作为载体的沙粒病毒

dl等人,(2011)j virol[病毒学杂志]85,7928-7932)。天然沙粒病毒基因组由两个rna片段组成，并包含编码糖蛋白和核蛋白以及聚合酶l和基质蛋白z的开放阅读框(orf)，糖蛋白和核蛋白两者都编码在短(s)片段上，聚合酶l和基质蛋白z编码在大(l)片段上(图1a)。为了除了四个沙粒病毒orf之外，还掺入外源转基因序列，可以复制s片段并且可以将沙粒病毒的gp和np orf分隔到所得的两个s片段上(s
np
、s
gp
；图1b-e；(cheng by等人,(2015)j virol[病毒学杂志]89,7373-7384；emonet sf等人,(2009)proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊]106,3473-3478；kallert sm等人,(2017)nat commun[自然-通讯]8,15327)。将np和gp分离到单独的s片段背后的概念是迫使病毒携带三个基因组rna片段，以维持其完整的蛋白质组。因此，如何将np、gp和两个异源orf(在图1b-1g中命名为“h.p.”)定位在两个片段上存在四种可能性。这四种可能性在此被称为r3lcmv、artlcmv、r3lcmvrev和artlcmvrev(图1b-e)。已经证明r3lcmvrev和artlcmvrev只能生长到非常低的滴度，远低于r3lcmv或artlcmv(cheng by等人,(2015)j virol[病毒学杂志]89,7373-7384)，因此不符合上述标准1r3lcmvrev和artlcmvrev生长不良据称是由于np紧邻5’非翻译区(utr)，因此在各自(较弱)的病毒启动子序列的控制下进行表达。因此，r3lcmvrev和artlcmvrev的设计不太适合工业生产。kallert等人(kallert sm等人,(2017)nat commun[自然-通讯]8,15327)进一步证明了r3lcmv在基因上是不稳定的：在免疫缺陷小鼠感染期间，r3lcmv经历了节段间rna重组，产生了一种双节段病毒，该病毒使np和gp开放阅读框在一个rna节段上进行过重新组合。所得病毒已失去(大部分)其转基因并且不再是减毒的(图1f)，因此出于安全考虑而未能满足上述标准2。总之，r3lcmv和r3lcmvrev都不能同时符合三个标准(产量、遗传稳定性、转基因表达水平；图2)。相比之下，在免疫缺陷型动物中，artlcmv即使长时间复制后在遗传上也是稳定的。背后的机制解释是，可以假定artlcmv中的np和gp orf在一个s片段上重组(图1g)，但在所得s片段的两个末端上复制3’utr的同时产生这种重组只能以失去5’utr为代价。已知5’utr和3’utr通过rna碱基配对形成非共价的锅柄式结构，使得病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)以序列且结构依赖性方式识别模板。因此，生物活性需要精确的5’utr和3’utr，不允许偏离天然序列(perez和de la torre(2003)j virol[病毒学杂志]77,1184-1194)。因此，如图1g所示的假定的重组产物应不能作为病毒rdrp识别的模板，并且可能在生物学上是无活性的。artlcmv不仅在遗传学上是稳定的，而且在细胞培养中生长良好(cheng by等人,(2015)j virol[病毒学杂志]89,7373-7384；kallert sm等人,(2017)nat commun[自然-通讯]8,15327；popkin dl等人,(2011)j virol[病毒学杂志]85,7928-7932)。因此，artlcmv是如图1b-1e所述的四种策略中唯一的三段沙粒病毒设计。符合上述规定1和2，即良好的产量和确保安全的遗传稳定性。2.2糖蛋白及其前体
[0009]
gp开放阅读框编码三个功能性蛋白质亚基，这些功能性蛋白质亚基表达为一种核糖体翻译产物。在新生多肽插入内质网(er)过程中，信号肽被信号肽酶从随后的gp1结构域切割掉(图3a)。剩余的gp1-gp2序列是插入膜的，它被枯草杆菌蛋白酶kexin同工酶-1(ski-1)/位点1蛋白酶(s1p，图3a)翻译后切割成gp1和gp2亚基，但gp1和gp2结构域在成熟糖蛋白复合物中保持非共价结合。尤其值得注意的是，沙粒病毒gp信号肽(sp)的基本性质：与大多数长度约为20个氨基酸并且在信号肽酶切割后迅速降解的信号肽不同，沙粒病毒糖蛋白sp通常长度大于50个氨基酸(eichler r等人,(2003)febs lett 538,203-206)并且不仅用于
将gp蛋白插入er，而且它们仍然与gp1/gp2复合物结合并掺入到成熟的病毒粒子中。此外，沙粒病毒糖蛋白sp在ski-1/s1p从gp2将gp1进行翻译后蛋白水解切割中起重要作用。在瞬时转染实验中，当用沙粒病毒sp替代外源信号肽时，gp1/gp2序列被插入到er中，但没有经过ski-1/s1p的处理(agnihothram，ss等人,(2006)j virol[病毒学杂志]80,5189-5198；eichler r等人,(2003)embo rep 4,1084-1088；schrempf s等人,(2007)j virol[病毒学杂志]81,12515-12524)。然而，为了使糖蛋白复合物具有生物活性，ski-1/s1p对gp1/gp2的切割是非常重要的(pinschewer,dd等人,(2003)proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊]100,7895-7900)。2.3工程化的沙粒病毒颗粒和沙粒病毒基因组片段
[0010]
最近研究表明，可以对感染性沙粒病毒颗粒进行工程改造，使其包含能够在受感染细胞中扩增和表达其遗传物质的基因组，但不能在正常的非基因工程化细胞(即感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒)产生更多子代(国际公开号：wo 2009/083210a1、wo 2014/140301a1和wo 2015/082570a1)。研究还表明，可以对修饰的沙粒病毒基因组片段进行工程改造，使其在orf的野生型位置以外的位置携带病毒orf(国际公开号：wo 2016/075250a1和公开号：us 2017/0319673a1)。研究进一步表明，可以对修饰的皮钦德病毒基因组片段进行工程改造，使其在orf的野生型位置以外的位置携带病毒orf(国际公开号：wo 2017/198726a1和公开号：us 2019/0135875a1)。
[0011]
迫切需要用于各种疾病的疫苗和免疫疗法的组合物，例如工程化沙粒病毒颗粒和相关组合物。
3

技术实现要素：

[0012]
本文提供了核苷酸序列、沙粒病毒颗粒、沙粒病毒基因组或反基因组片段和相关组合物。本文还提供了产生沙粒病毒基因组或反基因组rna片段的方法、产生沙粒病毒颗粒的方法和从cdna或rna中拯救沙粒病毒颗粒的方法。3.1核苷酸序列和相关组合物以及方法
[0013]
在一个方面，本文提供了核苷酸序列。在某些实施例中，本文提供了一种核苷酸序列，包括第一开放阅读框(orf)和第二orf，其中，两个orf的其中之一处于有义方向，而另一orf处于反义方向；所述第一orf包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且所述第一orf不编码全长第一多肽；而所述第二orf包含编码以下项的核苷酸序列：a)第二多肽；或b)第一多肽的功能片段，并且所述第二orf不编码全长第一多肽；或c)第二多肽的功能片段，并且所述第二orf不编码全长第二多肽；或d)异源非沙粒病毒多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。
[0014]
在某些实施例中，所述第一orf和所述第二orf被沙粒病毒基因间区(igr)隔开，并且每个orf受沙粒病毒3’非翻译区(utr)或沙粒病毒5’utr控制。
[0015]
在某些实施例中，所述第一orf还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列；所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽，并且选自由沙粒病毒
gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0016]
在某些实施例中，所述第二orf还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列；所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽，并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0017]
在某些实施例中，所述第一orf是还包含另一orf的转录单位的一部分，其中，所述另一orf和所述第一orf被内部核糖体进入位点(ires)隔开。在某些实施例中，所述第二orf是还包含另一orf的转录单位的一部分，其中，所述另一orf和第二orf被ires隔开。在某些实施例中，所述第一orf和/或所述第二orf包含编码沙粒病毒gp信号肽或其功能片段的核苷酸序列，并且所述另一orf包含编码异源非沙粒病毒多肽或沙粒病毒np、z或l的核苷酸序列。
[0018]
在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l来自lcmv、拉沙病毒(lassa virus)、皮钦德病毒(pichinde virus)、奥利华斯病毒(oliveros virus)、塔米埃米病毒(tamiami virus)、莫巴拉病毒(mobala virus)、莫佩亚病毒(mopeia virus)、伊派病毒(ippy virus)、阿马帕里病毒(amapari virus)、弗莱克索病毒(flexal virus)、瓜纳瑞托病毒(guanarito virus)、拉蒂诺病毒(latino virus)、马秋波病毒(machupo virus)、帕腊南病毒(parana virus)、皮里陶病毒(pirital virus)、萨比亚病毒(sabia virus)、塔卡里伯病毒(tacaribe virus)、熊峡谷病毒(bear canyon virus)、白水阿罗约病毒(whitewater arroyo virus)、奥尔帕瓦约病毒(allpahuayo virus，allv)、阿拉善病毒(alxa virus)、查帕雷病毒(chaparevirus)、丽江病毒(lijiang virus)、库皮科斯病毒(cupixi virus)、加伊罗病毒(gairo virus)、黎河病毒(loei river virus)、卢约病毒(lujo virus)、卢那病毒(luna virus)、卢里病毒(luli virus)、卢克病毒(lunk virus)、马林塔尔病毒(mariental virus)、美利奴步道病毒(merino walk virus)、莫洛戈罗病毒(morogoro virus)、奥卡汉贾病毒(okahandja virus)、阿波雷病毒(apor
é
virus)、琉球病毒(ryukyu virus)、索卢韦齐病毒(solwezi virus)、苏里斯病毒(souris virus)、温州病毒(wenzhou virus)、大灌木丛湖病毒(big brushy tank virus)、卡塔里那病毒(catarina virus)、斯金纳湖病毒(skinner tank virus)、通托河病毒(tonto creek virus)、沙普里病毒(xapuri virus)或鸠宁病毒(junin virus)。
[0019]
在某些实施例中，本文提供了一种核苷酸序列，包括开放阅读框(orf)，其中，所述orf包含编码以下项的核苷酸序列：a)第一多肽的功能片段，和b)异源非沙粒病毒多肽或第二多肽；其中所述orf不编码全长第一多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同，并且选自由不是来自拉沙病毒的沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。在某些实施例中，所述第一和第二多肽选自由以下各项组成的组：lcmv、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病
毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒的沙粒病毒gp、np、z、l。
[0020]
在某些实施例中，所述orf是第一orf并且所述核苷酸序列还包含第二orf。在某些实施例中，所述第二orf包含编码第三多肽、所述第一多肽的功能片段、第三多肽的功能片段或第二异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽，并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；两个orf的其中之一处于有义方向，而另一orf处于反义方向；所述第二orf不编码全长第一多肽；所述第二orf不编码全长第三多肽；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。在某些实施例中，所述第二orf包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且由所述第一orf编码的功能片段不同于由所述第二orf编码的功能片段。
[0021]
在某些实施例中，所述核苷酸序列不进一步包含第二orf。
[0022]
在某些实施例中，所述核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组s片段。在某些实施例中，所述核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组l片段。
[0023]
在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒3’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒5’utr的控制。在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒5’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒3’utr的控制。
[0024]
在某些实施例中，所述第一orf包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合。在某些实施例中，所述第二orf包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第二orf包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；其中，由所述第一orf编码的所述异源非沙粒病毒多肽和由所述第二orf编码的所述异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒3’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒5’utr的控制。
[0025]
在某些实施例中，所述第一orf包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第二orf包含编码np的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒5’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒3’utr的控制。
[0026]
在某些实施例中，所述第一多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、
no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134相同的氨基酸序列。
[0027]
在某些实施例中，所述第一多肽的功能片段包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128、seq id no:135、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129、seq id no:136、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。
[0028]
在某些实施例中，由所述第一orf或第二orf编码的功能片段为沙粒病毒gp信号肽或其功能片段。
[0029]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽、所述第二异源非沙粒病毒多肽或所述两个异源非沙粒病毒多肽各自是源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在某些实施例中，所述抗原选自由以下各项组成的组：(a)病毒抗原，所述病毒抗原源自病毒家族，所述病毒家族选自由以下各项组成的组：腺病毒科、疱疹病毒科、光滑噬菌体科、正粘病毒科、细小病毒科、丝状病毒科、汉坦病毒科、痘病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、副粘病毒科、肺病毒科、小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科、嗜肝dna病毒科、披膜病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科和冠状病毒科；(b)细菌抗原，其中所述细菌抗原源自细菌家族，所述细菌家族选自由以下各项组成的组：水螺菌属家族、固氮螺菌属家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体科家族、蛭弧菌属家族、弯曲杆菌科家族、衣原体科家族、梭菌科家族、肠杆菌科家族、gardinella菌属家族、巴氏杆菌科家族、盐杆菌科家族、螺杆菌属家族、军团菌科家族、李斯特氏菌科家族、甲基球菌科家族、分枝杆菌科家族、奈瑟氏菌科家族、海洋螺菌属家族、巴氏杆菌科家族、链球菌科家族、假单胞菌科家族、根瘤菌科家族、螺旋菌属家族、螺状菌科家族、葡萄球菌科家族、螺杆菌属家族、耶尔森氏菌属家族、炭疽杆菌和蝙蝠弧菌属家族，和(c)肿瘤新生抗原或新生表位和肿瘤相关抗原；并且所述肿瘤相关抗原选自由以下各项组成的组：hpv 16 e7和e6蛋白的人工融合蛋白、致瘤病毒抗原、癌-睾丸抗原、癌胚抗原、组织分化抗原、突变蛋白抗原、adipophilin、aim-2、aldhiai、bclx(l)、bing-4、calca、cd45、cpsf、细胞周期蛋白di、dkki、enah(hmcna)、ga733(epcam)、epha3、ezh2、fgf5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、g250/mn/caix、her-2/neu、idoi、igf2b3、il13ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、kif20a、lengsin、m-csf、mcsp、mdm-2、meloe、mmp-2、mmp-7、mucl、muc5ac、p53(非突变)、pax5、pbf、prame、psma、rage、rage-i、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、secemin 1、sox10、steapi(六跨膜前列腺上皮抗原1)、存活素、端粒酶、vegf、wt1、
egf-r、cea、cd20、cd33、cd52、melana/mart1、mart2、ny-eso-1、p53、mage a1、mage a3、mage-4、mage-5、mage-6、cdk4，α-actinin-4、artc1、bcr-abl、bcr-abl融合蛋白(b3a2)、b-raf、casp-5、casp-8、β联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、clpp、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud2、延伸因子2、etv6-aml、etv6-aml1融合蛋白、flt3-itd、fn1、gpnmb、ldlr-岩藻糖基转移酶融合蛋白、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、h-ras、k-ras(v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、n-ras、rbaf600、sirt2、snrpd1、ssx、ssx2、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tgfβrii、磷酸丙糖异构酶、ormdm-2、lmp2、hpv e6、hpv e7、egfrviii(表皮生长因子突变体iii)、独特型、gd2、神经节苷脂g2)、ras突变体、p53(突变体)、蛋白酶3(pri)、酪氨酸酶、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、前列腺酸性磷酸酶pap、neo-pap、ml-iap、afp、erg(tmprss2ets融合基因)、nai 7、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、trp2、trp2-int2、gd3、岩藻糖基gmi、间皮素、psca、sle(a)、cyplbl、placi、gm3、boris、tn、globoh、ny-br-i、sart3、stn、碳酸酐酶ix、oy-tesi、精子蛋白17、lck、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-i、fap、pdgfr-beta、madct-2、for相关抗原1、trpi、gp100、ca-125、ca19-9、钙网膜蛋白、上皮膜抗原(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、cd19、cd34、cd99、cdi17、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液蛋白(gcdfp-15)、hmb-45抗原、myo-dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体(肿瘤m2-pk)、bage bage-1、cage、ctage、fate、gage、gage-i、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-sar-35、spanxbi、spai7、ssx、sycp1、tpte、碳水化合物/神经节苷脂gm2(癌胚抗原-免疫原-1ofa-i-1)、gm3、ca15-3(ca 27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca50、cam43、cea、ebna、ef2、eb病毒抗原、hla-a2、hla-al1、hsp70-2、kiaao205、mum-i、mum-2、mum-3、i类肌球蛋白、gntv、herv-k-mel、lage-i、lage-2、(精子蛋白)spi7、scp-i、p15(58)、hom/mel-40、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、tsp-180、p185erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hl、tag-72、tag-72-4、ca-72-4、cam 17.1、numa、3-联蛋白、p16、tage、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、co-029、htgp-175、m344、mg7-ag、mov18、nb\70k、nyco-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tlp、tps、cd22、cd27、cd30、cd70、prostein、tarp(t细胞受体γ可变阅读框蛋白)、trp-p8、整合素avβ3(cd61)、催乳素或ral-b、cd123、cll-1、cd38、cs-1、cd138和ror1。
[0030]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽的表达或所述第二异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒3’utr的控制；与在相应的沙粒病毒5’utr控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平或在相应的沙粒病毒5’utr控制下表达的相同的第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平或所述第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0031]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒3’utr控制并且所述第二异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒5’utr控制，与在含有包含编码在沙粒病毒5’utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和相同的第二异源非沙粒病毒多肽的核苷酸
序列的基因组的沙粒病毒颗粒感染类似的细胞群之后，在沙粒病毒5’utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和相同的第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在含有包含所述核苷酸序列的基因组的沙粒病毒颗粒感染细胞群之后，表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0032]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的核苷酸序列的翻译产物。
[0033]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其含有包含本文所提供的核苷酸序列的基因组。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由s片段和l片段组成。
[0034]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含一个s片段和两个l片段。
[0035]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0036]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0037]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、we病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0038]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组编码所述异源非沙粒病毒多肽，并且所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于第二沙粒病毒颗粒，所述第二沙粒病毒颗粒的基因组编码相同的异源非沙粒病毒多肽；并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。
[0039]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒与其亲本病毒相比是减毒的。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0040]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0041]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒在沙粒病毒3’utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽；与对受试者或类似受试者施用在沙粒病毒5’utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的另一沙粒病毒颗粒之后相比，对受试者施用所述沙粒病毒颗粒之后，所述沙粒病毒颗粒在受试者中诱导针对所述异源非沙粒病毒多肽的免疫应答高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30
倍。
[0042]
在某些实施例中，所述核苷酸序列是能够转录成沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列。在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒基因组或反基因组rna片段的方法，其中，所述方法包括转录本文所提供的dna序列。
[0043]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒颗粒的方法，其中，所述方法包括：a)将一个或多个本文所提供的dna序列或一个或多个rna序列转染到宿主细胞中，所述rna序列各自从本文所提供的dna序列体外转录；b)将编码沙粒病毒反式作用因子的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；c)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且d)收获沙粒病毒颗粒。
[0044]
在某些实施例中，使用双向启动子转录所述一个或多个dna序列。在某些实施例中，所述一个或多个dna序列在选自由以下项组成的组的启动子的控制下转录：a)rna聚合酶i启动子；b)rna聚合酶ii启动子；和c)t7启动子。
[0045]
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含本文所提供的核苷酸序列。
[0046]
在某些实施例中，本文提供了一种使用本文所提供的核苷酸序列拯救沙粒病毒颗粒的方法。
[0047]
在某些实施例中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的核苷酸序列、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体。
[0048]
在某些实施例中，本文提供了一种疫苗，其包含本文所提供的核苷酸序列、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。
[0049]
在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所提供的核苷酸序列、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。3.2沙粒病毒颗粒和相关组合物以及方法
[0050]
在另一个方面，本文提供了沙粒病毒颗粒。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒颗粒经工程化使得沙粒病毒的orf在两个或多个mrna转录物上分隔开。
[0051]
在某些实施例中，所述mrna转录物中的至少一个包含内部核糖体进入位点(ires)。
[0052]
在某些实施例中，所述mrna转录物能够转录成沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是s片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是l片段。
[0053]
在某些实施例中，所述两个或多个mrna转录物受沙粒病毒3’utr或沙粒病毒5’utr控制。
[0054]
在某些实施例中，所述沙粒病毒orf编码包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒orf编码包含与以下各项相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。
[0055]
在某些实施例中，所述沙粒病毒orf编码沙粒病毒gp信号肽、沙粒病毒gp1和gp2，并且所述沙粒病毒gp信号肽或其功能片段从第一mrna转录物表达(例如，病毒mrna转录物)和沙粒病毒gp1和gp2从第二mrna转录物表达(例如，病毒mrna转录物)。
[0056]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒3’utr控制。
[0057]
在某些实施例中，所述第二mrna转录物进一步编码异源非沙粒病毒信号肽。
[0058]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒信号肽是水疱性口炎病毒血清型印第安纳型糖蛋白的信号肽。
[0059]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物进一步包含编码异源非沙粒病毒多肽或沙粒病毒gp、np、z和l的核苷酸序列。
[0060]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在某些实施例中，所述抗原选自由以下各项组成的组：(a)病毒抗原，所述病毒抗原源自病毒家族，所述病毒家族选自由以下各项组成的组：腺病毒科、疱疹病毒科、光滑噬菌体科、正粘病毒科、细小病毒科、丝状病毒科、汉坦病毒科、痘病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、副粘病毒科、肺病毒科、小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科、嗜肝dna病毒科、披膜病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科和冠状病毒科；(b)细菌抗原，所述细菌抗原源自细菌家族，所述细菌家族选自由以下各项组成的组：水螺菌属家族、固氮螺菌属家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体科家族、蛭弧
菌属家族、弯曲杆菌科家族、衣原体科家族、梭菌科家族、肠杆菌科家族、gardinella菌属家族、巴氏杆菌科家族、盐杆菌科家族、螺杆菌属家族、军团菌科家族、李斯特氏菌科家族、甲基球菌科家族、分枝杆菌科家族、奈瑟氏菌科家族、海洋螺菌属家族、巴氏杆菌科家族、链球菌科家族、假单胞菌科家族、根瘤菌科家族、螺旋菌属家族、螺状菌科家族、葡萄球菌科家族、螺杆菌属家族、耶尔森氏菌属家族、炭疽杆菌和蝙蝠弧菌属家族，和(c)肿瘤新生抗原或新生表位和肿瘤相关抗原；并且所述肿瘤相关抗原选自由以下各项组成的组：hpv 16 e7和e6蛋白的人工融合蛋白、致瘤病毒抗原、癌-睾丸抗原、癌胚抗原、组织分化抗原、突变蛋白抗原、adipophilin、aim-2、aldhiai、bclx(l)、bing-4、calca、cd45、cpsf、细胞周期蛋白di、dkki、enah(hmcna)、ga733(epcam)、epha3、ezh2、fgf5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、g250/mn/caix、her-2/neu、idoi、igf2b3、il13ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、kif20a、lengsin、m-csf、mcsp、mdm-2、meloe、mmp-2、mmp-7、mucl、muc5ac、p53(非突变)、pax5、pbf、prame、psma、rage、rage-i、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、secemin 1、sox10、steapi(六跨膜前列腺上皮抗原1)、存活素、端粒酶、vegf、wt1、egf-r、cea、cd20、cd33、cd52、melana/mart1、mart2、ny-eso-1、p53、mage a1、mage a3、mage-4、mage-5、mage-6、cdk4，α-actinin-4、artc1、bcr-abl、bcr-abl融合蛋白(b3a2)、b-raf、casp-5、casp-8、β联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、clpp、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud2、延伸因子2、etv6-aml、etv6-aml1融合蛋白、flt3-itd、fn1、gpnmb、ldlr-岩藻糖基转移酶融合蛋白、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、h-ras、k-ras(v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、n-ras、rbaf600、sirt2、snrpd1、ssx、ssx2、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tgfβrii、磷酸丙糖异构酶、ormdm-2、lmp2、hpv e6、hpv e7、egfrviii(表皮生长因子突变体iii)、独特型、gd2、神经节苷脂g2)、ras突变体、p53(突变体)、蛋白酶3(pri)、酪氨酸酶、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、前列腺酸性磷酸酶pap、neo-pap、ml-iap、afp、erg(tmprss2ets融合基因)、nai 7、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、trp2、trp2-int2、gd3、岩藻糖基gmi、间皮素、psca、sle(a)、cyplbl、placi、gm3、boris、tn、globoh、ny-br-i、sart3、stn、碳酸酐酶ix、oy-tesi、精子蛋白17、lck、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-i、fap、pdgfr-beta、madct-2、for相关抗原1、trpi、gp100、ca-125、ca19-9、钙网膜蛋白、上皮膜抗原(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、cd19、cd34、cd99、cdi17、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液蛋白(gcdfp-15)、hmb-45抗原、myo-dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体(肿瘤m2-pk)、bage bage-1、cage、ctage、fate、gage、gage-i、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-sar-35、spanxbi、spai7、ssx、sycp1、tpte、碳水化合物/神经节苷脂gm2(癌胚抗原-免疫原-1ofa-i-1)、gm3、ca15-3(ca 27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca50、cam43、cea、ebna、ef2、eb病毒抗原、hla-a2、hla-al1、hsp70-2、kiaao205、mum-i、mum-2、mum-3、i类肌球蛋白、gntv、herv-k-mel、lage-i、lage-2、(精子蛋白)spi7、scp-i、p15(58)、hom/mel-40、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、tsp-180、p185erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hl、tag-72、tag-72-4、ca-72-4、cam 17.1、numa、3-联蛋白、p16、tage、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、co-029、htgp-175、m344、mg7-ag、mov18、
