靶向TACC3的异恶唑衍生物作为抗癌剂的制作方法

靶向tacc3的异恶唑衍生物作为抗癌剂
1.相关申请
2.本技术要求2019年11月14日提交的欧洲专利申请号19209120.5的权益；上述申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开涉及可用作转化酸性含卷曲螺旋蛋白3(tacc3)抑制剂的式(i)的取代化合物、此类化合物的药物组合物、其制备方法和用途。更具体地，tacc3抑制剂可用于治疗或改善tacc3介导的癌症，包括乳腺癌、白血病、肺癌、结肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、肾癌和cns癌。
4.

背景技术：

5.癌症是一种以不受控制的细胞分裂为表征的复杂疾病。在癌症类型中，乳腺癌是女性最常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因之一。随着对肿瘤生物学的了解，不断发展靶向药物疗法来提高患者的生存率。
6.尽管美国食品药品监督管理局(fda)已经批准了大约二十四种用于治疗乳腺癌的药物，但全世界每年仍有五十万人死于乳腺癌。特别是考虑到目前可用的化疗剂的副作用，近年来，开发引起毒性较小的靶向疗法一直是重点。由于癌症的特征是有可能侵入或扩散到身体其他部位的异常且不受控制的细胞生长或恶性肿瘤，因此靶向和抑制负责肿瘤细胞增殖和存活的特定大分子的功能的药物或物质用于靶向乳腺癌的治疗。
7.由于微管重组是细胞分裂过程中的一个重要步骤，因此干扰这一过程的药物一直是癌症研究的主要焦点。抗有丝分裂药物通过激活纺锤体组装检查点(sac)来破坏微管的聚合动力学，从而阻止从中期到后期的转变。结果，细胞停止分裂，这些有丝分裂停滞的细胞最终死亡。对有丝分裂事件机制的持续研究可能会导致新的靶蛋白候选物和/或途径，这对于为癌症患者提供更有效的治疗选择非常重要。抗微管剂，例如长春花生物碱、美登素(maytansinoid)和紫杉烷是此类药物的例子，所述药物广泛用作各种肿瘤的化学治疗剂(marzo&naval，2013)。然而，关于这些药物的一个重要问题是，药物对非致瘤性细胞的毒性导致严重的副作用。
8.耐药性也是另一个主要问题，使患者对这些药物的反应高度不可预测(gascoigne&taylor，2009)。为了克服这些问题并改善化疗反应，确定了靶向有丝分裂特异性激酶和微管运动蛋白的抗有丝分裂、癌症特异性疗法(dominguez-brauer等人，2015)。重
要的是，由于磷酸化是细胞周期调节和纺锤体组装中的关键步骤，因此在这些过程中发挥作用的激酶已作为潜在靶点进行了很长时间的研究。其中，已经开发和临床测试了针对细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)、aurora激酶和polo样激酶(plk)的特异性抑制剂(sanchez-martinez,gelbert,lallena,&de dios,2015；strebhardt&ullrich,2006；tang等人，2017)。与抗微管剂相比，这些抗有丝分裂药物尽管毒性低，但没有一种表现出惊人的临床结果，导致临床效率有限(chan、koh&li，2012)。因此，选择性地和有效地靶向分裂癌细胞的替代靶分子仍有待阐明和开发。
9.tacc3是tacc成员之一，是一种非激酶微管结合蛋白并在中心体调节和确保微管稳定性中起关键作用(singh、thomas、gireesh&manna，2014)。该tacc3基因在tacc3中心体微管的成核作用中也具有重要作用。在包括前列腺癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等多种癌症类型中观察到其升高的水平。因此，敲低tacc3可抑制肾细胞癌(rcc)中的肿瘤发生和细胞生长(guo&liu,2018)。tacc3功能的破坏也会导致一系列不同的细胞结果，其包括导致有丝分裂停滞的多极纺锤体形成(yao等人，2012)，导致半胱天冬酶依赖性细胞凋亡(schneider等人，2007)以及在某些情况下，衰老(schmidt等人，2010)的染色体错位。这些研究表明，tacc3是参与癌细胞纺锤体组装的关键分子，使其成为癌症靶向治疗的重要和潜在靶点。
10.khs101是一种小分子tacc3抑制剂，首次被发现可促进大鼠神经元分化(wurdak等人，2010)。尽管通过khs101治疗抑制了胶质母细胞瘤(gbm)异种移植物的肿瘤生长(polson等人，2018)，但由于系统稳定性低和工作剂量高，它需要进行药理学优化才能转化为临床应用(wurdak等人，2010)。另一种tacc3抑制剂，spl-b，已被证明可抑制卵巢癌细胞中的中心体微管成核作用并抑制卵巢癌异种移植物中的肿瘤生长(yao等人，2014)。综上所述：目前可用的两种tacc3抑制剂，khs101和spl-b，显示出可分别减少胶质母细胞瘤和卵巢癌异种移植物中的肿瘤生长。然而，由于效力低或全身稳定性低，这些抑制剂均未达到临床阶段。
11.所有上述证据都支持tacc3在癌症中的关键作用，并且，tacc3功能的抑制将有效治疗或改善多种人类癌症。此外，仍然需要具有适合用作人用药物的药代动力学和药效学性质的tacc3抑制剂化合物。


技术实现要素：

12.在一个方面，本公开涉及式(i)的化合物：
[0013][0014]
或其药学上可接受的盐，其中
[0015]
x1为n或cr6；
[0016]
x2是n或cr3；
[0017]
r1为芳基或杂芳基；
[0018]
r2为h或烷基；
[0019]
r3、r4和r6各自独立地为h、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、羧基、酰基、乙酰基、酯、硫酯、烷氧基、磷酰基、氨基、酰胺、氰基、硝基、叠氮基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基或磺酰胺；和
[0020]
r5是杂环基、烷基或氨基。
[0021]
在另一方面，本公开涉及用本文公开的化合物治疗tacc3介导的疾病和疾患(disorder)的方法。在某些实施方式中，tacc3介导的疾病或疾患是癌症。
[0022]
一方面，本公开的一个目的是通过使用比癌症治疗中可用的特异性抑制剂更小剂量的具有高效力的tacc3抑制剂作为有丝分裂阻断剂来减少不需要的副作用。
[0023]
作为所有化合物的一个实施例，化合物5在具有不同亚型的不同乳腺癌细胞系中显示出比已知的tacc3抑制剂更佳的抗增殖作用，而对正常乳腺细胞系影响较小。除乳腺癌细胞外，化合物5还对多种癌症类型表现出高效的细胞毒性(约90％的gi
50
值小于1μm)，所述多种癌症类型包括在nci-60组(nci-60panel)中的结肠癌、黑色素瘤、肺癌、中枢神经系统、卵巢癌细胞、白血病细胞、肾癌细胞和前列腺癌细胞系。此外，化合物5对携带fgfr3-tacc3融合蛋白的细胞显示出显著的抗癌作用，其活性与这些细胞的tacc3水平相关。化合物5还降低了erk1/2磷酸化，这是激活的fgfr信号传导的标志物，同时强烈诱导有丝分裂停滞和细胞凋亡。
[0024]
此外，与其他两种tacc3抑制剂相比，发现化合物5在较低剂量下可诱导有丝分裂停滞、细胞凋亡和dna损伤。它还以剂量依赖性方式诱导异常纺锤体的形成。值得注意的是，化合物5的口服给药抑制了乳腺癌免疫缺陷的和免疫活性的小鼠模型中的肿瘤生长。化合物5还削弱了转移性生长(metastatic outgrowth)并显著改善了携带高度侵袭性乳腺癌转移瘤的小鼠的总体生存率。与乳腺癌肿瘤模型相似，化合物5显著抑制了结肠癌异种移植物和免疫活性同基因模型的肿瘤生长。因此，本公开提供了一种具有高效力的新型tacc3抑制剂作为有丝分裂阻断剂，用于治疗原发性和转移性乳腺癌以及潜在的其他癌症。
[0025]
在某些方面，本公开(i)提供选自通式i表示的组的化合物作为tacc3抑制剂，(ii)提供选自通式i表示的组的化合物作为抗癌剂，其应答于tacc3抑制，(iii)以化合物5为例，对乳腺癌细胞系上的所有化合物进行综合分析，(iv)揭示了该化合物对各种细胞过程(例如，有丝分裂停滞、dna损伤和细胞凋亡)表现出比其他可用的tacc3抑制剂更佳的效果，(v)证明化合物5的体内抗肿瘤有效性，在当乳腺癌和结肠癌动物模型中口服给药时没有可观察到的毒性，和(vi)显示出其削弱转移性生长和提高携带转移瘤小鼠的总体生存率，其表明它可以用作有丝分裂阻断剂，用于治疗应答于tacc3抑制的乳腺癌和其他癌症。
附图说明
[0026]
图1：一般来说，图1示出了tacc3在几种不同的癌症类型中上调，并且其高水平与较差的总体生存率相关。图1a是tcga患者的肿瘤和正常组织之间tacc3的差异mrna表达图，表示为百万每千碱基长度的reads数(rpkm)(log2)的值。***：p《0.001。(blca：膀胱尿路上皮癌；brca：乳腺浸润癌；esca：食管癌；hnsc：头颈鳞状细胞癌；kipan：混合肾癌(kich+kirc+kirp)；kirc：肾透明细胞癌；lihc：肝细胞肝癌；luad：肺腺癌；lusc：肺鳞癌；stad：胃腺癌；
stes：胃和食管癌；ucec：子宫内膜癌)。图1b是分别从metabric、km绘图仪数据库、gse31210和tcga数据集检索的显示出tacc3水平对乳腺癌(b-1)和胃癌(b-2)的总生存率、肺癌(b-3)的无复发生存率和前列腺癌(b-4)患者的无病生存率的影响的图。对数秩检验用于统计学分析。
[0027]
图2：示出了通过选择tacc3水平、肿瘤分级、肿瘤分期、er、pr和her2状态作为协变量在metabric患者中进行的多变量分析。tacc3表达基于第25个百分位进行分隔。
[0028]
图3：一般来说，图3示出tacc3抑制诱导有丝分裂停滞、细胞凋亡和dna损伤。图3a是在metabric患者中，根据tacc3表达水平分隔的有丝分裂和dna修复相关基因组进行的来自gsea的富集图。数据显著性表示为归一化富集分数(nes)和fdr(q)值。n指示分析中使用的基因总数。图3b描绘了示出在乳腺癌细胞系中的tacc3特异性sirna的敲低效率的qrt-pcr研究。用20nm的两种不同的针对tacc3的sirna来转染细胞，转染48小时后检测tacc3 mrna水平。图上的百分比示出了敲低效率。*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001。图3c是示出用两种不同sirna敲低tacc3后乳腺癌细胞生长抑制的图。用靶向tacc3的sirna来转染细胞，转染72小时后测量细胞活性(cell viability)。图3d示出了tacc3敲低后乳腺癌细胞中的有丝分裂停滞、细胞凋亡和dna损伤标志物的蛋白质印迹分析(western blot analysis)。gapdh用作蛋白质上样对照。
[0029]
图4：一般来说，图4示出了化合物5，一种新型tacc3抑制剂，与tacc3结合。图4a示出了在完整的jimt-1细胞中，化合物5与tacc3蛋白的靶向接合。jimt-1细胞用载体、化合物5或spl-b(作为阳性对照)(1μm)处理6小时，收集细胞，在指定温度下加热，然后裂解。对上清液中的可溶性蛋白进行蛋白质印迹，并检测tacc3蛋白水平。丽春红染色用作上样对照。cetsa曲线指示tacc3相对谱带强度百分比并示出了治疗组之间的转移。图4b是示出使用等温滴定量热法(itc)确定tacc3和化合物5相互作用的缔合常数的图。上迹线示出了原始数据，下迹线示出了将tacc3滴定到化合物5的综合数据。使用与itc200仪器一起提供的origin 7软件应用单个交互模型的模型拟合。如图4c示出了使用jimt-1细胞蛋白提取物的darts测定的蛋白质印迹结果，以确认化合物5和tacc3之间的相互作用。cdk4用作非靶蛋白，其水平在治疗组之间没有变化。使用了10μm的药物。spl-b用作用于结合的阳性对照。图4d是示出对β-肌动蛋白归一化的治疗组之间的tacc3相对谱带强度的量化并且代表两个独立实验的图。数据表示为平均值
±
sd。**p《0.01
[0030]
图5：一般来说，图5示出了化合物5比目前可用的tacc3抑制剂、spl-b和khs101更有效力。图5a是示出用三种不同抑制剂对tacc3的药理学抑制及其对乳腺癌细胞系的细胞活性的影响的图(ic
50
：抑制浓度50％)。在所有以下细胞活性实验中，通过磺酰罗丹明b(srb)测定法测量细胞活性，重复三次。图5b示出了用三种不同tacc3抑制剂处理12天的jimt-1细胞的集落形成实验。集落用结晶紫染色。使用imagej软件(下图)计数和分析集落数。数据表示为平均值
±
sd。*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001。图5c示出了用化合物5、spl-b或khs101处理的jimt-1细胞的蛋白质印迹分析，以测试剂量反应对有丝分裂停滞、dna损伤和细胞凋亡标志物的影响。在蛋白质印迹实验中使用相同数量的蛋白质和相同的暴露时间来比较三种药物对这些标志物的影响。图5d是示出化合物5(500nm)处理的jimt-1细胞的annexin v/pi染色的图。图上提供了annexin v/pi双阳性细胞的百分比。图5e示出了在化合物5处理的jimt-1细胞中诱导异常纺锤体形成。细胞用两种不同剂量的化合物5处
理12小时，在甲醇中固定，然后用抗α-微管蛋白(绿色)抗体染色。dna用dapi(蓝色)染色。比例尺：10μm。图5f是示出如d中所见的纺锤体异常的量化的图。数据代表三个独立实验(t检验)的平均值和标准偏差(sd)*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001。通过与载体组比较确定显著性。图5g示出了载体中的sac标志物、bubr1(红色)和α-微管蛋白(绿色)与化合物5(500nm)处理的jimt-1细胞相比的免疫荧光染色。图5h示出了在用纺锤体检查点激酶(mps1)抑制剂(tc mps1)治疗后，化合物5治疗的jimt-1细胞中有丝分裂停滞、dna损伤和细胞凋亡标志物的蛋白质印迹分析。jimt-1细胞用200nm化合物5治疗24小时，然后用1μm tc mps1治疗12小时。gapdh用作上样对照。
[0031]
图6：一般来说，图6示出了描绘了化合物5在携带fgfr3-tacc3融合蛋白的细胞系和nci-60癌细胞系中示出了显著的抗癌活性。图6a示出了rt112和rt4细胞中tacc3蛋白水平的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照。图6b是示出用三种不同抑制剂对tacc3的药理学抑制及其对表达fgfr3-tacc3融合的细胞系(rt112和rt4)的细胞活性的影响的图。在药物孵育3天后测试细胞活性并通过srb测定法测量。图6c是示出用三种抑制剂治疗后srb染色的代表性孔的图像。图6d示出了在用不同剂量的tacc3抑制剂治疗24小时后，在rt112细胞中的有丝分裂停滞标志物、p-histone h3以及erk磷酸化(thr202/tyr204)的蛋白质印迹分析。图6e是示出由对化合物5的nci-60五剂量筛查确定的平均gi
50
值(m)的图。黑色虚线指示了1μm阈值。图6f是示出化合物5的gi
50
值与从depmap.org获得的tacc3依赖性分数之间的相关性的图。较低的分数意味着tacc3更可能依赖于给定的细胞系。
[0032]
图7：一般来说，图7示出了tacc3水平对化合物5反应至关重要。图7a示出了三种不同抑制剂对tacc3的药理抑制作用及其对正常乳腺细胞系(mcf-12a)的细胞活性的影响。图7b示出了化合物5对根据其亚型而分隔的乳腺正常上皮细胞系、mcf-12a和癌细胞系的ic
50
水平。图7c示出了这些细胞系的tacc3蛋白水平。通过蛋白质印迹分析tacc3蛋白水平。gapdh用作上样对照。图7d示出了mcf-12a细胞的集落形成实验。用对照或tacc3载体(250ng)瞬时转染细胞48小时。随后将转染的细胞接种在12孔板上。12天后细胞用结晶紫染色。图7e示出了使用imagej软件对集落数进行计数和分析。数据表示为三个独立实验的平均值
±
sd。*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001。ns：不显著。图7f是示出化合物5治疗过度表达tacc3的mcf-12a细胞后的细胞活性测定的图。图7g示出mcf-12a和乳腺癌细胞系模型的倍增时间评估。细胞以低密度铺板并生长1周。然后每天都对它们进行计数。使用单因素方差分析测试。
[0033]
图8：一般来说，图8示出了化合物5对肿瘤生长的削弱显著大于spl-b。图8a示出了以口服载体、5mg/kg的化合物5或spl-b治疗30天的jimt-1异种移植物的肿瘤体积变化。当肿瘤达到90-100mm3时开始治疗。图8b示出了jimt-1异种移植物30天的体重变化百分比。*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001；ns：不显著。
[0034]
图9：一般来说，图9示出了化合物5的不同剂量和给药途径在体内jimt-1异种移植物中抑制肿瘤生长而不影响小鼠体重。图9a示出以不同剂量和给药途径应用所有三个化合物5组后肿瘤体积变化。图9b示出了不同剂量和给药方式治疗过程中小鼠体重的变化。图9c示出了在雌性裸鼠中用载体或25mg/kg的化合物5治疗后jimt-1异种移植物的肿瘤体积变化。当肿瘤达到90-100mm3时开始治疗。图9d示出了用载体或化合物5治疗的小鼠的肿瘤重量。图9e示出了治疗后小鼠体重变化(％)。
[0035]
图10：一般来说，图10示出了化合物5显著削弱肿瘤生长并提高免疫活性小鼠的生存率。图10a示出了化合物5对高侵袭性同基因小鼠乳腺癌模型(emt6异种移植物)的影响的肿瘤体积评估。与载体对照相比，每天对每个数据点进行多重t检验，计算显著性。*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001。图10b是用载体(中位生存期14天)或化合物5(中位生存期22天)处理的emt6异种移植物的kaplan-meier生存率曲线。使用对数秩检验计算p值。图10c示出了治疗后emt6异种移植物的体重百分比变化。
[0036]
