗体的核酸序列如seq id no.20至seq id no.22所示。
[0133]
组成根据本技术的一实施例的单价双特异性抗体的示例hu11f11 x f06的氨基酸序列如下表1所示。
[0134]
[表1]
[0135]
[0136][0137]
单价双特异性抗体(monovalent bispecific antibody)是异二聚体形式，其中，scfv连接至抗α-突触核蛋白抗体或抗-bace(anti-bace)抗体的重链fc之一的c-末端，但scfv没有连接至另一个重链fc。
[0138]
一般而言，在制备单价双特异性抗体时，旋钮-旋钮(knob-knob)二聚体、旋钮-孔(knob-hole)二聚体、孔-孔(hole-hole)二聚体抗体的组合都会产生。为分离纯的异二聚体(knob-hole dimer，旋钮-孔二聚体)的纯化过程中，为比较纯化分辨率并作为对照物质，单特异性抗体(monospecific antibody，150kd，与旋钮-旋钮(knob-knob)二聚体大小相同)和二价双特异性抗体(bivalent bispecific antibody，200kd，与孔-孔(hole-hole)二聚体大小相同)被另外克隆。
[0139]
在制备用于比较和分析纯化分辨率的对照物质的单特异性抗体的重链序列的情况下，仅有编码抗α-突触核蛋白抗体或抗-bace(anti-bace)抗体的重链可变区和人免疫球蛋白重链恒定区，而在二价双特异性抗体的重链序列情况下，scfv通过连接子连接到与单特异性抗体相同的重链序列c末端，但在重链恒定区没有进行任何形式的序列取代。单特异性抗体、二价双特异性抗体和单价双特异性抗体均具有相同的轻链序列区。
[0140]
本实施例使用的抗igf1r scfv(1564、f06、vh5、vh9、vh16)的重链可变序列和轻链可变序列如下表2所示。
[0141]
[表2]
[0142]
[0143][0144]
(2)瞬时表达式(transient expression)
[0145]
将所述制备的载体进行maxi-prep(qiagen，凯杰)以确保大量的质粒dna(plasmid dna)后，如下导入到细胞中。在制备单价双特异性抗体的情况下，孔型(hole type)重链表达载体dna、旋钮型(knob type)重链表达载体dna和轻链表达载体dna以0.5：0.5：1的比例进行转导，而在制备单特异性抗体或二价双特异性抗体的情况下，重链表达载体dna和轻链表达载体dna以1:1的比例进行转导。
[0146]
在转染前一天，expicho
tm
(gibco，cat：a29127)细胞在expicho
tm
表达培养基中(expression medium(gibco，cat:a29100-01))以3x10e6至4x10e6活细胞/毫升(viable cells/ml)的浓度调整后，在8％co2，37℃，120rpm条件下培养1天。在dna转染当天，使用新鲜培养基将生长至7x10e6至10x10e6活细胞/毫升(viable cells/ml)且存活率为95％或更高的细胞稀释至6x106活细胞/毫升(viable cells/ml)而进行制备。
[0147]
为了转染到准备好的亲代细胞中，使用expifectamine
tm cho转染试剂盒(transfection kit(gibco，cat：a29129))准备expifectamine
tm cho&质粒dna(plasmid dna)复合物。分装冷的optipro
tm
(gibco，cat：12309019)培养基后，分别接种适当浓度制备的dna和expifectamine
tm
cho试剂，混合(mix)后室温下静置5分钟，然后接种到亲代细胞并进行转染后开始培养。转染后第二天，将expifectamine
tm cho转染试剂盒(transfection kit)中包含的增强子(enhancer)和补料(feed)接种到转染细胞中，5天后额外接种补料(feed)，然后在8％co2，37℃，120rpm条件下培养10天，完成制备。
[0148]
(3)培养基收获(culture medium harvest)
[0149]
为获得制备完成的培养液，将培养液转移至离心瓶中，以4℃，6500rpm离心分离30分钟后，使用0.2μm大小的过滤器过滤，收获除去悬浮物的培养液作为样品。然后，进行纯化处理。
[0150]
实施例2：用于确认通过亲和层析法纯化单价双特异性抗体的工序条件的实验制备
[0151]
根据实施例1的方法制备单价双特异性抗体。此时，双特异性抗体中，ch11f11或hu11f11克隆用作抗-α-突触核蛋白抗体，1564、vh5、vh9、vh16或f06克隆用作抗-igf-1r抗体，这两种均属于vh3家族抗体，因此，每个重链可变区都包含vh3结构域。
[0152]
在实际制备中，作为靶标抗体的单价双特异性抗体主要是通过杵臼(knob-in-hole)产生的，并且作为二次产物的二价双特异性抗体和单特异性抗体产生量相对较少。但是，本实施例中为更清楚地证明根据本发明的纯化工序可以根据vh3结构域的数量引起的亲和力差异分离抗体的事实，制备了提高在该纯化中被认为是二次产物，即杂质的二价双特异性抗体和单特异性抗体的浓度的组合物(即，为纯化提供更不利的条件)，并且对该组合物进行了纯化工序。
