鸡甲基化时钟的制作方法

1.本发明涉及一种确定鸡的实足年龄和表观遗传年龄(“鸡甲基化时钟”)的方法。
2.发明背景
3.鸡(gallus gallus)是一种重要的非哺乳类脊椎动物模式生物，以及商业生产的肉和蛋的一种重要来源。因此，影响鸡的生长、病原抗性和肉质的因素具有相当大的科学和经济意义。已经进行了广泛的全基因组关联研究以阐明潜在的遗传框架。表观遗传修饰为遗传变异提供了重要的补充和扩展，但相对地，在鸡中仍未得到充分探索。
4.动物甲基化组可以高度多样化，从具有稀疏的甲基化模式和仅有数万个甲基化标志物的某些昆虫基因组到具有密集的甲基化模式和数千万个甲基化标志物的哺乳动物基因组。到目前为止，对非哺乳类脊椎动物(尤其是禽类)的全基因组dna甲基化模式知之甚少。
5.dna甲基化与老化过程相关，并表示对cpg二核苷酸(5'-c-磷酸-g-3')(即，在胞嘧啶核苷酸沿其5'至3'方向位于碱基的线性序列中鸟嘌呤核苷酸的前面的dna区域中)具有高特异性的表观遗传修饰。
6.低甲基化区域(lmr)表示动态甲基化组的一个关键特征。lmr是dna甲基化景观的局部减少，并表示cpg贫乏的远端调控区，其通常反映转录因子与其他dna结合蛋白的结合。最初在小鼠中描述了lmr(stadler et al.nature 480，490-495(2011))。除哺乳动物以外的lmr的进化保守性仍未得到探索。
7.人类基因组中cpg离散集处的与年龄相关的dna甲基化变化已得到鉴定并用于预测年龄(horvath,s.(2013).dna methylation age of human tissues and cell types.genome biology 14:3156)。这些“表观遗传时钟”可估计特定组织或独立组织的dna甲基化年龄，并且可预测死亡率和死亡时间。
8.表观遗传年龄与实足年龄高度相关，但根据老化加速或减速过程的环境因素，表观遗传年龄可与实足年龄有大幅偏移。
9.表观遗传年龄加速(表观遗传年龄＞实足年龄)表明，根据实足年龄，底层组织的老化比预期的要快，而负值(表观遗传年龄＜实足年龄，年龄减速)表明组织老化比预期的要慢。表观遗传年龄加速和许多与年龄相关的病况与疾病(例如肠道中的炎症过程)有联系。
10.谈到家鸡的福利和性能时，肠道健康至关重要。肠道疾病通常与炎症过程相关，并影响着胃肠道(git)的结构完整性，由于体重减少、饲料转化效率低、死亡率增加和药物成本增加而导致巨大的经济损失(m'sadeq,s.a.,wu,s.,swick,r.a.&choct,m.(2015).towards the control of necrotic enteritis in broiler chickens with in-feed antibiotics phasing-out worldwide.animal nutrition,1,1-11；timbermont,l.,haesebrouck,f.,ducatelle,r.&van immerseel,f.(2011).necrotic enteritis in broilers:an updated review on the pathogenesis.avian pathol,40,341-347)。
11.因此，迫切需要用于生物学病况(例如肠道的炎症)的新的描述和预测标志物，以
控制正在进行的生产过程，并在必要时进行早期干预。
12.鉴于上述情况，本发明的目的是开发用于确定鸡的实足年龄(“鸡甲基化时钟”)或用于确定鸡的年龄加速的方法，这也适用于评估和/或监测鸡群的健康状况。


技术实现要素：

13.通过本发明的不同实施方式来解决上述目的。通常以及通过简单描述，本发明的主要方面可以描述如下:
14.在第一个方面，本发明涉及一种建立鸡甲基化时钟的方法，所述方法包括:
15.(a)确定特定鸡组织的与年龄相关的训练样本的基因组cpg位点的甲基化率和读数覆盖；
16.(b)使用截止值在步骤(a)的所有训练样本中定义一组具有可靠的甲基化率的cpg位点；和