图11：一般来说，图11示出了用化合物5靶向tacc3显著削弱了结肠直肠癌小鼠模型中的肿瘤生长。图11a示出了化合物5对免疫功能低下(hct-116)和同基因免疫活性(ct-26)小鼠模型的结直肠癌异种移植物的影响的肿瘤体积评估。每天口服载体或化合物5(25和/或50mg/kg)来治疗小鼠。当肿瘤体积达到90-100mm3时开始治疗。使用学生t检验计算显著性。*：p《0.05；**：p《0.01。图11b示出了治疗后hct-116和ct-26异种移植物的体重变化百分比。
[0037]
图12：一般来说，图12示出了用化合物5靶向tacc3对4t1.luc2模型中的转移性生长的影响。图12a示出了将4t1.luc2细胞注射到尾静脉中的小鼠的生物发光(bli)图像。在肺中建立转移后，每天口服载体或化合物5(50mg/kg)对小鼠进行治疗。bli使用ivis(体内成像系统)监测转移性生长，每周一次。图12b是用载体(中位生存期19天)或化合物5(中位生存期28天)治疗的4t1.luc2同基因模型的kaplan-meier生存率曲线。使用对数秩检验计算p值。
[0038]
图13：一般来说，图113示出了高剂量化合物5对小鼠体重和内脏器官的影响。图13a示出了每天口服100mg/kg化合物5持续7天后的小鼠体重(g)。图13b示出了单剂量施用化合物5(500mg/kg)后的小鼠体重(g)。在不同的日子处死小鼠。图13c是用载体或500mg/kg的化合物5治疗的小鼠及其器官的照片(下图)。药物治疗后48小时处死它们。
[0039]
图14：示出了化合物5的药物特异性物理化学性质的总结。a在25℃、ph 7.4的磷酸钠缓冲液中2小时后的动力学溶解度(buttar等人，2010)。blogd：辛醇/磷酸钠缓冲液(50mm，ph 7.4)中的分布系数(unger等人，1978年)。cppb：在37℃下通过人体平衡透析评估血浆蛋白结合(buttar等人，2010年)。dt1/2：小鼠和人肝微粒体的半衰期(分别为mlm和hlm)(kalvass等人，2001)。eclint：mlm和hlm的内在清除率(kalvass等人，2001)。fcyp：在hlm中评估的化合物5对细胞色素p450同工酶的抑制作用(bourrie等人，1996)。gpapp：caco-2细胞单层的表观渗透系数(camenisch等人，1998)。
具体实施方式
[0040]
在许多不同的癌症类型中观察到升高的tacc3水平，这使其成为癌症治疗的极具吸引力的靶点。tacc3在调节微管和中心体以及维持纺锤体稳定性方面具有重要作用(schneider等人，2007；thakur等人，2013)。
[0041]
为了进一步研究不同肿瘤类型中的tacc3水平，本发明人对许多不同癌症类型及其正常组织对应物中的tacc3水平进行了分析(图1a)。发现tacc3在包括乳腺癌在内的许多不同癌症类型中显著地过度表达。然后，使用不同数据库(metabric和km plotter)和数据集(gse31210和tcga)对不同患者生存率数据集进行了分析。发现高tacc3水平与乳腺癌(图1b-1)和胃癌(图1b-2)中较差的总体生存率显著相关。此外，高tacc3水平与较差的肺癌患
者无复发生存率(图1b-3)和前列腺癌患者的无病生存率(图1b-4)相关。重要的是，多变量cox回归分析表明了tacc3表达是乳腺癌的独立预后因素(图2)。总之，这些结果指示了tacc3是一个临床相关的靶点，并且在几种不同的癌症中具有很强的预后作用，其表达水平是定义疾病严重程度和患者生存率的重要因素。因此，抑制tacc3功能是提高乳腺癌和其他癌症患者生存率的有希望的治疗策略。
[0042]
hela细胞中tacc3水平的降低已被证明会导致有丝分裂停滞(schneider等人，2007)和半胱天冬酶依赖性细胞凋亡(kimura等人，2013)。在本公开中，发现表达高tacc3水平的乳腺癌患者具有丰富的有丝分裂进展和dna修复基因，支持tacc3在乳腺癌发展中的致癌作用(图3a)。接下来，本发明人研究了tacc3耗竭对不同乳腺癌细胞系的细胞活性的影响。使用了四种具有不同分子亚型的不同乳腺癌细胞系模型。jimt-1(一种her2阳性乳腺癌细胞系)和bt-474t-dm1r(t-dm1抗性)(一种管腔b亚型乳腺癌细胞系)被示出具有高tacc3水平(saatci等人，2018)。另一方面，mda-mb-436和mda-mb-157都是三阴性乳腺癌(tnbc)细胞系。在本公开中，首先使用小干扰rna(sirna)来降低这些细胞系中的tacc3水平。图3b示出了在所有细胞系中，在用sirna治疗48小时后，总tacc3水平降低了大约60-70％。与此一致，观察到tacc3敲低会导致乳腺癌细胞的显著的生长抑制(图3c)。然后，研究了tacc3敲低可能引起的相关机制。在所有测试的乳腺癌细胞系中用sirna抑制tacc3水平会激活有丝分裂停滞、细胞凋亡和dna损伤(图3d)。
[0043]
本发明人通过测试它们在tacc3异常表达的乳腺癌细胞中的抗增殖作用，对一系列小分子进行了内部筛查(ma等人，2003；song等人，2018)。具体地，选择jimt-1细胞系用于筛查化合物在细胞活性中的影响，这是由于与其它测试的乳腺癌细胞系相比，它的高tacc3蛋白水平以及其体内致瘤性(saatci等人，2018；tanner等人)al.,2004)(其将分别在图7和8-9中讨论)。本发明人通过使用培养细胞的实验揭示了化合物5抑制细胞生长(ic
50
为190nm)并表现出抗肿瘤作用。因此，可以通过使用该化合物作为抗癌药物的活性药物成分(api)来开发有效的抗癌剂。因此，为了获得对表达高tacc3水平的癌细胞具有抗癌活性的新化合物，合成了具有式(i)基本结构的化合物。
[0044]
在一个方面，本公开涉及式(i)的化合物：
[0045][0046]
或其药学上可接受的盐，其中
[0047]
x1为n或cr6；
[0048]
x2是n或cr3；
[0049]
r1为芳基或杂芳基；
[0050]
r2为h或烷基；
[0051]
r3、r4和r6各自独立地为h、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、羧基、酰基、乙酰基、酯、硫酯、烷氧基、磷酰基、氨基、酰胺、氰基、硝基、叠氮基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基或磺酰胺；
和
[0052]
r5是杂环基、烷基或氨基。
[0053]
在某些实施方式中，该化合物不是
[0054]
在某些实施方式中，r1是芳基(例如，苯基)。在其他实施方式中，r1是杂芳基(例如，苯并二氧环戊烷、二氢苯并呋喃、苯并呋喃或嘧啶基)。
[0055]
在某些实施方式中，r1被一个或多个选自以下的取代基所取代：烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、羧基、酰基、乙酰基、酯、硫酯、烷氧基、磷酰基、氨基、酰胺、氰基、硝基、叠氮基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基、烷基磺酰基(例如，甲基磺酰基)或磺酰胺。在某些实施方式中，r1被以下所取代：烷基(例如，甲基、乙基、异丙基、氟乙基或三氟甲基)、烷氧基(例如，甲氧基、三氟甲氧基、二氟甲氧基、乙氧基或丙氧基)、烷硫基(例如，甲硫基)、芳烷氧基(例如，苄氧基)、羟基、卤素(例如，氟或氯)或氨基(例如，二甲氨基烷基)。在某些优选实施方式中，r1被卤素(例如，氟)取代。在某些实施方式中，卤素(例如，f)是异恶唑的对位。在其他实施方式中，卤素(例如，f)是异恶唑的邻位。在其他实施方式中，卤素(例如，f)是异恶唑的间位。在某些优选实施方式中，r1被两个卤素(例如，f)取代。在某些实施方式中，一个卤素(例如，f)是异恶唑的间位，且一个卤素(例如，f)是异恶唑的邻位。在其他优选实施方式中，r1被烷氧基(例如，甲氧基)取代。在某些实施方式中，烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的对位。在其他实施方式中，烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的邻位。在某些实施方式中，烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的间位。在又一些其它优选实施方式中，r1被烷基(例如，甲基、乙基或三氟甲基)取代。在又一些其它优选实施方式中，r1被卤素(例如，氟)和烷氧基(例如，甲氧基)取代。在进一步优选的实施方式中，r1被甲氧基部分和一个或两个氟部分取代。在最优选的实施方式中，r1被甲氧基部分和两个氟部分取代。在某些实施方式中，烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的对位，f是异恶唑的间位。在又一些其它实施方式中，烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的对位并且f是异恶唑的邻位。在其他实施方式中，卤素(例如，f)是异恶唑的对位并且烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的间位。在又一些实施方式中，烷氧基(例如，甲氧基)是异恶唑的对位；一个卤素(例如，f)是异恶唑的间位；并且一个卤素(例如，f)是异恶唑的邻位。
[0056]
在某些实施方式中，r2是烷基(例如，甲基或乙基)。在某些实施方式中，r2被氨基(例如，二甲氨基或二乙氨基)或腈取代。在其他实施方式中，r2是h。
[0057]
在某些实施方式中，x1是n。在其他实施方式中，x1是cr6。在某些实施方式中，r6是h。
[0058]
在某些实施方式中，x2是n。在其他实施方式中，x2是cr3。在某些实施方式中，r3是h或卤素(例如，氟或氯)。
[0059]
在某些实施方式中，r3是h或卤素(例如，氟或氯)。
[0060]
在某些实施方式中，r4是烷基(例如，甲基)。
[0061]
在某些实施方式中，r5是杂环基(例如，氮杂环丁烷基、吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、氧杂氮杂双环辛基(oxaazabicyclooctanyl)、氧杂氮杂双环庚基(oxaazabicycloheptnyl)、硫代吗啉基、硫代吗啉基二氧化物、六氢呋喃吡咯基
(hexahydrofuropyrrolyl)或氮杂双环己基)。在某些实施方式中，r5是含6元杂环基并且环的主链包含一个氮。在某些实施方式中，r5是含6元杂环基并且环的主链包含一个氮和一个氧。在其他实施方式中，r5是含7元杂环基并且环的主链包含一个氮。在某些实施方式中，r5是含7元杂环基并且环的主链包含一个氮和一个氧。在其他实施方式中，r5是含8元杂环基并且环的主链包含一个氮。在某些实施方式中，r5是含8元杂环基并且环的主链包含一个氮和一个氧。在某些优选的实施方式中，r5是含氮杂环基并且氮直接键合到带有r4取代基的芳基或杂芳基环上。在某些优选的实施方式中，r5是2,6-二甲基吗啉、4-甲基哌啶或4-(三氟甲基)哌啶。
[0062]
在某些实施方式中，r5被以下所取代：烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、羧基、酰基、乙酰基、酯、硫酯、烷氧基、磷酰基、氨基、酰胺、氰基、硝基、叠氮基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基、杂环基或磺酰胺。在某些实施方式中，r5被以下所取代：酯(例如，乙酯)、羧基、烷基(例如，甲基或三氟甲基)、羟烷基(例如，羟乙基)、卤素(例如，氟)、环烷基(例如，环丙基或环丁基)取代或杂环基(例如，氧杂环丁烷基(oxetnyl)或四氢呋喃基)。在某些优选实施方式中，r5被卤素(例如，氟)取代。在某些优选实施方式中，r5被两个烷基部分取代。在更进一步优选的实施方式中，r5被两个甲基部分取代。
[0063]
在其他实施方式中，r5是氨基。在某些实施方式中，r5被以下所取代：烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、羧基、酰基、乙酰基、酯、硫酯、烷氧基、磷酰基、氨基、酰胺、氰基、硝基、叠氮基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基、磺酰胺、环烷基或杂环基。在某些实施方式中，r5被以下所取代：烷基(例如，二氟乙基或异丁基)、烷氧基烷基(例如，甲氧基乙基)、羟烷基(例如，羟乙基)、环烷基(例如，环丙基)或杂环基(例如，吡喃基)取代。
[0064]
在某些实施方式中，式i的化合物具有由式ii表示的结构：
[0065][0066]
本公开的抗癌剂包含通式(i)表示的化合物，其中；
[0067]
r1：未取代的苯基或邻-、间-或对-ch3、c2h5、ch(ch3)2、och3、oc2h5、oc3h7、sch3、cf2ch3、cf3、ocf3、ochf2、n(ch3)2、f、cl、oh单或双取代的苯基、吡啶基(pyridyl)、苄氧基或胡椒基基团；r2：h、ch3；r3：h、f、cl；r4：h、ch3；x1：ch、n；r5：吗啉、2,6-二甲基吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉1,1-二氧化物、吗啉-4-胺、哌啶、四氢-2h-吡喃-4-胺、哌啶-1-胺、4-氟哌啶、4,4-二氟哌啶、4-甲基哌啶、4-(三氟甲基)哌啶、哌嗪、n-甲基哌嗪、吡咯烷、2-(4-哌啶基)乙醇、2-(1-哌嗪基)乙醇、4-哌啶甲酸、4-哌啶甲酸乙酯、(1r,4r)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷、(1s,4s)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷基团。
[0068]
在某些实施方式中，r1是苯基。在其他实施方式中，r1是吡啶基。在又一些其他实施方式中，r1是苄氧基。在又一些其他实施方式中，r1是胡椒基。在某些实施方式中，r1被以下所取代：ch3、c2h5、ch(ch3)2、och3、oc2h5、oc3h7、sch3、cf2ch3、cf3、ocf3、ochf2、n(ch3)2、f、cl或
oh。在某些优选实施方式中，r1被ch3取代。在其他优选实施方式中，r1被och3取代。在某些实施方式中，och3是异恶唑的对位。在某些实施方式中，och3是异恶唑的邻位。在某些实施方式中，och3是异恶唑的间位。在又一些其他优选实施方式中，r1被f取代。在某些实施方式中，r1被一个f取代。在某些实施例中，f是异恶唑的对位。在某些实施方式中，f是异恶唑的邻位。在某些实施方式中，f是异恶唑的间位。在某些实施方式中，r1被两个fs取代。在某些实施方式中，第一个f是异恶唑的间位，第二个f是异恶唑的邻位。在进一步优选的实施方式中，r1被och3和f取代。在某些实施方式中，och3是异恶唑的对位并且f是异恶唑的间位。在某些实施方式中，och3是异恶唑的对位并且f是异恶唑的邻位。在某些实施方式中，f是异恶唑的对位并且och3是异恶唑的间位。在进一步优选的实施方式中，r1被och3和两个f取代。在某些实施方式中，och3是异恶唑的对位并且两个f都是异恶唑的间位。在某些实施方式中，och3是异恶唑的对位；一个f是异恶唑的间位；并且一个f是异恶唑的邻位。
[0069]
在某些实施方式中，r2是h。在其他实施方式中，r2是ch3。
[0070]
在某些实施方式中，r3是h。在其它实施方式中，r3是f。在又一些其它实施方式中，r3是cl。
[0071]
在某些优选实施方式中，r5是吗啉。在其他优选实施方式中，r5是哌啶。在又一些其他优选实施方式中，r5是4-氟哌啶。在又一些其他优选实施方式中，r5是4,4-二氟哌啶。在又一些其他优选实施方式中，r5是3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷。在又一些其他优选实施方式中，r5是8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷。在又一些其他优选实施方式中，r5是2,6-二甲基吗啉。在又一些其他优选实施方式中，r5是4-甲基哌啶。在又一些其他优选实施方式中，r5是4-甲基哌啶。
[0072]
在某些实施方式中，x1是c。在其他实施方式中，x1是n。
[0073]
本公开的某些最终成分如下所示：
[0074]
3-(3-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物6)
[0075]
3-(2-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物7)
[0076]
n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)-3-苯基异恶唑-5-胺(化合物8)
[0077]
3-(4-乙氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物9)
[0078]
n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)-3-(4-丙氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物10)
[0079]
3-(4-氟苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物11)
[0080]
3-(4-氯苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物12)
[0081]
n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)-3-(对甲苯基)异恶唑-5-胺(化合物13)
[0082]
3-(4-乙基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物14)
[0083]
3-(4-异丙基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物15)
[0084]