[0153]
这种组合物以1：3：1的比例包含以与实施例1相同的方式制备的单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体，而与实施例1不同的地方在于其不包含旋钮(knob)和孔(hole)。这种组合物包含通过如下纯化工序分离的抗体：
[0154]
通过仅具有b(z)结构域的单纯抗化凝胶(mabselectsure(ge healthcare，cat.no.17543803))作为树脂的亲和层析法进行纯化，分离具有fc的待纯化物质。
[0155]
使用平衡缓冲液(50mmtris盐酸盐(tris-hcl)(ph7.2)，100mm氯化钠(nacl))进行平衡后，将回收的培养液装载到色谱柱上。
[0156]
装载完成后，使用平衡缓冲液清洗3色谱柱体积(column volume)后，使用50mm柠檬酸钠(sodium citrate)(ph3.4)洗脱。洗脱液中加入1mtris盐酸盐(tris-hcl)(ph9.0)中和至ph7.0后，进行0.2μm灭菌过滤。
[0157]
实施例3：使用各种蛋白a(protein a)树脂比较抗体纯化效果
[0158]
为了选择适合纯化单价双特异性抗体的蛋白a树脂，使用如下表3所示的具有各种规格和结构域的市售蛋白a色谱柱纯化包含ch11f11单特异性抗体、ch11f11-f06单价双特异性抗体和ch11f11-f06二价双特异性抗体的样品，并且比较了其效果。
[0159]
[表3]
[0160][0161]
每种树脂的纯化方法在下面实施例3-1至3-7中详细描述。
[0162]
纯化后的样品通过尺寸排阻高效液相色谱(size exclusion-high performance liquid chromatography，se-hplc)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，sds-page)、或液相色谱-质谱联用仪(liquid chromatography mass spectrometer，lc/ms)进行分析，以确认纯化结果。
[0163]
通过尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)分析时，使用40mm磷酸钠(sodium phosphate)和400mm高氯酸钠(sodium perchlorate)(ph6.8)作为流动相，以1mg/ml的分析样品浓度注入20ul的分析样品体积，以0.8ml/min的流速进行分析。通过在280nm波长处的吸光度测定分析峰。在通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析时，使用nupage 4-12％bis-tris凝胶和mops电泳缓冲液在非还原(non-reducing)和还原(reducing)条件下进行分析。在还原(reducing)条件下，在分析样品中加入5％2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)，以70℃加热10分钟后进行分析。在通过液相色谱-质谱联用仪(lc/ms)分析时，其由沃特世acquity超高效液相色谱(waters acquity ultra high performance liquid chromatography，uplc)系统和沃特世synapt g2-s四极杆飞行时间(q-tof)质谱仪(waters synapt g2-s quadrupole-time of flight(q-tof)mass spectrometer)组成，并且使用plrp-sbeh s-200色谱柱进行分析。数据使用沃特世(waters)biopharmalynx v.1.3.软件分析。
[0164]
实施例3-1：单纯抗化凝胶(mabselect sure)
[0165]
使用hitrap单纯抗化凝胶(mabselect sure)(ge healthcare,cat.no.29-0486-84)树脂确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(以下称为residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0166]
图1显示了根据实施例3-1的亲和层析法的纯化曲线。图1中，x轴为样品体积，单位为ml，y轴为280nm处的紫外(uv)波长，单位为mau。如图1所示，在实施例3-1中，仅出现一个洗脱峰。由此证实，hitrap单纯抗化凝胶(mabselect sure)树脂没有显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的亲和力差异。
[0167]
