1.本发明涉及具有2,5-吡啶二羧酸类生产能力的转化细胞及其用途。
背景技术：
2.面向可持续社会的实现，利用以可再生能源为原料的生物学方法的化合物制造方法的开发是重要的。2,5-吡啶二羧酸(2,5-pdca)类具有与由不可再生资源大量制造的对苯二甲酸类似的骨架作为树脂原料，通过生物学方法从植物残渣进行制造的方法是已知的，因此作为由可再生能源得到的对苯二甲酸替代化合物而被期待(专利文献1、非专利文献1、2)。此外，2,5-吡啶二羧酸类还已知作为在食品及医药品用途中有用的水溶性维生素的烟酸的前体，还可以作为植物的生长促进剂、有机发光材料、粘接剂等的原料使用(专利文献2、非专利文献3～5)。
3.作为在生物学上制造2,5-吡啶二羧酸类的方法，公开了使导入了原儿茶酸-2,3-双加氧酶的红球菌属(rhodococcus jostii rha1)株作用于木质素的方法(专利文献1、非专利文献2)。但是，其生产率非常低，此外，由于利用不均匀地含有多种化合物的木质素，因此难以利用本方法进行稳定的2,5-吡啶二羧酸类的制造。进而，作为反应所需的氮源，也需要另外添加氯化铵。
4.此外，作为得到2,5-吡啶二羧酸类的生物学反应，已知有利用作为4-氨基-3-羟基苯甲酸同化菌而分离的博德特氏菌(bordetella sp.10d)株所具有的4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶(ahda)的反应(非专利文献6)。根据本文献，4-氨基-3-羟基苯甲酸受到4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶的氧化裂解，成为2-氨基-5-羧基粘康酸-6-半醛(2-amino-5-carboxymuconic 6-semialdehyde)，之后通过非酶的自变换，由纯化酶确认成为2,5-吡啶二羧酸。
5.但是，在博德特氏菌(bordetella sp.10d)株中，2-氨基-5-羧基粘康酸-6-半醛通过脱氨酶(ahdb)转化为2-羟基粘康酸-6-半醛(2-hydroxymuconic 6-semialdehyde)，因此实际上在培养液中没有检测到2,5-吡啶二羧酸，没有达到2,5-吡啶二羧酸类的制造。此外，即使尝试使用纯化过的4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶来制造2,5-吡啶二羧酸类，也需要添加作为原料的4-氨基-3-羟基苯甲酸类，从经济的观点出发，难以实用地制造2,5-吡啶二羧酸类。
6.专利文献1：国际公开第2016/202875号
7.专利文献2：日本特开2018-83789号公报
8.非专利文献1：alessandro pellis et al.,nature communications,vol.10,pp.1762(2019)
9.非专利文献2：zoe mycroft et al.,green chemistry,vol.17,pp.4974(2015)
10.非专利文献3：erick j.vandamme,jose luis revuelta,industrial biotechnology of vitamins,biopigments,and antioxidants(book),john wiley&sons,2016
11.非专利文献4：min zeng et al.,journal of materials chemistry c,vol.7,pp.2751(2019)
12.非专利文献5：qiao zhang et al.,journal of the american chemical society vol.141,pp.8058(2019)
13.非专利文献6：shinji takenaka et al.,europian journal of biochemistry,vol.269,pp.5871(2002)
技术实现要素：
14.本发明涉及以下1)～2)。
15.1)一种具有2,5-吡啶二羧酸类生产能力的转化细胞，其中，在具有生物合成4-氨基苯甲酸类的能力的微生物中，下述(i)和(ii)的多肽的表达得到强化：
16.(i)具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽、
17.(ii)具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽。
18.2)一种2,5-吡啶二羧酸类或其盐的制造方法，其中，包含1)的培养转化细胞的工序。
具体实施方式
19.本发明涉及一种具有2,5-吡啶二羧酸类生产能力的转化细胞、以及使用其的2,5-吡啶二羧酸类的制造方法。
20.本发明人等发现，通过制作产生具有特定的酶活性的多肽的微生物，并使用该微生物，能够高效地制造2,5-吡啶二羧酸类。
21.根据本发明，能够高效地制造作为树脂、食品、医药品、植物的生长促进剂、有机发光材料、粘接剂等的原料使用的2,5-吡啶二羧酸类。
22.在本发明中，氨基酸序列或核苷酸序列的同一性通过lipman-pearson法(science，1985，227：1435-1441)来计算。具体而言，通过使用遗传信息处理软件genetyx ver.12的同源性分析(search homology)程序，将unit size to compare(ktup)作为2进行分析来计算。
23.在本发明中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步更优选98％以上、且优选99％以上的同一性。