nb\70k、nyco-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tlp、tps、cd22、cd27、cd30、cd70、prostein、tarp(t细胞受体γ可变阅读框蛋白)、trp-p8、整合素avβ3(cd61)、催乳素或ral-b、cd123、cll-1、cd38、cs-1、cd138和ror1。
[0061]
在某些实施例中，与在相应的沙粒病毒5’utr控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，在沙粒病毒3’utr控制下表达的所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0062]
在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒3’utr的控制在并且所述两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5’utr的控制，与在沙粒病毒5’utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒感染类似的细胞群之后，表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在所述沙粒病毒颗粒感染细胞群之后，表达所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍，并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒5’utr的控制并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5’utr的控制。
[0063]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组编码所述异源非沙粒病毒多肽和/或所述第二异源非沙粒病毒多肽，并且所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于第二沙粒病毒颗粒，所述第二沙粒病毒颗粒的基因组编码相同的异源非沙粒病毒多肽和/或相同的第二异源非沙粒病毒多肽；并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。
[0064]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由s片段和l片段组成。
[0065]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含一个s片段和两个l片段。
[0066]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒包含如图4c所示的基因组组构。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒包含如图4e所示的基因组组构。
[0067]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0068]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：
a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0069]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、we病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0070]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒与其亲本野生型病毒相比是减毒的。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0071]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0072]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒在沙粒病毒3’utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽；与对受试者或类似受试者施用在沙粒病毒5’utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的另一沙粒病毒颗粒之后相比，对受试者施用所述沙粒病毒颗粒之后，所述沙粒病毒颗粒在受试者中诱导针对所述异源非沙粒病毒多肽的免疫应答高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0073]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的翻译产物。
[0074]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna，其中，所述cdna能够转录成沙粒病毒颗粒基因组或反基因组片段。
[0075]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒基因组或反基因组片段的方法，其中，所述方法包括转录本文所提供的cdna。
[0076]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒颗粒的方法，其中，所述方法包括：a)将一个或多个本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna或一个或多个rna序列转染到宿主细胞中，所述rna序列各自从本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna体外转录；b)将编码沙粒病毒反式作用因子的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；c)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且d)收获沙粒病毒颗粒。
[0077]
在某些实施例中，使用双向启动子转录所述一个或多个cdna序列。在某些实施例中，所述一个或多个cdna序列在选自由以下项组成的组的启动子的控制下转录：a)rna聚合酶i启动子；b)rna聚合酶ii启动子；和c)t7启动子。
[0078]
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含编码本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的dna序列。
[0079]
在某些实施例中，一种使用本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物或其cdna序列来拯救沙粒病毒颗粒的方法。
[0080]
在某些实施例中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的沙粒病毒颗粒、本文所提供的翻译产物、本文所提供的cdna或本文所提供的dna表达载体。
[0081]
在某些实施例中，本文提供了一种疫苗,其包含本文所提供的沙粒病毒颗粒、本文所提供的翻译产物、本文所提供的cdna或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。
[0082]
在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物,其包含本文所提供的沙粒病毒颗粒、本文所提供的翻译产物、本文所提供的cdna或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。3.3沙粒病毒颗粒基因组或反基因组片段和相关组合物以及方法
[0083]
在另一个方面，本文提供了沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段，其经工程化使其病毒转录产生第一mrna转录物和第二mrna转录物，其中，所述第一mrna转录物包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且所述第一mrna转录物不编码全长第一多肽；而所述第二mrna转录物包含编码以下项的核苷酸序列：a)第二多肽；或b)第一多肽的功能片段，并且所述第二mrna转录物不编码全长第一多肽；或c)第二多肽的功能片段，并且所述第二mrna转录物不编码全长第二多肽；或d)异源非沙粒病毒多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。
[0084]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列，所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0085]
在某些实施例中，所述第二mrna转录物还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列，所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0086]
在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l来自lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。
[0087]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段，其经工程化使其病毒转录产生编码以下项的mrna转录物：a)第一多肽的功能片段，和b)异源非沙粒病毒多肽或第二多肽；所述mrna转录物不编码全长第一多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同并且选
自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。
[0088]
在某些实施例中，所述mrna转录物是第一mrna转录物，并且所述沙粒病毒基因组或反基因组片段的病毒转录进一步产生第二mrna转录物；所述第二mrna转录物包含编码以下项的核苷酸序列：第三多肽；第三多肽的功能片段；或第二异源非抗沙病毒多肽；所述第三多肽不同于所述第一和第二多肽并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0089]
在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且由所述第一mrna转录物编码的功能片段不同于由所述第二mrna转录物编码的功能片段。
[0090]
在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段的病毒转录不进一步产生第二mrna转录物。
[0091]
在某些实施例中，所述mrna转录物包含内部核糖体进入位点(ires)。
[0092]
在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是s片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是l片段。
[0093]
在某些实施例中，所述功能片段受沙粒病毒3’utr控制。在某些实施例中，所述功能片段受沙粒病毒5’utr控制。
[0094]
在某些实施例中，所述第一、第二和第三多肽各自包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。
[0095]
在某些实施例中，所述第一多肽包含与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134相同的氨基酸序列。
[0096]
在某些实施例中，所述第一多肽的功能片段包含与以下各项的氨基酸序列具有至
少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128、seq id no:135、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129、seq id no:136、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。
[0097]
在某些实施例中，所述功能片段为沙粒病毒gp信号肽或其功能片段。
[0098]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽、所述第二异源非沙粒病毒多肽或所述两个异源非沙粒病毒多肽各自是源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在某些实施例中，所述抗原选自由以下各项组成的组：(a)病毒抗原，所述病毒抗原源自病毒家族，所述病毒家族选自由以下各项组成的组：腺病毒科、疱疹病毒科、光滑噬菌体科、正粘病毒科、细小病毒科、丝状病毒科、汉坦病毒科、痘病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、副粘病毒科、肺病毒科、小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科、嗜肝dna病毒科、披膜病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科和冠状病毒科；(b)细菌抗原，其中所述细菌抗原源自细菌家族，所述细菌家族选自由以下各项组成的组：水螺菌属家族、固氮螺菌属家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体科家族、蛭弧菌属家族、弯曲杆菌科家族、衣原体科家族、梭菌科家族、肠杆菌科家族、gardinella菌属家族、巴氏杆菌科家族、盐杆菌科家族、螺杆菌属家族、军团菌科家族、李斯特氏菌科家族、甲基球菌科家族、分枝杆菌科家族、奈瑟氏菌科家族、海洋螺菌属家族、巴氏杆菌科家族、链球菌科家族、假单胞菌科家族、根瘤菌科家族、螺旋菌属家族、螺状菌科家族、葡萄球菌科家族、螺杆菌属家族、耶尔森氏菌属家族、炭疽杆菌和蝙蝠弧菌属家族，和(c)肿瘤新生抗原或新生表位和肿瘤相关抗原；并且所述肿瘤相关抗原选自由以下各项组成的组：hpv 16 e7和e6蛋白的人工融合蛋白、致瘤病毒抗原、癌-睾丸抗原、癌胚抗原、组织分化抗原、突变蛋白抗原、adipophilin、aim-2、aldhiai、bclx(l)、bing-4、calca、cd45、cpsf、cyclin di、dkki、enah(hmcna)、ga733(epcam)、epha3、ezh2、fgf5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、g250/mn/caix、her-2/neu、idoi、igf2b3、il13ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、kif20a、lengsin、m-csf、mcsp、mdm-2、meloe、mmp-2、mmp-7、mucl、muc5ac、p53(非突变)、pax5、pbf、prame、psma、rage、rage-i、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、secemin 1、sox10、steapi(六跨膜前列腺上皮抗原1)、存活素、端粒酶、vegf、wt1、egf-r、cea、cd20、cd33、cd52、melana/mart1、mart2、ny-eso-1、p53、mage a1、mage a3、mage-4、mage-5、mage-6、cdk4，α-actinin-4、artc1、bcr-abl、bcr-abl融合蛋白(b3a2)、b-raf、casp-5、casp-8、β联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、clpp、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud2、延伸因子2、etv6-aml、etv6-aml1融合蛋白、flt3-itd、fn1、gpnmb、ldlr-岩藻糖基转移酶融合蛋白、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、h-ras、k-ras(v-ki-ras2kirsten
大鼠肉瘤病毒癌基因)、n-ras、rbaf600、sirt2、snrpd1、ssx、ssx2、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tgfβrii、磷酸丙糖异构酶、ormdm-2、lmp2、hpv e6、hpv e7、egfrviii(表皮生长因子突变体iii)、独特型、gd2、神经节苷脂g2)、ras突变体、p53(突变体)、蛋白酶3(pri)、酪氨酸酶、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、前列腺酸性磷酸酶pap、neo-pap、ml-iap、afp、erg(tmprss2ets融合基因)、nai 7、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、trp2、trp2-int2、gd3、岩藻糖基gmi、间皮素、psca、sle(a)、cyplbl、placi、gm3、boris、tn、globoh、ny-br-i、sart3、stn、碳酸酐酶ix、oy-tesi、精子蛋白17、lck、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-i、fap、pdgfr-beta、madct-2、for相关抗原1、trpi、gp100、ca-125、ca19-9、钙网膜蛋白、上皮膜抗原(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、cd19、cd34、cd99、cdi17、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液蛋白(gcdfp-15)、hmb-45抗原、myo-dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体(肿瘤m2-pk)、bage bage-1、cage、ctage、fate、gage、gage-i、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-sar-35、spanxbi、spai7、ssx、sycp1、tpte、碳水化合物/神经节苷脂gm2(癌胚抗原-免疫原-1ofa-i-1)、gm3、ca15-3(ca 27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca50、cam43、cea、ebna、ef2、eb病毒抗原、hla-a2、hla-al1、hsp70-2、kiaao205、mum-i、mum-2、mum-3、i类肌球蛋白、gntv、herv-k-mel、lage-i、lage-2、(精子蛋白)spi7、scp-i、p15(58)、hom/mel-40、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、tsp-180、p185erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hl、tag-72、tag-72-4、ca-72-4、cam 17.1、numa、3-联蛋白、p16、tage、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、co-029、htgp-175、m344、mg7-ag、mov18、nb\70k、nyco-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tlp、tps、cd22、cd27、cd30、cd70、prostein、tarp(t细胞受体γ可变阅读框蛋白)、trp-p8、整合素avβ3(cd61)、催乳素或ral-b、cd123、cll-1、cd38、cs-1、cd138和ror1。
[0099]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒3’utr控制，并且所述第二mrna转录物受沙粒病毒5’utr控制。
[0100]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；由所述第一mrna转录物编码的所述异源非沙粒病毒多肽和由所述第二mrna转录物编码的所述异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒3’utr控制，并且所述第二mrna转录物受沙粒病毒5’utr控制。
[0101]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码np的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒5’utr控制，并且所述第二mrna转录物受沙粒病毒3’utr控制。
[0102]
在某些实施例中，与在相应沙粒病毒5’utr控制下表达的相同异源非沙粒病毒多肽的表达水平或在相应沙粒病毒5’utr控制下表达的相同的第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，在沙粒病毒3’utr控制下表达的所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平或在沙粒病毒3’utr控制下表达的所述第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0103]
在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒3’utr的控制在并且所述两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5’utr的控制，与在沙粒病毒5’utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒感染类似的细胞群之后，表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在所述沙粒病毒颗粒感染细胞群之后，表达所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍，并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒5’utr的控制并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5’utr的控制。
[0104]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的翻译产物。
[0105]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段。
[0106]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由s片段和l片段组成。
[0107]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含一个s片段和两个l片段。
[0108]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0109]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和
c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0110]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、we病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0111]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组编码所述异源非沙粒病毒多肽和/或所述第二异源非沙粒病毒多肽，并且所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于第二沙粒病毒颗粒，所述第二沙粒病毒颗粒的基因组编码相同的异源非沙粒病毒多肽和/或相同的第二异源非沙粒病毒多肽；并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。
[0112]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒与其亲本野生型病毒相比是减毒的。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0113]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0114]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒在沙粒病毒3’utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽；与对受试者或类似受试者施用在沙粒病毒5’utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的另一沙粒病毒颗粒之后相比，对受试者施用所述沙粒病毒颗粒之后，所述沙粒病毒颗粒在受试者中诱导针对所述异源非沙粒病毒多肽的免疫应答高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0115]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒表达两个异源非沙粒病毒多肽，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒3’utr的控制在并且所述两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5’utr的控制，与在沙粒病毒5’utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒感染类似的细胞群之后，表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在所述沙粒病毒颗粒感染细胞群之后，表达所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍，并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒5’utr的控制并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5’utr的控制。
[0116]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna。
[0117]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒基因组或反基因组片段的方法，其中，所述方法包括转录本文所提供的cdna。
[0118]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒颗粒的方法，其中，所述方法包括：a)将一个或多个本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列或一个或多个rna序列转染到宿主细胞中，所述rna序列各自从本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列体外转录；b)将编码沙粒病毒反式作用因子的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；c)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且d)收获沙粒病毒颗粒。
[0119]
在某些实施例中，使用双向启动子转录所述一个或多个cdna序列。在某些实施例中，所述一个或多个cdna序列在选自由以下项组成的组的启动子的控制下转录：
a)rna聚合酶i启动子；b)rna聚合酶ii启动子；和c)t7启动子。
[0120]
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含编码本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列。
[0121]
在某些实施例中，本文提供了一种使用本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段或编码沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列拯救沙粒病毒颗粒的方法。
[0122]
在某些实施例中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体。
[0123]
在某些实施例中，本文提供了一种疫苗，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。
[0124]
在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。3.4定义
[0125]
如本文所使用且除非另有说明，术语“gp”是指沙粒病毒糖蛋白和任何沙粒病毒糖蛋白前体。在一个示例性实施例中，沙粒病毒糖蛋白前体可以翻译后被切割成信号肽、gp1和gp2。在某些实施例中，沙粒病毒糖蛋白或任何沙粒病毒糖蛋白前体可以是野生型的。在其他实施例中，沙粒病毒糖蛋白或任何沙粒病毒糖蛋白前体可以是重组的。gp在第5.1节中进一步得以描述。
[0126]
如本文所使用且除非另有说明，术语“np”是指沙粒病毒核蛋白和任何沙粒病毒核蛋白前体。在某些实施例中，沙粒病毒核蛋白或任何沙粒病毒核蛋白前体可以是野生型的。在其他实施例中，沙粒病毒核蛋白或任何沙粒病毒核蛋白前体可以是重组的。np在第5.1节中进一步得以描述。
[0127]
如本文所使用且除非另有说明，术语“z”是指沙粒病毒z蛋白和任何沙粒病毒z蛋白前体。在某些实施例中，沙粒病毒z蛋白或任何沙粒病毒z蛋白前体可以是野生型的。在其他实施例中，沙粒病毒z蛋白或任何沙粒病毒z蛋白前体可以是重组的。z在第5.1节中进一步得以描述。
[0128]
如本文所使用且除非另有说明，术语“l”是指沙粒病毒l蛋白和任何沙粒病毒l蛋白前体。在某些实施例中，沙粒病毒l蛋白或任何沙粒病毒l蛋白前体可以是野生型的。在其他实施例中，沙粒病毒l蛋白或任何沙粒病毒l蛋白前体可以是重组的。l在第5.1节中进一步得以描述。
[0129]
如本文所使用且除非另有说明，术语“功能片段”是指多肽的片段。如本文所述的多肽的功能片段不是全长多肽。在某些实施例中，功能片段可以具有本领域普通技术人员已知的一种或多种功能。在某些实施例中，功能片段可以具有衍生出该功能片段的多肽的生物学功能。在一个示例性实施例中，功能片段可以是具有介导糖蛋白前体插入内质网(er)膜的功能的信号肽。在进一步的实施例中，除了介导糖蛋白前体插入er膜的功能外，信
号肽还可以具有其他功能，例如介导多肽的切割和/或充当反式作用成熟因子。在其他实施例中，功能片段可以不具有本领域普通技术人员已知的任何功能。功能片段在第5.2节中进一步得以描述。
[0130]
如本文所使用且除非另有说明，术语“异源非沙粒病毒多肽”是指非沙粒病毒来源的多肽。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽是报告蛋白(参见第5.3.1节)。在其他实施例中，异源非沙粒病毒多肽是信号肽(参见第5.3.2节)。在其他实施例中，异源非沙粒病毒多肽是抗原(参见第5.3.3节)。3.5惯例和缩写
d)、断裂-e(split-e)和断裂-f(split-f)载体基因组及其x和y变体的基因组组构。图4a-4f示出了split-a(图4a)、split-b(图4b)、split-c(图4c)、split-d(图4d)、split-e(图4e)和split-f(图4f)载体基因组的基因组组构的示意性描述，各自表达两个异源非沙粒病毒多肽(“h.p.”)，这两个异源非沙粒病毒多肽可以是相同的或彼此不同。针对图4a-4f中显示的每一个基因组组构，描述了仅在两个可能位点的其中之一处携带转基因的x和y变体(split-ax、split-ay、split-bx、split-by等)。
[0135]
图5：dna质粒表达盒分别用于通过瞬时转染产生感染性的基于lcmv和基于鸠宁candid#1的split-a、split-c、split-e、split-f载体，以及artlcmv和artcand载体。沙粒病毒rna基因组片段从聚合酶i驱动的表达盒(pol-i-l、pol-i-s1、pol-i-s2)转录，该表达盒由上游聚合酶i启动子(pol-i-p)和下游聚合酶i终止子(pol-i-t)组成，其一侧有目的病毒片段的cdna，该cdna包括其5’非模板g(“g”)。病毒片段包含如图1a-1g的图例所示的元素。最小病毒反式作用因子np和l从命名为pc-np和pc-l的质粒表达，其包含具有cmv增强子(cmv-enh.)和人工下游内含子的肌动蛋白启动子(act-p.)，其后分别是病毒np或l蛋白的cdna以及多腺苷酸化位点(poly-a)。
[0136]
图6a-6e：artlcmv与基于lcmv的split-a、split-c、split-e和split-f载体的细胞培养物生长情况的比较。用如图5所示的质粒转染表达lcmv-gp的bhk-21细胞(flatz l等人,nat med 2010[自然-医学]；16,339-345)以产生包含如图6a-6b所示的基因组的载体。转染后6天，通过免疫病灶测定法测定3t3细胞上的具有复制能力的载体滴度。用病毒载体以moi＝0.01感染正常的bhk-21细胞(不表达lcmv-gp)，48小时后收集上清液(图6c)。基于来自1个(图6b和图6c)细胞培养孔或两个(图6a)细胞培养孔的平均值的结果，通过免疫病灶测定法在3t3细胞上测定感染滴度。用病毒载体以moi＝0.001感染293f悬浮细胞(不表达lcmv-gp)，在指定的时间点(例如，24小时、48小时、72小时、96小时或120小时)收集上清液，并通过在3t3细胞上进行免疫病灶测定法测定上清液中的感染滴度(图6d)。在48小时收集成的上清液(图6d)用于通过免疫病灶测定法测定表达lcmv np的感染滴度。gp假型293t-gp细胞或3t3细胞用作细胞底物(来自3t3细胞的值如图6d所示)。293t-gp的比率：计算每个载体(artlcmv、split-c和split-e)的3t3滴度，每个载体作为包装所有三个基因组片段的颗粒部分的替代物(图6e)。黑色圆圈代表来自三份细胞培养孔的独立值，条形显示平均值+/-标准偏差。
[0137]
图7：通过荧光显微术比较从split-c(tom/gfp)与从artlcmv(tom/gfp)载体的gfp表达。bhk-21细胞用split-c(tom/gfp)或artlcmv(tom/gfp)感染。替代性地，一些bhk-21细胞不被感染(“无病毒”)。感染后24小时，通过荧光显微术观察到绿色荧光(图7)。
[0138]
图8a-8e：通过流式细胞术比较split-c(tom/gfp)和artlcmv(tom/gfp)载体的gfp和tom表达。如图8a所示，bhk-21细胞用split-c(tom/gfp)或artlcmv(tom/gfp)感染，或不被感染(“无病毒”；与图7相同的实验)。感染后32小时，使用gfp和tom表达的流式细胞术分析细胞。对不同的用split-c(tom/gfp)、artlcmv(tom/gfp)感染的细胞群和表达gfp的细胞群进行设门用于进一步分析(图8b)。对非荧光未被感染的细胞进行设门用于对比(图8b)。图8c示出了如图8b所示设门的细胞的gfp和tom荧光性。分别显示了gfp和tom通道中三个细胞群的几何平均荧光强度。图8d-8e示出了通过流式细胞术比较从split-c(tom/gfp)、artlcmv(tom/gfp)和artlcmv(gfp/tom)载体的gfp和tom共表达。bhk-21细胞用split-c