实施例3-2：抗体纯化凝胶(mabselect prisma)
[0168]
使用抗体纯化凝胶(mabselect prisma)(ge healthcare,cat.no.17-5199-01)确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0169]
图2显示了根据实施例3-2的亲和层析法的纯化曲线。如图2所示，在实施例3-2中，仅出现一个洗脱峰。由此证实，抗体纯化凝胶(mabselect prisma)树脂没有显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的亲和力差异。
[0170]
实施例3-3：蛋白a ff(protein a ff)
[0171]
使用hitrap蛋白a ff(protein a ff)(ge healthcare,cat.no.17-5079-01)确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲
液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0172]
图3显示了根据实施例3-3的亲和层析法的纯化曲线。如图3所示，在实施例3-3中，洗脱峰没有显现出明显的分离。由此证实，hitrap蛋白a ff(protein a ff)树脂没有显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的显著的亲和力差异。
[0173]
实施例3-4：mabselect xtra
[0174]
使用mabselect xtra(ge healthcare,cat.no.17-5269-07)确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中准备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0175]
图4显示了根据实施例3-4的亲和层析法的纯化曲线，图5和图6分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。如图4所示，在洗脱缓冲液的ph范围内确认了三个峰。具体而言，在相对较高的ph下，具有少量(两个)vh3结构域的单特异性抗体首先被洗脱(peak1，峰1)，随着ph降低，具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体第二个被洗脱，然后，在更低的ph下，具有最多(四个)vh3结构域的二价双特异性抗体最后被洗脱。由此证实，mabselect xtra树脂显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的亲和力差异，并且根据这种亲和力差异可以选择性纯化ch11f11-f06。在其他克隆组合也显示出了这种结果。
[0176]
此外，通过根据图5和图6的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到通过亲和层析法分离的肽分别对应于单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体。
[0177]
实施例3-5：蛋白a hp(protein a hp)
[0178]
使用hitrap蛋白a hp(protein a hp)(ge healthcare,cat.no.17-0402-01)确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0179]
图7显示了根据实施例3-5的亲和层析法的纯化曲线，图8和图9分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。如图7所示，在洗脱缓冲液的ph范围内确认了三个峰。具体而言，在相对较高的ph下，具有少量(两个)vh3结构域的单特异性抗体首先被洗脱(peak1，峰1)，随着ph降低，具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体第二个被洗脱，然后，在更低的ph下，具有最多(四个)vh3结构域的二价双特异性
抗体最后被洗脱。由此证实，hitrap蛋白a hp(protein a hp)树脂显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的亲和力差异，并且根据这种亲和力差异可以选择性纯化ch11f11-f06。在其他克隆组合也显示出了这种结果。
[0180]
此外，通过根据图8和图9的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到通过亲和层析法分离的肽分别对应于单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体。
[0181]
实施例3-6：poros mabcapture a选择
[0182]