n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物16)
[0085]
3-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物17)
[0086]
3-(4-(二氟甲氧基)苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物18)
[0087]
n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物19)
[0088]
3-(4-(甲硫基)苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物20)
[0089]
3-(4-(二甲基氨基)苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物21)
[0090]
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物22)
[0091]
3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物23)
[0092]
3-(3,4-二甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物24)
[0093]
3-(2,3-二氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物25)
[0094]
3-(苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑5-胺(化合物26)
[0095]
3-(6-甲氧基吡啶-3-基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物27)
[0096]
4-(5-((2-吗啉代嘧啶-4-基)氨基)异恶唑-3-基)苯酚(化合物30)
[0097]
3-(4-(苄氧基)苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物32)
[0098]
n-(2-((2r,6s)-2,6-二甲基吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物33)
[0099]
n-(2-(3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物34)
[0100]
n-(2-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛-3-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物35)
[0101]
n-(2-((1s,4s)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物36)
[0102]
n-(2-((1r,4r)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚-5-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物37)
[0103]
n-(2-(4-氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物38)
[0104]
n-(2-(4,4-二氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物39)
[0105]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-硫代吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物40)
[0106]
4-(4-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)氨基)嘧啶-2-基)硫代吗啉1,1-二氧化物(化合物41)
[0107]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物42)
[0108]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-甲基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物43)
[0109]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物44)
[0110]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(吡咯-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物45)
[0111]
2-(1-(4-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)氨基)嘧啶-2-基)哌啶-4-基)乙烷-1-醇(化合物46)
[0112]
2-(4-(4-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)氨基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)乙烷-1-醇(化合物47)
[0113]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物48)
[0114]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(哌嗪-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物49)
[0115]
1-(4-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)氨基)嘧啶-2-基)哌啶-4-甲酸乙酯(化合物50)
[0116]
1-(4-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)氨基)嘧啶-2-基)哌啶-4-甲酸(化合物51)
[0117]n4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)-n
2-吗啉代嘧啶-2,4-二胺(化合物52)
[0118]n4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)-n
2-(哌啶-1-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物53)
[0119]n4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)-n
2-(四氢-2h-吡喃-4-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物54)
[0120]
n-(5-氯-2-(4-氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物59)
[0121]
n-(5-氟-2-(4-氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物60)
[0122]
n-(2-(4-氟哌啶-1-基)-6-甲基嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物61)
[0123]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代吡啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物62)
[0124]
3-(4-甲氧基苯基)-n-甲基-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物63)
[0125]
3-(4-(二甲氨基)苯基)-n-(2-(4-氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物64)
[0126]
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-氟哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物65)
[0127]
n-(2-(3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基)嘧啶-4-基)-3-(3-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物66)
[0128]
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(吡咯烷-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物67)
[0129]
3-(2,3-二氢苯并呋喃-5-基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物69)
[0130]
3-(2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物70)
[0131]n2-环丙基-n
4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物71)
[0132]n2-异丁基-n
4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物72)
[0133]n2-(2-甲氧基乙基)-n
4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物73)
[0134]
n1,n
1-二乙基-n
2-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)-n
2-(2-吗啉代嘧啶-4-基)乙烷-1,2-二胺(化合物74)
[0135]n1-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)-n2,n
2-二甲基-n1-(2-吗啉代嘧啶-4-基)乙烷-1,2-二胺(化合物75)
[0136]
2-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)(2-吗啉代嘧啶-4-基)氨基)乙腈(化合物76)
[0137]
3-(5-甲氧基吡啶-2-基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物77)
[0138]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代吡啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物78)
[0139]
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代吡啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物79)
[0140]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(4-吗啉代-1,3,5-三嗪环-2-基)异恶唑-5-胺(化合物80)
[0141]n2-(2,2-二氟乙基)-n
4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)嘧啶-2,4-二胺(化合物81)
[0142]
2-((4-((3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)乙烷-1-醇(化合物82)
[0143]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物83)
[0144]
3-(2,3-二氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物84)
[0145]
3-(3,5-二氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物85)
[0146]
n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物86)
[0147]
3-(苯并呋喃-5-基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物87)
[0148]
3-(2,5-二氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物88)
[0149]
3-(2,5-二氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-((2r,6s)-2,6-二甲基吗啉基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物89)
[0150]n4-(3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-基)-n
2-甲基嘧啶-2,4-二胺(化合物90)
[0151]
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物91)
[0152]
3-(3-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-甲基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物92)
[0153]
n-(2-((2r,6s)-2,6-二甲基吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(3-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物93)
[0154]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-(三氟甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物94)
[0155]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-甲基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物95)
[0156]
n-(2-((2r,6s)-2,6-二甲基吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物96)
[0157]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(2,2,6,6-四甲基吗啉代)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物97)
[0158]
n-(2-(3,3-二甲基吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物98)
[0159]
n-(2-(2,2-二甲基吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物99)
[0160]
n-(2-(3,5-二甲基吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物100)
[0161]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(2-甲基吗啉代)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物101)
[0162]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(3-甲基吗啉代)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物102)
[0163]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(2-(三氟甲基)吗啉代)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物103)
[0164]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(四氢-1h-氟[3,4-c]吡咯-5(3h)-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物104)
[0165]
n-(2-(3-氮杂双环[3.1.0]己-3-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物105)
[0166]
n-(2-(7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物106)
[0167]
n-(2-(4,4-二甲基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物107)
[0168]
n-(2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚-6-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物108)