17.(c)通过应用惩罚回归模型，使用步骤(b)的甲基化率作为输入以及与训练样本相关的年龄作为因变量，进行惩罚回归；
18.从而获取一组cpg位点，其具有相应的加权因子和线性模型方程的截距作为定义鸡甲基化时钟的参数。
19.在第二个方面，本发明提供了一种用于预测鸡的实足年龄的体外方法，所述方法包括以下步骤:
20.a)从来源于鸡对象或待测鸡群体的生物样本材料中获取鸡基因组dna；
21.b)确定鸡基因组dna中如表2所示的cpg位点的甲基化水平或可选地如表3所示的cpg位点的甲基化水平；
22.c)将来自待测样本的鸡基因组dna中这些cpg位点的甲基化水平和来自与年龄相关的参考样本的相同cpg位点的甲基化水平进行比较，
23.并由此推断对象或待测群体的实足年龄。
24.在本发明的一个具体实施方案中，一组特定cpg位点对应于下表2中列出的一组63个甲基化标志物(全基因组甲基化法)。
25.在本发明的一个具体实施方案中，一组特定cpg位点对应于下表3中列出的一组54个与lmr相关的甲基化标志物(lmr甲基化法)。
26.在第三方面，本发明涉及一种用于预测鸡组织样本的实足年龄的方法，所述方法包括:
27.(a)从来自鸡对象或待测鸡群体的组织样本材料中获取基因组dna，
28.(b)确定如表2所示的cpg位点的甲基化率或可选地如表3所示的cpg位点的甲基化率，并将其乘以它们各自的加权因子，以获取那些cpg位点的加权甲基化率，
29.(c)计算步骤(b)中获取的加权甲基化率的总和，并添加各自的线性模型方程的截距，
30.从而预测鸡组织样本的实足年龄。
31.在第四方面，本发明涉及一种用于检测鸡组织样本中加速老化的方法，所述方法包括:
32.(a)从来自鸡对象或待测鸡群体的组织样本材料中获取基因组dna，
33.(b)确定如表2所示的cpg位点的甲基化率或可选地如表3所示的cpg位点的甲基化率，并将其乘以它们各自的加权因子，以获取那些cpg位点的加权甲基化率，
34.(c)计算步骤(b)中获取的加权甲基化率的总和，并添加各自的线性模型方程的截距，从而预测所鸡组织样本的年龄(表观遗传年龄)以及
35.(d)将步骤(c)的预测年龄与组织样本的实际的实足年龄进行比较，
36.其中预测年龄大于实足年龄，表明鸡组织中加速老化。
37.由于表观遗传年龄加速(即表观遗传年龄》实足年龄)与环境反应(例如肠道微生物组的失衡)、特定病况或病症(例如肠道的炎症)相关，上述方法用作特别适用于评估和/或监测鸡群健康状况的诊断工具。
38.发明详述
39.下面将描述本发明的要素。这些要素与具体实施方式一起列出；然而，应该理解的是，它们可以任何方式和任何数量进行组合，以创建额外的实施方式。各种描述的示例和优选实施方式不应该被解释为将本发明限制于仅明确描述的实施方式。该描述应被理解为支持和涵盖由两个或更多个明确描述的实施方式组合或一个或多个明确描述的实施方式与任何数量的公开要素和/或优选要素组合而形成的实施方式。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的元素的任何排列和组合都应被认为是由本技术的说明书所公开的。
40.如本文所用，术语“[本]发明的”、“根据本发明”、“根据发明”等用于指本文描述的和/或要求保护的本发明的所有方面和实施方式。
[0041]
如本文所用，术语“包括”应被解释为涵盖“包含”和“由...组成”，这两种含义都是特定的，并因此是根据本发明单独公开的实施方式。如本文所用，“和/或”将被视为具体披露了两个指定特征或组分中的每一个特征或组分具有或不具有另一个特征或组分的情况。例如，“a和/或b”将被视为具体披露了(i)a、(ii)b和(iii)a和b中的每一种，就好像每一种情况在本文中单独列出一样。在本发明的上下文中，术语“大约”和“接近”表示本领域技术人员将理解的仍确保所述特征的技术效果的精度区间。该术语通常表示相对于指示数值的偏差为
±
20％、
±
15％、
±
10％，以及例如5％。正如本领域技术人员将理解的，给定技术效果的数值的具体偏差将取决于技术效果的性质。例如，相比于人造或工程化技术效果，自然或生物技术效果通常可具有更大的偏差。提及单数名词时使用了不定冠词或定冠词，例如“一个”、“一”或“该”。除非另有明确说明，否则这包含该名词的复数形式。