使用poros mabcapture a select(thermo fisher scientific,cat.no.a26458)确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中准备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0183]
图10显示了根据实施例3-6的亲和层析法的纯化曲线，图11和图13分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。如图10所示，在洗脱缓冲液的ph范围内确认了三个峰。具体而言，在相对较高的ph下，具有少量(两个)vh3结构域的单特异性抗体首先被洗脱(peak 1，峰1)，随着ph降低，具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体第二个被洗脱，然后，在更低的ph下，具有最多(四个)vh3结构域的二价双特异性抗体最后被洗脱。由此证实，poros mabcapture a select树脂显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的亲和力差异，并且根据这种亲和力差异可以选择性纯化ch11f11-f06。在其他克隆组合也显示出了这种结果。
[0184]
此外，通过根据图11和图12的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到通过亲和层析法分离的肽分别对应于单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体。
[0185]
实施例3-7：absolute high cap
[0186]
使用absolute high cap(agc)确认样品的分辨率。在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将实施例1中准备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。
[0187]
图13显示了根据实施例3-6的亲和层析法的纯化曲线，图14和图15分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。如图13所示，在洗脱缓冲液的ph范围内确认了三个峰。具体而言，在相对较高的ph下，具有少量(两个)vh3结构域的单特异性抗体首先被洗脱(peak 1，峰1)，随着ph降低，具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体第二个被洗脱，然后，在更低的ph下，具有最多(四个)vh3结构域的二价双特异性抗体最后被洗脱。由此证实，absolute high cap树脂显示出根据样品中存在的肽的vh3结构域数量的差异引起的亲和力差异，并且根据这种亲和力差异可以选择性纯化
ch11f11-f06。在其他克隆组合也显示出了这种结果。
[0188]
此外，通过根据图14和图15的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到通过亲和层析法分离的肽分别对应于单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体。
[0189]
实施例3-1至3-7的纯化结果总结
[0190]
实施例3-4至实施例3-7中检测到峰的洗脱缓冲液的ph浓度梯度如下表4所示。
[0191]
[表4]
[0192][0193]
总结实施例3-1至实施例3-7的纯化结果并且详细描述于下表5中。
[0194]
[表5]
[0195][0196]
每个实施例的分辨率(resolution,rs)、回收率(recovery yield)和单价抗体收率(monovalent yield)采用如下计算式进行计算。
[0197][0198]
tr1：峰1的停留时间(retention time)。
[0199]
tr2：峰2的停留时间(retention time)
[0200]
w1/21：峰1到半高处(half height)之间的宽度
[0201]
w1/22：峰2到半高处(half height)之间的宽度
[0202]
**回收率(recovery)(％)＝回收量(output)(mg)/加入量(input)(mg)x 100
[0203]
***单价抗体收率(monovalent yield)(％)＝单价抗体回收量(monovalent output)(mg)x纯度(purity)(％)/单价抗体加入量(monovalent input)(mg)x纯度(purity)(％)x 100
[0204]