[0169]
n-(2-(1-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物109)
[0170]
n-(2-(6-氮杂螺[2.5]辛烷-6-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物110)
[0171]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(3-甲基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-8-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物111)
[0172]
n-(2-(2,2-二氟吗啉代)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物112)
[0173]
n-(2-(2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.2]辛-5-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物113)
[0174]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(3-(三氟甲基)吗啉代)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物114)
[0175]
n-(2-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚-3-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物115)
[0176]
n-(2-(2-氧杂-5-氮杂双环[4.1.0]庚-5-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物116)
[0177]
n-(2-(4-氧杂-7-氮杂螺[2.5]辛-7-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物117)
[0178]
n-(2-(7-氧杂-4-氮杂螺[2.5]辛-4-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物118)
[0179]
n-(2-(2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-8-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物119)
[0180]
n-(2-(2-氧杂-6-氮杂螺[3.4]辛-6-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物120)
[0181]
n-(2-(2-氧杂-7-氮杂螺[3.5]壬-7-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物121)
[0182]
n-(2-(2-氧杂-7-氮杂螺[4.4]壬-7-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物122)
[0183]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(2,2,6,6-四氟吗啉代)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺
(化合物123)
[0184]
n-(2-(6-氮杂双环[3.1.1]庚-6-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物124)
[0185]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(3-甲基-6-氮杂双环[3.1.1]庚-6-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物125)
[0186]
n-(2-(3,5-二甲基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物126)
[0187]
3-(2-氟-4-甲氧基苯基)-n-(2-(4-异丙基哌啶-1-基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物127)
[0188]
n-(2-(4-(二氟甲基)哌啶-1-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物128)
[0189]
n-(2-(6-氮杂螺[3.5]壬-6-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物129)
[0190]
n-(2-(2-氮杂螺[3.5]壬-2-基)嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物130)
[0191]
3-(2-氯-4-甲氧基苯基)-n-(2-吗啉代嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物131)
[0192]
本公开的各个原始中间体如下所示：
[0193]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4a)
[0194]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(3-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4b)
[0195]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(2-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4c)
[0196]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-苯基异恶唑-5-胺(化合物4d)
[0197]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-乙氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4e)
[0198]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-丙氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4f)
[0199]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-氟苯基)异恶唑-5-胺(化合物4g)
[0200]
3-(4-氯苯基)-n-(2-氯嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物4h)
[0201]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(对甲苯基)异恶唑-5-胺(化合物4i)
[0202]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-乙基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4j)
[0203]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-异丙基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4k)
[0204]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-(三氟甲基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物4l)
[0205]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-(1,1-二氟乙基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物4m)
[0206]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-(二氟甲氧基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物4n)
[0207]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-(三氟甲氧基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物4o)
[0208]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-(甲硫基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物4p)
[0209]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(4-(二甲基氨基)苯基)异恶唑-5-胺(化合物4r)
[0210]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(3-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4s)
[0211]
3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-n-(2-氯嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物4t)
[0212]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4u)
[0213]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(2,3-二氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物4v)
[0214]
3-(苯并[d][1,3]二氧戊环-5-基)-n-(2-氯嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物4y)
[0215]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(6-甲氧基吡啶-3-基)异恶唑-5-胺(化合物4z)
[0216]
3-(4-甲氧基苯基)-n-(2-(甲硫基)嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物28)
[0217]
4-(5-((2-氯嘧啶-4-基)氨基)异恶唑-3-基)苯酚(化合物29)
[0218]
3-(4-(苄氧基)苯基)-n-(2-氯嘧啶-4-基)异恶唑-5-胺(化合物31)
[0219]
n-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物55)
[0220]
n-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物56)
[0221]
n-(2-氯-6-甲基嘧啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物57)
[0222]
n-(2-氯吡啶-4-基)-3-(4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物58)
[0223]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(2-氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物132)
[0224]
n-(2-氯嘧啶-4-基)-3-(2,5-二氟-4-甲氧基苯基)异恶唑-5-胺(化合物133)
[0225]
本公开的抗癌剂包含通式(i)的化合物，其由本公开的某些最终化合物的以下化学结构表示：
[0226]
在某些实施方式中，该化合物选自
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231][0231]
或其药学上可接受的盐。
[0232]
上述化合物是本发明人合成的新型化合物。在下文中，将描述这些新化合物的合成方法。本公开的代表性化合物根据下文所述的一般合成方法进行并且在以下方案中更具体地进行说明。由于方案是说明性的，因此不应将本公开解释为受所表达的化学反应和条件的限制。制备用于方案中的各种起始原料是本领域技术人员熟知的。以下方案中表示的式(i)化合物或其形式的取代基如本文先前所定义。
[0233]
在另一方面，本公开提供包含本文公开的化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
[0234]
在又一方面，本公开提供在受试者中治疗tacc3介导的疾病或疾患的方法，包括向受试者施用权利要求1-53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，tacc3介导的疾病或疾患是癌症。在某些实施方式中，癌症是乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤癌、肺癌、中枢神经系统癌、卵巢癌、白血病癌、肾癌或前列腺癌。在某些实施方式中，癌症是选自nci-60组的癌症。
[0235]
在又一方面，本公开提供在受试者中治疗癌症的方法，其包括向受试者施用权利要求1-53中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，癌症是乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤癌、肺癌、中枢神经系统癌、卵巢癌、白血病癌、肾癌或前列腺癌。在某些实施方式中，癌症是选自nci-60组的癌症。
[0236]
在又一方面，本公开提供了制备本公开的化合物的方法，其中该方法由方案i表示：
[0237][0238]
方案i
[0239]
或其药学上可接受的盐，其中
[0240]
x1为n或cr6；
[0241]
x2是n或cr3；
[0242]
r1为芳基或杂芳基；
[0243]
r2为h或烷基；
[0244]
r3、r4和r6各自独立地为h、烷基、烯基、炔基、卤素、羟基、羧基、酰基、乙酰基、酯、硫酯、烷氧基、磷酰基、氨基、酰胺、氰基、硝基、叠氮基、烷硫基、烯基、炔基、环烷基或磺酰胺；
[0245]
r5是杂环基、烷基或氨基；
[0246]r51
卤素；
[0247]r52
是杂环基或烷基；
[0248]
x
10
是碱基
[0249]
x
11
是贵金属催化剂；以及
[0250]
x
12
是膦配体。
[0251]
在某些实施方式中，碱是碳酸盐、氧化物、叔胺、仲胺或氢化物。在某些实施方式中，氧化物是醇盐(例如，叔丁醇盐)。在某些实施方式中，叔胺是叔烷基胺(例如，二异丙基乙胺)。在某些实施方式中，氢化物是金属氢化物(例如，氢化钠)。在某些实施方式中，碳酸盐是金属碳酸盐(例如，碳酸铯)。
[0252]
在某些实施方式中，贵金属催化剂是钯催化剂(例如，乙酸钯(ii))。
[0253]
在某些实施方式中，膦催化剂是芳基膦(例如，三苯基膦)。在某些实施方式中，膦催化剂是xantphos。
[0254]
在某些实施方式中，方法还包括溶剂。在某些实施方式中，溶剂是叔丁醇、二甲基乙酰胺或二恶烷。
[0255]
在某些实施方式中，方法还包括加热。
[0256]
在某些实施方式中，方法在惰性气氛下进行。
[0257]
药物组合物
[0258]
本公开的组合物和方法可用于治疗有需要的个体。在某些实施方式中，个体是诸如人类等哺乳动物，或非人类哺乳动物。当施用于动物(例如，人类)时，组合物或化合物优选作为药物组合物施用，所述药物组合物包含例如本公开的化合物及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在本领域中是众所周知的并且包括，例如，水溶液如水或生理缓冲盐水或其它溶剂或载体如乙二醇、甘油、油如橄榄油或可注射的有机酯。在优选的实施方式中，当此类药物组合物用于人类给药，特别是用于侵入性给药途径(即，避免通过上皮屏障
转运或扩散的途径，例如，注射或植入)时，水溶液是无热原的，或基本上无热原的。例如，可以选择赋形剂以实现剂的延迟释放或选择性地靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是剂量单位形式，例如片剂、胶囊剂(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、颗粒剂、用于重构的冻干剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、栓剂、注射剂等。组合物还可以存在于透皮给药系统中，例如，皮肤贴剂。组合物还可以存在于适合局部给药的溶液中，例如，洗剂、乳膏或软膏。
[0259]
药学上可接受的载体可以包含生理学上可接受的剂，其例如起到稳定、增加溶解度或增加诸如本公开的化合物等化合物的吸收的作用。例如，这样的生理上可接受的剂包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质或其他稳定剂或赋形剂。例如，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的剂)的选择取决于组合物的给药途径。制剂或药物组合物可以是自乳化药物传递系统或自微乳化药物传递系统。药物组合物(制剂)也可以是脂质体或其他聚合物基质，其可以在其中掺入例如本公开的化合物。例如，包含磷脂或其他脂质的脂质体是无毒的、生理上可接受的和可代谢的载体，其制备和给药相对简单。