[0042]
应当理解的是鉴于本文包含的教导，将本发明的教导应用于特定的问题或环境，以及包括本发明的变体或其附加特征(例如其他方面和实施方式)，将在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0043]
除非上下文另有说明，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方式。
[0044]
本文引用的全部参考文献、专利和出版物均全文以引用的方式并入本文。
[0045]
术语“测试”/“被测试”应在本公开中表示实体经受本发明的分析应用。
[0046]
术语“基因组dna”应指的是对象或对象组的基因组的dna分子或片段。
[0047]
在本发明的上下文中，本文的术语“甲基化概况”、“甲基化模式”、“甲基化状态”或“甲基化状况”用来描述基因组序列的甲基化状态，并且该术语指的是与甲基化相关的特定
基因组位点处的dna片段的特征。此类特征包括但不限于该dna序列中的任一胞嘧啶(c)残基是否甲基化、甲基化c残基的位置、任何特定残基片段上甲基化c的百分比以及(由于例如，等位基因来源的差异的)甲基化的等位基因差异。
[0048]
术语“甲基化状况”指的是特定甲基化位点的状况(即甲基化与非甲基化)。因此，基于一个或多个甲基化位点的甲基化状况，可以确定甲基化概况。因此，术语“甲基化概况”或以及“甲基化模式”指的是生物样本中任何特定残基片段上甲基化c或未甲基化c的相对或绝对浓度。例如，如果dna序列内通常不甲基化的胞嘧啶(c)残基甲基化，则它可称为“超甲基化”；然而，如果dna序列内通常甲基化的胞嘧啶(c)残基未甲基化，则它可称为“去甲基化”。同样地，如果与来自不同区域或来自不同个体的另一序列相比(例如，相对于正常核酸)，dna序列(例如，样本核酸)内的胞嘧啶(c)残基甲基化，那么相对于另一序列，该序列被认为是超甲基化的。可选地，如果与来自不同区域或不同个体的另一序列相比，dna序列内的胞嘧啶(c)残基未甲基化，那么相对于另一序列，该序列被认为是去甲基化的。这些序列被称为“差异甲基化的”。
[0049]
如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”指的是核苷酸碱基上存在甲基部分，其中该甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不含甲基部分，但5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的位置5含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，而5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个示例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的位置5含有甲基部分，然而，为了本文的目的，胸腺嘧啶存在于dna中时不被认为是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是dna的一种典型核苷碱基。dna的典型核苷碱基是胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。rna的典型碱基是尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤。相应地，“甲基化位点”是目标基因核酸区域中可能发生甲基化的位置。例如，含有cpg的位置是甲基化位点，其中胞嘧啶可以甲基化或可以不甲基化。
[0050]
如本文所用，“cpg位点”或“甲基化位点”是指核酸内的核苷酸，其通过体内自然发生的事件或在体外使核苷酸发生化学甲基化的事件而容易发生甲基化。
[0051]
如本文所用，“甲基化核酸分子”指的是含有一个或多个甲基化的核苷酸的核酸分子。