作为实验的结果，仅实施例3-4至3-7中使用的色谱柱显示出根据肽中包含的vh3结构域的数量引起的亲和力差异，其结果证实，单特异性抗体、单价双特异性抗体和二价双特异性抗体根据ph浓度梯度被有效分离。更具体地，实施例3-4至3-7中分离的抗体根据抗igf1r scfv的存在和数量具有两个、三个和四个不同数量的vh3结构域，其中，所述抗igf1r scfv与在可变区中包含vh3结构域的单特异性抗体的fc的c末端连接，并且实施例3-4至3-7中使用的色谱柱，由于蛋白a树脂具有全域，可以精确地识别所述抗体的vh3结构域数量差异，以使抗体被有效分离。通常更优选的是由于为提高fc结合力和碱性稳定性(alkaline stability)只使用特定结构域b(z)的改进的色谱柱，如单纯抗化凝胶(mabselect sure)和抗体纯化凝胶(mabselect prisma)等，与之相比，根据本公开，包含常规的(未导入特定突变)蛋白a的树脂可以更有效地用于根据vh3结构域的数量从包含vh3结构域的肽混合物中分离肽。
[0205]
实施例4：来自培养液的抗体纯度分析
[0206]
使用poros a 20μm(thermo fisher,cat.no.1-5022-26)，确认了即使在不纯化蛋白a直接使用培养液的情况下，是否也可以分析所需的含有fc的生物活性肽。使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))平衡后，直接装载培养液(harvested cell culture fluid，收获的细胞培养液)。使用2色谱柱体积(column volume)的平衡缓冲液进行未结合洗涤(unbound wash)，然后使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为1分钟，所用的梯度(gradient)条件为洗脱缓冲液50％》100％/30色谱柱体积(column volume)。通过相同的方法分析使用蛋白a(protein a)预纯化(pre-purified)的样品，并且比较结果。
[0207]
图16显示了根据实施例4的亲和层析法的分析曲线。如图16所示，确认了不经过蛋白a色谱柱直接分析培养液的结果与分析使用蛋白a预纯化(pre-purified)的样品的结果，分别为90.3％和90.5％非常相似，并且洗脱曲线和分辨率(resolution)也是相似的。
[0208]
上述结果证实，根据一实施例的分离方法，即使不使用蛋白a初级纯化瞬时(transient)培养液，也可以以优异的分辨率(resolution)分离和分析肽。因此，根据一实施例的分离方法可以用作一种非常有效的分析方法，即使在细胞株开发初期候选细胞株的数量多，也可以使用培养液直接确认抗体的比例和纯度，而无需经过初级纯化过程。
[0209]
实施例5：各种不对称形式的多肽的纯化
[0210]
实施例5-1：igg(vh3(+))-scfv(vh3+)
[0211]
使用实施例3中使用的蛋白a树脂确认样品的分辨率。表5所示的可以确认分辨率的所有蛋白a树脂都可以用作蛋白a树脂，但作为代表性的，使用poros mabcapture a select(thremo fisher scientific,cat.no.a26458)进行纯化。作为用于纯化的样品，使
用根据实施例1的方法产生的具有两个vh3结构域的单特异性抗体(hu11f11)和具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体(hu11f11-f06)的混合物。
[0212]
在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将制备的样品装载(loading)到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。图17显示了亲和层析法的纯化曲线，图18和图19分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。
[0213]
适用洗脱缓冲液的ph浓度梯度的结果如图17所示，分离了两个峰。具体而言，在相对较高的ph下，具有少量(两个)vh3结构域的单特异性抗体首先被洗脱(peak 1，峰1)，随着ph降低，具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体第二个被洗脱(peak 2，峰2)。根据图18和图19的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到这些结果。
[0214]
实施例5-2.igg(vh3(-))-scfv(vh3+)
[0215]
使用实施例3中使用的蛋白a树脂确认样品的分辨率。表5所示的可以确认分辨率的所有蛋白a树脂都可以用作蛋白a树脂，但作为代表性的，使用poros mabcapture a select(thremo fisher scientific,cat.no.a26458)进行纯化。作为用于纯化的样品，除了使用在igg可变区中不包含vh3结构域的抗体的ch1e4克隆或抗-bace(anti-bace)抗体这一点之外，使用根据与实施例1相同方法产生的不具有vh3结构域的单特异性抗体(ch1e4或抗bace(anti-bace))和具有一个vh3结构域的单价双特异性抗体(ch1e4-f06或抗-bace-f06(anti-bace-f06))的混合物。