[0260]
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用的而没有过量的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其与合理的收益/风险比相称。
[0261]
如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料(encapsulating material)。在与配方的其他成分相容的意义上，每种载体必须是“可接受的”，对患者无害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油等油类；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；(21)药物配方中使用的其他无毒相容物质。
[0262]
药物组合物(制剂)可以通过多种给药途径中的任一种施用于受试者，例如，包括口服(例如，在水溶液或非水溶液或混悬液中服剂、片剂、胶囊(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、丸剂、粉剂、颗粒剂、用于舌头的糊剂)；通过口腔黏膜吸收(例如，舌下)；皮下；透皮(例如，作为贴在皮肤上的贴剂)；和局部(例如，作为涂抹在皮肤上的乳膏、软膏或喷雾剂)。该化合物也可以配制用于吸入。在某些实施方式中，化合物可以简单地溶解或悬浮在无菌水中。合适的给药途径和适用于其的组合物的细节可以在例如美国专利号6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896以及其中引用的专利中找到。
[0263]
制剂可以方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗的宿主、特定的给药方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，在百分之一百中，该量占活性成分的约百分之1至约百分之九十九，优选约百分之5至约百分之70，最优选约百分之10至约百分之30。
[0264]
制备这些制剂或组合物的方法包括使活性化合物(诸如本公开的化合物)与载体
和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，制剂通过将本公开的化合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使产品成型来制备。
[0265]
适合于口服给药的本公开的制剂可以是胶囊剂(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用调味的基础，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、冻干剂、粉剂、颗粒剂的形式，或作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液，或作为水包油或油包水液体乳液，或作为酏剂或糖浆，或作为锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或作为漱口水等，每一种都含有预定量的本公开的化合物作为活性成分。组合物或化合物也可以作为丸剂、冲剂或糊剂给药。
[0266]
为制备用于口服给药的固体剂型(胶囊剂(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、片剂、丸剂、糖衣丸、散剂、颗粒剂等)，将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙，和/或以下的任何：(1)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液缓凝剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土、膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；(10)络合剂，例如改性和未改性的环糊精；(11)着色剂。在胶囊(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可以包含缓冲剂。类似类型的固体组合物也可用作软填充和硬填充明胶胶囊中的填充剂，所述软填充和硬填充明胶胶囊使用诸如乳糖或乳糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。
[0267]
片剂可以通过压制或模制制成，任选地使用一种或多种辅助成分。压制片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，淀粉乙醇酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模压用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。
[0268]
药物组合物的片剂和其他固体剂型，诸如糖衣丸、胶囊剂(包括喷洒胶囊和明胶胶囊)、丸剂和颗粒剂，可以任选地刻痕或制备有包衣和壳，例如肠溶包衣和药物配制领域中公知的其它包衣制备。也可以使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球来配制它们，以提供其中活性成分的缓慢或受控释放，从而提供所需的释放曲线。它们可以通过例如通过细菌截留过滤器过滤来灭菌，或通过在使用前立即加入可以溶解在无菌水或一些其他无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的杀菌剂来灭菌。这些组合物还可以任选地包含不透明剂，并且可以是这样的组合物，其仅或优选地在胃肠道的特定部分中，任选地以延迟的方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实施例包括聚合物和蜡。如果合适的话，活性成分也可以与一种或多种上述赋形剂一起呈微囊化形式。
[0269]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、用于重构的冻干剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分之外，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、环糊精及其衍生物、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及其混合物。
[0270]
除了惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、加香剂和防腐剂。
[0271]
除活性化合物外，混悬剂还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶，以及其混合物。
[0272]
用于局部或透皮给药的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。可以在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
[0273]
除了活性化合物外，软膏、糊剂、乳膏和凝胶还可以含有赋形剂，诸如动植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌，或它们的混合物。
[0274]
除活性化合物外，粉剂和喷雾剂还可以含有赋形剂，诸如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂还可以包含常用的推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代的烃，诸如丁烷和丙烷。
[0275]
透皮贴剂具有向身体提供本公开的化合物的受控传递的附加优点。这种剂型可以通过将活性化合物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加化合物穿过皮肤的通量。这种通量的速率可以通过提供速率控制膜或将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制。
[0276]
如本文所用，短语“肠胃外给药(parenteral administration)”和“肠胃外给药(administered parenterally)”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉注射、肌肉注射、动脉内注射、鞘内注射、囊内注射、眶内注射、心内注射、皮内注射、腹腔注射、经气管注射、皮下注射、皮下注射、皮下注射、关节内注射、包膜下注射、蛛网膜下腔注射、椎管内注射和胸骨内注射和输注。适合肠胃外给药的药物组合物包含一种或多种活性化合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散体、悬浮液或乳液、或可在使用前重新配制成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末，其中可能含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。
[0277]
可用于本公开的药物组合物的合适的水性和非水性载体的实施例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油，诸如橄榄油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。
[0278]
这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过加入各种抗菌剂和抗真菌剂来确保防止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等。还可能需要在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的剂如单硬脂酸铝和明胶来实现。
[0279]
在某些情况下，为了延长药物的作用，需要减缓药物从皮下或肌肉注射中的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。药物的吸收速率取决于其溶出速率，而溶出速率又可能取决于晶体大小和晶型。或者，通过将药物溶解或悬浮在油载体中来实现肠胃外给药药物形式的延迟吸收。
[0280]
通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成受试化合物的微囊化基
质来制备可注射长效制剂。根据药物与聚合物的比例，以及所使用的特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实施例包括聚原酸酯和聚酸酐。还可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备长效注射制剂。
[0281]
对于本公开的方法中的使用，活性化合物可以本身或作为药物组合物给予，该药物组合物包含例如0.1至99.5％(更优选0.5至90％)的活性成分与药学上可接受的载体组合。
[0282]
引入方法也可以通过可充电或可生物降解的装置来提供。近年来，已经开发出各种缓释聚合物装置并在体内进行了测试，用于药物的受控传送，包括蛋白质生物药物。多种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，其包括可生物降解的和不可降解的聚合物，可用于形成在特定靶向位点持续释放化合物的植入物。
[0283]
药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以获得有效实现特定患者、组合物和给药方式的所需治疗性反应而对患者无毒性的活性成分的量。
[0284]
选择的剂量水平将取决于多种因素，其包括特定化合物或所用化合物组合或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所用特定化合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和既往病史以及医学领域熟知的类似因素。
[0285]
具有本领域一般技术的医师或兽医可以容易地确定和开出所需药物组合物的治疗有效量。例如，医师或兽医一开始可以以低于所需的水平的药物组合物或化合物的剂量以达到所需的治疗效果，并逐渐增加剂量直至达到所需的效果。“治疗有效量”是指足以引起所需治疗效果的化合物浓度。通常理解化合物的有效量将根据受试者的体重、性别、年龄和病史而变化。影响有效量的其他因素可包括但不限于患者病情的严重程度、所治疗的疾患、化合物的稳定性，以及如果需要，与本公开的化合物一起施用的其它类型的治疗剂。可以通过多次给药来传递更大的总剂量。确定功效和剂量的方法是本领域技术人员已知的(isselbacher等人.(1996)harrison's principles of internal medicine 13ed.,1814-1882，通过引用并入本文)。
[0286]
通常，用于本公开内容的组合物和方法的活性化合物的合适日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。
[0287]
如果需要，活性化合物的有效日剂量可以以一、二、三、四、五、六或更多个亚剂量在全天以适当的间隔分开给药，任选地以单位剂型给药。在本公开的某些实施方式中，活性化合物可以每天给药两次或三次。在优选的实施方式中，活性化合物将每天给药一次。
[0288]
接受这种治疗的患者是任何有需要的动物，包括灵长类动物，特别是人类；和其他哺乳动物，例如马、牛、猪、羊、猫和狗；家禽；和一般的宠物。
[0289]
在某些实施方式中，本公开的化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂联合给药。
[0290]
本公开包括本公开化合物的药学上可接受的盐在本公开的组合物和方法中的用途。在某些实施方式中，本公开的预期盐包括但不限于烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。在某些实施方式中，本公开的预期盐包括但不限于l-精氨酸、苯乙苄胺(benenthamine)、苄星(benzathine)、甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、脱醇、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺、海巴胺、1h-咪唑、锂、l-赖氨酸、镁、4-(2-羟乙基)吗啉、哌
嗪、钾、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠、三乙醇胺、氨丁三醇和锌盐。在某些实施方式中，本公开的预期盐包括但不限于na、ca、k、mg、zn或其他金属盐。在某些实施方式中，本公开的预期盐包括但不限于1-羟基-2-萘甲酸、2,2-二氯乙酸、2-羟基乙磺酸、2-氧代戊二酸、4-乙酰氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、乙酸、己二酸、l-抗坏血酸、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、(+)-樟脑酸、(+)-樟脑-10-磺酸、癸酸(癸酸)、己酸(己酸)、辛酸(正辛酸)、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环己基氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、d-葡萄糖庚酸、d-葡萄糖酸、d-葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、l-苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、烟酸、硝酸、油酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、l-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸和十一碳烯酸盐。
[0291]
药学上可接受的酸加成盐也可以作为各种溶剂化物存在，诸如与水、甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺等。也可以制备这些溶剂化物的混合物。此类溶剂化物的来源可以是来自结晶溶剂的、制备溶剂或结晶溶剂中固有的或此类溶剂无关的。
[0292]
润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和加香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
[0293]
药学上可接受的抗氧化剂的实施例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、丁基羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0294]
定义
[0295]
除非本文另有定义，本技术中使用的科学技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文描述的与化学、细胞和组织培养、分子生物学、细胞和癌症生物学、神经生物学、神经化学、病毒学、免疫学、微生物学、药理学、遗传学和蛋白质和核酸化学有关的命名和技术，是本领域众所周知和常用的那些。
[0296]