24.在本发明中，“1个或多个氨基酸缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列”是指1个以上10个以下、优选1个以上8个以下、更优选1个以上5个以下、进一步优选1个以上3个以下的氨基酸缺失、取代、附加、或插入的氨基酸序列。此外，本说明书中的“1个或多个核苷酸缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列”是指1个以上且30个以下、优选为1个以上且24个以下、更优选为1个以上且15个以下、进一步更优选为1个以上且9个以下的核苷酸缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。在本说明书中，氨基酸或核苷酸的“附加”中包含序列的一末端及两末端的氨基酸或核苷酸的附加。
25.在本发明中，控制区域和基因的“可工作地连结”是指基因和控制区域以该基因能够在该控制区域的控制下表达的方式连结。基因和控制区域的“可工作地连结”的顺序是本
领域技术人员公知的。
26.在本发明中，用于细胞的功能、性状、形质的用语“本来”是为了表示该功能、性状、形质存在于该细胞的野生型而使用的。对照而言，用语“外来”不是从原来存在于该细胞，而是用于表示从外部导入的功能、性状、形质。例如，“外来”基因或多核苷酸为从外部导入细胞的基因或多核苷酸。外来基因或多核苷酸可以是与导入其的细胞同种的生物，也可以是来自不同种的生物(即异种基因或多核苷酸)。
27.本发明中，作为“2,5-吡啶二羧酸类”，具体而言，可以举出下述通式(1)所示的2,5-吡啶二羧酸衍生物。
[0028][0029]
[式中，r1及r2分别独立地表示氢原子、羟基(-oh)、甲氧基(-och3)、氨基(-nh2)、卤素原子、羧基(-cooh)、甲基(-ch3)、乙基(-ch2ch3)。]
[0030]
2,5-吡啶二羧酸衍生物可以以盐的形态存在，作为该盐，例如可以举出：与钠、钾等碱金属的盐、与钙、镁等碱土金属的盐等。
[0031]
此外，作为4-氨基苯甲酸类，具体而言，可以举出下述通式(2)所示的4-氨基苯甲酸衍生物。
[0032][0033]
[式中，r1及r2表示与上述相同的基团。]
[0034]
式(1)或(2)中，作为r1及r2所示的卤素原子，可以举出氟原子、氯原子、溴原子、碘原子，优选为氟原子。
[0035]
r1和r2优选为氢原子、羟基(-oh)、甲氧基(-och3)、氟原子(-f)或甲基(-ch3)，更优选r1和r2均为氢原子。
[0036]
在本发明中，“具有2,5-吡啶二羧酸类生产能力的转化细胞”是在具有生物合成4-氨基苯甲酸类的能力的微生物中，(i)具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽、和(ii)具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽的表达得到强化的微生物细胞。
[0037]
作为(i)具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽，例如可以举出：(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成且具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽、(b)由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与序列号4所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成且具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽。
mutagensis kit)(clonetech公司)、kod-plus-mutagenesis kit(东洋纺公司)等市售的位点特异性突变导入用试剂盒。
[0046]
在本发明中，具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽与具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽的表达得到强化的转化细胞只要以宿主细胞能够表达该多肽的表达所需的多核苷酸的状态而含有即可，该多肽可以是外来的，也可以是该细胞本来具有的。例如，可以举出以能够表达该多核苷酸的方式导入的细胞、该多核苷酸的表达程度得到增强的细胞。具体而言，可以举出导入了包含该多核苷酸及与其可工作地连结的控制区域的载体或dna片段的细胞、或者该多核苷酸的控制区域被取代为强控制区域的细胞等。
[0047]
在此，作为多核苷酸，作为编码(i)具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽的多核苷酸，可以举出下述(a)或(b)的多核苷酸、作为编码(ii)具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽的多核苷酸，可以举出下述(c)的多核苷酸(将这些多核苷酸也称为“本发明的多核苷酸”)。
[0048]
(a)由序列号1所示的核苷酸序列构成的多核苷酸、或由与序列号1所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成且编码具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽的多核苷酸；
[0049]