[0052]
如本文所用，“cpg岛”描述一段dna序列，其包含功能上或结构上偏离的cpg密度。例如，yamada等人描述了一套确定cpg岛的标准：它的长度必须为至少400个核苷酸，gc含量大于50％并且ocf/ecf比率大于0.6(yamada等人，2004，genome research，14，247-266)。其他人已粗略地将cpg岛定义为长度为至少200个核苷酸的序列，其gc含量大于50％并且ocf/ecf比率大于0.6(takai等人，2002，proc.natl.acad.sci.usa，993740-3745)。
[0053]
如本文所用，术语“亚硫酸氢钠”涵盖任何合适类型的亚硫酸氢钠，例如亚硫酸氢钠、或能够在不对甲基化胞嘧啶进行化学修饰的情况下将胞嘧啶(c)化学转化为尿嘧啶(u)的其他化学试剂，并因此可用于根据dna的甲基化状况对dna序列进行差异修饰，例如美国专利公开us2010/0112595al(menchen等人)。如本文所用，对甲基化或非甲基化dna进行“差异修饰”的试剂涵盖在从甲基化和非甲基化dna产生可区分的产物的过程中对甲基化和/或非甲基化dna进行修饰的任何试剂，从而允许鉴定dna甲基化状况。这些过程可包括但不限于化学反应(例如，通过重亚硫酸盐将c转化为u)和酶处理(例如，通过甲基化依赖的核酸内切酶进行切割)。因此，对甲基化dna进行优先切割或消化的酶能够在dna甲基化时以更高的
效率切割或消化dna分子，而对未甲基化dna进行优先切割或消化的酶在dna未甲基化时表现出明显更高的效率。
[0054]
在本发明的上下文中，还包括任何“基于非重亚硫酸盐的方法”和“基于非重亚硫酸盐的定量方法”，以测试任何给定的待测甲基化位点的甲基化状况。这些术语指的是用于不需要使用重亚硫酸盐的量化甲基化核酸或非甲基化核酸的任何方法。这些术语也指的是不需要重亚硫酸盐处理的用于制备待量化核酸的方法。基于非重亚硫酸盐的方法的示例包括但不限于使用一种或多种甲基化敏感性酶消化核酸的方法和使用与基于甲基化状况的核酸结合的试剂分离核酸的方法。术语“甲基敏感性酶”和“甲基化敏感性限制性酶”是dna限制性内切核酸酶，其活性取决于其dna识别位点的甲基化状态。例如，有一些甲基敏感性酶只有在其dna识别序列未甲基化处才会进行切割或消化。因此，未甲基化的dna样本将切成比甲基化的dna样本更小的片段。类似地，超甲基化的dna样本将不会被切割。相反，有一些甲基敏感性酶只有在其dna识别序列甲基化处才切割。如本文所用，术语“切割”、“切”和“消化”可互换使用。
[0055]
甲基化年龄取决于个体或群体的生物学状态或状况，并考虑了生活环境(如压力、营养等)。术语“甲基化年龄”、“表观遗传年龄”和“生物学年龄”具有相同的含义，并且在本技术的上下文中可互换使用。
[0056]
在本发明的上下文中使用的术语“甲基化标志物”、“时钟cpg”或“cpg位点”指的是潜在甲基化的cpg位置。甲基化通常发生在含有cpg的核酸中。含有cpg的核酸可存在于例如cpg岛、cpg双链、启动子、内含子或基因外显子中。例如，潜在甲基化位点可涵盖指定基因的启动子/增强子区域。“鸡基因组dna中的一组特定cpg位点”指的是显示出与年龄最佳相关的cpg位点。
[0057]
如在本发明的上下文中所用的，术语“鸡”指的是物种原鸡(gallus gallus)。
[0058]
建立鸡甲基化时钟
[0059]
[1]发明人开发了一种建立鸡甲基化时钟的方法。该方法包括
[0060]
(a)确定特定鸡组织的与年龄相关的训练样本的基因组cpg位点的甲基化率和读数覆盖；
[0061]
(b)使用截止值在步骤(a)的所有训练样本中定义一组具有可靠的甲基化率的cpg位点；和
[0062]
(c)通过应用惩罚回归模型，使用步骤(b)的甲基化率作为输入以及与训练样本相关的年龄作为因变量，进行惩罚回归；
[0063]
从而获取一组cpg位点，其具有相应的加权因子和线性模型方程的截距作为定义鸡甲基化时钟的参数。
[0064]