除非另有说明，本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法以及在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中描述的方法来实施。参见、例如、“principles of neural science”,mcgraw-hill medical,new york,n.y.(2000)；motulsky,“intuitive biostatistics”,oxford university press,inc.(1995)；lodish等人,“molecular cell biology,4th ed.”,w.h.freeman&co.,new york(2000)；griffiths等人,“introduction to genetic analysis,7th ed.”,w.h.freeman&co.,n.y.(1999)；和gilbert等人,“developmental biology,6th ed.”,sinauer associates,inc.,sunderland,ma(2000)。
[0297]
除非本文另有定义，否则本文使用的化学术语是根据本领域的常规用法使用的，“the mcgraw-hill dictionary of chemical terms”,parker s.,ed.,mcgraw-hill,san francisco,c.a.(1985)”为例。
[0298]
所有上述内容以及本技术中提及的任何其他出版物、专利和公开的专利申请均通过引用具体并入本文。在冲突的情况下，以本规范(包括其具体定义)为准。
[0299]
术语“剂”在本文中用于表示化学化合物(例如，有机或无机化合物、化合物的混合物)、生物大分子(例如，核酸、抗体，包括其部分以及人源化的，嵌合和人抗体和单克隆抗
体、蛋白质或其部分，例如，肽、脂质、碳水化合物)，或由生物材料如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。例如，剂(agent)包括结构已知的剂和结构未知的剂。这种剂抑制ar或促进ar降解的能力可以使它们适合作为本公开的方法和组合物中的“治疗剂”。
[0300]“患者”、“受试者”或“个体”可互换使用，指的是人类或非人类动物。这些术语包括哺乳动物，例如人类、灵长类动物、家畜(包括牛、猪等)、伴侣动物(例如，犬科动物、猫科动物等)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。
[0301]“治疗(treating)”疾病或患者是指采取措施获得有益或期望的结果，包括临床结果。如本文所用并且如本领域所熟知的，“治疗(treating)”是用于获得有益或期望结果，包括临床结果的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于一种或多种症状或病症的减轻或改善、疾病程度的减轻、稳定的(即不恶化)疾病状态、防止疾病传播、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓解以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”还可以意味着与未接受治疗的预期生存率相比延长的生存率。
[0302]
术语“预防”是本领域公认的，并且当用于与诸如局部复发(例如疼痛)、诸如癌症的疾病、诸如心力衰竭的综合征或任何其他医学状况病症相关的病症时，是本领域熟知，并且包括施用组合物，相对于未接受该组合物的受试者，该组合物减少受试者的医学病症症状的频率或延迟了其发作。因此，癌症的预防包括，例如，相对于未治疗的对照群体，在接受预防性治疗的患者群体中减少可检测到的癌性生长的数量，和/或相对于未治疗的对照群体，在治疗群体中延迟可检测的癌生长的出现，例如，通过统计学上和/或临床上显著的量。
[0303]
可以使用本领域技术人员已知的多种方法中的一种来对受试者“施用(administering)”物质、化合物或剂或物质、化合物或剂“的给药(administration of)”。例如，化合物或剂可以通过静脉内、动脉、皮内、肌肉内、腹膜内、皮下、眼部、舌下、口服(通过摄入)、鼻内(通过吸入)、脊柱内、脑内和经皮(通过吸收，例如，通过皮肤导管)给药。化合物或剂也可以通过可再充电或可生物降解的聚合物装置或其他装置适当地引入，例如贴片和泵，或制剂，其提供化合物或剂的延长、缓慢或受控释放。例如，也可以一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行施用。
[0304]
例如，向受试者施用物质、化合物或剂的适当方法还将取决于受试者的年龄和/或身体状况以及化合物或剂的化学和生物学性质(例如，溶解度、消化率、生物利用度、稳定性和毒性)。在一些实施方式中，化合物或剂被口服施用，例如通过摄入施用于受试者。在一些实施方式中，口服施用的化合物或剂在缓释或缓释制剂中，或使用用于这种缓释或缓释的装置来施用。
[0305]
如本文所用，短语“联合给药”是指两种或更多种不同治疗剂的任何形式的给药，使得在先前施用的治疗剂在体内仍然有效的同时施用第二种剂(例如，两种剂同时对患者有效，这可能包括两种剂的协同作用)。例如，不同的治疗化合物可以以相同的制剂或单独的制剂同时或依次给药。因此，接受这种治疗的个体可以受益于不同治疗剂的联合作用。
[0306]
药物或剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当施用于受试者时将具有预期治疗效果的药物或剂的量。完全的治疗效果不一定要通过一剂量的给药来实现，而可能只有在一系列剂量的给药后才会出现。因此，治疗有效量可以以一次或多次的给药来施用。受试者所需的精确有效量将取决于，例如，受试者的体型、健康和年龄，以及所治疗疾病的性质
和程度，诸如癌症或mds。技术人员可以通过常规实验容易地确定给定情况下的有效量。
[0307]
如本文所用，术语“可选”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括事件或情况发生的实例以及不发生的实例。例如，“任选取代的烷基”是指烷基可以被取代以及烷基未被取代。
[0308]
应当理解，本领域普通技术人员可以选择本公开的化合物上的取代基和取代模式，以产生化学稳定的化合物，该化合物可以通过本领域已知的技术以及下面阐述的那些方法，从容易获得的起始原料容易地合成。如果取代基本身被多于一个基团取代，则应理解这些多个基团可以在相同碳或不同碳上，只要产生稳定的结构即可。
[0309]
如本文所用，术语“任选地取代的”是指用指定取代基的基团取代给定结构中的一到六个氢基团，其包括但不限于：羟基、羟烷基、烷氧基、卤素、烷基、硝基、甲硅烷基、酰基、酰氧基、芳基、环烷基、杂环基、氨基、氨基烷基、氰基、卤代烷基、卤代烷氧基、-oco-ch
2-o-烷基、-op(o)(o-烷基)2或-ch
2-op(o)(o-烷基)2。优选地，“任选地取代”是指在给定结构中的一至四个氢基团(hydrogen radical)被上述取代基取代。更优选地，一到三个氢基团被如上所述的取代基取代。应当理解，取代基可以被进一步取代。
[0310]
如本文所用，术语“烷基”是指饱和脂族基团，包括但不限于c
1-c
10
直链烷基或c
1-c
10
支链烷基。优选地，“烷基”基团是指c
1-c6直链烷基基团或c
1-c6支链烷基基团。最优选地，“烷基”基团是指c
1-c4直链烷基基团或c
1-c4支链烷基基团。“烷基”的实施例包括但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、新-戊基、1-己基、2-己基、3-己基、1-庚基、2-庚基、3-庚基、4-庚基、1-辛基、2-辛基、3-辛基或4-辛基等。“烷基”基团可以被任选地取代。
[0311]
术语“酰基”是本领域公认的并且是指由通式烃基c(o)-表示的基团，优选烷基c(o)-。
[0312]
术语“酰氨基”是本领域公认的并且是指被酰基基团取代的氨基基团并且可以，例如，由式烃基c(o)nh-表示。
[0313]
术语“酰氧基”是本领域公认的并且是指由通式烃基c(o)o-表示的基团，优选烷基c(o)o-。
[0314]
术语“烷氧基”是指具有与其连接的氧的烷基。代表性的烷氧基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
[0315]
术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基取代的烷基并且可以由通式烷基-o-烷基表示。
[0316]
术语“烷基”是指饱和脂族基团，其包括直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环族)基团、烷基取代的环烷基基团和环烷基取代的烷基基团。在某些实施方式中，直链或支链烷基在其主链中具有30个或更少的碳原子(例如，直链为c
1-c
30
，支链为c
3-c
30
)，并且更优选为20或更少。
[0317]
此外，在整个说明书、实施例和权利要求书中使用的术语“烷基”旨在包括未取代和取代的烷基基团，后者是指在烃主链的一个或多个碳上具有取代氢的取代基的烷基部分，包括卤代烷基如三氟甲基和2,2,2-三氟乙基等。
[0318]
术语“c
x-y”或“c
x-c
y”当与化学部分如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基结合使用时，意在包括含有从x到y的基团链中的碳。c0烷基表示基团位于末端位置的氢，如果在内部则为键。例如，c
1-6
烷基在链中含有一到六个碳原子。
[0319]
如本文所用，术语“烷基氨基”是指被至少一个烷基基团取代的氨基基团。
[0320]
如本文所用，术语“烷硫基”是指被烷基基团取代的硫醇基团并且可以由通式烷基s-表示。
[0321]
如本文所用，术语“酰胺”是指基团
[0322][0323]
其中，r9和r
10
各自独立地表示氢或烃基基团，或r9和r
10
与它们所连接的n原子一起构成杂环，该杂环在该环结构中具有4至8个原子。
[0324]
术语“胺”和“氨基”是本领域公认的并且是指未取代的和取代的胺及其盐，例如，这部分可以由下式表示：
[0325][0326]
其中，r9、r
10
和r
10
'各自独立地表示氢或烃基基团，或r9和r
10
与它们所连接的n原子一起构成杂环，该杂环在该环结构中具有4至8个原子。
[0327]
如本文所用，术语“氨基烷基”是指被氨基基团取代的烷基基团。
[0328]
如本文所用，术语“芳烷基”是指被芳基基团取代的烷基基团。
[0329]
如本文所用，术语“芳基”包括取代或未取代的单环芳族基团，其中环的每个原子都是碳。优选地，该环是5-至7-元环，更优选6-元环。术语“芳基”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳对于两个相邻的环是共同的，其中至少一个环是芳族的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。芳基包括苯、萘、菲、苯酚、苯胺等。
[0330]
术语“氨基甲酸酯”是本领域公认的并且是指一组
[0331][0332]
其中，r9和r
10
独立地表示氢或烃基基团。
[0333]
如本文所用，术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基基团。
[0334]
术语“碳环”包括5-7元单环和8-12元双环。双环碳环的每个环可以选自饱和的、不饱和的和芳族环。碳环包括其中一个、两个或三个或更多个原子在两个环之间共享的双环分子。术语“稠合碳环”是指其中每个环与另一个环共享两个相邻原子的双环碳环。稠合碳环的每个环可以选自饱和的、不饱和的和芳族环。在示例性实施方式中，芳族环(例如，苯基)可以稠合到饱和的或不饱和的环(例如，环己烷、环戊烷或环己烯)。只要化合价允许，饱和的、不饱和的和芳族双环的任何组合都包括在碳环的定义中。示例性“碳环”包括环戊烷、环己烷、双环[2.2.1]庚烷、1,5-环辛二烯、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛-3-烯、萘和金刚烷。示例性稠合碳环包括萘烷、萘、1,2,3,4-四氢化萘、双环[4.2.0]辛烷、4,5,6,7-四氢-1h-茚和双环[4.1.0]庚-3-烯。“碳环”可以在任何一个或多个能够带有氢原子的位置上被取代。
[0335]
如本文所用，术语“碳环基烷基”是指被碳环基团取代的烷基基团。
[0336]
术语“碳酸盐”是本领域公认的并且指的是基团-oco
2-。
[0337]
如本文所用，术语“羧基”是指由式-co2h表示的基团。
[0338]
如本文所用，术语“酯”是指基团-c(o)or9，其中，r9代表烃基基团。
[0339]
如本文所用，术语“醚”是指通过氧与另一个烃基基团连接的烃基基团。因此，烃基基团的醚取代基可以是烃基-o-。醚可以是对称的或不对称的。醚的实施例包括但不限于杂环-o-杂环和芳基-o-杂环。醚包括“烷氧基烷基”基团，其可由通式烷基-o-烷基表示。
[0340]
如本文所用，术语“卤素(halo)”和“卤素(halogen)”是指卤素并且包括氯、氟、溴和碘。
[0341]
如本文所用，术语“杂烷基”和“杂芳烷基”是指被杂芳基取代的烷基。
[0342]
术语“杂芳基(heteroaryl)”和“杂芳基(hetaryl)”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选5-至7-元环，更优选5-至6-元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选一至四个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂芳基”和“杂芳基(hetaryl)”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳对于两个相邻的环是共同的，其中至少一个环是芳香杂环的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基基团包括例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
[0343]
如本文所用，术语“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧和硫。
[0344]
如本文所用，术语“杂环基烷基”是指被杂环基基团取代的烷基基团。
[0345]
术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，优选3-至10-元环，更优选3-至7-元环，其环结构包括至少一个杂原子，优选一到四个杂原子，更优选一或两个杂原子。术语“杂环基”和“杂环的”还包括具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳对于两个相邻的环是共同的，其中至少一个环是杂环的，例如，其他环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。例如，杂环基包括哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。
[0346]
如本文所用，术语“烃基”是指通过不具有＝o或＝s取代基的碳原子键合的基团，并且通常具有至少一个碳-氢键并且主要是碳主链，但是可以任选地包括杂原子。因此，就本技术的目的而言，如甲基、乙氧基乙基、2-吡啶基甚至三氟甲基的基团被认为是烃基，但是诸如乙酰基(其在连接碳上具有＝o取代基)和乙氧基(其被连接通过氧气，而不是碳)的取代基不被认为是烃基。烃基基团包括但不限于芳基、杂芳基、碳环、杂环、烷基、烯基、炔基及其组合。
[0347]
如本文所用，术语“羟烷基”是指被羟基取代的烷基。
[0348]
当与化学部分如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基结合使用时，术语“低级”意在包括取代基中有十个或更少原子，优选六个或更少原子的基团。例如，“低级烷基”是指包含十个或更少碳原子、优选六个或更少碳原子的烷基。在某些实施方式中，本文定义的酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基取代基分别为低级酰基、低级酰氧基、低级烷基、低级烯基、低级炔基或低级烷氧基，无论它们单独出现还是与其他取代基组合出现，诸如在引述中的羟烷基和芳烷基(在这种情况下，例如，当计算烷基取代基中的碳原子时，芳基基团内的原子不计算在内)。
[0349]
术语“多环基”、“多环”和“多环的”是指两个或更多个环(例如，环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基)，其中两个或更多个原子对两个相邻的环是共有的，例如，环是“稠环”。多环的每个环可以被取代或未被取代。在某些实施方式中，多环的每个环在环中包含3至10个原子，优选5至7个。
[0350]
术语“硫酸盐”是本领域公认的并且是指基团-oso3h，或其药学上可接受的盐。
[0351]
术语“磺酰胺”是本领域公认的并且是指由以下通式表示的基团
[0352][0353]
其中，r9和r
10
独立地代表氢或烃基。
[0354]
术语“亚砜”是本领域公认的并且指的是基团-s(o)-。
[0355]
术语“磺酸盐”是本领域公认的并且是指基团so3h，或其药学上可接受的盐。
[0356]
术语“砜”是本领域公认的并且是指基团-s(o)
2-。
[0357]