(b)由序列号3所示的核苷酸序列构成的多核苷酸、或由与序列号3所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成且编码具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽的多核苷酸；
[0050]
(c)由序列号5所示的核苷酸序列构成的多核苷酸、或由与序列号5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列构成且编码具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽的多核苷酸。
[0051]
作为与序列号1、3或5所示的核苷酸序列具有至少90％的同一性的核苷酸序列的例子，可以举出相对于序列号1、3或5所示的核苷酸序列1个或多个核苷酸缺失、取代、附加、或插入的核苷酸序列。在核苷酸序列中导入核苷酸的缺失、取代、附加、或插入等突变的方法如上所述。上述多核苷酸可以是1根链或2根链的形态，或者可以是dna也可以是rna。该dna可以是cdna、化学合成dna等人工dna。
[0052]
上述多核苷酸可以重组至载体中。优选含有本发明的多核苷酸的载体为表达载体。此外，优选该载体是能够将本发明的多核苷酸导入宿主微生物、且能够在宿主微生物内表达该多核苷酸的表达载体。优选该载体包含本发明的多核苷酸、以及与其可工作地连结的控制区域。该载体可以是在质粒等染色体外能够独立增殖和复制的载体，或者也可以是重组至染色体内的载体。
[0053]
作为具体的载体的例子，例如可以举出：pbluescript ii sk(-)(stratagene)、puc18/19、puc118/119等puc系载体(takara bio)、pet系载体(takara bio)、pgex系载体(ge healthcare)、pcold系载体(takara bio)、phy300plk(takara bio)、pub110(mckenzie，t.et al.，1986，plasmid 15(2)：93-103)、pbr322(takara bio)、prs403(stratagene)、pmw218/219(nippon gene)、pri 909/910等pri系载体(takara bio)、pbi系载体(clontech)、in3系载体(implanter innovations)、pptr1/2(takara bio)、pdjb2(d.j.ballance et al.,gene,36,321-331,1985)、pab4-1(van hartingsveldt w et al.,mol gen genet,206,71-75,1987)、pleu4(m.i.g.roncero et al.,gene,84,335-343,
1989)、ppyr225(c.d.skory et al.,mol genet genomics,268,397-406,2002)、pfg1(gruber,f.et al.,curr genet,18,447-451,1990)等。
[0054]
此外，上述多核苷酸也可以构建为含有该多核苷酸的dna片段。作为该dna片段，例如可以举出pcr扩增dna片段及限制性内切酶切断dna片段。优选该dna片段可以为包含本发明的多核苷酸、及与其可工作地连结的控制区域的表达盒。
[0055]
上述载体或dna片段中包含的控制区域是用于在导入了该载体或dna片段的宿主细胞内表达本发明的多核苷酸的序列，例如可以举出启动子或终止子等表达调节区域、复制起始点等。该控制区域的种类可以根据导入载体或dna片段的宿主微生物的种类适当选择。根据需要，该载体或dna片段还可以具有抗生素抗性基因、氨基酸合成相关基因等选择标记。
[0056]
对于向宿主细胞的载体或dna片段的导入，可以使用一般的转化法，例如电穿孔法、转化法、转染法、连结法、原生质体法、粒子枪法、农杆菌法。
[0057]
导入目标载体或dna片段的转化细胞可以利用选择标记进行选择。例如，在选择标记为抗生素抗性基因的情况下，通过在该抗生素添加培养基中进行培养，能够选择导入了目标载体或dna片段的细胞。此外，例如，在选择标记为氨基酸合成相关基因的情况下，基因导入该氨基酸要求性的宿主细胞后，能够以该氨基酸要求性的有无为指标，选择导入了目标载体或dna片段的细胞。或者，也可以通过利用pcr等调查转化细胞的dna序列来确认目标载体或dna片段的导入。
[0058]
此外，作为强控制区域，可以例示作为公知的高表达启动子的t7启动子、lac启动子、tac启动子、trp启动子、tu启动子、gap启动子等，但并不特别限定于这些。
[0059]
作为将存在于宿主细胞的基因组上的上述多核苷酸的控制区域取代为强控制区域的方法，可以举出将包含强控制区域和选择标记的多核苷酸序列的dna片段导入宿主细胞，选择通过同源重组或非同源重组等转化的细胞的方法等。
[0060]
在本发明中，宿主细胞使用具有生物合成4-氨基苯甲酸类的能力的微生物。该微生物可以使用真菌、酵母、放线菌、大肠杆菌、枯草杆菌等中的任意种，但优选大肠杆菌、放线菌。作为放线菌，可以举出棒状杆菌属菌、分枝杆菌属菌、红球菌属菌、链霉菌属菌、丙酸杆菌属菌等，优选为棒状杆菌属菌，更优选为谷氨酸棒状杆菌。
[0061]“具有生物合成4-氨基苯甲酸类的能力”是指只要是能够供给4-氨基苯甲酸类的微生物即可，更优选为增强了4-氨基苯甲酸类的供给能力的微生物。作为强化微生物的4-氨基苯甲酸类的供给能力的方法，例如可以举出：将编码生物合成4-氨基苯甲酸类所需的多肽的多核苷酸及含有与其可工作地连结的控制区域的载体导入细胞的方法；将编码用于细胞本来具有的生物合成4-氨基苯甲酸类所需的多肽的多核苷酸的控制区域取代为强控制区域的方法等。