[0216]
在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将制备的样品装载(loading)到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。图20和图21分别显示了亲和层析法的洗脱峰，图22和图23分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)的结果，并且图24和图25分别显示了聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。
[0217]
适用洗脱缓冲液的ph浓度梯度的结果如图20和图21所示，分离了两个峰。具体而言，在相对较高的ph下，不具有(0个)vh3结构域的单特异性抗体首先被洗脱(peak 1，峰1)，随着ph降低，具有一个vh3结构域的单价双特异性抗体第二个被洗脱(peak 2，峰2)。根据图22至图25的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到这些结果。
[0218]
实施例5-3.fc-scfv(vh3+)
[0219]
使用实施例3中使用的蛋白a树脂确认样品的分辨率。表5所示的可以确认分辨率的所有蛋白a树脂都可以用作蛋白a树脂，但作为代表性的，使用poros mabcapture a select(thremo fisher scientific,cat.no.a26458)进行纯化。作为用于纯化的样品，通
过木瓜蛋白酶(papain)处理单特异性抗体(hu11f11)和单价双特异性抗体(hu11f11-f06)，以制备去除fab的fc和fc-scfv(f06)。具体而言，使用消化缓冲液(digestion buffer,10mm磷酸盐缓冲液(pbs),20mm乙二胺四乙酸(edta),10mm半胱氨酸盐酸盐(cysteine-hcl)(ph 7.4))稀释木瓜蛋白酶，并且与制备的样品按照1：100(木瓜蛋白酶：抗体)的比例混合，在37℃下反应4小时。
[0220]
在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。图26显示了亲和层析法的纯化曲线，图27和图28分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果。
[0221]
适用洗脱缓冲液的ph浓度梯度的结果如图26所示，分离了两个峰。常规抗体的fab连接到fc的n末端，而本实施例中分离的样品的fc的n末端不包含fab。但即便如此，根据图26，在相对较高的ph下，不具有(0个)vh3结构域的fc首先被洗脱(peak 1，峰1)，随着ph降低，具有一个vh3结构域的fc-scfv(f06)第二个被洗脱(peak 2，峰2),并且根据图27和图28的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)的结果再次确认到这些结果。该结果表明，根据本发明的纯化方法不仅适用于简单的抗体纯化，还可以广泛适用于具有不同vh3结构域数量的各种含有fc的肽，例如，含有fc-scfv的各种肽(例如，与药物或功能性肽连接的fc-scfv)。
[0222]
实施例5-4.glp-1-fc-scfv(vh3+)
[0223]
使用实施例3中使用的蛋白a树脂确认样品的分辨率。表5所示的可以确认分辨率的所有蛋白a树脂都可以用作蛋白a树脂，但作为代表性的，使用poros mabcapture a select(thremo fisher scientific,cat.no.a26458)进行纯化。作为用于纯化的样品，除了在fc处代替fab与glp-1(glucagon-like peptide-1，胰高血糖素样肽-1)的已知的序列连接这一点之外，使用与实施例1相同的方法产生的glp-1-fc(f06)和具有一个vh3结构域的glp-1-fc-scfv(f06)的混合物。本实施例中使用的glp-1作为一种肽类药物，其与糖尿病、阿尔兹海默氏症等疾病相关的研究和临床研究正在被积极进行中。本实施例试验了即使包含这种肽类药物的情况下是否也可以根据vh3结构域的数量进行分离。
[0224]
在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。图29显示了亲和层析法的纯化曲线，图30显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)的结果。
[0225]
适用洗脱缓冲液的ph浓度梯度的结果如图29所示，分离了两个峰。常规抗体的fab连接到fc的n末端，而本实施例中分离的样品是在fc的n末端代替fab包含glp-1的融合肽。但即便如此，根据图29，在相对较高的ph下，不具有(0个)vh3结构域的glp-1-fc首先被洗脱