术语“取代的”是指在主链的一个或多个碳上具有取代氢的取代基的部分。应理解，“取代”或“被取代”包括隐含的条件，即这种取代与取代的原子和取代基的允许化合价一致，并且取代产生稳定的化合物，例如，其不会自发地经历转化，例如通过重排、环化、消除等。如本文所用，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有容许的取代基。在广义方面，允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族取代基。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个、相同或不同。出于本公开的目的，杂原子(如氮)可以具有氢取代基和/或满足杂原子的化合价的本文所述的有机化合物的任何允许的取代基。取代基可包括本文所述的任何取代基，例如，卤素、羟基、羰基(例如，羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如，硫酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸盐、膦酸盐、次膦酸盐、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸盐、磺酸盐，氨磺酰基(sulfamoyl)、亚磺酰氨基(sulfonamido)、磺酰基(sulfonyl)、杂环基、芳烷基或芳族或芳香杂环部分。本领域技术人员将理解，如果合适的话，烃链上被取代的部分本身可以被取代。
[0358]
如本文所用，术语“硫代烷基”是指被硫醇基团取代的烷基基团。
[0359]
如本文所用，术语“硫酯”是指基团-c(o)sr9或-sc(o)r9[0360]
其中，r9代表烃基。
[0361]
如本文所用，术语“硫醚”等同于醚，其中氧被硫取代。
[0362]
术语“尿素”是本领域公认的并且可以用以下通式表示
[0363][0364]
其中，r9和r
10
独立地代表氢或烃基。
[0365]
如本文所用，术语“调节”包括抑制(inhibition)或抑制(suppression)功能或活性(例如细胞增殖)以及增强功能或活性。
[0366]
短语“药学上可接受的”是本领域公认的。在某些实施方式中，该术语包括组合物、赋形剂、佐剂、聚合物和其他材料和/或剂型，在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物
的组织接触使用的而没有过量的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的那些，其与合理的收益/风险比相称。
[0367]“药学上可接受的盐”或“盐”在本文中是指适合或与患者治疗相容的酸加成盐或碱加成盐。
[0368]
如本文所用，术语“药学上可接受的酸加成盐”是指由式i表示的任何碱化合物的任何无毒的有机或无机盐。形成合适盐的示例性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及金属盐如正磷酸一氢钠和硫酸氢钾。形成合适盐的示例性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸，例如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸，以及磺酸如对甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单酸盐或二酸盐，并且此类盐可以水合、溶剂化或基本上无水的形式存在。通常，式i化合物的酸加成盐更易溶于水和各种亲水性有机溶剂，并且与它们的游离碱形式相比通常表现出更高的熔点。合适的盐的选择是本领域技术人员已知的。其他非药学上可接受的盐，例如草酸盐，可用于分离式i化合物以供实验室使用，或用于随后转化为药学上可接受的酸加成盐。
[0369]
如本文所用，术语“药学上可接受的碱加成盐”是指由式i表示的任何酸化合物或其任何中间体的任何无毒有机或无机碱加成盐。形成合适盐的示例性无机碱包括氢氧化锂、钠、钾、钙、镁或钡。形成合适盐的示例性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺，例如甲胺、三甲胺和甲基吡啶(picoline)或氨。合适的盐的选择是本领域技术人员已知的。
[0370]
可用于本公开的方法和组合物的许多化合物在其结构中具有至少一个立体中心。该立体中心可以存在于r或s构型中，所述r和s表示法与在pure appl.chem.(1976),45,11-30中描述的规则一致。本公开内容涵盖所有立体异构形式，诸如化合物、盐、前药或其混合物(包括立体异构体的所有可能混合物)的对映异构和非对映异构形式。参见，例如，wo01/062726。
[0371]
此外，某些含有烯基基团的化合物可能以z(zusammen)或e(entgegen)异构体的形式存在。在每种情况下，本公开内容包括混合物和单独的单独异构体。
[0372]
一些化合物也可以互变异构形式存在。这些形式虽然没有在本文描述的公式中明确指出，但旨在包括在本公开的范围内。
[0373]“前药”或“药学上可接受的前药”是指在施用后在宿主中代谢(例如，水解或氧化)以形成本公开的化合物(例如，式i的化合物)的化合物。前药的典型实施例包括在活性化合物的功能部分上具有生物不稳定或可裂解(保护)基团的化合物。前药包括可被氧化、还原、胺化、脱氨基、羟基化、脱羟基化、水解、脱水解、烷基化、脱烷基化、酰化、脱酰化、磷酸化或去磷酸化以产生活性化合物的化合物。在美国专利号6,875,751、7,585,851和7,964,580中公开了使用酯或氨基磷酸酯作为生物不稳定或可裂解(保护)基团的前药的实施例，这些专利的公开内容通过引用并入本文。本公开的前药被代谢以产生式i化合物。本公开在其范围内包括本文所述化合物的前药。选择和制备合适前药的常规程序如“design of prodrugs”ed.h.bundgaard,elsevier,1985中所述。
[0374]
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如可用于配制用于药用或治疗用途的药物的液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封包材料。
[0375]
如本文所用的术语“溶解度对数”、“logs”或“logs”在本领域中用于量化化合物的水溶性。化合物的水溶性显著影响其吸收和分布特性。低溶解度通常伴随着较差的吸收。logs值是以mol/l为单位测量的溶解度的单位剥离对数(以10为底)。
[0376]
实施例
[0377]
现在对本公开进行一般性描述，通过参考以下实施例将更容易理解，这些实施例仅出于说明本公开的某些方面和实施方式的目的而被包括在内，并不旨在限制本公开。
[0378]
实施例1：本公开化合物的示例性合成
[0379]
在式(i)中，当r2、r3和r4为h且r5为的吗啉时具有r1修饰的衍生物
[0380]
化合物5-27的合成方法论如方案1所示，包括以下工艺步骤：
[0381]
i)在socl2(亚硫酰氯)的存在下，通过在etoh(乙醇)中回流来酯化适当的酸衍生物以产生化合物1a-z，
[0382]
ii)在nah(氢化钠；矿物油中60％分散体)存在下，化合物1a-z在甲苯中的溶液与乙腈回流，得到β-酮腈衍生物2a-z，
[0383]
iii)化合物2a-z与h2n.oh hcl(盐酸羟胺)在naoh(氢氧化钠)水溶液中于100℃下反应，得到异恶唑-5-胺类似物3a-z，
[0384]
iv)在t-buok(叔丁醇钾)存在下，化合物3a-z与2,4-二氯嘧啶或4-氯-2-(甲硫基)嘧啶(仅针对化合物28)在t-buoh(叔丁醇)中于室温下反应，得到化合物4a-z和化合物28，
[0385]
v)n-buoh(丁醇)中的化合物4a-z与吗啉一起回流以产生化合物5-27。
[0386][0387]
方案1.化合物5-28的合成。试剂和条件：(a)socl2，etoh，回流，3h；(b)nah、mecn、甲苯，回流，2h；(c)h2n.oh hcl、naoh、h2o，回流，4h；(d)t-buok，2,4-二氯嘧啶，t-buoh，rt，24h；(e)t-buok，4-氯-2-(甲硫基)嘧啶，t-buoh，rt，24h；(f)吗啉，n-buoh，回流，5h。
[0388]
化合物30的合成方法论如图2所示，包括以下工艺步骤：
[0389]
i)在bbr3(三溴化硼)存在下，0℃下，在dcm(二氯甲烷)中对化合物4a进行脱甲基化，得到化合物29，
[0390]
ii)将n-buoh中的化合物29与吗啉一起回流，得到化合物30。
[0391]
化合物32的合成方法论如方案2所示，包括以下工艺步骤：
[0392]
i)在diad(偶氮二甲酸二异丙酯)和pph3(三苯基膦)存在下，化合物29在无水thf
(四氢呋喃)中与苯甲醇在0℃下反应产生化合物31，
[0393]
ii)n-buoh中的化合物31与吗啉一起回流，得到化合物32。
[0394][0395]
方案2.化合物30和32的合成。试剂和条件：(a)bbr3，dcm，0℃，24h；(b)苯甲醇，diad，pph3，thf，0℃，24h；c)吗啉，n-buoh，回流，5h。
[0396]
在式(i)中，当r1为4-甲氧基苯基，r2、r3和r4为h时具有r5修饰的衍生物
[0397]
对于具有r5修饰的衍生物的合成，使用了方案3中概述的合成程序。因此，化合物4a或化合物28被用作起始中间体，然后用各种胺处理，但不限于作为仲胺衍生物的吗啉、硫代吗啉、哌嗪、哌啶和吡咯烷或作为伯胺的氨基吗啉、氨基哌啶和氨基吡喃衍生物，使用方法a、b或c(33-54)，得到最终化合物。如果胺衍生物是hcl盐形式，则使用方法b(对于化合物34-39)。如果胺衍生物是伯胺，则使用方法c(对于化合物52-54)。
[0398]
化合物33-54的合成方法论如方案3所示，包括以下工艺步骤：
[0399]
i)化合物4a和不是hcl(氯化氢)盐形式的适当胺衍生物在buoh中回流以获得化合物33、40-51(方法a)。
[0400]
·
对于化合物49，使用n-boc保护的哌嗪，然后在dcm中用tfa(三氟乙酸)水解保护基团，得到最终化合物49。此外，在lioh.h2o(氢氧化锂一水合物)的存在下，化合物50在thf:h2o中于回流下水解，得到化合物51。
[0401]
ii)如果胺衍生物呈盐形式，则在dipea(n,n-二异丙基乙胺)存在下，将适当的胺的盐酸盐溶解在buoh中，得到游离胺，其
[0402]
iii)然后在回流下与化合物4a反应以获得最终化合物34-39(方法b)。
[0403]
iv)如果胺衍生物是伯胺，则使用化合物28作为起始原料，首先在dcm中用m-cpba(间氯过氧苯甲酸)处理，然后得到的砜中间体与相应的胺衍生物反应得到最终化合物52-54(方法c)。
[0404][0405]
方案3.化合物33-54的合成。试剂和条件：(a)适当的胺衍生物，n-buoh，回流，5h；(b)适当的胺衍生物，dipea，n-buoh，回流，5h；(c)i)m-cpba，dcm，0℃，2h；ii)适当的胺衍生物，n-buoh，回流，5h。
[0406]
在式(i)中，当r1为4-苯基甲氧基，r2为h且r5为吗啉或4-氟哌啶时具有嘧啶环(x、r3、r4取代)修饰的衍生物
[0407]
对于具有嘧啶环修饰的衍生物，使用方案4中概述的合成程序。以化合物3a为起始原料，其与各种嘧啶衍生物(如2,4,5-三氯嘧啶、2,4-二氯-5-氟嘧啶、2,4-二氯-6-甲基嘧啶或2,4-二氯吡啶)经历亲核芳香取代反应得到最终化合物59-62。
[0408]
化合物59-62的合成方法论如方案4所示，包括以下工艺步骤：
[0409]
i)在室温下，在t-buok的存在下，化合物3a与合适的嘧啶衍生物在t-buoh中反应，得到化合物55-57(方法a)。在室温下，在nah的存在下，化合物3a与2,4-二氯吡啶在dma(n,n-二甲基乙酰胺)中反应以获得化合物58(方法b)。
[0410]
ii)在dipea的存在下，化合物55-57与4-氟哌啶hcl在n-buoh中反应生成化合物59-61(方法c)。
[0411]
iii)在xantphos(4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽)、cs2co3(碳酸铯)和pd(oac)2(乙酸钯(ii))的存在下，化合物58在二恶烷中用吗啉在100℃下于微波中处理30分钟以获得化合物62(方法d)。
[0412][0413]
方案4.化合物59-62的合成。试剂和条件：(a)适当的嘧啶衍生物，t-buok，t-buoh，rt，24h；(b)2,4-二氯吡啶，nah，dma，rt，24h；(c)4-氟哌啶hcl，dipea，n-buoh，回流，5h；(d)吗啉，cs2co3，黄磷，pd(oac)2，二恶烷，100℃，30分钟，微波。
[0414]
当r1是4-甲氧基苯基，r3和r4是h且r5是吗啉时，“n”桥甲基化(r2取代)
[0415]
对于化合物63的合成，使用了方案5中概述的合成程序。以化合物5为起始原料，经烷基化得到n-甲基化衍生物63。
[0416]
化合物63的合成方法论如方案5所示，包括以下工艺步骤：
[0417]
i)将化合物5溶解在dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中并在cs2co3的存在下于室温与ch3i(甲基碘)反应得到化合物63。
[0418][0419]
方案5.化合物63的合成。试剂和条件：(a)ch3i，cs2co3，dmf，rt，2h。
[0420]
当r2、r3和r4为h时，式(i)中具有r1和r5的不同组合的化合物的合成
[0421]
根据细胞毒性研究的结果，一些具有强效活性的化合物的r1和r2组合成一个新的分子，得到了新的化合物。对于杂化化合物的合成，使用了方案6中概述的合成程序。
[0422]
化合物64-67的合成方法如方案6所示，包括以下工艺步骤：
[0423]
i)将化合物4r或4s和适当的胺衍生物在buoh中回流，得到最终化合物；如果胺衍生物呈盐形式，则在dipea(n,n-二异丙基乙胺)的存在下，将适当的胺的hcl盐溶于buoh中，得到游离胺，其再与化合物4r或4s在回流下反应得到最终化合物64-66(方法a)。
[0424]
ii)如果胺衍生物不是呈hcl盐的形式，化合物4s用胺衍生物在n-buoh中处理以获得最终化合物67(方法b)。
[0425][0426]
方案6.化合物64-67的合成。试剂和条件：(a)适当的胺衍生物，dipea，n-buoh，回流，5h；(b)适当的胺衍生物，n-buoh，回流，5h。
[0427]
本公开的实施方式包括原始中间体化合物的化学结构，其与本文所述的胺衍生物反应，但不限于，用于合成通式(i)的化合物，并且可以选自在表1中列出的化合物。
[0428]
表1.
[0429]
[0430]
[0431][0432]
本公开的实施方式包括表2中列出的具有特有的1h nmr/
13
c nmr性质的化合物。
[0433]
表2.
[0434]
[0435]
[0436]
[0437]
[0438]
[0439]
[0440]
[0441][0442]
实施例2：示例性生物学结果
[0443]
使用以下程序确定本公开的化合物治疗tacc3介导的癌症或其相关症状或并发症的能力。使用jimt-1细胞系测试本公开的化合物对细胞死亡诱导的活性，该细胞系是具有高tacc3水平的细胞系。通过graphpad prism(graphpad软件)计算半最大细胞增殖的抑制作用所需的每种化合物的浓度。下面的表3按对细胞生长的抑制作用强度的顺序展示了化合物。本公开化合物5、9、13、14、20-24、26、33、34、37-40、42-45、59、60和63-67对细胞生长具有显著的抑制作用。
[0444]
表3.本公开的化合物对jimt-1细胞的ic
50
值。
[0445]
[0446]
[0447][0448]
由于本公开的这些化合物表现出细胞生长抑制作用，因此当它们在药物组合物中用作抗癌剂时，可以预期它们会抑制肿瘤的生长。因此，本发明人选择化合物5进一步详细分析其对细胞生长的活性，特别是其对tacc3和细胞分裂的作用，以及其在相关动物模型中对肿瘤生长的体内抑制作用。
[0449]
为了确定化合物5是否靶向tacc3，在本公开中进行了基于随温度升高的药物靶稳定化的细胞热转移测定(cetsa)(martinez molina et al.,2013)。为此，将具有载体、化合物5或spl-b(作为阳性对照)的jimt-1细胞孵育6小时，然后收集细胞裂解物。用化合物5治疗jimt-1乳腺癌细胞在温度升高后显著稳定了细胞tacc3，表明化合物5可能在jimt-1细胞中与tacc3特异性地相互作用(图4a)。蛋白质热熔解曲线也示出载体和化合物5处理的谱带强度之间的热转移。这种相互作用也通过等温滴定量热法(itc)得到验证。将tacc3滴定到化合物5中，并通过记录量热温差和热量变化进行监测。如图4b所示，化合物5在25℃下与tacc3结合的热力学参数(kd：1.5nm；δh：4.929e7 cal/mol；δs：1.65e5cal/mol/deg，n：0.704)证明了这两个分子之间的相互作用。化合物5与tacc3的结合最后通过药物亲和力反应的靶点稳定性(darts法)得到验证。darts是一种无标签策略，以识别小分子的潜在直接蛋白质靶标，并基于与小分子结合后靶蛋白的稳定性和保护免受蛋白水解(lomenick，jung等人，2011，pai，lomenick等人，2015)。如图6c所示，在链霉蛋白酶的存在下，tacc3蛋白在与化合物5孵育后稳定(图4d)。
[0450]
之后，比较了tacc3抑制剂(化合物5)与可用的tacc3抑制剂(khs101和spl-b)对细胞活性的相对影响。测试了jimt-1、mda-mb-436、mda-mb-157和bt-474t-dm1r细胞系对这三种药物的反应。在所有测试的细胞系中，发现化合物5的ic
50
值显著低于两种可用的tacc3抑制剂(图5a)。与khs101和spl-b相比，用化合物5处理的不同癌细胞系的细胞活性显著降低也通过使用jimt-1细胞的集落形成实验得到验证。结果，用化合物5处理的jimt-1细胞的平均集落数显著低于用相同剂量的其他两种抑制剂处理的那些(图5b)。因此，用srb测定法检测到的低细胞活性和低数量的jimt-1细胞集落表明化合物5在体外比其他两种tacc3抑制剂(khs101和spl-b)更有效和更有效力。在化合物5、spl-b和khs101治疗后，进一步测试了在乳腺癌细胞系中的有丝分裂停滞、细胞凋亡和dna损伤过程的诱导，如sitacc3治疗的情况。证明使用化合物5的分析结果与使用sirna抑制tacc3表达的实验结果非常一致，进一步表明化合物5靶向tacc3。结果，sitacc3诱导的有丝分裂停滞、dna损伤和细胞凋亡可以被化合物5以剂量依赖性方式重演(图5c)。另一方面，与化合物5治疗的细胞相比，在相当高的剂量下才观察到通过spl-b和khs101治疗对这些标志物的相似诱导水平。尽管包括了其他人使用的更高的khs101剂量(campo&breuer，2018)，但仅在非常高的剂量下才观察到这些标志物的诱导。显然，这些结果与通过用三种抑制剂的治疗获得的细胞活性数据和ic