[0062]
其中，作为用于生物合成4-氨基苯甲酸类所需的多肽，可以举出(iii)4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶(4-amino-4-deoxychorismate synthase)、(iv)4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶(4-amino-4-deoxychorismate lyase)等。因此，4-氨基苯甲酸类的供给能力的强化可以举出强化它们中的任意1种以上的表达的方式。
[0063]
具体而言，可以举出：将含有选自(iii)编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的多核苷酸(例如，序列号7)和(iv)编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的多核苷酸(例如，序列号8)
中的1种以上以及与其可工作地连结的控制区域的载体或dna片段导入微生物的方法；将微生物本来具有的以下的多核苷酸的控制区域的1个以上取代为强控制区域的方法等。
[0064]
含有目标多核苷酸的载体的导入方法、或将控制区域向强控制区域的取代方法可以与上述方法同样地进行。
[0065]
培养如此制备的本发明的转化细胞，评价2,5-吡啶二羧酸类的生产率，选择适当的转化细胞，由此可以得到有用的2,5-吡啶二羧酸类的生产株。产物的测定方法可以按照后述参考例中记载的方法进行。
[0066]
本发明的2,5-吡啶二羧酸类或其盐的制造方法通过用适当的培养基培养上述转化细胞来实施。培养条件可以根据所使用的微生物适当设计。
[0067]
培养转化细胞的培养基含有碳源、氮源、无机盐类等，只要是能够高效地进行本发明的转化细胞的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任一种。作为碳源，例如可以使用葡萄糖等糖类、甘油等多元醇类、乙醇等醇类、或丙酮酸、琥珀酸或柠檬酸等有机酸类。优选可以举出葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖及它们的含有物等糖类。
[0068]
此外，作为氮源，例如可以使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆粕碱提取物、甲基胺等烷基胺类、或氨或其盐等。
[0069]
此外，也可以根据需要使用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、镁、钙、钾、铁、锰、锌等盐类、特定的氨基酸、特定的维生素、消泡剂等。
[0070]
培养通常可以为10℃～40℃、6小时～72小时、优选9小时～60小时、更优选12小时～48小时、根据需要搅拌或振荡同时进行。此外，培养中也可以根据需要在培养基中添加氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素。
[0071]
从培养物中回收和纯化2,5-吡啶二羧酸类的方法没有特别限制。即，可以通过组合公知的离子交换树脂法、沉淀法、结晶法、重结晶法、浓缩法等方法来进行。例如，2,5-吡啶二羧酸类可以通过离心分离等除去菌体，用阳离子和阴离子交换树脂除去离子物质，浓缩菌体而得到。培养物中积累的2,5-吡啶二羧酸类可以不经分离直接使用。
[0072]
关于上述的实施方式，在本发明中还公开了以下的方式。
[0073]
＜1＞一种具有2,5-吡啶二羧酸类生产能力的转化细胞，其中，在具有生物合成4-氨基苯甲酸类的能力的微生物中，下述(i)和(ii)的多肽的表达得到强化：
[0074]
(i)具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽、
[0075]
(ii)具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽。
[0076]
＜2＞一种＜1＞所述的转化细胞，其中，(i)的具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽为(a)由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成且具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽、或(b)由序列号4所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与序列号4所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成且具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽。
[0077]
＜3＞＜1＞或＜2＞所述的转化细胞，其中，(ii)的显示4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽为(c)由序列号6所示的氨基酸序列构成的多肽、或由与序列号6所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性的氨基酸序列构成且具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽。
[0078]
＜4＞＜1＞～＜3＞中任一项所述的转化细胞，其中，具有生物合成4-氨基苯甲酸