(tom/gfp)、artlcmv(tom/gfp)或artlcmv(gfp/tom)以感染复数为0.1(moi＝0.1)感染，其基因组如图8d所示。感染后24小时，处理细胞用于gfp和tom表达的流式细胞术分析(图8e)。呈现gfp和/或tom荧光的细胞百分比显示在各个象限中(图8e)。
[0139]
图9a-9c：在持续感染的agrag小鼠中，基于lcmv的split-c载体(非r3lcmv)的遗传稳定性。用10e5个pfu的基于lcmv的split-c载体(表达gfp和tom，与图7和图8a-8e中相同的载体)或如kallert等人所述的r3lcmv(gfp)(kallert sm等人,(2017)nat commun[自然-通讯]8,15327)，或基于克隆13骨架并表达we病毒株糖蛋白的双片段的野生型lcmv(基因组组构如图1a所示)静脉内感染agrag小鼠。在指定的时间点，通过检测病毒np(作为总感染性的量度，图9a)或gfp转基因(作为转基因表达感染性的量度，图9b)采集血液来测定病毒感染性。np的比率：然后计算gfp感染性(图9c)。图9d-9f：在持续感染的agrag小鼠中，基于lcmv的split-c和artlcmv载体(非r3lcmv)的遗传稳定性。用10e5个pfu的i)基于lcmv的表达gfp的split-c载体(split-c(gfp))，ii)artlcmv(gfp)，iii)r3lcmv(gfp)(如kallert等人所述(kallert sm等人,(2017)nat commun[自然-通讯]8,15327)，或iv)基于克隆13骨架并表达we病毒株糖蛋白的双片段的野生型lcmv(基因组组构如图1a所示)静脉内感染agrag小鼠。在指定的时间点，通过检测病毒np(作为总感染性的量度，图9d)或gfp转基因(作为转基因表达感染性的量度，图9e)采集血液来测定病毒感染性。然后计算np：gfp的感染比率(图9f)。符号代表最初三只(lcmvwt)、五只(r3lcmv(gfp))、四只(artlcmv(gfp))和六只(split-c)动物的平均值+/-sem。
[0140]
图10a-10d：与artlcmv的s
gp
片段相比，从基于lcmv的split-c载体的s1片段表达的癌症睾丸抗原的免疫原性。balb/c小鼠用5x10e5pfu的基于lcmv的表达gfp和癌症睾丸抗原p1a的split-c载体或递送相同的转基因(即癌症睾丸抗原p1a)的artlcmv载体进行免疫。各个载体基因组如图10a所示。免疫后9天，用载有源自p1a(图10b)的lpylgwlvf(seq id no:43)肽表位或免疫显性的源自np的骨架表位rpqasgvym(seq id no:44)(np118，图10c)的mhc i类四聚体(h-2ld)在外周血中测定cd8+ t细胞应答。计算每只小鼠的p1a：np118特异性cd8+ t细胞比率作为转基因免疫显性的量度(图10d)。使用未配对的双尾学生t检验确定统计显著性。**：p《0.01，n.s.：p》0.05。
[0141]
图11a-11n：与artlcmv的s
gp
片段相比，从基于lcmv的split-c载体的s1片段表达的人工hpv16 e7e6融合抗原的免疫原性。c57bl/6小鼠用10e5pfu的基于lcmv的表达gfp和人工hpv16 e7e6融合抗原的split-c载体或递送相同的转基因(即gfp和人工hpv16 e7e6融合抗原)的artlcmv载体进行免疫。各个载体基因组如图11a所示。对照小鼠未免疫(“无”)。免疫后8天，在外周血中测定cd8+ t细胞应答，并且免疫后22天，在脾脏中测定cd8+ t细胞应答。该实验使用载有源自hpv16e7蛋白(e7-dex，图11b、11e、11h和11j-11n)的rahynivtf(seq id no:45)肽表位或免疫显性的源自np的骨架表位fqpqngqfi(seq id no:46)(np396-tet，图11c、11f和11i)的mhc i类右旋体(h-2db)。计算p1a：np118特异性cd8+ t细胞比率作为转基因免疫显性的量度(图11d和图11g)。e7-dex+和np396-tet+细胞频率表示为cd8+b220-细胞的百分比(图11b、11c、11e和11f)。每个脾脏的e7-dex+或np396-tet+cd8+b220-细胞的绝对数量如图11h和图11i所示。表达指定标志物的e7-dex+cd8+b220-细胞亚群如图11j-11n列举。使用未配对的双尾学生t检验确定统计显著性。**：p《0.01，*：p《0.05，n.s.：p》0.05。
[0142]
图12a-12c：split-c-cand载体的细胞培养物生长的评估。用如图5所示的质粒转染表达lcmv-gp的bhk-21细胞(flatz l等人,nat med 2010[自然-医学]；16,339-345)以产生包含如图12a-12b所示的基因组的split-c-cand(tom/gfp)和split-c-cand(tom/e7e6)载体。转染后5天，将上清液在正常293t细胞(不表达lcmv-gp)上盲传。接种后2、7和9天收集培养物上清液，并在3t3细胞上测定具有复制能力的载体滴度(图12c)。
[0143]
图13a-13d：通过流式细胞术比较从split-c-cand(tom/gfp)和artcand(tom/gfp)载体的gfp和tom表达。如图13a所示，293t细胞用split-c-cand(tom/gfp)或artcand(tom/gfp)感染，或不被感染(“无病毒”)。感染后72小时，使用流式细胞术分析细胞的gfp和tom表达(图13b-13d)。当针对侧向散射(ssc-h；图13c-13d)绘制gfp和tom时，在被split-c-cand(tom/gfp)和artlcand(tom/gfp)感染的细胞培养物中检测到表达gfp(图13c)或tom(图13d)的不同细胞群，而在未被感染的对照细胞培养物中未检测到。结果显示病毒感染的培养物的gfp平均荧光强度(mfi；图13c)和tom mfi(图13d)。
[0144]
图14a-14d：与artcand的s
gp
片段相比，从基于cand的split-c载体的s1片段表达的人工hpv16 e7e6融合抗原的免疫原性。c57bl/6小鼠用2x10e5ffu的基于cand的表达tom的split-c载体(split-c-cand(tom/e7e6))和由hpv16的e7和e6蛋白(cassetti等人,vaccine[疫苗]2004；3-4,520-527)组成的人工融合抗原，或递送相同的转基因(即tom和e7e6)的artcand载体(artcand(tom/e7e6))进行免疫。各个载体基因组如图14a所示。免疫后9天，用载有源自hpv16 e7蛋白(图14b)的rahynivtf(seq id no:45)肽表位的mhc i类右旋体(h-2db)和载有源自np的骨架表位ytvkypnl(seq id no:47)(np205，图14c)的mhc i类四聚体(h-2kb)在外周血中测定cd8+ t细胞应答。计算每只小鼠的e7：np205特异性cd8+ t细胞比率作为转基因免疫显性的量度(图14d)。使用未配对的双尾学生t检验确定统计显著性。**：p《0.01，n.s.：p》0.05。
5具体实施方式
[0145]
本文提供了沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒颗粒在遗传上是稳定的并且提供高水平的转基因表达。在某些实施例中，这些沙粒病毒颗粒是三片段的。本文还提供了与此类沙粒病毒颗粒相关的核苷酸序列和沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，本文提供了一种核苷酸序列(参见第5.4节)，其包含一个或多个orf，所述orf包含编码沙粒病毒gp、np、l或z(参见第5.1节)和/或异源非沙粒病毒多肽(参见第5.3节)的功能片段(参见第5.2节)的核苷酸序列。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒颗粒经工程化使得沙粒病毒的orf在两个或多个mrna转录物上分隔开(参见地5.5节)。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段经工程化使得其转录产生一个或多个mrna转录物，所述mrna转录物包含编码沙粒病毒gp、np、l或z的功能片段的核苷酸序列(参见第5.6节)。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒是遗传上稳定的，即不会在宿主中恢复到类似野生型(更具毒性)的复制行为(遗传稳定性)(参见第5.13节)。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒可显示高水平的转基因表达以引发针对所需靶抗原的强免疫应答(转基因表达水平)(参见第5.13节)。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒可在细胞培养中显示良好的生长，使沙粒病毒颗粒能够在工业发酵过程中产生高滴度(产量)(参见第5.13节)。在某些实施例中，本文
所提供的沙粒病毒颗粒可适用于疫苗、疾病治疗和/或用在免疫疗法中的应用(参见第5.11节和第5.12节)。
[0146]
与本文所提供的方法和组合物一起使用的沙粒病毒可以是旧大陆病毒(old world viruses)，例如拉沙病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒或伊派病毒，或新大陆病毒(new world viruses)，例如阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、鸠宁病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、奥利华斯病毒、帕腊南病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、塔米埃米病毒、熊峡谷病毒、奥尔帕瓦约病毒或白水阿罗约病毒。与本文所提供的方法和组合物一起使用的沙粒病毒可以是例如沙粒病毒、哺乳类沙粒病毒属、旧大陆哺乳类沙粒病毒属、新大陆哺乳类沙粒病毒属、进化枝a的新大陆哺乳类沙粒病毒属、进化枝b的新大陆哺乳类沙粒病毒属、进化枝c的新大陆哺乳类沙粒病毒属或进化枝d。与本文所提供的方法和组合物一起使用的沙粒病毒可以是哺乳类沙粒病毒属，包括但不限于奥尔帕瓦约病毒、阿拉善病毒鸠宁病毒、熊峡谷病毒、萨比亚病毒、皮钦德病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、弗莱克索病毒、加伊罗病毒、瓜纳瑞托病毒、伊派病毒、拉沙病毒、拉蒂诺病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、马秋波病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、奥利华斯病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、阿马帕里病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、塔卡里伯病毒、塔米埃米病毒、温州病毒、白水阿罗约病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒或沙普里病毒。5.1选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组的多肽
[0147]
在某些实施例中，本文提供了一种核苷酸序列，其包含一个或多个orf，所述orf包含编码多肽的功能片段的核苷酸序列。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段经工程化使得其转录产生一个或多个mrna转录物，所述mrna转录物包含编码多肽的功能片段的核苷酸序列。在某些实施例中，本文所述的多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，即选自由沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l是野生型的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l是重组的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l是突变的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l衍生自减毒的病毒。
[0148]
在某些实施例中，本文所述的多肽选自由野生型沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，本文所述的多肽是野生型沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述野生型沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2。
[0149]
在某些实施例中，本文所述的多肽选自由重组沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，本文所述的多肽是重组沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述重组沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2，其中一种或多种可以是重组的。
[0150]
在某些实施例中，本文所述的多肽选自由突变的沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，本文
所述的多肽是突变的沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述突变的沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2，其中一种或多种可以是突变的。
[0151]
在某些实施例中，本文所述的多肽选自由衍生自减毒的病毒的沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，本文所述的多肽衍生自减毒的病毒的沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2，其中一种或多种衍生自减毒的病毒。
[0152]
在某些实施例中，本文所述的多肽选自由以下各项组成的组：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒的gp、np、z和l。
[0153]
在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:
134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、
seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:
id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:
no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、
no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:
no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:
64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。
[0157]
在某些实施例中，本文所述的多肽是沙粒病毒l，即沙粒病毒l蛋白或任何l蛋白前体。在某些实施例中，本文所述的多肽是野生型沙粒病毒l蛋白或任何野生型l蛋白前体。在其他实施例中，本文所述的多肽是重组沙粒病毒l蛋白或任何重组l蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒l是沙粒病毒l蛋白或以下病毒的任何l蛋白前体：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒(、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项
的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同
的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。5.2本文所提供的功能片段
[0158]
用于本文所述的组合物和方法的功能片段是多肽的片段。本文所述的多肽的功能片段不是全长多肽。
[0159]
在某些实施例中，功能片段可以具有本领域普通技术人员已知的一种或多种功能。在某些实施例中，功能片段可以具有该功能片段所衍生自的多肽的生物学功能，例如沙粒病毒颗粒生长所需的生物学功能。在某些实施例中，功能片段可以作为分离的片段支持其所衍生自的多肽的生物学功能，而与全长多肽的背景无关。在一个示例性实施例中，功能片段可以是具有介导糖蛋白前体插入内质网(er)膜的功能的信号肽。在进一步的实施例中，除了介导糖蛋白前体插入er膜外，信号肽还可以具有其他功能，例如介导多肽的切割和/或充当反式作用成熟因子。在其他实施例中，功能片段可以不具有本领域普通技术人员
已知的任何功能。
[0160]
在某些实施例中，功能片段的长度可以是5、8、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38、40、42、45、48、50、52、55、58、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250或300个氨基酸。在某些实施例中，功能片段的长度为5至10个氨基酸、10至25个氨基酸、25至50个氨基酸、50至100个氨基酸、100至150个氨基酸、150至200个氨基酸、200至250个氨基酸、250至300个氨基酸、300至400个氨基酸、400至500个氨基酸、500至750个氨基酸、750至1000个氨基酸、1000至1250个氨基酸、1250至1500个氨基酸、1500至1750个氨基酸、1750至2000个氨基酸、2000至2500个氨基酸或大于2500个或更多个氨基酸。在某些实施例中，功能片段的长度不超过2500个氨基酸。
[0161]
在某些实施例中，功能片段可以由5、8、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38、40、42、45、48、50、52、55、58、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250或300个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由58个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由193个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由200个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由201个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由207个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由215个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由225个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由232个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由233个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由234个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由235个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由15个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由20个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由1至15个氨基酸残基组成。在某些实施例中，功能片段可以由2至20个氨基酸残基组成。
[0162]
在某些实施例中，功能片段是沙粒病毒gp、np、z或l的片段，即沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体或l蛋白前体的片段。在某些实施例中，沙粒病毒gp、np、z或l的功能片段是野生型的。在其他实施例中，沙粒病毒gp、np、z和l的功能片段是重组的。在某些实施例中，沙粒病毒gp、np、z或l的功能片段是突变的。在某些实施例中，沙粒病毒gp、np、z或l的功能片段衍生自减毒的病毒。
[0163]
在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白或l蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒糖蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒核蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒z蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒l蛋白的片段。
[0164]
在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体或l蛋白前体的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒糖蛋白前体的片段。在某些实施例中，野生型沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒核蛋白前体的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒z蛋白前体的片段。在某些实施例中，功能片段是野生型沙粒病毒l蛋白前体的片段。
[0165]
在某些实施例中，功能片段是重组沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白或l蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是重组沙粒病毒糖蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是重组沙粒病毒核蛋白的片段。在某些实施例中，功能片段是重组沙粒病毒z蛋白的片段。
no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相
同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp信号肽包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128或seq id no:135。
[0172]
在某些实施例中，功能片段是gp1。在某些实施例中，本文所述的gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙
粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，
本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp1包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129或seq id no:136。
[0173]
在某些实施例中，功能片段是gp2。在某些实施例中，本文所述的gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130
或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:
38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp2包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。
[0174]
在某些实施例中，功能片段可以由gp信号肽、gp1和gp2中的一个以上组成。在某些实施例中，功能片段可以由gp信号肽和gp1组成。在某些实施例中，功能片段可以由gp信号肽和gp2组成。在某些实施例中，功能片段可以由gp1和gp2组成。在某些实施例中，功能片段不是全长糖蛋白前体。
[0175]
在某些实施例中，功能片段是沙粒病毒gp信号肽的片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp信号肽是野生型的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp信号肽是重组的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp信号肽选自由以下各项组成的组：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克
病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒的gp信号肽。在某些实施例中，功能片段选自由以下各项组成的组：沙粒病毒gp信号肽的n区、疏水区1(h-1区)和疏水区2(h-2区)。在某些实施例中，功能片段是沙粒病毒gp信号肽的n区。在某些实施例中，功能片段是沙粒病毒gp信号肽的h-1区。在某些实施例中，功能片段是沙粒病毒gp信号肽的h-2区。
[0176]
在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列
的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:
70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:
id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:
no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段是包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列的多肽的片段：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、
id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段包含与含有以下各项的氨基酸序列的多肽的片段的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段包含与含有以下各项的氨基酸序列的多肽的片段的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段包含与含有以下各项的氨基酸序
列的多肽的片段的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段包含与含有以下各项的氨基酸序列的多肽的片段的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的功能片段包含与含有以下各项的氨基酸序列的多肽的片段的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:
no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。5.3异源非沙粒病毒多肽
[0178]
如本文所述，在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以不是来源于沙粒病毒。
[0179]
在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列(参见第5.4节)包含第一开放阅读框(orf)和第二orf，所述第一orf包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，所述第一多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，并且所述第二orf包含编码本文所提供的异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列。在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列包含开放阅读框(orf)，并且所述orf包含编码第一多肽和异源非沙粒病毒多肽的功能片段的核苷酸序列，所述第一多肽选自由不是来自拉沙病毒的沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒包含编码异源多肽的基因组，所述异源多肽来源于沙粒病毒，但衍生自与所述包含gp、np、z和l的沙粒病毒颗粒所衍生自的沙粒病毒类型不同的沙粒病毒类型。在一个示例性实施例中，异源多肽来自拉沙病毒，而沙粒病毒颗粒包含lcmv或皮钦德病毒的gp、np、z和l。
[0180]
在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒经工程化使得沙粒病毒orf在两个或更多个mrna转录物上分隔开(参见第5.5节)。在某些实施例中，mrna转录物的其中之一进一步包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列。在某些实施例中，mrna转录物的其中之一进一步包含编码异源多肽的核苷酸序列，所述异源多肽来源于沙粒病毒，但衍生自与所述包含gp、np、z和l的沙粒病毒颗粒所衍生自的沙粒病毒类型不同的沙粒病毒类型。在一个示例性实施例中，异源多肽来自拉沙病毒，而沙粒病毒颗粒包含lcmv或皮钦德病毒的gp、np、z和l。
[0181]
在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段(参见第5.6节)经工程化使得其病毒转录产生第一mrna转录物和第二mrna转录物，所述第一mrna转录物包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，所述第一多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，并且所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段经工程化使得其病毒转录产生rna转录物，所述mrna转录物编码第一多肽和异源非沙粒病毒多肽或第二多肽的功能片段，所述第一多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段经工程化使得其病毒转录产生mrna转录物，所述mrna转录物编码第一多肽和异源多肽的功能片段，所述第一多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，所述异源多肽来源于沙粒病毒，但衍生自与所述包含gp、np、z和l的沙粒病毒基因组所衍生自的沙粒病毒类型不同的沙粒病毒类型。在一个示例性实施例中，异源多肽来自拉沙病毒，而沙粒病毒基因组包含lcmv或皮钦德病毒的gp、np、z和l。
[0182]
在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽的长度为约、至多约或至少约5、8、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38、40、42、45、48、50、52、55、58、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或大于1000个氨基酸。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽的长度为约、至少约或至多约5至10个氨基酸、10至25个氨基酸、25至50个氨基酸、50至100个氨基酸、100至150个氨基酸、150至200个
氨基酸、200至250个氨基酸、250至300个氨基酸、300至400个氨基酸、300至500个氨基酸、350至600个氨基酸、400至500个氨基酸、500至750个氨基酸、750至1000个氨基酸、1000至1250个氨基酸、1250至1500个氨基酸、1500至1750个氨基酸、1750至2000个氨基酸、2000至2500个氨基酸或大于2500个或更多个氨基酸。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽的长度不超过500个氨基酸。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽的长度不超过750个氨基酸。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽的长度不超过1000个氨基酸。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽的长度不超过2500个氨基酸。
[0183]
在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽由约、至少约或至多约5、8、10、12、15、18、20、22、25、28、30、32、35、38、40、42、45、48、50、52、55、58、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约58个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约193个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约200个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约480个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约450个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约500个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约350个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约400个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约550个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约600个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约15个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约20个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约1至20个氨基酸残基组成。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽可以由约、至少约或至多约200至600个氨基酸残基组成。
[0184]
在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽是报告蛋白(参见第5.3.1节)。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽是异源非沙粒病毒信号肽(参见第5.3.2节)。在某些实施例中，异源非沙粒病毒多肽是抗原(参见第5.3.3节)。5.3.1报告蛋白
[0185]
在某些实施例中，本文所述的异源非沙粒病毒多肽是报告蛋白或荧光蛋白。在某些实施例中，所述报告蛋白是荧光蛋白。在某些实施例中，所述报告蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)。当暴露于紫外线或蓝光时，gfp会发出明亮的绿光。在其他实施例中，所述报告蛋白是红色荧光蛋白(rfp)。在一个示例性实施例中，所述报告蛋白是tom。
[0186]
报告蛋白和基因很容易被本领域技术人员识别。报告蛋白的非限制性实例包括各种酶，例如但不限于β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、萤光素酶或rfp。
[0187]
在某些实施例中，所述报告蛋白能够与本文所述的抗原同时表达。理想情况下，表达是在普通光或其他波长的光下可见的。在某些实施例中，所述报告蛋白产生的作用强度可用于直接测量和监测所述沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。
5.3.2异源非沙粒病毒信号肽
[0188]