基于上述发现，发明人已鉴定出鸡(gallus gallus)基因组中的许多cpg(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)位点，其中dna甲基化水平与实足年龄组织特异地并且组织独立地相关。
[0065]
也就是说，测量这些位置(cpg位点)的dna甲基化可以分别准确预测鸡的实足年龄。
[0066]
术语“甲基化率”指的是甲基化胞嘧啶的数量除以覆盖在特定位点的胞嘧啶的总数。
[0067]
术语“cpg位点的读数覆盖”应理解为在参考序列中与已知cpg位点对齐的读数的
数量。
[0068]
可使用重亚硫酸盐测序在步骤(a)中确定基因组cpg位点的甲基化率和读数覆盖。
[0069]
步骤(a)中使用的特定组织的与年龄相关的训练样本可以是例如肠道组织、肌肉组织、器官组织或皮肤组织。
[0070]
优选地，步骤(b)中定义的覆盖截止值为3。
[0071]
上述方法还可包括以下步骤：(d)优化回归模型的拟合，使得cpg位点的数量减少到100以下。为了优化步骤(d)中回归模型的拟合，算法优选应用与套索回归组合的岭回归。有利地，使用0至1之间的α值来平衡岭回归和套索回归的方法。
[0072]
预测实足年龄
[0073]
基于上述内容，发明人开发了用于鸡的多组织年龄预测器(“鸡甲基化时钟”)。这些多组织年龄预测器对于大多数组织广泛适用，以及不需要任何调整或偏移。
[0074]
术语“实足年龄”指的是从出生/孵化开始流逝的日历时间。
[0075]
[8]本发明的一个具体实施方式涉及一种用于预测鸡的实际足龄的体外方法，所述方法包括以下步骤：
[0076]
a)从来源于鸡对象或待测鸡群体的生物样本材料中获取鸡基因组dna；
[0077]
b)确定鸡基因组dna中如表2所示的cpg位点的甲基化水平(基于全基因组甲基化法)或可选地如表3所示的cpg位点的甲基化水平(基于lmr的甲基化法)；
[0078]
c)将来自待测样本的鸡基因组dna中这些cpg位点的甲基化水平和来自与年龄相关的参考样本的相同cpg位点的甲基化水平进行比较，并由此推断对象或待测群体的实足年龄。
[0079]
与年龄相关的参考样本作为对照，并表示在预定和特定的实足年龄时的平均甲基化水平。
[0080]
用于预测鸡的实足年龄的方法可用于测试动物个体和测试整个动物群体，例如鸡、或肉鸡群/蛋鸡群。
[0081]
来自对象或待测群体的生物样本材料选自体液；排泄物；组织材料(例如肌肉组织、肠道组织、器官组织、皮肤组织)；羽毛材料(例如羽毛笔)；或其组合。体液的示例是血液和唾液。排泄物包括肠道内容物、粪便和盲肠排泄物及其混合物、溶液或悬浮液。肌肉组织的示例是乳房(胸大肌)，肠道组织的示例是回肠和空肠；器官组织的示例是脾组织或心脏组织。
[0082]
根据本发明的步骤b)可包括重亚硫酸盐转化过程。在步骤c)中，可使用回归分析来确定对象或测试的群体的表观遗传年龄。有关重亚硫酸盐转化和回归分析的细节在上文的定义和下文的实验部分提供。
[0083]
[9]本发明的一个具体实施方式涉及一种用于预测鸡组织样本的实际足龄的方法，所述方法包括以下步骤：
[0084]
(a)从来自鸡对象或待测鸡群体的组织样本材料中获取基因组dna，
[0085]
(b)确定如表2所示的cpg位点的甲基化率或可选地如表3所示的cpg位点的甲基化率，并将其乘以它们各自的加权因子，以获取那些cpg位点的加权甲基化率，
[0086]
(c)计算步骤(b)中获取的加权甲基化率的总和，并添加各自的线性模型方程的截距，
[0087]
从而预测鸡组织样本的实足年龄。
[0088]
步骤(a)中使用的来自鸡对象或待测鸡群体的组织样本材料可选自肠道组织、肌肉组织、器官组织或皮肤组织。优选地，步骤(a)中使用的来自鸡对象或待测鸡群体的组织样本材料是肠道组织，优选地从粪便样本材料中分离的肠道组织。
[0089]
使用重亚硫酸盐测序有利地确定步骤(b)中cpg位点的甲基化率。
[0090]
检测加速老化
[0091]
表观遗传年龄取决于个体(或群体)的生物学状态或状况。
[0092]
表观遗传年龄可与实足年龄匹配或不匹配。表观遗传年龄与实足年龄的偏差是年龄加速幅度或年龄减速幅度。