类的能力的微生物是选自下述(iii)和(iv)中的1种以上的酶的表达得到强化的微生物：
[0079]
(iii)4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶、
[0080]
(iv)4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶。
[0081]
＜5＞＜1＞～＜4＞中任一项所述的转化细胞，其中，所述微生物为大肠杆菌或棒状杆菌属菌。
[0082]
＜6＞＜5＞所述的转化细胞，其中，棒状杆菌属菌是谷氨酸棒状杆菌。
[0083]
＜7＞一种2,5-吡啶二羧酸类或其盐的制造方法，其中，包含培养＜1＞～＜6＞中任一项所述的转化细胞的工序。
[0084]
＜8＞＜7＞所述的方法，其中，在含有糖类作为碳源的培养基中培养。
[0085]
＜9＞＜7＞或＜8＞所述的方法，其中，包含从所述培养物中回收2,5-吡啶二羧酸类或其盐的工序。
[0086]
＜10＞＜6＞～＜8＞中任一项所述的方法，其中，2,5-吡啶二羧酸类为下述通式(1)所示的2,5-吡啶二羧酸衍生物：
[0087][0088]
[式中，r1及r2分别独立地表示氢原子、羟基、甲氧基、氨基、卤素原子、羧基、甲基、乙基，]
[0089]
4-氨基苯甲酸类为下述通式(2)所示的4-氨基苯甲酸衍生物：
[0090][0091]
[式中，r1及r2表示与上述相同的基团。]
[0092]
＜11＞＜10＞所述的方法，其中，在式(1)和(2)中，r1和r2均为氢原子。
[0093]
[实施例]
[0094]
以下，基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。
[0095]
实施例1 2,5-吡啶二羧酸的制备
[0096]
在以下的实施例中，只要没有特别记载，pcr使用prime star max premix(takara bio)进行。
[0097]
(1)2,5-吡啶二羧酸制造用质粒的制作
[0098]
(a)质粒pecsf_gaps_pababc的制作
[0099]
将由谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032株按照常规方法提取的基因组作为模板，使用引物gn14_127(序列号9，tattaattaaatgcgcgttttaattattga
taattatgattc)和gn14_133(序列号10，ttgcggccgcttgtttaaacctccttacagaaaaatggttgggcg)通过pcr，扩增含有编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因和编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因的dna片段，将其插入质粒pecsf_gaps(参照日本特开2016-146779号公报)的paci位点和noti位点之间，由此得到质粒pecsf_gaps_pababc。
[0100]
(b)质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122的制作
[0101]
将上述得到的质粒pecsf_gaps_pababc作为模板，使用引物pababccory vec r(序列号11，aaatttaaacctcctttacagaaaaatggttgg)和pababccoryvec f(序列号12，ggaggtttaaacaagcggccgcgatatc)通过pcr合成载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作含有编码具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽hfm122的基因(序列号1)的质粒，将其作为模板，使用引物pecsfd hfm122f(序列号13，aggaggtttaaatttatgcgcactcaggtggctat)和pecsfdhfm122r(序列号14，cttgtttaaacctccttatacgagtggcagtccta)通过pcr合成嵌入用dna片段。用dpni(takara bio)对这些pcr产物进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)纯化各个dna片段，通过in-fusion hd cloning kit(takara bio)进行连结，由此构建质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122。使用得到的质粒溶液，转化ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基(bacto trypton 1％、酵母提取物(yeast extract)0.5％、nacl 1％、硫酸卡那霉素50μg/ml、琼脂1.5％)后，在37℃下静置一夜，对得到的菌落使用sapphire amp(takara bio)和引物pababc+poba for cpcr f(序列号15，gctatcaaaacattcggcacattggttttcc)、pababc+poba for cpcr r(序列号16，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，筛选确认过目的dna片段的导入的转化株。将得到的转化株接种于lbkm液体培养基(胰蛋白胨(bacto trypton)1％、酵母提取物(yeast extract)0.5％、nacl 1％、硫酸卡那霉素50μg/ml)2ml中，在37℃下培养一夜。从该培养液，使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的纯化。