在某些实施例中，本文所述的异源非沙粒病毒多肽是异源非沙粒病毒信号肽。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒信号肽是糖蛋白的信号肽。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒信号肽源自病毒家族，所述病毒家族选自由以下各项组成的组：腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒属和禽类腺病毒属)、疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒5型、单纯疱疹病毒6型、eb病毒(epstein-barr virus)、hhv6-hhv8、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒)、光滑噬菌体科(例如，光滑噬菌体属、大肠杆菌噬菌体ms2、异型小病毒属(allolevirus))、正粘病毒科(例如，流感病毒a型、流感病毒b型、流感病毒c型)、细小病毒科(例如，细小病毒b19)、丝状病毒科(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)、汉坦病毒科、痘病毒科(例如，脊索动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、野兔痘病毒属、猪痘病毒、软疣痘病毒属和昆虫痘病毒亚科)、多瘤病毒科、乳头瘤病毒科(例如，人乳头瘤病毒))、副粘病毒科(例如，副粘病毒属、副流感病毒1型、麻疹病毒属(麻疹病毒)、腮腺炎病毒属(例如，腮腺炎病毒))、肺病毒科(例如，肺病毒属、人呼吸道合胞病毒和偏肺病毒属(例如，禽肺病毒和人偏肺病毒))、小核糖核酸病毒科(例如，肠道病毒属、鼻病毒属、肝病毒属(例如，人甲型肝炎病毒)、心病毒属和口疮病毒属)、呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属、水稻病毒属)、逆转录病毒科(例如，哺乳动物b型逆转录病毒、哺乳动物c型逆转录病毒、禽类c型逆转录病毒和d型逆转录病毒群、blv-htlv逆转录病毒、慢病毒(例如人类免疫缺陷病毒(hiv)1和hiv-2(例如，hiv gp160))、泡沫病毒)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒)、嗜肝dna病毒科(例如，乙型肝炎病毒)、披膜病毒科(例如、甲病毒属(例如，辛德毕斯病毒(sindbis virus))和风疹病毒属(例如，风疹病毒))、弹状病毒科(例如，水疱病毒属、狂犬病毒属、短暂热病毒属、胞质弹状病毒属和胞核弹状病毒属)、沙粒病毒科(例如，沙粒病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、鸠宁病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、奥利华斯病毒、帕腊南病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、塔米埃米病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)和拉沙病毒))和冠状病毒科(例如，冠状病毒属和环曲病毒属)。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒信号肽是水疱性口炎病毒血清型印第安纳型糖蛋白的信号肽。5.3.3抗原
[0189]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是抗原。在某些实施例中，所述抗原源自感染性生物体、肿瘤或过敏原。在一个实施例中，所述抗原是感染性病原体或与任何能够引发免疫应答的疾病相关。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是来源于病毒、细菌、真菌、寄生虫的抗原，或者可以在肿瘤或肿瘤相关疾病(即癌症)、自身免疫病、退行性疾病、遗传性疾病、物质依赖、肥胖或过敏性疾病中表达。
[0190]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是病毒抗原。病毒抗原的非限制性实例包括源自以下各项的抗原：腺病毒科(例如，哺乳动物腺病毒属和禽类腺病毒属)、疱疹病毒科(例如，单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒5型、单纯疱疹病毒6型、eb病毒(epstein-barr virus)、hhv6-hhv8、巨细胞病毒和水痘带状疱疹病毒)、光滑噬菌体科(例如，光滑噬菌体属、大肠杆菌噬菌体ms2、异型小病毒属(allolevirus))、正粘病毒科(例
如，流感病毒a型、流感病毒b型、流感病毒c型)、细小病毒科(例如，细小病毒b19)、丝状病毒科(例如，埃博拉病毒、马尔堡病毒)、汉坦病毒科、痘病毒科(例如，脊索动物痘病毒亚科、副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、野兔痘病毒属、猪痘病毒、软疣痘病毒属和昆虫痘病毒亚科)、多瘤病毒科、乳头瘤病毒科(例如，人乳头瘤病毒))、副粘病毒科(例如，副粘病毒属、副流感病毒1型、麻疹病毒属(麻疹病毒)、腮腺炎病毒属(例如，腮腺炎病毒))、肺病毒科(例如，肺病毒属、人呼吸道合胞病毒和偏肺病毒属(例如，禽肺病毒和人偏肺病毒))、小核糖核酸病毒科(例如，肠道病毒属、鼻病毒属、肝病毒属(例如，人甲型肝炎病毒)、心病毒属和口疮病毒属)、呼肠孤病毒科(例如，正呼肠孤病毒、环状病毒、轮状病毒属、质型多角体病毒属、斐济病毒属、植物呼肠孤病毒属、水稻病毒属)、逆转录病毒科(例如，哺乳动物b型逆转录病毒、哺乳动物c型逆转录病毒、禽类c型逆转录病毒和d型逆转录病毒群、blv-htlv逆转录病毒、慢病毒(例如人类免疫缺陷病毒(hiv)1和hiv-2(例如，hiv gp160))、泡沫病毒)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒)、嗜肝dna病毒科(例如，乙型肝炎病毒)、披膜病毒科(例如、甲病毒属(例如，辛德毕斯病毒(sindbis virus))和风疹病毒属(例如，风疹病毒))、弹状病毒科(例如，水疱病毒属、狂犬病毒属、短暂热病毒属、胞质弹状病毒属和胞核弹状病毒属)、沙粒病毒科(例如，沙粒病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、伊派病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、鸠宁病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、奥利华斯病毒、帕腊南病毒、皮钦德病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、塔米埃米病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)和拉沙病毒))和冠状病毒科(例如，冠状病毒属和环曲病毒属)。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒包含编码抗原的基因组，该抗原源自哺乳类沙粒病毒属(例如，奥尔帕瓦约病毒、阿拉善病毒、鸠宁病毒、熊峡谷病毒、萨比亚病毒、皮钦德病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、弗莱克索病毒、加伊罗病毒、瓜纳瑞托病毒、伊派病毒、拉沙病毒、拉蒂诺病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、马秋波病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、奥利华斯病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、阿马帕里病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、塔卡里伯病毒、塔米埃米病毒、温州病毒、白水阿罗约病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒或沙普里病毒)，其中哺乳类沙粒病毒属不同于沙粒病毒的种，源自该沙粒病毒的沙粒病毒颗粒包含gp、np、z以及l。在一个具体实施例中，所述病毒抗原是hiv gp120、gp41、hiv nef、rsv f糖蛋白、rsv g糖蛋白、htlv tax、单纯疱疹病毒糖蛋白(例如，gb、gc、gd和ge)或乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎病毒e蛋白或冠状病毒刺突蛋白。在一个实施例中，所述病毒抗原不是hiv抗原。
[0191]
在其他实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是细菌抗原(例如，细菌包被蛋白)。细菌抗原的非限制性实例包括源自细菌家族的抗原，所述细菌家族选自由以下各项组成的组：水螺菌属家族、固氮螺菌属家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体属菌种、蛭弧菌属家族、弯曲杆属菌种、衣原体属菌种(例如，肺炎衣原体)、梭菌属、肠杆菌科家族(例如，柠檬酸杆菌属菌种、爱德华氏菌属、产气肠杆菌、欧文氏菌属菌种(envinia species)、大肠杆菌、哈夫尼菌属菌种、克雷伯氏菌属菌种、摩根氏菌属菌种、普通变形杆菌、普鲁威登菌属(providencia)、沙门氏菌属菌种、粘质沙雷菌和福氏志贺菌)、gardinella菌属家族、流感嗜血杆菌、盐杆菌科家族、螺杆菌属家族、军团菌科家族、李斯特氏菌属菌种、甲基球菌科家
族、分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌)、奈瑟氏菌科家族、海洋螺菌属家族、巴氏杆菌科家族、肺炎球菌属菌种、假单胞菌属菌种、根瘤菌科家族、螺旋菌属家族、螺状菌科家族、葡萄球菌属(例如，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和酿脓葡萄球菌(staphylococcus pyrogenes))、链球菌属(例如，肠炎链球菌、筋膜链球菌(streptococcus fasciae)和肺炎链球菌)、vampirovibr helicobacter属家族、耶尔森氏菌属家族、炭疽杆菌和蝙蝠弧菌属家族。
[0192]
在其他实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是寄生虫抗原(例如，原生动物抗原)。寄生虫抗原的非限制性实例包括来自寄生虫的抗原，例如变形虫、疟原虫、疟原虫属、克氏锥虫。
[0193]
在还有其他的实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是真菌抗原。真菌抗原的非限制性实例包括源自以下真菌的抗原：犁头霉属菌种(例如，伞状犁头霉和分枝犁头霉)、曲霉菌属菌种(例如，黄曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、黑曲霉和土曲霉)、蛙粪霉、皮炎芽生菌、念珠菌属菌种(例如，白念珠菌、光滑念珠菌、克恩念珠菌(candida kern)、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、伪热带念珠菌、季也蒙念珠菌、皱褶念珠菌、类星形念珠菌和热带念珠菌)、粗球孢子菌、耳霉属菌种、新型隐球菌、小克银汉霉属菌种、皮肤癣菌、荚膜组织胞浆菌、石膏样小孢子菌、微小毛霉、巴西副球孢子菌、波氏假阿利什霉(pseudallescheria boydii)、西伯鼻孢子菌、卡氏肺孢菌、根霉属菌种(例如，少根根霉、米根霉和小孢根霉)、酵母菌属菌种、申克孢子丝菌、接合菌和菌纲例如接合菌纲、子囊菌纲、担子菌纲、半知菌纲和卵菌纲。
[0194]
在一些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是肿瘤新生抗原。本文所使用的“新生抗原”是指由肿瘤细胞中的突变产生的抗原，并且这种抗原通常不在正常细胞或组织中表达。不受理论约束地，因为健康组织通常不具有这些抗原，所以新生抗原代表优选的靶标。此外，不受理论约束地，在本发明的上下文中，由于识别新生抗原的t细胞可能没有经历阴性胸腺选择或在功能上不受外周耐受机制的影响，因此这种细胞可具有对抗原的高功能性亲合力和对肿瘤产生强烈的免疫应答，同时没有诱导破坏正常组织和自身免疫损伤的风险。在某些实施例中，所述新生抗原是mhc i类限制性新生抗原。在某些实施例中，所述新生抗原是mhc ii类限制性新生抗原。在某些实施例中，患者肿瘤细胞中的突变导致产生所述新生抗原的新型蛋白质。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是肿瘤新生表位。在某些实施例中，所述新生表位是mhc i类限制性新生表位。在某些实施例中，所述新生表位是mhc ii类限制性新生表位。
[0195]
在一些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是肿瘤抗原或肿瘤相关抗原。在一些实施例中，所述肿瘤抗原或肿瘤相关抗原包括源自以下肿瘤相关疾病的抗原，包括急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、儿童肾上腺皮质癌、aids相关癌症、卡波西肉瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤，基底细胞癌，胆管癌，肝外(参见胆管细胞癌)，膀胱癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤，脑干神经胶质瘤，脑癌，脑肿瘤，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤脑肿瘤，室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚叶肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、类癌胃肠道肿瘤、原发性不明癌、中枢神经系统淋巴瘤、原发性小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、儿童癌症、慢性支气管炎、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、结缔组织增生
性小圆细胞肿瘤、肺气肿、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肿瘤家族中的尤因肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤：颅外、性腺外或卵巢妊娠滋养细胞肿瘤、脑干胶质瘤、神经胶质瘤、儿童脑星形细胞瘤、儿童视觉通路和下丘脑、类胃癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏病、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视觉通路神经胶质瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(胰腺内分泌癌)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、急性淋巴母细胞性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞/小细胞肺癌、艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)、梅克尔细胞癌、间皮瘤、成人恶性肿瘤、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤，蕈样肉芽肿，骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、成人急性骨髓性白血病、儿童急性骨髓瘤，多发性(骨髓癌)、骨髓增生性疾病、慢性鼻腔及鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、少突胶质细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性骨纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢癌生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌(胰岛细胞)、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、儿童期、唾液腺癌、肉瘤、尤文家族肿瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里综合征(s
é
zary syndrome)、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、梅克尔细胞皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌——参见皮肤癌(非黑色素瘤)、鳞状颈癌伴隐匿性原发性、转移性胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤t细胞淋巴瘤——参见蕈样真菌病和塞扎里综合征、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、儿童肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、未知原发部位癌、成人未知原发部位、儿童癌症、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫颈癌、子宫内膜子宫肉瘤、支气管肿瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、儿童脊索瘤、结直肠癌、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病(成人/儿童)、小细胞肺癌、髓上皮瘤、口腔癌、乳头状瘤病、中等分化松果体实质肿瘤、垂体瘤、涉及15号染色体上nut基因的呼吸道癌、脊髓瘤、胸腺瘤、甲状腺癌、阴道癌；外阴癌和肾母细胞瘤。
[0196]
肿瘤或肿瘤相关抗原的非限制性实例包括adipophilin、aim-2、aldhiai、bclx(l)、bing-4、calca、cd45、cpsf、细胞周期蛋白d1、dkk1、enah(hmena)、epcam、epha3、ezh2、fgf5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、g250/mn/caix、her-2/neu、ido1、igf2b3、il13ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、kif20a、lengsin、m-csf、mcsp、mdm-2、meloe、mmp-2、mmp-7、mucl、muc5ac、p53、pax5、pbf、prame、psma、rage-1、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、secemin 1、sox10、steap1、存活素、端粒酶、vegf、wt1、egf-r、cea、cd52、gp 100蛋白、melana/mart1、ny-eso-1、p53、mage1、mage3、cdk4，α-actinin-4、artc1、bcr-abl融合蛋白(b3a2)、b-raf、casp-5、casp-8、β联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、clpp、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud2、延
伸因子2、etv6-aml1融合蛋白、flt3-itd、fn1、gpnmb、ldlr-岩藻糖基转移酶融合蛋白、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、k-ras、n-ras、rbaf600、sirt2、snrpd1、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tgfβrii、磷酸丙糖异构酶、lengsin、m-csf、mcsp或mdm-2。
[0197]
在一些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是呼吸道病原体抗原。在一个具体的实施例中，呼吸道病原体是病毒，例如rsv、冠状病毒、人偏肺病毒、副流感病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、腺病毒、鼻病毒或prrsv。呼吸道病毒抗原的非限制性实例包括呼吸道合胞病毒f、g和m2蛋白、冠状病毒(sars、hucov)刺突蛋白(s)、人偏肺病毒融合蛋白、副流感病毒融合蛋白和血凝素蛋白(f、hn)、亨德拉病毒(hev)和尼帕病毒(niv)附着糖蛋白(g和f)、腺病毒衣壳蛋白、鼻病毒蛋白和prrsv野生型或经修饰的gp5和m蛋白。
[0198]
在一个具体的实施例中，呼吸道病原体是细菌，例如炭疽杆菌(bacillus anthracis)、结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、百日咳鲍特菌(bordetella pertussis)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、鼠疫耶尔森氏菌(yersinia pestis)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、土拉热弗朗西丝菌(francisella tularensis)、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、肺炎衣原体(chlamydia pneumoniae)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitides)和流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)。呼吸道细菌抗原的非限制性实例包括炭疽杆菌保护性抗原pa、结核分枝杆菌抗原85a和热激蛋白(hsp65)、百日咳鲍特菌类毒素(pt)和丝状血凝素(fha)、肺炎链球菌定位酶a和表面黏附蛋白a(psaa)、鼠疫耶尔森氏菌f1和v亚基，以及源自金黄色葡萄球菌、土拉热弗朗西丝菌、嗜肺军团菌、肺炎衣原体、铜绿假单胞菌、脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌的各种蛋白。
[0199]
在一些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是t细胞表位。在其他实施例中，所述异源orf编码细胞因子和生长因子。
[0200]
在其他实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是在自身免疫性疾病中表达的抗原。在更具体的实施例中，所述自身免疫性疾病可以是i型糖尿病、多发性硬化、类风湿性关节炎、红斑狼疮和银屑病。自身免疫性疾病抗原的非限制性实例包括ro60、dsdna或rnp。
[0201]
在其他实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽是在过敏性疾病中表达的抗原。在更具体的实施例中，所述过敏性疾病可包括但不限于季节性和常年性鼻结膜炎、哮喘和湿疹。过敏抗原的非限制性例子包括bet v 1和fel d 1。5.4本文所提供的核苷酸序列
[0202]
在一个方面，本文提供了核苷酸序列。在某些实施例中，本文提供了一种核苷酸序列，包括第一开放阅读框(orf)和第二orf，其中，两个orf的其中之一处于有义方向，而另一orf处于反义方向；所述第一orf包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且所述第一orf不编码全长第一多肽；而所述第二orf包含编码以下项的核苷酸序列：a)第二多肽；或b)第一多肽的功能片段，并且所述第二orf不编码全长第一多肽；或c)第二多肽的功能片段，并且所述第二orf不编码全长第二多肽；或d)异源非沙粒病毒多肽；并且
所述第一和第二多肽彼此不同并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。
[0203]
在某些实施例中，所述第一orf和所述第二orf被沙粒病毒基因间区(igr)隔开，并且每个orf受沙粒病毒3'非翻译区(utr)或沙粒病毒5'utr的控制。
[0204]
在某些实施例中，所述第一orf还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列；所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽，并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0205]
在某些实施例中，所述第二orf还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列；所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽，并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0206]
在某些实施例中，所述第一orf是进一步包含另一orf的转录单位的一部分，其中，所述另一orf和所述第一orf被内部核糖体进入位点(ires)隔开。在某些实施例中，所述第二orf是进一步包含另一orf的转录单位的一部分，其中，所述另一orf和第二orf被ires隔开。在某些实施例中，所述第一orf和/或所述第二orf包含编码沙粒病毒gp信号肽或其功能片段的核苷酸序列，并且所述另一orf包含编码异源非沙粒病毒多肽或沙粒病毒np、z或l的核苷酸序列。
[0207]
在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l源自lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒(、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。
[0208]
在某些实施例中，本文提供了一种核苷酸序列，包括开放阅读框(orf)，其中，所述orf包含编码以下项的核苷酸序列：a)第一多肽的功能片段，和b)异源非沙粒病毒多肽或第二多肽；其中所述orf不编码全长第一多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同，并且选自由非源自拉沙病毒的沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。在某些实施例中，所述第一和第二多肽选自由以下各项组成的组：lcmv、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒的沙粒病毒gp、np、z、l。
[0209]
在某些实施例中，所述orf是第一orf并且所述核苷酸序列进一步包含第二orf。在某些实施例中，所述第二orf包含编码第三多肽、所述第一多肽的功能片段、第三多肽的功能片段或第二异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽，并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；两个orf的其中之一处于有义方向，而另一orf处于反义方向；所述第二orf不编码全长第一多肽；所述第二orf不编码全长第三多肽；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。在某些实施例中，所述第二orf包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且由所述第一orf编码的功能片段不同于由所述第二orf编码的功能片段。
[0210]
在某些实施例中，所述核苷酸序列不进一步包含第二orf。
[0211]
在某些实施例中，所述核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组s片段。在某些实施例中，所述核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组l片段。
[0212]
在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒3’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒5’utr的控制。在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒5’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒3’utr的控制。
[0213]
在某些实施例中，所述第一orf包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合。在某些实施例中，所述第二orf包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第二orf包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；其中，由所述第一orf编码的所述异源非沙粒病毒多肽和由所述第二orf编码的所述异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒3’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒5’utr的控制。
[0214]
在某些实施例中，所述第一orf包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第二orf包含编码np的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第一orf受沙粒病毒5’utr的控制，并且所述第二orf受沙粒病毒3’utr的控制。
[0215]
在某些实施例中，所述第一多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:
97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140；所述第二多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140；所述第三多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述第一多肽包含与以下各项相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。
[0216]
在某些实施例中，所述第一多肽的功能片段包含与以下各项的氨基酸序列具有至
少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128、seq id no:135、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129、seq id no:136、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。
[0217]
在某些实施例中，由所述第一orf或第二orf编码的功能片段为沙粒病毒gp信号肽或其功能片段。
[0218]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽、所述第二异源非沙粒病毒多肽或所述两个异源非沙粒病毒多肽各自是源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在某些实施例中，所述抗原选自由以下各项组成的组：(a)病毒抗原，所述病毒抗原源自病毒家族，所述病毒家族选自由以下各项组成的组：腺病毒科、疱疹病毒科、光滑噬菌体科、正粘病毒科、细小病毒科、丝状病毒科、汉坦病毒科、痘病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、副粘病毒科、肺病毒科、小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科、嗜肝dna病毒科、披膜病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科和冠状病毒科；(b)细菌抗原，其中所述细菌抗原源自细菌家族，所述细菌家族选自由以下各项组成的组：水螺菌属家族、固氮螺菌属家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体科家族、蛭弧菌属家族、弯曲杆菌科家族、衣原体科家族、梭菌科家族、肠杆菌科家族、gardinella菌属家族、巴氏杆菌科家族、盐杆菌科家族、螺杆菌属家族、军团菌科家族、李斯特氏菌科家族、甲基球菌科家族、分枝杆菌科家族、奈瑟氏菌科家族、海洋螺菌属家族、巴氏杆菌科家族、链球菌科家族、假单胞菌科家族、根瘤菌科家族、螺旋菌属家族、螺状菌科家族、葡萄球菌科家族、螺杆菌属家族、耶尔森氏菌属家族、炭疽杆菌和蝙蝠弧菌属家族，和(c)肿瘤新生抗原或新生表位和肿瘤相关抗原；并且所述肿瘤相关抗原选自由以下各项组成的组：hpv 16 e7和e6蛋白的人工融合蛋白、致瘤病毒抗原、癌-睾丸抗原、癌胚抗原、组织分化抗原、突变蛋白抗原、adipophilin、aim-2、aldhiai、bclx(l)、bing-4、calca、cd45、cpsf、细胞周期蛋白di、dkki、enah(hmcna)、ga733(epcam)、epha3、ezh2、fgf5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、g250/mn/caix、her-2/neu、idoi、igf2b3、il13ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、kif20a、lengsin、m-csf、mcsp、mdm-2、meloe、mmp-2、mmp-7、mucl、muc5ac、p53(非突变)、pax5、pbf、prame、psma、rage、rage-i、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、secemin 1、sox10、steapi(六跨膜前列腺上皮抗原1)、存活素、端粒酶、vegf、wt1、egf-r、cea、cd20、cd33、cd52、melana/mart1、mart2、ny-eso-1、p53、mage a1、mage a3、mage-4、mage-5、mage-6、cdk4，α-actinin-4、artc1、bcr-abl、bcr-abl融合蛋白(b3a2)、b-raf、casp-5、casp-8、β联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、clpp、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud2、延伸因子2、etv6-aml、etv6-aml1融合蛋白、flt3-itd、fn1、gpnmb、ldlr-岩藻糖基
转移酶融合蛋白、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、h-ras、k-ras(v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、n-ras、rbaf600、sirt2、snrpd1、ssx、ssx2、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tgfβrii、磷酸丙糖异构酶、ormdm-2、lmp2、hpv e6、hpv e7、egfrviii(表皮生长因子突变体iii)、独特型、gd2、神经节苷脂g2)、ras突变体、p53(突变体)、蛋白酶3(pri)、酪氨酸酶、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、前列腺酸性磷酸酶pap、neo-pap、ml-iap、afp、erg(tmprss2ets融合基因)、nai 7、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、trp2、trp2-int2、gd3、岩藻糖基gmi、间皮素、psca、sle(a)、cyplbl、placi、gm3、boris、tn、globoh、ny-br-i、sart3、stn、碳酸酐酶ix、oy-tesi、精子蛋白17、lck、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-i、fap、pdgfr-beta、madct-2、for相关抗原1、trpi、gp100、ca-125、ca19-9、钙网膜蛋白、上皮膜抗原(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、cd19、cd34、cd99、cdi17、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液蛋白(gcdfp-15)、hmb-45抗原、myo-dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体(肿瘤m2-pk)、bage bage-1、cage、ctage、fate、gage、gage-i、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-sar-35、spanxbi、spai7、ssx、sycp1、tpte、碳水化合物/神经节苷脂gm2(癌胚抗原-免疫原-1ofa-i-1)、gm3、ca15-3(ca 27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca50、cam43、cea、ebna、ef2、eb病毒抗原、hla-a2、hla-al1、hsp70-2、kiaao205、mum-i、mum-2、mum-3、i类肌球蛋白、gntv、herv-k-mel、lage-i、lage-2、(精子蛋白)spi7、scp-i、p15(58)、hom/mel-40、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、tsp-180、p185erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hl、tag-72、tag-72-4、ca-72-4、cam 17.1、numa、3-联蛋白、p16、tage、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、co-029、htgp-175、m344、mg7-ag、mov18、nb\70k、nyco-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tlp、tps、cd22、cd27、cd30、cd70、prostein、tarp(t细胞受体γ可变阅读框蛋白)、trp-p8、整合素avβ3(cd61)、催乳素或ral-b、cd123、cll-1、cd38、cs-1、cd138和ror1。