[0093]
因此，也可以通过将来自待测样本的鸡基因组dna中甲基化标志物(即cpg位点)的甲基化水平与来自年龄相关参考样本的相同标志物(即cpg位点)的甲基化状态进行比较来确定表观遗传年龄。术语“与年龄相关的参考样本”应按照上述定义理解。
[0094]
更具体地，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定或建立鸡表观遗传年龄的体外方法，所述方法包括以下步骤:(a)从来自对象或待测群体的生物样本材料中获取鸡基因组dna；(b)确定鸡基因组dna中一组特定cpg(5'-胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤)位点(“时钟cpg”)的甲基化水平；和c)将来自待测样本的鸡基因组dna中这些cpg位点的甲基化水平与来自年龄相关的参考样本(“对照”)的相同cpg位点的甲基化状况进行比较；从而确定对象或待测群体的表观遗传年龄。
[0095]
来自对象或待测群体的生物样本材料选自体液；排泄物；组织材料(例如肌肉组织、肠道组织、器官组织、皮肤组织)；羽毛材料，或其组合。以上提供了体液和组织材料的示例。
[0096]
排泄物样本材料可选自肠道内容物、废弃物样本和身体排泄物样本及其溶液或悬浮液。术语“废弃物样本”指的是包含垫料残留物的混合粪便滴落物。
[0097]
来源于对象或待测群体的生物样本优选为粪便。可以在宰杀前收集粪便样本材料。从粪便中分离的dna材料含有大量的肠道细胞dna(粘膜)。
[0098]
在一个特别优选的实施方案中，来自对象或待测群体的生物样本是来自鸡群体的合并的粪便样本材料。通过组合和混合个体粪便样本获取合并的粪便样本材料。
[0099]
样本量(即要采集的排泄物样本的数量；每个样本在畜舍内的特定地点采集)必须根据实际放养密度，即属于待测群体的实际动物的数量来确定。
[0100]
通常，对于大多数家鸡群体来说，最少为80至100只个体的排泄物样本就足够了。例如，对于20000只肉鸡群来说，需要96只个体的样本以达到95％的置信水平。
[0101]
为了获取合并的排泄物样本材料，可以使用多种取样方法。在一个实施方案中，通过系统网格取样(系统随机取样)来获取合并的排泄物样本。对于这种方法，基于个体排泄物样本的期望的数量(即样本大小)，将禽类群体所在的畜舍或区域划分成相同单元或子区域的网格图案。然后，在第一网格单元内确定随机样本收集位点，并在该位点采集第一个样本。最后，使用各个单元内相同的相对位置处依次从相邻单元(例如以蛇形、角形或锯齿形的方式)获取更多的样本。可以使用骰子或随机数生成器获取随机起点。对于重复样本可任选地重复上述过程。
[0102]
作为肉鸡群的一个示例，在初始生长期(起始阶段，第5天至第10天)和/或增强生
长期(第11天至第18天)以及任选地还有后期，可以每天收集和分析排泄物样本。可选地，从第10天开始，每天收集并分析来自肉鸡群的排泄物样本材料，特别是粪便样本材料。
[0103]
步骤(b)，确定鸡基因组dna中一组特定cpg(5'-胞嘧啶-磷酸鸟嘌呤)位点(“时钟cpg”)的甲基化水平，可包括重亚硫酸盐转化过程。其中，基因组dna中的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，而基因组dna中的5'-甲基胞嘧啶残基未转化为尿嘧啶。
[0104]
全基因组重亚硫酸盐测序是基于基因组dna的亚硫酸氢钠转化的全基因组dna甲基化分析，然后在下一代测序平台上测序。接着，将序列与参照基因组重新比对，以基于由未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶导致的错配来确定cpg二核苷酸的甲基化状态。
[0105]
例如，可使用商用illumina
tm
平台测量甲基化水平。
[0106]
为了量化甲基化水平，可使用各种已建立的方案来计算甲基化的β值，其等于特定位置的甲基化胞嘧啶的分数。
[0107]