[0102]
(c)质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122的制作
[0103]
将上述得到的质粒pecsf_gaps_pababc_hfm122作为模板，使用引物pabc last r(序列号17，ttacagaaaaatggttgggcgcaa)和hfm122f(序列号18，atgcgcactcaggtggctatcg)通过pcr合成载体用dna片段。接着，通过人工基因合成制作包含谷氨酸棒状杆菌atcc13032株所具有的tuf基因(cg0587)的启动子(以下，称为tu启动子)的dna片段(序列号19，tacgtacctgcaggtagcgtgtcagtaggcgcgtagggtaagtggggtagcggcttgttagatatcttgaaatcggctttcaacagcattgatttcgatgtatttagctggccgttaccctgcgaatgtccacagggtagctggtagtttgaaaatcaacgccgttgcccttaggattcagtaactggcacattttgtaatgcgctagatctgtgtgctcagtcttccaggctgcttatcacagtgaaagcaaaaccaattcgtggctgcgaaagtcgtagccaccacgaagtccaaaggaggatctaaattatgaataatataaaaggaggaattaattaa)，将其作为模板，使用引物pabc-ptu f(序列号20，accatttttctgtaatacgtacctgcaggtagcgtg)和ptu-hfm122r(序列号21，cacctgagtgcgcatttaattaattcctcctttta)通过pcr合成嵌入用dna片段。用dpni(takara bio)对这些pcr产物进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)纯化各个dna片段，通过in-fusion hd cloning kit(takara bio)进行连结，由此构建质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122。使用得到的质粒溶液，转化ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，在37℃下静置一夜，对得到的菌落使用sapphire amp
(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号22，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc+poba for cpcr r(序列号16，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，筛选确认过目的dna片段的导入的转化株。将得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，在37℃下培养一夜。从该培养液，使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的纯化。
[0104]
(d)质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm122的制作
[0105]
将上述得到的质粒pecsf_gaps_pababc_tud_hfm122作为模板，使用引物pgapaba_tu vec f(序列号23，ggaggtttaaacaagcgg)和pgapaba_tu vec r(序列号24，aatttagatcctcctttggacttcgtg)通过pcr合成载体用dna片段。接着，以含有编码通过人工基因合成制作的hfm122的基因(序列号1)的质粒为模板，使用引物hfm122ins f(序列号25，aggaggatctaaattatgcgcactcaggtggctatc)和hfm122ins r(序列号26，cttgtttaaacctccttatacgagtggcagtcctacg)通过pcr合成嵌入用dna片段。用dpni(takara bio)对这些pcr产物进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)纯化各个dna片段，通过in-fusion hd cloning kit(takara bio)进行连结，由此构建质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm122。使用得到的质粒溶液，转化ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，在37℃下静置一夜，对得到的菌落使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号22，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc+poba for cpcr r(序列号16，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，筛选确认过目的dna片段的导入的转化株。将得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，在37℃下培养一晚。从该培养液，使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的纯化。