[0219]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽或所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3'utr的控制下表达；并且与在相应的沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比或与在相应的沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平或所述第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0220]
在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达。在某些实施例中，与在沙粒病毒5’utr的控制下表达的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0221]
在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr的控制下表达，并且
另一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr的控制下表达。在某些实施例中，与在沙粒病毒5’utr的控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽和相同的第二异源非沙粒病毒多肽(即所述相同的异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且所述相同的第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达)的组合表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0222]
在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达。在某些实施例中，与在沙粒病毒5’utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和相同的第二异源非沙粒病毒多肽(即所述相同的异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且所述相同的第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达)的细胞比例相比，表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞(例如，共表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞)比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在一些实施例中，细胞比例是用本公开的沙粒病毒(例如，一个异源非沙粒病毒在沙粒病毒3’utr的控制下表达并且另一个异源非沙粒病毒在沙粒病毒5’utr的控制下表达)感染细胞群后确定的。在一些实施例中，细胞比例是用另一个沙粒病毒(例如，两个异源非沙粒病毒都在沙粒病毒5’utr的控制下表达)感染细胞群后确定的。
[0223]
在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3’utr控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中沙粒病毒3’utr的控制下表达。在某些实施例中，与在沙粒病毒5’utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和相同的第二异源非沙粒病毒多肽(即所述相同的异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中沙粒病毒5’utr的控制下表达，并且所述相同的第二异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中沙粒病毒5’utr的控制下表达)的细胞比例相比，表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞(例如，共表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞)比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在一些实施例中，细胞比例是用本公开
的沙粒病毒(例如，一个异源非沙粒病毒在沙粒病毒3’utr的控制下表达并且另一个异源非沙粒病毒在沙粒病毒5’utr的控制下表达)感染细胞群后确定的。在一些实施例中，细胞比例是用另一个沙粒病毒(例如，两个异源非沙粒病毒都在沙粒病毒5’utr的控制下表达)感染细胞群后确定的。
[0224]
在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列包括第一开放阅读框(orf)和第二orf，并且两个orf的其中之一处于有义方向，而另一orf处于反义方向。在某些实施例中，所述第一orf处于有义方向，而所述第二orf处于反义方向。在其他实施例中，所述第一orf处于反义方向，而所述第二orf处于有义方向。在某些实施例中，所述第一orf和/或所述第二orf是转录单位的一部分，所述转录单位进一步包含另一orf，其中，所述另一orf和所述第一orf和/或所述第二orf中的每一个被内部核糖体进入位点(ires)隔开。
[0225]
在某些实施例中，所述功能片段由所述第一orf或所述第二orf单独编码。在某些实施例中，所述功能片段与异源非沙粒病毒多肽或选自沙粒病毒gp、np、z和l的多肽融合。在某些实施例中，所述功能片段受沙粒病毒3’utr的控制。在其他实施例中，所述功能片段受沙粒病毒5’utr的控制。在某些实施例中，由所述第一orf编码的功能片段不同于由所述第二orf编码的功能片段。
[0226]
在某些实施例中，由所述第一orf或第二orf编码的功能片段为沙粒病毒gp信号肽。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp信号肽不与沙粒病毒gp、np、z或l融合。
[0227]
在某些实施例中，本文所提供的核苷酸是mrna。在某些实施例中，本文所提供的核苷酸是包含内部核糖体进入位点(ires)的mrna。在其他实施例中，本文所提供的核苷酸是dna。在某些实施例中，本文所提供的核苷酸能够翻译成产物，例如多肽。在某些实施例中，本文所提供的核苷酸是能够转录产生沙粒病毒基因组或反基因组rna片段的dna。在某些实施例中，如本文所述的核苷酸序列可以是dna表达载体的一部分。
[0228]
表一显示了由第一和第二orf编码的多肽的非限制性实例。表1：由第一和第二orf编码的多肽的非限制性实例。
[0229]
在某些实施例中，功能片段选自由沙粒病毒gp信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2组成的组。表2显示了由与gp的功能片段相关的第一和第二orf编码的多肽的非限制性实例。表2：由与gp的功能片段相关的第一和第二orf编码的多肽的非限制性实例。
5.4.1与本文所提供的核苷酸序列相关的沙粒病毒基因组或反基因组片段
[0230]
在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，所述核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组s片段。在某些实施例中，所述核苷酸序列是沙粒病毒基因组或反基因组l片段。在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列可以衍生自沙粒病毒基因组或反基因组片段。
[0231]
在某些实施例中，本文所述的核苷酸序列的第一orf和第二orf位于s片段中或衍生自s片段并被沙粒病毒基因间区(igr)分隔开。在某些实施例中，本文所述的核苷酸序列的第一orf和第二orf位于l片段中或衍生自l片段并被沙粒病毒基因间区(igr)分隔开。在某些实施例中，位于s片段中的所述第一orf受沙粒病毒3'非翻译区(utr)的控制，而位于s片段中的所述第二orf受沙粒病毒5'utr的控制。在某些实施例中，位于l片段中的所述第一orf受沙粒病毒3'非翻译区(utr)的控制，而位于l片段中的所述第二orf受沙粒病毒5'utr的控制。在某些实施例中，位于s片段中的所述第一orf受沙粒病毒5'utr的控制，而位于s片段中的所述第二orf受沙粒病毒3'utr的控制。在某些实施例中，位于l片段中的所述第一orf受沙粒病毒5'utr的控制，而位于l片段中的所述第二orf受沙粒病毒3'utr的控制。
[0232]
关于本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的更多细节在第5.6节中有描述。5.4.2包含本文所提供的核苷酸序列的沙粒病毒颗粒
[0233]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其含有包含本文所提供的核苷酸序列的基因组。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由s片段和l片段组成。
[0234]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含一个s片段和两个l片段。
[0235]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0236]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0237]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、we病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病
毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0238]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组编码所述异源非沙粒病毒多肽和/或所述第二异源非沙粒病毒多肽，并且所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于第二沙粒病毒颗粒，所述第二沙粒病毒颗粒的基因组编码相同的异源非沙粒病毒多肽和/或相同的第二异源非沙粒病毒多肽；并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。
[0239]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒与其亲本病毒相比是减毒的。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0240]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0241]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽；与在沙粒病毒5'utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的另一沙粒病毒颗粒相比，所述沙粒病毒颗粒诱导针对所述异源非沙粒病毒多肽的免疫应答高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在一些实施例中，在对受试者施用本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒)后获得免疫应答(例如，更高的免疫应答)。在一些实施例中，在对受试者或类似的受试者施用在沙粒病毒5'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒后获得免疫应答。在一些实施例中，将在对受试者施用本公开的沙粒病毒颗粒后获得的免疫应答与在对受试者或类似的受试者施用另一沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒5'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒)后获得的免疫应答进行比较。在一些实施例中，所述受试者和/或所述类似的受试者是需要治疗的受试者。在一些实施例中，所述受试者和/或所述类似的受试者是患有疾病和/或具有疾病症状的受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是健康受试者。在一些实施例中，所述
类似的受试者是没有疾病的受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是需要治疗的受试者。
[0242]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其包含本文所提供的核苷酸序列。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒是遗传上稳定的。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒提供高水平的转基因表达。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是双片段的，即由两个沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。在某些实施例中，所述两个沙粒病毒基因组或反基因组片段是一个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的，即由三个沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。在某些实施例中，所述三个沙粒病毒基因组或反基因组片段是两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三个沙粒病毒基因组或反基因组片段是一个s片段和两个l片段。关于本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的更多细节在第5.6节中有所描述。5.4.3与本文所提供的核苷酸序列相关的组合物和方法
[0243]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的核苷酸序列的翻译产物。
[0244]
在某些实施例中，所述核苷酸序列是能够转录成沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列。在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒基因组或反基因组rna片段的方法，其中，所述方法包括转录本文所提供的dna序列。
[0245]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒颗粒的方法，其中，所述方法包括：a)将一个或多个本文所提供的dna序列或一个或多个rna序列转染到宿主细胞中，所述rna序列各自从本文所提供的dna序列体外转录；b)将编码沙粒病毒反式作用因子的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；c)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且d)收获沙粒病毒颗粒。
[0246]
在某些实施例中，使用双向启动子转录所述一个或多个dna序列。在某些实施例中，所述一个或多个dna序列在选自由以下项组成的组的启动子的控制下转录：a)rna聚合酶i启动子；b)rna聚合酶ii启动子；和c)t7启动子。
[0247]
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含本文所提供的核苷酸序列。
[0248]
在某些实施例中，本文提供了一种使用本文所提供的核苷酸序列拯救沙粒病毒颗粒的方法。
[0249]
在某些实施例中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的核苷酸序列、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体。
[0250]
在某些实施例中，本文提供了一种疫苗，其包含本文所提供的核苷酸序列、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体。
[0251]
在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所提供的核苷酸序列、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒和药学上可接受的载体。5.5本文所提供的沙粒病毒颗粒
[0252]
在另一个方面，本文提供了沙粒病毒颗粒。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒颗粒经工程化使得沙粒病毒的orf在两个或多个mrna转录物上分隔开。
[0253]
在某些实施例中，所述mrna转录物中的至少一个包含内部核糖体进入位点(ires)。
[0254]
在某些实施例中，所述mrna转录物能够转录成沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是s片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是l片段。
[0255]
在某些实施例中，所述两个或多个mrna转录物受沙粒病毒3'utr或沙粒病毒5'utr控制。
[0256]
在某些实施例中，所述沙粒病毒orf编码包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％和100％相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒orf编码包含与以下各项相同的氨基酸序列的多肽：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。
[0257]
在某些实施例中，所述沙粒病毒orf编码沙粒病毒gp信号肽、沙粒病毒gp1和gp2，并且所述沙粒病毒gp信号肽或其功能片段从第一mrna转录物表达(例如，病毒mrna转录物)和沙粒病毒gp1和gp2从第二mrna转录物表达(例如，病毒mrna转录物)。
[0258]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒3'utr控制。
[0259]
在某些实施例中，所述第二mrna转录物进一步编码异源非沙粒病毒信号肽。
[0260]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒信号肽是水疱性口炎病毒血清型印第安纳型糖蛋白的信号肽。
[0261]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物进一步包含编码异源非沙粒病毒多肽或沙
dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体(肿瘤m2-pk)、bage bage-1、cage、ctage、fate、gage、gage-i、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-sar-35、spanxbi、spai7、ssx、sycp1、tpte、碳水化合物/神经节苷脂gm2(癌胚抗原-免疫原-1ofa-i-1)、gm3、ca15-3(ca 27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca50、cam43、cea、ebna、ef2、eb病毒抗原、hla-a2、hla-al1、hsp70-2、kiaao205、mum-i、mum-2、mum-3、i类肌球蛋白、gntv、herv-k-mel、lage-i、lage-2、(精子蛋白)spi7、scp-i、p15(58)、hom/mel-40、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、tsp-180、p185erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hl、tag-72、tag-72-4、ca-72-4、cam 17.1、numa、3-联蛋白、p16、tage、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、co-029、htgp-175、m344、mg7-ag、mov18、nb\70k、nyco-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tlp、tps、cd22、cd27、cd30、cd70、prostein、tarp(t细胞受体γ可变阅读框蛋白)、trp-p8、整合素avβ3(cd61)、催乳素或ral-b、cd123、cll-1、cd38、cs-1、cd138和ror1。
[0263]
在某些实施例中，与在相应的沙粒病毒5'utr控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，在沙粒病毒3'utr控制下表达的所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)类似的细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述细胞是来自受试者的生物样本。在某些实施例中，所述生物样本源自器官(例如，脾脏)。在某些实施例中，所述生物样本是血液样本。
[0264]
在某些实施例中，与在相应沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同异源非沙粒病毒多肽的表达水平或在相应沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，在沙粒病毒3'utr的控制下表达的异源非沙粒病毒多肽的表达水平和/或在沙粒病毒3'utr的控制下表达的第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表
达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒和/或在沙粒病毒3'utr的控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒3'utr的控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的第二异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)细胞群后，表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒3'ut的r控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的第二异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)类似的细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒3'utr的控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述细胞是源自受试者的生物样本。在某些实施例中，所述生物样本源自器官(例如，脾脏)。在某些实施例中，所述生物样本是血液样本。
[0265]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒表达两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒3'utr的控制，并且两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5'utr的控制。在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒5'utr的控制，并且两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒3'utr的控制。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒5'utr的控制，并且所述相同的两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5'utr的控制。
[0266]
在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3'utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5'utr的控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3'utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒5'utr的控制下表达。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达。.在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中沙粒病毒5'
utr的控制下表达，并且所述第二异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和相同的第二异源非沙粒病毒多肽(即所述相同的异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达，并且所述相同的第二异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达)的细胞比例相比，表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞(例如，共表达所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽的细胞)比例高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在一些实施例中，细胞比例是用本公开的沙粒病毒(例如，一个异源非沙粒病毒在沙粒病毒3'utr的控制下表达并且另一个异源非沙粒病毒在沙粒病毒5'utr的控制下表达)感染细胞群后确定的。在一些实施例中，细胞比例是用另一个沙粒病毒(例如，两个异源非沙粒病毒都在沙粒病毒5'utr的控制下表达)感染细胞群后确定的。
[0267]
在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽(例如，在一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)细胞群后，表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，表达(例如，共表达)两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽(例如，在一个s片段的沙粒病毒5'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段的沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)类似的细胞群后表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽。
[0268]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组编码所述异源非沙粒病毒多肽和/或所述第二异源非沙粒病毒多肽，并且所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于第二沙粒病毒颗粒，所述第二沙粒病毒颗粒的基因组编码相同的异源非沙粒病毒多肽和/或相同的第二异源非沙粒病毒多肽；并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表
达为一个orf。
[0269]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由s片段和l片段组成。
[0270]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含一个s片段和两个l片段。
[0271]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒包含如图4c所示的基因组组构。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒包含如图4e所示的基因组组构。
[0272]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0273]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0274]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、we病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷
病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0275]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒与其亲本野生型病毒相比是减毒的。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0276]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0277]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽；与在沙粒病毒5'utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的另一沙粒病毒颗粒相比，所述沙粒病毒颗粒诱导针对所述异源非沙粒病毒多肽的免疫应答高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在一些实施例中，在对受试者施用本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒)后获得免疫应答(例如，更高的免疫应答)。在一些实施例中，在对受试者或类似的受试者施用在沙粒病毒5'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒后获得免疫应答。在一些实施例中，将在对受试者施用本公开的沙粒病毒颗粒后获得的免疫应答与在对受试者或类似的受试者施用另一沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒5'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒)后获得的免疫应答进行比较。在一些实施例中，所述受试者和/或所述类似的受试者是需要治疗的受试者。在一些实施例中，所述受试者和/或所述类似的受试者是患有疾病和/或具有疾病症状的受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是健康受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是没有疾病的受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是需要治疗的受
试者。
[0278]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，所述沙粒病毒颗粒经工程化使得沙粒病毒的orf在两个或多个mrna转录物上分隔开。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其包含本文所提供的核苷酸序列(参见第5.4节)。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段(参见第5.6节)。本文所述的沙粒病毒颗粒在遗传上是稳定的，并且提供高水平的转基因表达。
[0279]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的，即由三个沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。在某些实施例中，所述三个沙粒病毒基因组或反基因组片段是两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三个沙粒病毒基因组或反基因组片段是一个s片段和两个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含编码沙粒病毒gp、np、z和l的沙粒病毒orf。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒表达一个或多个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，本文所述的三片段的沙粒病毒颗粒可以由沙粒病毒基因组或反基因组片段中的六个位置组成，例如，位置1受沙粒病毒s片段5'utr的控制；位置2受沙粒病毒s片段3'utr的控制；位置3受沙粒病毒s片段5'utr的控制；位置4受沙粒病毒s片段3'utr的控制；位置5受沙粒病毒l片段5'utr的控制；位置6受沙粒病毒l片段3'utr的控制。在某些实施例中，位置1至6可以在两个或多个位置编码相同的多肽。在其他实施例中，位置1至6可以各自编码不同的多肽。在某些实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至6的三片段的沙粒病毒颗粒具有复制能力。在其他实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至6的三片段的沙粒病毒颗粒具有复制缺陷。
[0280]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是双片段的，即由两个沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。在某些实施例中，所述两个沙粒病毒基因组或反基因组片段是一个s片段和一个l片段。在某些实施例中，双片段的沙粒病毒颗粒的基因组可以由沙粒病毒基因组或反基因组片段中的四个位置组成，例如，位置1受沙粒病毒s片段5'utr的控制；位置2受沙粒病毒s片段3'utr的控制；位置3受沙粒病毒l片段5'utr的控制；位置4受沙粒病毒l片段3'utr的控制。在某些实施例中，位置1至4可以在两个或多个位置编码相同的多肽。在其他实施例中，位置1至4可以各自编码不同的多肽。在某些实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至4的双片段的沙粒病毒颗粒具有复制能力。在其他实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至4的双片段的沙粒病毒颗粒具有复制缺陷。
[0281]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在其他实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述
沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0282]
在某些实施例中，包含本文所述核苷酸序列的沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于携带一个或多个相同的异源非沙粒病毒多肽的第二沙粒病毒颗粒，并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。5.5.1沙粒病毒的开放阅读框
[0283]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组(参见第5.1节)。
[0284]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，即选自由沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l是野生型的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l是重组的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l是突变的。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l衍生自减毒的病毒。
[0285]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由野生型沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码野生型沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述野生型沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2。