可用统计预测方法来进行步骤c)。优选地，在步骤c)中使用回归分析(例如惩罚回归)来确定对象或测试的群体的表观遗传年龄。
[0108]
在根据本发明的确定鸡的表观遗传年龄的一个实施方案中，所述一组甲基化标志物(即cpg位点)对应于如下表2所示的63个cpg位点(全基因组甲基化法)。在可选实施方案中，所述一组甲基化标志物(即cpg位点)对应于如下表3所示的54个cpg位点(lmr甲基化法)。
[0109]
本发明还提供了一种用于检测鸡组织样本中加速老化的方法，所述方法包括:
[0110]
(a)从来自鸡对象或待测鸡群体的组织样本材料中获取基因组dna，
[0111]
(b)确定如表2所示的cpg位点的甲基化率或可选地如表3所示的cpg位点的甲基化率，并将其乘以它们各自的加权因子，以获取那些cpg位点的加权甲基化率，
[0112]
(c)计算步骤(b)中获取的加权甲基化率的总和，并添加各自的线性模型方程的截距，从而预测鸡组织样本的年龄(表观遗传年龄)以及
[0113]
(d)将步骤(c)的预测年龄与组织样本的实际的实足年龄进行比较，
[0114]
其中预测年龄大于实足年龄，表明鸡组织加速老化。
[0115]
上述方法适用于个体对象，即个体鸡，以及也适用于整个鸡群体，例如一群肉鸡或蛋鸡。
[0116]
鸡的生命周期始于从孵化场中的亲本鸡取出的蛋，然后在恒温下孵化21天，直至鸡孵化，尽管在这个阶段，早成鸡的年龄可长达72小时，它们被称为一日鸡。这些鸡按性别进行分类，以及母鸡饲养接近一年产蛋。
[0117]
肉鸡的寿命明显更短，以及从21天到高达170天不等。在美国，肉鸡平均在47天后屠宰，屠宰重量为2.6公斤，而在欧洲，平均屠宰年龄为42天(体重为2.5公斤)。
[0118]
肉鸡通常成群饲养，一个鸡舍可包含20000只或更多的鸡，以及在这个生产周期中用多达三种不同类型的饲料(起始阶段饲料、生长阶段饲料和结束阶段饲料)喂养。
[0119]
禽类通常暴露于多种外部环境因素，如细菌、病毒、寄生虫、饮食或气候。这些因素在群体性能或群体一致性方面影响着生产周期的结果，并表现为单只禽类或禽类群体的不同甲基化模式，这可使年龄加速可以检测得到。
[0120]
发明人发现，鸡的表观遗传和实足年龄的不匹配，以及尤其是表观遗传年龄加速(即表观遗传年龄》实足年龄)是由临床或亚临床/潜在病况或病症引起的亚健康状况的早
期指征。
[0121]
因此，根据本发明的方法可用于监测个人或群体随时间变化的健康状况和/或可用于确定鸡畜的健康状况，并因此可用于确定治疗或营养干预的必要性。
[0122]
因此，方法可包括向测试的个体或群体提供个性化(定制的)治疗，使得预测的表观遗传年龄更接近个体或群体的实足年龄。
[0123]
此类治疗或干预可包括喂食或施用健康促进物质，如畜牧饲料添加剂或治疗剂。术语“施用”或相关术语包括口服施用。口服施用可以通过饮用水、口喂、气雾剂喷雾或动物饲料。术语“畜牧饲料添加剂”指的是用于有利影响健康动物的性能的或有利影响环境的任何添加剂。畜牧饲料添加剂的示例是消化增强剂(即，喂给动物时通过对目标饲料材料的作用而增加饮食消化性的物质)；肠道菌群稳定剂；微生物或其他化学定义的物质(当喂给动物时，对肠道菌群有积极的影响)；或有利地影响环境的物质。优选地，健康促进物质选自益生菌剂、益生元剂、植物制品(botanical)、有机酸/脂肪酸、噬菌体和溶菌酶或其任意组合。
[0124]
除了上述之外，本发明还涉及本文所述的方法用于开发常规分析工具(例如实时pcr、靶向测序/面板测序、作为两者的输入的甲基化dna免疫沉淀、芯片/阵列技术或甲基化dna测序)的用途。
[0125]
最后，本发明提供包含计算机可读代码的有形计算机可读介质，其在由计算机执行时使计算机执行以下操作:a)接收与来源于对象或待测群体的生物样本中鸡基因组dna内的一组cpg位点(即甲基化标志物；“时钟cpg”)的甲基化水平对应的信息和b)通过将统计预测算法应用于这些cpg位点的测量的甲基化水平来确定对象或待测群体的表观遗传年龄，其中所述一组cpg位点包含如表2所示的cpg位点或如表3所示的cpg位点。
[0126]