[0106]
(e)质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm122_ahda的制作
[0107]
将上述得到的质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm122作为模板，使用引物ahda vec r(序列号27，cgcttgtttaaacctccttatacgagtggcagtcctacg)和ahda vec f(序列号28，gccgcgatatcgttgtaaaaaaccccgctc)通过pcr合成载体用dna片段。接着，通过人工基因合成来制作包含编码具有4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶活性的多肽的基因ahda(序列号5)的质粒，将其作为模板，使用引物ahda ins f(序列号29、aggtttaaacaagcgatgatcatcctggaaaacttcaagatg)和ahda ins r(序列号30、caacgatatcgcggcttaatcgcgtcctggagcaac)通过pcr合成嵌入用dna片段。用dpni(takara bio)对这些pcr产物进行处理后，使用nucleospin gel and pcr clean-up(takara bio)纯化各个dna片段，通过in-fusion hd cloning kit(takara bio)进行连结，由此构建质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm122_ahda。使用得到的质粒溶液，转化ecos competent e.coli dh5α株(nippon gene)，将细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，在37℃下静置一晚，对得到的菌落使用sapphire amp(takara bio)和引物ptu seq 1(序列号22，gcttgttagatatcttgaaatcggctttc)、pababc+poba for cpcr r(序列号16，ggaagatgcgtgatctgatccttcaactc)进行pcr反应，筛选确认过目的dna片段的导入的转化株。将得到的转化株接种于lbkm液体培养基2ml中，在37℃下培养一晚。使用该培养液，使用nucleospin plasmid easypure(takara bio)进行质粒的纯化。
[0108]
在构建的质粒中，在gap启动子的控制下连结编码4-氨基-4-脱氧分支酸合成酶的基因、以及编码4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶的基因，进而在tu启动子的控制下连结编码具有4-氨基苯甲酸羟基化活性的多肽的基因、以及编码4-氨基-3-羟基苯甲酸-2,3-双加氧酶
的基因。
[0109]
(2)质粒导入宿主细胞
[0110]
使用上述得到的质粒pecsf_gaps_pababc_tu_hfm122_ahda，利用电穿孔法(bio-rad)转化谷氨酸棒状杆菌drhg145株(参照日本特愿2014-523757)。将得到的转化细胞液涂布于lbkm琼脂培养基后，在30℃下静置2天，将得到的菌落作为转化株。
[0111]
(3)转化株的培养
[0112]
将上述得到的转化株接种在表3所示的cgxii培养基(含有硫酸卡那霉素50μg/ml)10ml中，在30℃下培养48小时后，通过离心分离除去菌体，将其作为培养上清液。按照参考例1的方法对得到的培养上清液中的2,5-吡啶二羧酸浓度进行定量。
[0113]
[表1]
[0114]
cgxii培养基组成(1l当量)
[0115]
葡萄糖(glucose)50g(nh4)2so420g尿素(urea)5gkh2po41gk2hpo41gmgso4·
7h2o0.25gcacl2·
2h2o10mgfeso4·
7h2o10mgmnso4·
5h2o10mgznso4·
7h2o1mgcuso4·
5h2o0.2mgnicl2·
6h2o0.02mg生物素(biotin)(ph7)0.2mg胰蛋白胨(tryptone)10g
[0116]
(4)结果
[0117]
转化株的培养结果表示：在培养上清液中检测出0.40g/l的2,5-吡啶二羧酸，通过使用本菌株能够制造2,5-吡啶二羧酸。
[0118]
参考例1 2,5-吡啶二羧酸的定量
[0119]
2,5-吡啶二羧酸的定量通过hplc进行。将供于hplc分析的反应液用0.1％磷酸适当稀释后，使用acroprep 96孔板(0.2μm ghp膜，nihon pall)进行不溶物的除去。hplc的装置使用色谱仪(chromaster)(hitachi high-tech science)。分析柱使用l-column ods(4.6mm i.d.
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150mm，化学物质评价研究机构)，洗脱液a为0.1m磷酸二氢钾的0.1％磷酸溶液，洗脱液b为70％甲醇，在流速1.0ml/分钟、柱温度为40℃的条件下进行梯度洗脱。2,5-吡啶二羧酸的检测使用uv检测器(检测波长280nm)。使用标准试样[2,5-吡啶二羧酸(销售商编码p0552、东京化成工业)]制作浓度校准曲线，基于浓度校准曲线进行2,5-吡啶二羧酸的定量。