[0286]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由重组沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码重组沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述重组沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2，其中一种或多种可以是重组的。
[0287]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由突变的沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码突变的沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，所述突变的沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2，其中一种或多种可以是突变的。
[0288]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由衍生自减毒的病毒的沙粒病毒糖蛋白、核蛋白、z蛋白、l蛋白、糖蛋白前体、核蛋白前体、z蛋白前体和l蛋白前体组成的组。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码衍生自减毒的病毒的沙粒病毒糖蛋白前体。在某些实施例中，衍生自减毒的病毒的所述沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2，其中一种或多种衍生自减毒的病毒。
[0289]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽选自由以下各项组成的组：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒的gp、np、z和l。
[0290]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:
no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:
id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨
基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码多肽，该多肽包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。
[0291]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码沙粒病毒gp，即沙粒病毒糖蛋白或任何糖蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码野生型沙粒病毒糖蛋白或任何野生型糖蛋白前体。在其他实施例中，所述沙粒病毒的orf编码重组沙粒病毒糖蛋白或任何重组糖蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒糖蛋白前体可以被加工成gp信号肽、gp1和gp2。在某些实施例中，所述沙粒病毒gp是沙粒病毒糖蛋白或以下病毒的任何糖蛋白前体：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒(、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病
毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:1、
id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒gp包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。
[0292]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码沙粒病毒np，即沙粒病毒核蛋白或任何核蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码野生型沙粒病毒核蛋白或任何野生型核蛋白前体。在其他实施例中，所述沙粒病毒的orf编码重组沙粒病毒核蛋白或任何重组核蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒np是沙粒病毒核蛋白或以下病毒的任何核蛋白前体：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序
列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、
seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒np包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131或seq id no:138。
[0293]
在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码沙粒病毒z，即沙粒病毒z蛋白或任何z蛋白前体。在某些实施例中，本文所述的多肽是野生型沙粒病毒z蛋白或任何野生型z蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒的orf编码重组沙粒病毒z蛋白或任何重组z蛋白前体。在某些实施例中，所述沙粒病毒z是沙粒病毒z蛋白或以下病毒的任何z蛋白前体：lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒(、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒
(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少85％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％
相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132或seq id no:139。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒z包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:13、
id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少90％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少95％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少96％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少97％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少98％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有至少99％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有100％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有80％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、
seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有85％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有90％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有95％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有96％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有97％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有98％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒l包含与以下各项的氨基酸序列具有99％相同的氨基酸序列：seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。5.5.2本文所提供的沙粒病毒颗粒的沙粒病毒基因组或反基因组片段
[0295]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是双片段的，即由两个沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。在某些实施例中，所述两个沙粒病毒基因组或反基因组片段是一个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的，即由三个沙粒病毒基因组
或反基因组片段组成。在某些实施例中，所述三个沙粒病毒基因组或反基因组片段是两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三个沙粒病毒基因组或反基因组片段是一个s片段和两个l片段。
[0296]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由以下各项组成：a)在3'utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2，以及在5'utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽的s片段；b)在3’utr的控制下编码np以及在5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在3’utr的控制下编码l蛋白以及在5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的。在其他实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽彼此不同。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由图4a所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。
[0297]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由以下各项组成：a)在3'utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽或不编码多肽，以及在5'utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽的s片段；b)在3’utr的控制下编码np以及在5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和c)在3’utr的控制下编码l蛋白以及在5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的。在其他实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽彼此不同。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由图4b所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。
[0298]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由以下各项组成：a)在3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在3’utr的控制下编码np以及在5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在3’utr的控制下编码l蛋白以及在5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的。在其他实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽彼此不同。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由图4c所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。
[0299]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由以下各项组成：a)在3’utr的控制下编码异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽以及在5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在3’utr的控制下编码np以及在5’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽的s片段；和c)在3’utr的控制下编码l蛋白以及在5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的。在其他实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽彼此不同。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由图4d所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。
[0300]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由以下各项组成：a)在3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在3’utr的控制下编码np以及在5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片
段；和c)在3’utr的控制下编码l蛋白以及在5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的。在其他实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽彼此不同。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由图4e所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。
[0301]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由以下各项组成：a)在3'utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2，以及在5'utr的控制下编码异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在3’utr的控制下编码np以及在5’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽的s片段；和c)在3’utr的控制下编码l蛋白以及在5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的。在其他实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽彼此不同。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组可以由图4f所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段组成。
[0302]
在某些实施例中，包含本文所述的核苷酸序列的所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，包含本文所述的核苷酸序列的所述沙粒病毒颗粒与其亲本病毒相比是减毒的。在某些实施例中，包含本文所述的核苷酸序列的所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0303]
在某些实施例中，双片段的沙粒病毒颗粒的基因组可以由沙粒病毒基因组或反基因组片段中的四个位置组成，例如，位置1受沙粒病毒s片段5'utr的控制；位置2受沙粒病毒s片段3'utr的控制；位置3受沙粒病毒l片段5'utr的控制；位置4受沙粒病毒l片段3'utr的控制。在某些实施例中，位置1至4可以在两个或多个位置编码相同的多肽。在其他实施例中，位置1至4可以各自编码不同的多肽。在某些实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至4的双片段的沙粒病毒颗粒具有复制能力。在其他实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至4的双片段的沙粒病毒颗粒具有复制缺陷。
[0304]
在某些实施例中，三片段的沙粒病毒颗粒的基因组可以由沙粒病毒基因组或反基因组片段中的六个位置组成，例如，位置1受沙粒病毒s片段5'utr的控制；位置2受沙粒病毒s片段3'utr的控制；位置3受沙粒病毒s片段5'utr的控制；位置4受沙粒病毒s片段3'utr的控制；位置5受沙粒病毒l片段5'utr的控制；位置6受沙粒病毒l片段3'utr的控制。在某些实施例中，位置1至6可以在两个或多个位置编码相同的多肽。在其他实施例中，位置1至6可以各自编码不同的多肽。在某些实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至6的三片段的沙粒病毒颗粒具有复制能力。在其他实施例中，包含沙粒病毒基因组或反基因组片段中位置1至6的三片段的沙粒病毒颗粒具有复制缺陷。
[0305]
在某些实施例中，位置1编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和gp2。在某些实施例中，位置1编码：1)沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽；2)单独沙粒病毒gp信号肽；或3)沙粒病毒gp信号肽和np、z或l。在某些实施例中，位置1编码异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，位置1编码np。在某些实施例中，位置1编码z。在某些实施例中，位置1编码l。在某些实施例中，位置1不编码多肽。
[0306]
在某些实施例中，位置2编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和gp2。在某些实施例中，位置2编码：1)沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽；2)单独沙粒病毒gp信号肽；或3)沙粒病毒gp信号肽和np、z或l。在某些实施例中，位置2编码异源非沙粒病毒多
肽。在某些实施例中，位置2编码np。在某些实施例中，位置2编码z。在某些实施例中，位置2编码l。在某些实施例中，位置2不编码多肽。
[0307]
在某些实施例中，位置3编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和gp2。在某些实施例中，位置3编码：1)沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽；2)单独沙粒病毒gp信号肽；或3)沙粒病毒gp信号肽和np、z或l。在某些实施例中，位置3编码异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，位置3编码np。在某些实施例中，位置3编码z。在某些实施例中，位置3编码l。在某些实施例中，位置3不编码多肽。
[0308]
在某些实施例中，位置4编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和gp2。在某些实施例中，位置4编码：1)沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽；2)单独沙粒病毒gp信号肽；或3)沙粒病毒gp信号肽和np、z或l。在某些实施例中，位置4编码异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，位置4编码np。在某些实施例中，位置4编码z。在某些实施例中，位置4编码l。在某些实施例中，位置4不编码多肽。
[0309]
在某些实施例中，位置5编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和gp2。在某些实施例中，位置5编码：1)沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽；2)单独沙粒病毒gp信号肽；或3)沙粒病毒gp信号肽和np、z或l。在某些实施例中，位置5编码异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，位置5编码np。在某些实施例中，位置5编码z。在某些实施例中，位置5编码l。在某些实施例中，位置5不编码多肽。
[0310]
在某些实施例中，位置6编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和gp2。在某些实施例中，位置6编码：1)沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽；2)单独沙粒病毒gp信号肽；或3)沙粒病毒gp信号肽和np、z或l。在某些实施例中，位置6编码异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，位置6编码np。在某些实施例中，位置6编码z。在某些实施例中，位置6编码l。在某些实施例中，位置6不编码多肽。
[0311]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在其他实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍
生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0312]
在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于携带一个或多个相同的异源非沙粒病毒多肽的第二沙粒病毒颗粒，并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。
[0313]
在某些实施例中，包含本文所述的核苷酸序列的所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，包含本文所述的核苷酸序列的所述沙粒病毒颗粒与其亲本病毒相比是减毒的。在某些实施例中，包含本文所述的核苷酸序列的所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。5.5.3与本文所提供的核苷酸序列相关的组合物和方法
[0314]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的翻译产物。
[0315]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna，其中，所述cdna能够转录成沙粒病毒颗粒基因组或反基因组片段。
[0316]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒基因组或反基因组片段的方法，其中，所述方法包括转录本文所提供的cdna。
[0317]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒颗粒的方法，其中，所述方法包括：a)将一个或多个本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna或一个或多个rna序列转染到宿主细胞中，所述rna序列各自从本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna体外转录；b)将编码沙粒病毒反式作用因子的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；c)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且d)收获沙粒病毒颗粒。
[0318]
在某些实施例中，使用双向启动子转录所述一个或多个cdna序列。在某些实施例中，所述一个或多个cdna序列在启动子的控制下被转录，所述启动子选自由以下各项组成的组：
a)rna聚合酶i启动子；b)rna聚合酶ii启动子；和c)t7启动子。
[0319]
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含编码本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的dna序列。
[0320]
在某些实施例中，一种使用本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物或其cdna序列来拯救沙粒病毒颗粒的方法。
[0321]
在某些实施例中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的沙粒病毒颗粒、本文所提供的翻译产物、本文所提供的cdna或本文所提供的dna表达载体。
[0322]
在某些实施例中，本文提供了一种疫苗,其包含本文所提供的沙粒病毒颗粒、本文所提供的翻译产物、本文所提供的cdna或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。
[0323]
在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物,其包含本文所提供的沙粒病毒颗粒、本文所提供的翻译产物、本文所提供的cdna或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。5.6本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段
[0324]
在另一个方面，本文提供了沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段，其经工程化使其病毒转录产生第一mrna转录物和第二mrna转录物，其中，所述第一mrna转录物包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且所述第一mrna转录物不编码全长第一多肽；而所述第二mrna转录物包含编码以下项的核苷酸序列：a)第二多肽；或b)第一多肽的功能片段，并且所述第二mrna转录物不编码全长第一多肽；或c)第二多肽的功能片段，并且所述第二mrna转录物不编码全长第二多肽；或d)异源非沙粒病毒多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。
[0325]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列，所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0326]
在某些实施例中，所述第二mrna转录物还包含编码第二异源非沙粒病毒多肽或第三多肽的核苷酸序列，所述第三多肽不同于所述第一多肽和所述第二多肽并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0327]
在某些实施例中，所述沙粒病毒gp、np、z和l源自lcmv、拉沙病毒、皮钦德病毒、奥利华斯病毒、塔米埃米病毒、莫巴拉病毒、莫佩亚病毒、伊派病毒(、阿马帕里病毒、弗莱克索病毒、瓜纳瑞托病毒、拉蒂诺病毒、马秋波病毒、帕腊南病毒、皮里陶病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、熊峡谷病毒、白水阿罗约病毒、奥尔帕瓦约病毒(allv)、阿拉善病毒、查帕雷病
毒、丽江病毒、库皮科斯病毒、加伊罗病毒、黎河病毒、卢约病毒、卢那病毒、卢里病毒、卢克病毒、马林塔尔病毒、美利奴步道病毒、莫洛戈罗病毒、奥卡汉贾病毒、阿波雷病毒、琉球病毒、索卢韦齐病毒、苏里斯病毒、温州病毒、大灌木丛湖病毒、卡塔里那病毒、斯金纳湖病毒、通托河病毒、沙普里病毒或鸠宁病毒。
[0328]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段，其经工程化使其病毒转录产生编码以下项的mrna转录物：a)第一多肽的功能片段，和b)异源非沙粒病毒多肽或第二多肽；所述mrna转录物不编码全长第一多肽；并且所述第一和第二多肽彼此不同并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组。
[0329]
在某些实施例中，所述mrna转录物是第一mrna转录物，并且所述沙粒病毒基因组或反基因组片段的病毒转录进一步产生第二mrna转录物。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码第三多肽的核苷酸序列；第三多肽的功能片段；第一多肽的功能片段；或第二异源非抗沙病毒多肽；其中，所述第三多肽不同于所述第一和所述第二多肽并且选自由沙粒病毒gp、np、z和l组成的组，所述第二mrna转录物不编码全长第一多肽；所述mrna转录物不编码全长第三多肽；并且所述异源非沙粒病毒多肽和所述第二异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0330]
在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码第一多肽的功能片段的核苷酸序列，并且由所述第一mrna转录物编码的功能片段不同于由所述第二mrna转录物编码的功能片段。
[0331]
在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段的病毒转录不进一步产生第二mrna转录物。
[0332]
在某些实施例中，所述mrna转录物包含内部核糖体进入位点(ires)。
[0333]
在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是s片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是l片段。
[0334]
在某些实施例中，所述功能片段受沙粒病毒3'utr的控制。在某些实施例中，所述功能片段受沙粒病毒5'utr的控制。
[0335]
在某些实施例中，所述第一、第二和第三多肽各自包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127、seq id no:134、seq id no:49、seq id no:56、seq id no:63、seq id no:70、seq id no:77、seq id no:81、seq id no:88、seq id no:95、seq id no:102、seq id no:106、seq id no:110、seq id no:117、seq id no:124、seq id no:131、seq id no:138、seq id no:50、seq id no:57、seq id no:64、seq id no:71、seq id no:78、
seq id no:82、seq id no:89、seq id no:96、seq id no:103、seq id no:107、seq id no:111、seq id no:118、seq id no:125、seq id no:132、seq id no:139、seq id no:51、seq id no:58、seq id no:65、seq id no:72、seq id no:79、seq id no:83、seq id no:90、seq id no:97、seq id no:104、seq id no:108、seq id no:112、seq id no:119、seq id no:126、seq id no:133或seq id no:140。
[0336]
在某些实施例中，所述第一多肽包含与以下各项相同的氨基酸序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:48、seq id no:52、seq id no:59、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:80、seq id no:84、seq id no:91、seq id no:98、seq id no:105、seq id no:109、seq id no:113、seq id no:120、seq id no:127或seq id no:134。
[0337]
在某些实施例中，所述第一多肽的功能片段包含与以下各项的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列：seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id no:33、seq id no:142、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36、seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42、seq id no:53、seq id no:60、seq id no:67、seq id no:74、seq id no:85、seq id no:92、seq id no:99、seq id no:114、seq id no:121、seq id no:128、seq id no:135、seq id no:54、seq id no:61、seq id no:68、seq id no:75、seq id no:86、seq id no:93、seq id no:100、seq id no:115、seq id no:122、seq id no:129、seq id no:136、seq id no:55、seq id no:62、seq id no:69、seq id no:76、seq id no:87、seq id no:94、seq id no:101、seq id no:116、seq id no:123、seq id no:130或seq id no:137。
[0338]
在某些实施例中，所述功能片段为沙粒病毒gp信号肽或其功能片段。
[0339]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽、所述第二异源非沙粒病毒多肽或所述两个异源非沙粒病毒多肽各自是源自感染性生物体、肿瘤或过敏原的抗原。在某些实施例中，所述抗原选自由以下各项组成的组：(a)病毒抗原，所述病毒抗原源自病毒家族，所述病毒家族选自由以下各项组成的组：腺病毒科、疱疹病毒科、光滑噬菌体科、正粘病毒科、细小病毒科、丝状病毒科、汉坦病毒科、痘病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、副粘病毒科、肺病毒科、小核糖核酸病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、黄病毒科、嗜肝dna病毒科、披膜病毒科、弹状病毒科、沙粒病毒科和冠状病毒科；(b)细菌抗原，其中所述细菌抗原源自细菌家族，所述细菌家族选自由以下各项组成的组：水螺菌属家族、固氮螺菌属家族、固氮菌科家族、拟杆菌科家族、巴尔通体科家族、蛭弧菌属家族、弯曲杆菌科家族、衣原体科家族、梭菌科家族、肠杆菌科家族、gardinella菌属家族、巴氏杆菌科家族、盐杆菌科家族、螺杆菌属家族、军团菌科家族、李斯特氏菌科家族、甲基球菌科家族、分枝杆菌科家族、奈瑟氏菌科家族、海洋螺菌属家族、巴氏杆菌科家族、链球菌科家族、假单胞菌科家族、根瘤菌科家族、螺旋菌属家族、螺状菌科家族、葡萄球菌科家族、螺杆菌属家族、耶尔森氏菌属家族、炭疽杆菌和蝙蝠弧菌属家族，和(c)肿瘤新生抗原或新生表位和肿瘤相关抗原；并且所述肿瘤相关抗原选自由以下各项组成的组：hpv 16 e7和e6蛋白的人工融合蛋白、致瘤病毒抗原、癌-睾丸抗原、癌胚