(peak 1，峰1)，随着ph降低，具有一个vh3结构域的glp-1-fc-scfv(f06)第二个被洗脱(peak 2，峰2),并且根据图30的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)的结果再次确认到这些结果。该结果表明，根据本发明的纯化方法不仅适用于简单的抗体纯化，还可以广泛适用于分离具有不同vh3结构域数量的各种含有fc的肽，特别是除了抗体的组成元件之外还包含其他活性成分的生物活性肽。
[0226]
实施例5-1至实施例5-4中的洗脱缓冲液的ph浓度梯度如下表6所示。
[0227]
[表6]
[0228][0229][0230]
实施例5-5.igg(vh3(
±
))-scfv(vh3+)
[0231]
使用实施例3中使用的蛋白a树脂确认样品的分辨率。表5所示的可以确认分辨率的所有蛋白a树脂都可以用作蛋白a树脂，但作为代表性的，使用poros mabcapture a select(thremo fisher scientific,cat.no.a26458)进行纯化。作为用于纯化的样品，使用包含四种类型的抗体的混合物，其中所述四种类型的抗体类型包含：根据实施例1的方法产生的具有两个vh3结构域的单特异性抗体(hu11f11)和具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体(hu11f11-f06)，以及除了使用在igg可变区不包含vh3结构域的抗-bace(anti-bace)抗体这一点之外，根据与实施例1相同方法产生的不具有vh3结构域的单特异性抗体(anti-bace，抗-bace)和具有一个vh3结构域的单价双特异性抗体(anti-bace-f06，抗-bace-f06)。
[0232]
在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将制备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。图31显示了亲和层析法的纯化曲线，图32至图34分别显示了尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和液相色谱-质谱联用仪(lc/ms)的结果。
[0233]
作为适用洗脱缓冲液ph浓度梯度的结果，如图31所示，分离了四个峰，并且根据vh3结构域的数量，肽(抗bace(anti-bace)抗体：0个，抗bace-f06(anti-bace-f06)：1个，hu11f11抗体：2个，hu11f11-f06：3个)的峰显著分离，证实可以选择性纯化所需的肽。此外，图32至图34的尺寸排阻高效液相色谱(se-hplc)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)和液相色谱-质谱联用仪(lc/ms)的结果再次确认到这些结果。由此证实，本技术的分离方法可以根据各个肽中包含的vh3结构域的数量非常精确地纯化肽。
[0234]
实施例5-6.igg(vh3(
±
))-scfv(vh3+)
[0235]
使用实施例3中使用的蛋白a树脂确认样品的分辨率。5所示的可以确认分辨率的所有蛋白a树脂都可以用作蛋白a树脂，但作为代表性的，使用poros mabcapture a select(thremo fisher scientific,cat.no.a26458)进行纯化。作为用于纯化的样品，使用包含四种类型的抗体的混合物，其中所述四种类型的抗体包含：根据实施例1的方法产生的具有两个vh3结构域的单特异性抗体(hu11f11)和具有三个vh3结构域的单价双特异性抗体(hu11f11-f06)以及除了使用在igg可变区不包含vh3结构域的作为抗体克隆的ch1e4抗体这一点之外，根据与实施例1相同方法产生的不具有vh3结构域的单特异性抗体(ch1e4)和具有一个vh3结构域的单价双特异性抗体(ch1e4-f06)。
[0236]
在使用平衡缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph7.0))进行平衡后，将准备的样品装载到色谱柱上。使用洗脱缓冲液(25mm柠檬酸盐(citrate)/25mm磷酸钠(sodium phosphate)(ph2.5))，其停留时间(residence time)为5分钟，洗涤(wash)条件包含使用洗脱缓冲液0％》50％/1色谱柱体积(column volume)，ph范围为7.0至5.0。使用50％》100％/30色谱柱体积(column volume)的洗脱缓冲液进行梯度(gradient)条件。图35显示了亲和层析法的纯化曲线。
[0237]
作为适用洗脱缓冲液ph浓度梯度的结果，如图35所示，分离了四个峰，并且根据vh3结构域的数量，肽(ch1e4：0个，ch1e4-f06：1个；hu11f11：2个，hu11f11-f06：3个)的峰显著分离，证实可以根据vh3结构域的数量选择性纯化所需的肽。