根据本发明的方法的应用是例如(i)协助评估鸡的健康状况，(ii)监测临床病症和亚临床病症的进展或复发，或者(iii)研究药物、饲料化合物和/或特殊饮食对生物学年龄的影响-以及由此对鸡的健康状况的影响。
[0127]
根据本发明的方法的应用尤其有助于避免动物性能的损失，如体重增加和饲料转化率。
[0128]
附图简述
[0129]
图1.在产生最小误差的λ值下对于给定α的训练时钟的平均平方误差。
[0130]
图2.在产生最小误差的λ值下对于给定α的cpg数量。
实施例
[0131]
方法
[0132]
对第1-35天按工业标准在三个阶段用为了满足所有营养需求而配制的玉米豆粕饮食饲喂的ross 308雄性肉鸡进行肉鸡研究(表1)。
[0133]
表1
[0134][0135][0136]
分别在第3、15和35天对三只生理健康的禽执行安乐死，以切除脾、肠(回肠)和肌肉(胸大肌)样本用于dna提取(invitrogen purelink基因组dna分离试剂盒)和重亚硫酸盐测序。
[0137]
样本
[0138]
将动物划分至三种组织(胸、回肠和脾)和三种年龄(3d、15d、34d)。在这9组的每一组中，从3只独立的动物中制备dna，得到27个基因组dna样本。
[0139]
全基因组重亚硫酸盐测序
[0140]
进行全基因组重亚硫酸盐测序项目。使用来自swift biosciences的accel-ngs甲
基序列dna文库试剂盒制备文库。两个测序文库以条形码的形式标记在一个测序道上。在illumina hiseq x平台上使用标准的配对末端测序方案进行测序，读数长度为105个核苷酸。
[0141]
读数作图
[0142]
用bsmap 2.5(xi y,li w.2009.bsmap:whole genome bisulfite sequence mapping program.bmc bioinformatics 10:232.doi:10.1186/1471-2105-10-232.)对读数进行修剪和作图，使用gallus gallus基因组组装版本5.0(https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/gca_000002315.3)作为参考序列。使用picard工具(http://broadinstitute.github.io/picard)删除重复。通过将某个基因组位置具有甲基化的cpg的读数数目除以覆盖该位置的所有读数，使用与bsmap包一起分发的python脚本(methratio.py)来确定甲基化率。
[0143]
建立鸡dna甲基化时钟
[0144]
使用惩罚回归模型(在r包glmnet[https://cran.r-project.org/web/packages/glmnet/]中实现)在训练组中回归cpg探针上的实足年龄。对于全基因组时钟，我们将分析限于在每个测序样本中显示的链特异性覆盖大于3的cpg，形成一组12876934个的cpg。对于lmr时钟，我们将分析限于在每个测序样本中显示的链特异性覆盖大于3的cpg，形成一组765266个的cpg。
[0145]
结果
[0146]
glmnet的α参数在0和1之间的范围内变化，并被选为0.54(弹性净回归)，因为该值使得拟合接近最佳拟合和可控量的cpg。适用对训练数据的交叉验证，选择λ值为0.668。这鉴定出一组63个的cpg以及相应的β值，其定义这些cpg在鸡甲基化时钟中的权重。使用0.54的α值和0.668的λ值的9倍交叉验证的均方误差为2.912493天。这表明可以预测一个新样本，其误差约为1.7天。为了将时钟应用于新的样本，必须提供该样本在63个时钟cpg的甲基化率，并且必须执行具有训练时钟的包glmnet的命令predict.cv。
[0147]
表2：时钟cpg(全基因组甲基化，α＝0.54，λ＝0.6688101，#cpg's:63)。
[0148]
[0149]
[0150][0151]
表3：时钟cpg(lmr甲基化，α＝0.54，λ＝0.610，#cpg's：54)。
[0152]
[0153]
[0154]