抗原、组织分化抗原、突变蛋白抗原、adipophilin、aim-2、aldhiai、bclx(l)、bing-4、calca、cd45、cpsf、细胞周期蛋白di、dkki、enah(hmcna)、ga733(epcam)、epha3、ezh2、fgf5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、g250/mn/caix、her-2/neu、idoi、igf2b3、il13ralpha2、肠羧基酯酶、甲胎蛋白、激肽释放酶4、kif20a、lengsin、m-csf、mcsp、mdm-2、meloe、mmp-2、mmp-7、mucl、muc5ac、p53(非突变)、pax5、pbf、prame、psma、rage、rage-i、rgs5、rhoc、rnf43、ru2as、secemin 1、sox10、steapi(六跨膜前列腺上皮抗原1)、存活素、端粒酶、vegf、wt1、egf-r、cea、cd20、cd33、cd52、melana/mart1、mart2、ny-eso-1、p53、mage a1、mage a3、mage-4、mage-5、mage-6、cdk4，α-actinin-4、artc1、bcr-abl、bcr-abl融合蛋白(b3a2)、b-raf、casp-5、casp-8、β联蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、clpp、coa-1、dek-can融合蛋白、eftud2、延伸因子2、etv6-aml、etv6-aml1融合蛋白、flt3-itd、fn1、gpnmb、ldlr-岩藻糖基转移酶融合蛋白、nfyc、ogt、os-9、pml-rarα融合蛋白、prdx5、ptprk、h-ras、k-ras(v-ki-ras2kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、n-ras、rbaf600、sirt2、snrpd1、ssx、ssx2、syt-ssx1或-ssx2融合蛋白、tgfβrii、磷酸丙糖异构酶、ormdm-2、lmp2、hpv e6、hpv e7、egfrviii(表皮生长因子突变体iii)、独特型、gd2、神经节苷脂g2)、ras突变体、p53(突变体)、蛋白酶3(pri)、酪氨酸酶、psa、htert、肉瘤易位断点、epha2、前列腺酸性磷酸酶pap、neo-pap、ml-iap、afp、erg(tmprss2ets融合基因)、nai 7、pax3、alk、雄激素受体、细胞周期蛋白b1、聚唾液酸、mycn、trp2、trp2-int2、gd3、岩藻糖基gmi、间皮素、psca、sle(a)、cyplbl、placi、gm3、boris、tn、globoh、ny-br-i、sart3、stn、碳酸酐酶ix、oy-tesi、精子蛋白17、lck、高分子量黑色素瘤相关抗原(hmwmaa)、akap-4、ssx2、xage1、b7h3、legumain、tie2、page4、vegfr2、mad-ct-i、fap、pdgfr-beta、madct-2、for相关抗原1、trpi、gp100、ca-125、ca19-9、钙网膜蛋白、上皮膜抗原(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、cd19、cd34、cd99、cdi17、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液蛋白(gcdfp-15)、hmb-45抗原、myo-dl、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型的二聚体(肿瘤m2-pk)、bage bage-1、cage、ctage、fate、gage、gage-i、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-sar-35、spanxbi、spai7、ssx、sycp1、tpte、碳水化合物/神经节苷脂gm2(癌胚抗原-免疫原-1ofa-i-1)、gm3、ca15-3(ca 27.29\bcaa)、ca195、ca242、ca50、cam43、cea、ebna、ef2、eb病毒抗原、hla-a2、hla-al1、hsp70-2、kiaao205、mum-i、mum-2、mum-3、i类肌球蛋白、gntv、herv-k-mel、lage-i、lage-2、(精子蛋白)spi7、scp-i、p15(58)、hom/mel-40、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、tsp-180、p185erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hl、tag-72、tag-72-4、ca-72-4、cam 17.1、numa、3-联蛋白、p16、tage、ct7、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、co-029、htgp-175、m344、mg7-ag、mov18、nb\70k、nyco-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tlp、tps、cd22、cd27、cd30、cd70、prostein、tarp(t细胞受体γ可变阅读框蛋白)、trp-p8、整合素avβ3(cd61)、催乳素或ral-b、cd123、cll-1、cd38、cs-1、cd138和ror1。
[0340]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒3'utr的控制，并且所述第二mrna转录物受
沙粒病毒5'utr的控制。
[0341]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；由所述第一mrna转录物编码的所述异源非沙粒病毒多肽和由所述第二mrna转录物编码的所述异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒3'utr控制，并且所述第二mrna转录物受沙粒病毒5'utr控制。
[0342]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽以及沙粒病毒gp1和gp2的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第二mrna转录物包含编码np的核苷酸序列。在某些实施例中，所述第一mrna转录物受沙粒病毒5'utr控制，并且所述第二mrna转录物受沙粒病毒3'utr控制。
[0343]
在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3'utr的控制下表达，或所述第二异源非沙粒病毒多肽在沙粒病毒3'utr控制下表达；并且与在相应的沙粒病毒5'utr控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比或与在相应的沙粒病毒5'utr控制下表达的相同的第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平或所述第二异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0344]
在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒3'utr控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒5'utr控制。在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制。在某些实施例中，用本公开的沙粒病毒颗粒感染的细胞(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)表达(共表达)两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受另一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制)相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，细胞表达两个异源非沙粒病毒多肽)高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，一个异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达)相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，细胞表达两个异源非沙粒病毒多肽)高约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，一个异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中的沙粒病毒5'utr
的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达)相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，细胞表达两个异源非沙粒病毒多肽)高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0345]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是本文所提供的核苷酸序列(参见第5.4节)。在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列(参见第5.4节)衍生自本节中描述的沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，所述第一orf(参见第5.4节)的转录可产生本节中描述的第一mrna转录物，而所述第二orf(参见第5.4节)的转录可产生本节中描述的第二mrna转录物。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒(参见第5.5节)包含本节中描述的沙粒病毒基因组或反基因组片段。
[0346]
在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是s片段。在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段是l片段。在某些实施例中，由沙粒病毒基因组或反基因组片段编码的功能片段受3'utr的控制。在其他实施例中，由沙粒病毒基因组或反基因组片段编码的功能片段受5'utr的控制。
[0347]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合，并且所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受5'utr控制，并且所述第二mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4a所示的s1片段之一。
[0348]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合，并且所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受5'utr控制，并且所述第二mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合，并且不存在第二mrna转录物；所述第一mrna转录物受5'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4b所示的s1片段之一。
[0349]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列，并且所述第二mrna转录物包含编码np的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受5'utr控制，并且所述第二mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4b或图4e所示的s2片段之一。
[0350]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合，并且所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受3'utr控制，并且所述第二mrna转录物受5'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4c所示的s1片段之一。
[0351]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列，并且所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒多
肽的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受5'utr控制，并且所述第二mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列，并且不存在第二mrna转录物；所述第一mrna转录物受5'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4d所示的s1片段之一。
[0352]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合，并且所述第二mrna转录物包含编码np的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受5'utr控制，并且所述第二mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4d或图4f所示的s2片段之一。
[0353]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽是单一的或与异源非沙粒病毒多肽融合，并且所述第二mrna转录物包含编码另一异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同；所述第一mrna转录物受3'utr控制，并且所述第二mrna转录物受5'utr控制。在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码沙粒病毒gp信号肽的核苷酸序列，所述沙粒病毒gp信号肽与异源非沙粒病毒多肽融合，并且不存在第二mrna转录物；所述第一mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4e所示的s1片段之一。
[0354]
在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列，并且所述第二mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸序列；所述第一mrna转录物受3'utr控制，并且所述第二mrna转录物受5'utr控制。在某些实施例中，所述第一mrna转录物包含编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的核苷酸序列，并且不存在第二mrna转录物；所述第一mrna转录物受3'utr控制。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段是如图4f所示的s1片段之一。
[0355]
表三显示了由第一和第二mrna转录物编码的多肽的非限制性实例。表3：由第一和第二mrna转录物编码的多肽的非限制性实例。
[0356]
在某些实施例中，功能片段选自由沙粒病毒gp信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2组成的组。在某些实施例中，表4显示了由与gp的功能片段相关的第一和第二mrna转录物编码的多肽的非限制性实例。表4：由与gp的功能片段相关的第一和第二mrna转录物的多肽的非限制性实例。
5.6.1包含本文所提供的沙粒病毒基因或反基因组片段的沙粒病毒颗粒
[0357]
在某些实施例中，本文提供了一种沙粒病毒颗粒，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段。
[0358]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由s片段和l片段组成。
[0359]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是三片段的。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含两个s片段和一个l片段。在某些实施例中，所述三片段的沙粒病毒颗粒包含一个s片段和两个l片段。
[0360]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0361]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组由以下项组成：a)在沙粒病毒3’utr的控制下编码沙粒病毒gp信号肽和异源非沙粒病毒多肽或单独沙粒病毒gp信号肽以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码另一异源非沙粒病毒多肽或不编码多肽的s片段；b)在沙粒病毒3’utr的控制下编码np以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码异源非沙粒病毒信号肽、沙粒病毒gp1和沙粒病毒gp2的s片段；和c)在沙粒病毒3’utr的控制下编码l蛋白以及在沙粒病毒5’utr的控制下编码z蛋白的l片段；并且所述两个异源非沙粒病毒多肽是相同的或彼此不同。
[0362]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉沙病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)。在某些实施例中，所述lcmv是mp病毒
株、we病毒株、armstrong病毒株或armstrong克隆13病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮钦德病毒(picv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自鸠宁病毒疫苗candid#1，或鸠宁病毒疫苗xj克隆3病毒株。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥利华斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔米埃米病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫巴拉病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫佩亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自伊派病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿马帕里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自弗莱克索病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自瓜纳瑞托病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自拉蒂诺病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马秋波病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自帕腊南病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自皮里陶病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自萨比亚病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自塔卡里伯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自熊峡谷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自白水阿罗约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥尔帕瓦约病毒(allv)。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿拉善病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自查帕雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自丽江病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自库皮科斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自加伊罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自黎河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢约病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢里病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卢克病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自马林塔尔病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自美利奴步道病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自莫洛戈罗病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自奥卡汉贾病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自阿波雷病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自琉球病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自索卢韦齐病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自苏里斯病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自温州病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自大灌木丛湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自卡塔里那病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自斯金纳湖病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自通托河病毒。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒衍生自沙普里病毒。
[0363]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的基因组编码所述异源非沙粒病毒多肽和/或所述第二异源非沙粒病毒多肽，并且所述沙粒病毒颗粒的生长或感染性不低于第二沙粒病毒颗粒，所述第二沙粒病毒颗粒的基因组编码相同的异源非沙粒病毒多肽和/或相同的第二异源非沙粒病毒多肽；并且所述第二沙粒病毒颗粒中的所有沙粒病毒gp、np、z和l均表达为一个orf。
[0364]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的且具有复制能力。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒与其亲本野生型病毒相比是减毒的。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒是感染性的，但不能在非互补细胞中进一步产生感染性子代。
[0365]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、
9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。
[0366]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽；与在沙粒病毒5'utr控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的另一沙粒病毒颗粒相比，所述沙粒病毒颗粒诱导针对所述异源非沙粒病毒多肽的免疫应答高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在一些实施例中，在对受试者施用本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒)后获得免疫应答(例如，更高的免疫应答)。在一些实施例中，在对受试者或类似的受试者施用在沙粒病毒5'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒后获得免疫应答。在一些实施例中，将在对受试者施用本公开的沙粒病毒颗粒后获得的免疫应答与在对受试者或类似的受试者施用另一沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒5'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒)后获得的免疫应答进行比较。在一些实施例中，所述受试者和/或所述类似的受试者是需要治疗的受试者。在一些实施例中，所述受试者和/或所述类似的受试者是患有疾病和/或具有疾病症状的受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是健康受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是没有疾病的受试者。在一些实施例中，所述类似的受试者是需要治疗的受试者。
[0367]
在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达所述两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后表达所述异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)类似的细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达所述异源非沙粒病毒多肽。
[0368]
在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽(例如，在一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s
片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)细胞群后，表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，表达(例如，共表达)两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽(例如，在一个s片段的沙粒病毒5'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段的沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)的沙粒病毒颗粒被引入(或感染)类似的细胞群后表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒颗粒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达(例如，共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽。5.6.2与本文所提供的核苷酸序列相关的组合物和方法
[0369]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的翻译产物。
[0370]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna。
[0371]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒基因组或反基因组片段的方法，其中，所述方法包括转录本文所提供的cdna。
[0372]
在某些实施例中，本文提供了一种产生沙粒病毒颗粒的方法，其中，所述方法包括：a)将一个或多个本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列或一个或多个rna序列转染到宿主细胞中，所述rna序列各自从本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列体外转录；b)将编码沙粒病毒反式作用因子的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；c)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且d)收获沙粒病毒颗粒。
[0373]
在某些实施例中，使用双向启动子转录所述一个或多个cdna序列。在某些实施例中，所述一个或多个cdna序列在选自由以下项组成的组的启动子的控制下转录：a)rna聚合酶i启动子；b)rna聚合酶ii启动子；和c)t7启动子。
[0374]
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含编码本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列。
[0375]
在某些实施例中，本文提供了一种使用本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段或编码沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列拯救沙粒病毒颗粒的方法。
[0376]
在某些实施例中，本文提供了一种宿主细胞，其包含本文所提供的沙粒病毒基因
组或反基因组片段、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体。
[0377]
在某些实施例中，本文提供了一种疫苗，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。
[0378]
在某些实施例中，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段、本文所提供的翻译产物、本文所提供的沙粒病毒颗粒或本文所提供的dna表达载体和药学上可接受的载体。5.7本文所提供的翻译产物
[0379]
在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的核苷酸序列的翻译产物(参见第5.4节)。在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的翻译产物(参见第5.5节)。在某些实施例中，本文提供了一种本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段的翻译产物(参见第5.6节)。
[0380]
在某些实施例中，所述翻译产物是嵌合蛋白。在某些实施例中，所述翻译产物包含本文所提供的多肽(参见第5.1节)的功能片段(参见第5.2节)，所述多肽与异源非沙粒病毒多肽融合(参见第5.3节)。在某些实施例中，所述翻译产物包含本文所提供的多肽(参见第5.1节)的功能片段(参见第5.2节)，所述多肽与本文所提供的另一多肽融合(参见第5.1节)。在某些实施例中，所述翻译产物包含本文所提供的多肽(参见第5.1节)的功能片段(参见第5.2节)，所述多肽与本文所提供的相同的多肽或另一多肽的另一功能片段融合(参见第5.1节)。在某些实施例中，所述翻译产物包含本文所提供的多肽(参见第5.1节)的功能片段(参见第5.2节)。在某些实施例中，所述翻译产物包含异源非沙粒病毒多肽(参见第5.3节)。在某些实施例中，所述翻译产物包含本文所提供的多肽(参见第5.1节)。
[0381]
在某些实施例中，本文所提供的翻译产物是如表1中所列出的第一或第二orf中任一个的翻译产物。在某些实施例中，本文所提供的翻译产物是如表2中所列出的第一或第二orf中任一个的翻译产物。在某些实施例中，本文所提供的翻译产物是如表3中所列出的第一或第二mrna转录物中任一个的翻译产物。在某些实施例中，本文所提供的翻译产物是如表4中所列出的第一或第二mrna转录物中任一个的翻译产物。
[0382]
在某些实施例中，本文所提供的翻译产物是如图4a-4f中任一所示的沙粒病毒基因组或反基因组片段中任一个的翻译产物。5.8载体系统和细胞系
[0383]
在某些实施例中，本文提供了包含或由如第5.4节所描述的核苷酸序列组成的dna。在某些实施例中，本文提供了一种如第5.6节所描述的沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，本文提供了一种如第5.5节所描述的沙粒病毒颗粒中的沙粒病毒基因组或反基因组片段。在某些实施例中，本文提供了一种dna序列，其编码如第5.5节所描述的沙粒病毒颗粒中的mrna转录物。在某些实施例中，所述dna是cdna。
[0384]
在一个实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含如第5.4节所描述的核苷酸序列。在一个实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含编码如第5.6节所描述的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna。在一个实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含编码如第5.5节所描述的沙粒病毒颗粒中的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna。
在某些实施例中，本文提供了一种dna表达载体，其包含如第5.5节所描述的沙粒病毒颗粒中的mrna转录物的cdna。
[0385]
在一个实施例中，本文提供了一种dna表达载体系统，其编码如本文所述的双片段或三片段的沙粒病毒颗粒。具体地，本文提供了一种dna表达载体系统，其中一个或多个载体编码两个或三个沙粒病毒基因组或反基因组片段，即如本文所述的双片段的沙粒病毒的一个l片段和一个s片段，或如本文所述的三片段的沙粒病毒的一个l片段和两个s片段或两个l片段和一个s片段。这样的载体系统可以编码一个或多个单独的dna分子。
[0386]
在另一个实施例中，本文提供了如第5.6节所述的沙粒病毒s片段的dna或cdna，以及该dna或cdna是dna表达系统的一部分或被掺入到dna表达系统中。在其他实施例中，如第5.6节所述的沙粒病毒l片段的dna或cdna是dna表达系统的一部分或被掺入到dna表达系统中。
[0387]
在某些实施例中，本文所提供的dna可以衍生自特定的lcmv病毒株。lcmv病毒株包括克隆13、mp病毒株、arm ca 1371、arm e-250、we、ubc、traub、pasteur、810885、ch-5692、marseille#12、hp65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、douglas、gr01、sn05、cabn及其衍生物。在具体的实施例中，所述cdna衍生自lcmv克隆13。在具体的实施例中，所述cdna衍生自lcmv mp病毒株。
[0388]
在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的拉沙病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的皮钦德病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的鸠宁病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的奥利华斯病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的塔米埃米病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的莫巴拉病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的莫佩亚病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的伊派病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的阿马帕里病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的弗莱克索病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的瓜纳瑞托病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的拉蒂诺病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的马秋波病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的帕腊南病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的皮里陶病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的萨比亚病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的塔卡里伯病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的熊峡谷病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的白水阿罗约病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的奥尔帕瓦约病毒株(allv)。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的阿拉善病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的查帕雷病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的丽江病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的库皮科斯病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的加伊罗病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的黎河病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以