50
值一致(参见图5a)。此外，如通过annexin v/pi染色所评估的，用化合物5治疗jimt-1细胞72小时诱导凋亡细胞比例显著增加(从4.1％到45.6％)(图7d)。这些结果进一步验证了1)化合物5在nm范围工作剂量方面的高效力，和2)关于使用sirna通过tacc3下调获得的类似分子改变的特异性。
[0451]
然后，本发明人测试了作为tacc3抑制结果的有丝分裂纺锤体的潜在破坏，其先前已被证明这会导致严重的纺锤体缺陷(schneider,essmann等人，2007)。化合物5对tacc3的抑制已导致以剂量依赖性方式形成异常纺锤体结构(图5e)。在化合物5对tacc3抑制后，观察到的最显著的表型是在jimt-1细胞中形成多极纺锤体，其特征为中期板处染色体不正确排列(用最高剂量治疗时频率为73.4％)(图5f)。纺锤体缺陷的存在会激活纺锤体组装检查点(sac)，其进一步导致有丝分裂停滞，从而为修复纺锤体缺陷提供必要的时间(musacchio和salmon 2007)。为了证明tacc3抑制后sac激活，我们对bubr1(sac激活的标志物)进行了免疫荧光染色(chen 2002)。在化合物5治疗的jimt-1细胞中，我们观察当化合物5治疗后bubr1到染色体上的定位增加(图5g)。为了进一步检测活性sac信号传导对化合物5诱导的有丝分裂停滞、dna损伤和细胞死亡的作用，我们使用特异性抑制剂(tc mps1(choi，min等人，2017))在化合物5处理的细胞中抑制了sac激酶mps1，并分析了相关标志物的表达。如图5h所示，抑制mps1激酶导致有丝分裂停滞、细胞凋亡和dna损伤的显著丧失，表明化合物5可能通过在诱导严重纺锤体缺陷时激活sac而发挥作用，这进一步导致有丝分裂延长、凋亡的细胞死亡和dna损伤。
[0452]
fgfr3-tacc3致癌融合蛋白在许多实体瘤中被检测到，并且正作为有吸引力的治疗靶点被知晓，该靶点可以选择性靶向携带融合体的癌症(costa，carneiro等人，2016)。为了测试化合物5治疗是否能够抑制携带融合体的细胞系的生长，我们利用了两个人类膀胱癌细胞系(rt112和rt4)，已知它们含有fgfr3-tacc3融合蛋白(williams,hurst等人，2013)。tacc3的蛋白质印迹分析揭示了在rt112细胞中更高的表达(图6a)，这进一步伴随着对化合物5更强的反应，如rt112细胞中更低的ic50所证明的(图6b和c)。尽管在rt4细胞中对tacc3抑制的敏感性相对较低(可能由于较低的tacc3水平)，但与spl-b和khs101相比，化合物5在两种模型中产生最低的ic50值，这表明化合物5可能是靶向携带fgfr3-tacc3融合体的肿瘤的高度相关的治疗机会(图6b)。此外，化合物5以比其他tacc3抑制剂低至少10倍的剂量降低了erk1/2磷酸化，这是激活的fgfr信号传导以及强有丝分裂停滞的标志(图6d)，表明化合物5特异性阻断fgfr3-tacc3融合蛋白的功能。
[0453]
在乳腺癌细胞系中取得这些期望的结果之后，化合物5也在其他癌症类型中进行了测试。因此，筛查化合物5对nci-60人类细胞系的抗增殖活性。五剂量筛查(five-dose screen)的分析揭示了，几乎所有细胞系对于化合物5治疗是敏感的，具有小于1μm 50％生长抑制(gi
50
)值，表明其可能应用于其他癌症类型(图6e)。值得注意的是、我们发现nci-60细胞系的gi50值与从depmap.org获得的tacc3依赖性评分呈正相关(mcfarland、ho等人，2018)(图6f)。这表明更依赖于tacc3的细胞(即，其具有低tacc3依赖分数)对化合物5更敏感。总的来说，这些数据证明了化合物5的强效抗癌活性，同时强调其在各种癌症类型中的潜在应用。
[0454]
接下来，测试了化合物5相对于正常细胞对癌细胞系的特异性。因此，检查了正常乳腺上皮细胞、mcf-12a和其他几种乳腺癌细胞对化合物5的敏感性。令人惊讶的是，即使用高剂量的化合物5(5，10μm)治疗也没有达到50％的细胞生长抑制(图7a)，而与腔管(mcf7、t47d、zr75bt-474)乳腺癌细胞系相比，化合物5在较低剂量下抑制了三阴性(mda-mb-231、mda-mb-436、cal51和hcc1143)和her2阳性(jimt-1和hcc1954)乳腺癌细胞系的活性(图7b)。换句话说，化合物5特异性靶向肿瘤细胞，而对正常乳腺细胞无效。如图6c所示，对化合
物5更敏感的乳腺癌细胞系比mcf-12a表达更高的tacc3水平，其进一步支持tacc3的癌症特异性高表达。这显示对化合物5的敏感性与癌细胞中异常的tacc3表达水平是相关的。此外，低tacc3水平可以解释为什么mcf-12a细胞在低剂量下对任何tacc3抑制剂都没有反应。此外，与管腔细胞系相比，在两种最具侵袭性的乳腺癌亚型(tnbc和her2阳性)中观察到tacc3表达增加的趋势，其表明tacc3表达可能与癌症侵袭性有关。为了测试tacc3的转化潜力和细胞对tacc3依赖性以生存，我们在过度表达tacc3后在mcf-12a细胞中进行了集落形成试验(clonogenic growth assay)。如图7d和9e所示，tacc3过度表达增加了正常乳腺细胞系mcf-12a的集落形成能力。重要的是，tacc3在mcf-12a细胞中的过度表达使它们对化合物5的细胞毒性作用敏感，这进一步证明了细胞对tacc3的依赖性和化合物5的特异性(图7f)。为了排除我们在癌细胞和正常细胞之间观察到的差异是由于这些细胞增殖率的差异造成的可能性，我们计算了它们的倍增时间。如图7g所示，mcf-12a和癌细胞系的倍增时间之间没有显著差异，这表明对化合物5的反应可能不是由细胞分裂率的增加决定的。
[0455]
上述结果表明，表达高tacc3水平的乳腺癌细胞在体外对本发明新公开的tacc3抑制剂(化合物5)更敏感。因此，在免疫缺陷小鼠中进行了与spl-b相比化合物5对高致瘤性乳腺癌细胞系jimt-1的肿瘤生长的作用(barok等人，2007；tanner等人，2004)的测试。为此，将雌性裸鼠用jimt-1细胞注射到乳房脂肪垫(mfp)中，随后用载体或5mg/kg(口服)化合物5或spl-b处理，每隔一天施用30天。得出的结论是，与spl-b相比，化合物5显示出肿瘤生长的显著减少，并且对小鼠的体重没有重大影响(图8)。
[0456]
然后，使用jimt-1异种移植物测试低剂量化合物5的不同剂量和给药途径。化合物5以每两天2mg/kg(po.或iv)或5mg/kg(po.)的剂量施用于小鼠，持续30天(图9)。当与对照组相比以及在这些组之间，所有三个化合物5给药组肿瘤生长率均下降(图9a)。图9b表明，化合物5的给药对小鼠体重没有任何负面影响。此外，为了测试与先前实验相比更高剂量的化合物5对肿瘤生长的影响以获得更好的抗肿瘤效果并测试其耐受性，将雌性裸鼠用jimt-1细胞注射到乳房脂肪垫(mfp)中，随后用赋形剂或化合物5(25mg/kg，po.)处理23天。与载体处理的小鼠相比，化合物5显示出了非常显著的肿瘤生长的减少(图9c)。当与载体组的相比，肿瘤重量显著更低(图9d)。重要的是，化合物5由于治疗不影响小鼠体重，因此耐受性良好(图9e)。还使用免疫活性小鼠模型测试了体内tacc3抑制的效果(图10)。鼠三阴性乳腺癌(tnbc)细胞系(emt6)，其是一种快速生长且具有高度侵袭性的模型(yang,yang e等人，2017)，被注射进同基因balb/c小鼠的mfp中。与载体处理的小鼠相比，在化合物5处理的小鼠中观察到显著的肿瘤生长抑制(图10a)和57.1％的寿命延长(图10b)。此外，化合物5在同基因小鼠模型中再次具有良好的耐受性(图10c)。
[0457]
除了乳腺癌异种移植物和同基因模型之外，在结肠癌动物模型上测试了化合物5的抗肿瘤发生能力(图11)。将人类结肠癌细胞系(hct-116)和鼠结肠癌细胞系(ct26)分别注射到雌性裸鼠和balb/c小鼠的胁腹部区域。每天口服载体或25-50mg/kg的化合物5来治疗小鼠。与乳腺癌模型相似，化合物5显著削弱了肿瘤生长(图11a)并且在两种模型中都具有良好的耐受性(图11b)。
[0458]
接下来，为了检查tacc3抑制对转移性生长的影响，将侵袭性鼠乳腺肿瘤细胞(4t1-luc2(荧光素酶标记的))静脉内注射到免疫功能正常的雌性小鼠中。这里的目的是使用临床相关的转移模型确定化合物5对转移性生长和肺定植的影响。当小鼠在肺部出现转
pcr)和蛋白质印迹分别分析mrna和蛋白质水平的敲低效率。对于瞬时tacc3过度表达，用250ng空载体或tacc3载体(ohu21751；genscript，nj，usa)转染mcf-12a细胞48小时。
[0474]
集落形成实验
[0475]
对于单层培养，将jimt-1细胞的单细胞悬浮液(3x103细胞/孔)铺在12孔板中。孵育6小时后，用不同剂量的化合物5(5)、spl-b和khs101处理细胞。为了测试tacc3过度表达期间mcf-12a细胞的集落形成能力，将mcf-12a细胞(2x105)接种到6孔板中，次日进行tacc3转染。转染后48小时，计数细胞并将1x103细胞/孔接种到12孔板中。对于这两种实验设置，每4天更新一次培养基，并将细胞培养12天。然后将细胞用2％多聚甲醛固定15分钟，并在室温下用1％结晶紫(merck，darmstadt，德国)染色15分钟。用imagej软件(nih)对存活的集落(由至少50个细胞组成)进行计数。
[0476]
倍增时间评估
[0477]
为了评估倍增时间，将正常乳腺上皮细胞系mcf-12a和乳腺癌细胞系接种(3x104细胞/孔)在6孔板中。通过胰蛋白酶消化来收集细胞，每24小时计数一次细胞数，持续一周。绘制的这些细胞的生长曲线是细胞数/cm2与接种后天数的关系。使用以下公式计算倍增时间；
[0478][0479]
其中，t是在细胞生长的对数期所花费的时间，xe和xb分别是对数期的结束和开始时的细胞数。
[0480]
免疫荧光
[0481]
如前所述，进行jimt-1细胞的免疫荧光染色(cizmecioglu，arnold等人，2010)。基本上，1.5x105个jimt-1细胞/孔被接种在6孔板的玻璃盖玻片上。第二天，用载体、200nm或500nm化合物5处理细胞12小时。然后，将它们用冰冷的甲醇在-20℃下固定10分钟。然后，在室温下用含3％bsa的pbs溶液封闭细胞1小时，并在室温下用一级抗体和二级抗体孵育1小时。细胞用dapi复染5分钟(0.01μg/ml)。最后，使用immunohistomounth(santa cruz)安装盖玻片。使用配备有dic棱镜(直立)的直立荧光显微镜拍摄图像。
[0482]
nci-60癌细胞系组筛查
[0483]
化合物5(5)已提交给美国国家癌症研究所(nci号s807620)用于在人类肿瘤细胞系nci-60组中进行筛选，该小组由来自9种不同癌症类型的60种人癌细胞系组成。化合物5(5)首先在每个细胞系中以10μm的浓度在单剂量筛查中进行测试。在获得单剂量测定的结果后，进行开发治疗计划(dtp)的分析，并选择满足预定阈值抑制标准的化合物5用于nci全组5剂量测定。然后在10nm至100μm的剂量范围内，在五剂量nci-60筛查中对化合物5进行了两次测试，确定了60个细胞系的gi
50
(50％生长抑制)、tgi(总生长抑制)和lc
50
(诱导50％细胞死亡的致死剂量浓度)的值。详细的筛查方法可以从https://dtp.cancer.gov/discovery_development/nci-60/methodology.htm网页访问。简而言之，在细胞接种到96孔板后24小时，用5-logm浓度范围的化合物处理细胞2天。使用srb测定法评估细胞毒性。图中呈现的数据是两个实验的平均值。
[0484]
小鼠实验
[0485]
将六至八周大的雌性无胸腺裸鼠或balb/c小鼠饲养在温度受控的12小时光照/12
小时黑暗循环环境中。这项研究是根据比尔肯特大学机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee of bilkent university)进行的并根据该机构的指导方针和动物研究原则进行。对于裸鼠体内乳腺癌肿瘤的生长，在150μl的1:1dmem和matrigel(corning,ny,usa),v/v)中制备4x106jimt-1细胞并注射到雌性裸鼠的乳腺脂肪垫(mfp)。每天使用卡尺测量小鼠体重和肿瘤体积。肿瘤体积计算为长x宽2x0.5。一旦肿瘤体积达到约90-100mm3，异种移植物被随机分组。用载体(0.05％hpmc(羟丙基甲基纤维素)在ddh2o中和2％tween-80)或化合物5(隔日一次(qod.)以不同剂量-po.或iv.和给药方式-2或5mg/kg)处理动物。在一个单独的实验中，还以更高剂量的化合物5(25mg/kg)测试了动物。还使用jimt-1细胞将化合物5(5mg/kg，qod.，po.)与spl-b(5mg/kg，qod.，po.)对肿瘤生长的影响进行了比较。在治疗开始后20-30天处死小鼠，收集并储存肿瘤用于后续分析。为了在具有免疫活性的雌性balb/c小鼠模型中测试化合物5的效果，使用了侵袭性小鼠乳腺癌细胞系。1x106个emt-6细胞在pbs中制备并注射到小鼠的mfp中。类似地，一旦肿瘤体积达到90-100mm3，小鼠被随机分为两组并每天口服接受载体或25mg/kg的化合物5。使用1500mm3的预定义肿瘤体积截断值(cut-off)计算生存率。
[0486]
此外，化合物5在诱导肺转移后进行了测试。在pbs中以1x106个细胞/小鼠制备高度侵袭性和转移性4t1-luc2(荧光素酶标记)细胞，并静脉内注射给balb/c雌性小鼠。使用体内成像系统(ivis)监测转移发展，并定期量化生物发光。一旦发生肺转移，将小鼠随机分成两组，每天口服接受载体或50mg/kg化合物5。当小鼠死亡时计算生存率。
[0487]
除了乳腺癌模型，化合物5的抗肿瘤发生作用在免疫缺陷裸鼠(hct-116)和同基因免疫活性balb/c小鼠(ct-26)的结肠癌动物模型中进行了测试。4x106个hct-116和1x106个细胞分别在基质胶：pbs或pbs中制备，并皮下注射到小鼠的胁腹部区域。类似地，一旦肿瘤体积达到90-100mm3，小鼠被随机分为两组并每天口服接受载体或25-50mg/kg化合物5，持续20-25天。定期测量小鼠体重。
[0488]
对于毒性分析，裸雌性小鼠接受7天100mg/k的化合物5或以一次口服接受载体或500mg/kg的化合物5。定期测量小鼠体重，并收集器官用于确定可能的毒性。
[0489]
生物信息学分析
[0490]
使用癌症基因组图谱(tcga)患者构建不同肿瘤和正常组织之间的tacc3差异图(akbani et al.,2014)，数据从http://firebrowse.org/下载。对于tacc3的生存分析和预后意义，使用了不同的独立公开可用的癌症数据集。一个是乳腺癌分子分类学国际联盟(metabric)数据集(curtis，shah等人，2012)。metabric的发现和验证集(metabric discovery and validation set)的tacc3表达水平用于乳腺癌患者的总体生存率。使用来自tacc3水平第25和第75个四分位数的患者，并分别定义为低和高tacc3。使用kaplan meier绘图仪数据库分析了tacc3表达与胃癌患者总体生存率之间的关联，该数据库包括876名胃癌患者的总体生存率信息(szasz等人，2016)。使用https://www.cancer.gov/tcga从癌症基因组图谱(tcga)数据库中检索到由122名患者组成的前列腺癌患者的无病生存率数据并根据第25和第75百分位数对患者进行分隔。最后，肺癌患者的无复发生存率数据来自gse31210数据集，同样，25％和75％的患者用于该分析(okayama,kohno等人，2012)。broad institute网站(http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)上提供的有丝分裂和dna修复相关基因集的基因集富集分析(gsea)分析是使用乳腺癌metabric验
证数据集(n＝995)完成，其中根据tacc3表达水平将患者分为两组(高与低)。为了分析nci-60细胞系的tacc3依赖性，我们使用了来自broad institute、novartis和marcotte等人(13)(可在https://depmap.org/portal/中找到)的组合的rnai筛查的依赖性数据。使用spss软件中的metabric数据集进行多变量cox回归分析。选择tacc3水平、肿瘤分级、肿瘤分期、er、pr和her2状态作为协变量。tacc3表达基于第25个百分位进行分隔。
[0491]
统计分析
[0492]
除非另有说明，否则使用graphpad prism软件(graphpad software，inc)分析数据，并表示为三个独立实验的平均值
±
标准偏差。两组比较的统计显著性由双尾学生t检验确定。为了比较不同细胞系的倍增时间曲线，使用单向方差分析。使用多重t检验来确定emt6异种移植物的肿瘤体积治疗组之间的成对显著性。小于0.05的p和调整后的p(q)值被认为具有统计学意义。使用对数秩(mantel-cox)检验进行kaplan-meier生存曲线分析。
[0493]
实施例3：进一步的示例性生物学结果
[0494]
[0495][0496]
通过引用合并
[0497]
本文提及的所有出版物和专利均通过引用以其整体并入本文，就好像每个单独的出版物或专利被具体且单独地指示通过引用并入一样。在冲突的情况下，将以本技术(包括本文中的任何定义)为准。
[0498]
等同物
[0499]
尽管已经讨论了本公开的特定实施方式，但上述说明书是说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书和以下权利要求后，本公开的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应通过参考权利要求及其等同物的全部范围以及说明书以及此类变化来确定。