衍生自特定的卢约病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的卢那病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的卢里病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的卢克病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的马林塔尔病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的美利奴步道病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的莫洛戈罗病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的奥卡汉贾病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的阿波雷病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的琉球病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的索卢韦齐病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的苏里斯病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的温州病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的大灌木丛湖病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的卡塔里那病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的斯金纳湖病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的通托河病毒株。在某些实施例中，本文所提供的dna或cdna可以衍生自特定的沙普里病毒株。
[0389]
在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的lcmv病毒株。lcmv病毒株包括克隆13、mp病毒株、arm ca 1371、arm e-250、we、ubc、traub、pasteur、810885、ch-5692、marseille#12、hp65-2009、200501927、810362、811316、810316、810366、20112714、douglas、gr01、sn05、cabn及其衍生物。在某些实施例中，如本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒可以基于lcmv克隆13。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于lcmv mp病毒株。
[0390]
在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的拉沙病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的皮钦德病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的鸠宁病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的奥利华斯病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的塔米埃米病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的莫巴拉病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的莫佩亚病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的伊派病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的阿马帕里病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的弗莱克索病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的瓜纳瑞托病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的拉蒂诺病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的马秋波病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的帕腊南病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的皮里陶
病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的萨比亚病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的塔卡里伯病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的熊峡谷病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的白水阿罗约病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的奥尔帕瓦约病毒株(allv)。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的阿拉善病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的查帕雷病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的丽江病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的库皮科斯病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的加伊罗病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的黎河病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的卢约病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的卢那病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的卢里病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的卢克病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的马林塔尔病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的美利奴步道病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的莫洛戈罗病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的奥卡汉贾病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的阿波雷病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的琉球病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的索卢韦齐病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的苏里斯病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的温州病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的大灌木丛湖病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的卡塔里那病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的斯金纳湖病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的通托河病毒株。在某些实施例中，用于编码如本文所述的沙粒病毒颗粒而产生的载体可以基于特定的沙普里病毒株，
[0391]
在另一个实施例中，本文提供了一种细胞，其中该细胞包含本节上文所述的dna或载体系统。本文还提供了衍生自此类细胞的细胞系、包含此类细胞的培养物、培养此类细胞的方法。在某些实施例中，本文提供了一种细胞，其中，所述细胞包含三片段的沙粒病毒颗粒的cdna。在一些实施例中，所述细胞包含s片段和/或l片段。5.9沙粒病毒颗粒的产生
[0392]
一般地，沙粒病毒颗粒可以通过如针对lcmv所述的标准反向遗传技术(参见flatz等人,2006,proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊]103:4663-4668；sanchez等人,2006,virology[病毒学]350:370；ortiz-riano等人,2013,j gen virol.[普通病毒学杂志]94:1175-88，以上通过引用并入本文)重组产生。为了产生本文所提供的沙粒病毒颗粒，可以如下所述应用这些技术。
[0393]
在某些实施例中，这些病毒的基因组可以包含如第5.4节所述的核苷酸序列。这些病毒的基因组可以如第5.6节所述进行改造。如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒或如第5.6节所述的包含基因组或反基因组片段的沙粒病毒颗粒可以通过本领域技术人员已知的任何反向遗传技术重组产生。
[0394]
在某些实施例中，如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒或如第5.6节所述的包含基因组或反基因组片段的沙粒病毒颗粒可以是三片段的。三片段的沙粒病毒颗粒可以通过本领域已知的反向遗传技术(例如，如国际公开号：wo 2016/075250a1中所述)重组产生。5.9.1感染性且具有复制能力的沙粒病毒颗粒
[0395]
在某些实施例中，产生双片段的沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将各自在体外从第一和第二沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列转录的cdna或rna序列转染到宿主细胞中；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施例中，所述cdna包含在质粒中。
[0396]
在某些实施例中，当所述沙粒病毒颗粒是三片段的时，产生所述沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将各自在体外从一个l片段和两个s片段或两个l片段和一个s片段的dna序列转录的cdna或rna序列转染到宿主细胞中；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。
[0397]
一旦从cdna产生，沙粒病毒颗粒(即具有感染性和复制能力)就可以繁殖。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒可以在任何允许病毒生长至可实现如本文所述的病毒的用途的滴度的宿主细胞中繁殖。在一个实施例中，所述宿主细胞允许沙粒病毒颗粒生长至与表达相同的异源非沙粒病毒多肽的相应三片段artlcmv颗粒所测定的滴度相当的滴度。
[0398]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒可以在宿主细胞中繁殖。可以使用的宿主细胞的具体实例包括bhk-21、hek 293、vero等。在一个具体实施例中，所述沙粒病毒颗粒可以在细胞系中繁殖。
[0399]
在某些实施例中，所述宿主细胞保持在培养物中并用一个或多个质粒转染。所述质粒表达或编码将在一个或多个适合在哺乳动物细胞中表达的表达盒(例如，由聚合酶i启动子和终止子组成)的控制下产生的沙粒病毒基因组或反基因组片段。
[0400]
在具体的实施例中，所述宿主细胞保持在培养物中并用一个或多个质粒转染。所述质粒表达或编码将在一个或多个适合在哺乳动物细胞中表达的表达盒(例如，由聚合酶i启动子和终止子组成)的控制下产生的病毒基因。
[0401]
可用于产生病毒颗粒的质粒可以包括：i)编码s基因组片段(例如pol-i s)的质粒，ii)编码l基因组片段(例如pol-i l)的质粒。在某些实施例中，所述编码指导病毒l和s片段的细胞内合成的沙粒病毒聚合酶的质粒可以掺入到转染混合物中。例如，可以存在编
码l蛋白的质粒和/或编码np(分别为pc-l和pc-np)的质粒。l蛋白和np是病毒rna转录和复制所必需的最小反式作用因子。替代性地，病毒l和s片段以及np和l蛋白的细胞内合成可以使用表达盒进行，该表达盒含有pol-i和pol-ii启动子，其分别从相对侧读取到两个单独质粒的l和s片段cdnas中。
[0402]
在某些实施例中，当沙粒病毒颗粒是三片段的时，可用于产生包含一个l片段和两个s片段的三片段的沙粒病毒的质粒可以包括：i)各自编码s基因组片段(例如pol-i s)的两个质粒，ii)编码l基因组片段(例如pol-i l)的质粒。包含两个l片段和一个s片段的三片段的沙粒病毒所需的质粒是：i)各自编码l基因组片段(例如pol-l)的两个质粒，ii)编码s基因组片段(例如pol-i s)的质粒。
[0403]
在某些实施例中，当沙粒病毒颗粒是三片段的时，编码指导病毒l和s片段的细胞内合成的沙粒病毒聚合酶的质粒可以掺入到转染混合物中。例如，编码l蛋白的质粒和编码np(分别为pc-l和pc-np)的质粒。l蛋白和np是病毒rna转录和复制所必需的最小反式作用因子。替代性地，病毒l和s片段以及np和l蛋白的细胞内合成可以使用表达盒进行，该表达盒含有pol-i和pol-ii启动子，其分别从相对侧读取到两个单独质粒的l和s片段cdnas中。
[0404]
在某些实施例中，所述沙粒病毒基因组或反基因组片段受启动子的控制。典型地，可以使用rna聚合酶i驱动的表达盒、rna聚合酶ii驱动的表达盒或t7噬菌体rna聚合酶驱动的表达盒。在某些实施例中，编码所述沙粒病毒基因组或反基因组片段的质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子能够通过启动子从一个质粒转录。启动子的具体实例包括rna聚合酶i启动子、rna聚合酶ii启动子、rna聚合酶iii启动子、t7启动子、sp6启动子或t3启动子。
[0405]
此外，该质粒可以具有哺乳动物选择标记(例如，嘌呤霉素抗性)，该哺乳动物选择标记在适合于哺乳动物细胞中基因表达的表达盒(例如，如上的聚合酶ii表达盒)的控制下，或病毒基因转录物之后是内部核糖体进入位点(例如脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)，随后是哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，该质粒还具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
[0406]
为了获得稳定表达所需蛋白(例如沙粒病毒结构蛋白)的细胞系，可以使用任何常用策略(例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔)进行质粒转染宿主细胞。数天后，以滴定浓度添加合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，并使用针对目的病毒蛋白的抗体通过蛋白质印迹法或流式细胞术程序鉴定高表达克隆。
[0407]
为了回收本文所述的沙粒病毒颗粒，设想了以下程序。第一天：如上所述，通常在m6孔板中汇合的80％细胞用质粒混合物转染。为此，可以利用任何常用的策略，例如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。
[0408]
3-5天后：将培养的上清液(沙粒病毒载体制剂)收获、分装并在4oc、-20oc或-80oc下储存，具体取决于沙粒病毒载体在使用前应储存多长时间。沙粒病毒载体制剂的感染滴度通过免疫病灶测定法进行评估。替代性地，转染后的细胞和上清液可在转染后第3-5天传代到更大的容器(例如，t75组织培养瓶)中，并在传代后至多5天收集培养上清液。
[0409]
本技术还涉及异源非沙粒病毒多肽的表达，其中，编码所述基因组片段的质粒经修饰以掺入编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸。可以通过本领域技术人员已知的分子克隆技术，使用限制性内切酶和连接酶将编码异源非沙粒病毒多肽的核苷酸掺入该质粒中。
5.9.2感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒
[0410]
感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒能够如上所述被拯救。然而，一旦从dna产生，本文所提供的感染性复制缺陷型沙粒病毒能够在互补细胞中繁殖。互补细胞是通过修饰其基因组提供已从复制缺陷型沙粒病毒中除去的功能的细胞(例如，如果编码gp蛋白的orf缺失或功能失活，则互补细胞会提供gp蛋白)。
[0411]
由于沙粒病毒载体中一个或多个orf的去除或功能失活(此处以糖蛋白gp的缺失为例)，沙粒病毒载体可以在反式提供缺失的病毒基因(例如本实例中的gp)的细胞中产生和扩增。通过用一个或多个用于表达目的病毒基因的质粒(互补质粒，称为c质粒)转染细胞系(例如bhk-21、hek 293、vero或其他细胞系)产生这种互补细胞系(以下称为c细胞)。所述c质粒表达或编码在沙粒病毒载体中缺失的病毒基因，该沙粒病毒载体将在一个或多个适合在哺乳动物细胞中表达的表达盒(例如，哺乳动物聚合酶ii启动子，如具有多腺苷酸化信号的ef1α启动子)的控制下产生。此外，互补质粒具有哺乳动物选择标记(例如，嘌呤霉素抗性)，该哺乳动物选择标记在适合于哺乳动物细胞中基因表达的表达盒(例如，如上的聚合酶ii表达盒)的控制下，或病毒基因转录物之后是内部核糖体进入位点(例如脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点)，随后是哺乳动物抗性标记。为了在大肠杆菌中生产，该质粒还具有细菌选择标记，例如氨苄青霉素抗性盒。
[0412]
可使用的细胞(例如，bhk-21、hek 293、mc57g等)保持在培养物中，并通过任何常用策略(如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔)用互补质粒转染。数天后，以滴定浓度添加合适的选择剂，例如嘌呤霉素。按照标准程序分离和亚克隆存活的克隆，并使用针对目的病毒蛋白的抗体通过蛋白质印迹法或流式细胞术程序鉴定高表达的c细胞克隆。作为使用稳定转染的c细胞的替代性方法，对正常细胞的瞬时转染能够在如下将使用c细胞的每个步骤中补充缺失的病毒基因。此外，可以使用辅助病毒以反式提供缺失的功能。
[0413]
质粒可以有两种类型：i)两个质粒(称为tf质粒，其用于在c细胞中细胞内表达沙粒病毒的最小反式作用因子)在本实施例中衍生自例如lcmv的np和l蛋白；和ii)质粒(称为gs质粒)，其用于在c细胞中胞内表达沙粒病毒载体基因组片段，例如具有设计修饰的片段。tf质粒在适合于哺乳动物细胞中蛋白表达的表达盒的控制下表达各自沙粒病毒载体的np和l蛋白(通常例如，哺乳动物聚合酶ii启动子(如cmv或ef1α启动子))，它们中的任一种优先与多腺苷酸化信号结合。gs质粒表达载体的小的(s)和大的(l)基因组片段。典型地，可以使用聚合酶i驱动的表达盒或t7噬菌体(t7)rna聚合酶驱动的表达盒，后者优先使用3'末端核酶来处理初级转录物以产生正确的末端。在使用基于t7的系统的情况下，必须通过在回收过程中还包括附加的表达质粒来提供t7在c细胞中的表达，该附加的表达质粒被构建成类似于tf质粒，提供t7，或c细胞被构建成以稳定的方式附加地表达t7。在某些实施例中，tf和gs质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以由一个质粒的t7、poli和polii启动子转录。
[0414]
为了回收沙粒病毒载体，可以使用以下程序。第一天：通常在m6孔板中汇合的80％c细胞用两个tf质粒加上两个gs质粒的混合物转染。在某些实施例中，tf和gs质粒可以是相同的，即基因组序列和反式作用因子可以由一个质粒的t7、poli和polii启动子转录。为此，可以利用任何常用的策略，如磷酸钙、基于脂质体的方案或电穿孔。
[0415]
3-5天后：将培养上清液(沙粒病毒载体制剂)收获、分装并在4℃、-20℃或-80℃下
储存，具体取决于沙粒病毒载体在使用前应储存多长时间。然后通过在c细胞上进行免疫病灶测定来评估沙粒病毒载体制剂的感染滴度。替代性地，转染后的细胞和上清液可在转染后第3-5天传代到更大的容器(例如，t75组织培养瓶)中，并在传代后至多5天收集培养上清液。
[0416]
本发明还涉及抗原在细胞培养物中的表达，其中，所述细胞培养物被表达抗原的感染性复制缺陷型沙粒病毒感染。当用于在培养细胞中表达抗原时，可以使用以下两种程序：
[0417]
i)用本文所述的沙粒病毒载体制剂以一个或多个(例如2、3或4个)感染复数(moi)感染目的的细胞类型，导致在感染后不久就在所有细胞中产生抗原。
[0418]
ii)替代性地，可以使用较低的moi，并且可以根据病毒驱动的抗原表达水平选择单个细胞克隆。随后，由于沙粒病毒载体的非溶细胞性质，单个克隆可以无限扩增。无论采用何种方法，随后都可以从培养上清液或细胞本身中收集(和纯化)抗原，具体取决于所产生抗原的特性。然而，本发明不限于这两种策略，并且可以考虑使用感染性的复制缺陷型沙粒病毒作为载体来驱动抗原表达的其他方式。5.10使用本文所提供的组合物的方法-沙粒病毒颗粒的产生和拯救
[0419]
在某些实施例中，本文所提供的核苷酸序列(参见第5.4节)可用于产生和/或拯救沙粒病毒颗粒。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒(参见第5.5节)可用于产生和/或拯救沙粒病毒颗粒。在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段(参见第5.6节)可用于产生和/或拯救沙粒病毒颗粒。
[0420]
一般地，沙粒病毒颗粒可以通过如针对lcmv所述的标准反向遗传技术(参见flatz等人,2006,proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊]103:4663-4668；sanchez等人,2006,virology[病毒学]350:370；ortiz-riano等人,2013,j gen virol.[普通病毒学杂志]94:1175-88，以上通过引用并入本文)重组产生。
[0421]
在某些实施例中，产生或拯救的沙粒病毒颗粒可以是双片段的。在其他实施例中，产生或拯救的沙粒病毒颗粒可以是三片段的。三片段的沙粒病毒颗粒可以通过本领域已知的反向遗传技术(例如，如国际公开号：wo 2016/075250a1中所述)重组产生。5.10.1感染性且具有复制能力的沙粒病毒颗粒
[0422]
在某些实施例中，产生双片段的沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将一个或多个如第5.4节所述的dna序列，或一个或多个如第5.4节所述的rna序列，或一个或多个如第5.4节所述的各自从dna序列体外转录的rna序列转染到宿主细胞中；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施例中，所述dna包含在质粒中。
[0423]
在某些实施例中，当所述沙粒病毒颗粒是三片段的时，产生所述沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将一个或多个如第5.4节所述的dna序列，或一个或多个如第5.4节所述的rna序列，或一个或多个如第5.4节所述的各自从dna序列体外转录的rna序列转染到宿主细胞中，其中以上所述的核苷酸序列编码一个l片段和两个s片段或两个l片段和一个s片段；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些
更具体的实施例中，所述dna包含在质粒中。
[0424]
在某些实施例中，产生双片段的沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将一个或多个如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna序列，或一个或多个如第5.5节所述的各自从沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna体外转录的rna序列转染到宿主细胞中；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施例中，所述dna包含在质粒中。
[0425]
在某些实施例中，当所述沙粒病毒颗粒是三片段的时，产生所述沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将一个或多个如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna序列，或一个或多个如第5.5节所述的各自从沙粒病毒颗粒基因组的mrna转录物的cdna体外转录的rna序列转染到宿主细胞中，其中以上所述的核苷酸序列编码一个l片段和两个s片段或两个l片段和一个s片段；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施例中，所述dna包含在质粒中。
[0426]
在某些实施例中，产生双片段的沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列，或一个或多个如第5.6节所述的各自从沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列体外转录的rna序列转染到宿主细胞中；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施例中，所述dna包含在质粒中。
[0427]
在某些实施例中，当所述沙粒病毒颗粒是三片段的时，产生所述沙粒病毒颗粒的方法包括：(i)将如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列，或一个或多个如第5.6节所述的各自从沙粒病毒基因组或反基因组片段的cdna序列体外转录的rna序列转染到宿主细胞中，其中以上所述的核苷酸序列编码一个l片段和两个s片段或两个l片段和一个s片段；(ii)将驱动沙粒病毒反式作用因子的细胞内表达的核苷酸序列转染到所述宿主细胞中；(iii)将所述宿主细胞维持在适合病毒形成的条件下；并且(iv)收获沙粒病毒颗粒。在某些更具体的实施例中，所述dna包含在质粒中。
[0428]
关于感染性且具有复制能力的沙粒病毒颗粒的产生的更多详细信息在第5.9.1节中有描述。5.10.2感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒
[0429]
感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒能够如上所述被拯救。关于感染性复制缺陷型沙粒病毒颗粒的产生的更多详细信息在第5.9.2节中有描述。5.11使用本文所提供的组合物的方法-疫苗
[0430]
本技术还涉及疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)和药物组合物，其包含如第5.4节所述的核苷酸序列和相关表达产物、沙粒病毒颗粒和沙粒病毒基因组或反基因组片段。本技术还涉及疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗配方)和药物组合物，其包含如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒。本技术还涉及疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗配方)和药物组合物，其包含如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段和相关沙粒病毒颗粒。本技术还涉及疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗配方)和药物组合物，其包含如第5.7节所述的翻
译产物。本技术还涉及疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗配方)和药物组合物，其包含与如第5.4节所述的核苷酸序列相关的cdna、dna序列和/或dna表达载体，如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒，和/或如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段，例如编码如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列。此类疫苗、免疫原性组合物和药物组合物可以根据本领域的标准程序来配制。
[0431]
相关领域的普通技术人员将容易明白，对本文描述的方法和应用的适当修改和调整可以是显而易见的并且可以在不脱离其范围或任何实施例的情况下进行。
[0432]
在某些实施例中，本文提供了组合物，其包含如第5.4节所述的核苷酸序列。在另一个实施例中，本文提供了组合物，其包含如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒。在另一个实施例中，本文提供了组合物，其包含如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段。在另一个实施例中，本文提供了组合物，其包含如第5.7节所述的翻译产物。在另一个实施例中，本文提供了组合物，其包含与如第5.4节所述的核苷酸序列相关的cdna、dna序列和/或dna表达载体，如第5.5节所述的沙粒病毒颗粒，和/或如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段，例如编码如第5.6节所述的沙粒病毒基因组或反基因组片段的dna序列。此类组合物可以应用在治疗和预防疾病的方法中。在一个具体实施例中，本文所述的组合物用于治疗感染或易受感染的受试者。在其他实施例中，本文所述的组合物用于治疗易患或表现出癌症或肿瘤发生特征性症状或被诊断患有癌症的受试者。在另一个具体实施例中，本文所提供的免疫原性组合物可用于在施用该组合物的宿主中诱导免疫应答。本文所述的免疫原性组合物可用作疫苗并因此可配制成药物组合物。在一个具体实施例中，本文所述的免疫原性组合物用于预防或治疗受试者(例如，人类受试者)的感染或癌症。在其他实施例中，所述疫苗、免疫原性组合物或药物组合物适合于兽类和/或人类施用。
[0433]
在某些实施例中，本文提供了免疫原性组合物，其包含如本文所述的沙粒病毒载体。在某些实施例中，这种免疫原性组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施例中，这种免疫原性组合物还包含佐剂。与本文所述的组合物联合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施例中，术语“佐剂”是指当与本文所述的组合物联合施用或作为组合物的一部分施用时，增加、提高和/或增强对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒，以及最重要的是其载体化的基因产物的免疫应答的化合物，但当单独施用该化合物时，不会对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒和由后者所载体化的基因产物产生免疫应答。在一些实施例中，佐剂产生对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒和由后者所载体化的基因产物的免疫应答，并且不产生过敏或其他不良反应。佐剂可以通过多种机制(包括例如，淋巴细胞募集、b细胞和/或t细胞的刺激以及巨噬细胞或树突细胞的刺激)增强免疫应答。当本文所提供的疫苗或免疫原性组合物包含佐剂或与一种或多种佐剂一起施用时，可以使用的佐剂包括但不限于矿物盐佐剂或矿物盐凝胶佐剂、颗粒化佐剂、微粒化佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐(明矾)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3-o-脱酰单磷酰脂质a(mpl)(参见gb 2220211)、mf59(诺华公司(novartis))、as03(葛兰素史克公司(glaxosmithkline))、as04(葛兰素史克公司)、聚山梨醇酯80(tween 80；美国icl公司(icl americas,inc.))、咪唑并吡啶类化合物(参见国际申请号pct/us2007/064857，其公开为国际公开号wo2007/109812)、咪唑喹喔啉类化合物(参
见国际申请号pct/us2007/064858，其公开为国际公开号wo2007/109813)和皂苷，如qs21(参见kensil等人,1995,于vaccine design:the subunit and adjuvant approach[疫苗设计：亚基和佐剂方法](powell和newman编著,普林汉诺出版社,纽约(plenum press，ny))；美国专利号5,057,540)。在一些实施例中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是水包油乳剂(如角鲨烯或花生油)，可选地与免疫刺激剂(如单磷酰脂质a组合(参见stoute等人,1997,n.engl.j.med.[新英格兰医学杂志]336,86-91)。
[0434]
所述组合物单独包含本文所述的双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒，或连同药学上可接受的载体。可以使用所述沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的悬浮液或分散液，尤其是等渗的水性悬浮液或分散液。所述药物组合物可以经灭菌和/或可以包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且以本身已知的方式制备，例如通过采用传统的分散和悬浮工艺。在某些实施例中，此类分散液或悬浮液可以包含粘度调节剂。悬浮液或分散液保持在大约2℃至8℃的温度下，或者优选地为了更长时间的储存，可以先冷冻然后在使用前不久解冻，或者替代性地可以冻干储存。用于注射，疫苗或免疫原性制剂可以在水溶液、优选地生理相容的缓冲液(如汉克斯液、林格氏液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可以含有配方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0435]
在某些实施例中，本文所述的组合物另外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一个具体实施例中，本文所述的药物组合物包含0.001％至0.01％的硫柳汞。在其他实施例中，本文所述的药物组合物不包含防腐剂。
[0436]
所述药物组合物包含约103至约10
11
个双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的病灶形成单位。
[0437]
在一个实施例中，所述药物组合物的给药是肠胃外给药。肠胃外给药可以是静脉内或皮下给药。因此，用于肠胃外给药的单位剂型是例如安瓿或小瓶(vials)，例如，含有约103至10
10
个病灶形成单位或105至10
15
个沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的物理颗粒的小瓶。
[0438]
在另一个实施例中，通过(包括但不限于)口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、局部、皮下、经皮、鼻内和吸入途径，肿瘤内和通过划痕(例如，使用分叉针刮划皮肤表层)对受试者施用本文所提供的疫苗或免疫原性组合物。具体地，可以使用皮下或静脉内途径。
[0439]
对于鼻内给药或吸入给药，借助合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，根据本发明所使用的制剂可以方便地以气雾喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀来输送计量的量而确定。可将用于吸入器或吹入器的(例如明胶)胶囊和药筒配制成含有化合物的粉末混合物和合适的粉末基质，如乳糖或淀粉。
[0440]
活性成分的剂量取决于疫苗接种或免疫疗法的类型和受试者，以及他们的年龄、体重、个体状况、个体药代动力学数据和给药方式。在某些实施例中，采用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。有效剂量可以从源自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推算。
[0441]
在某些实施例中，包含沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的疫苗、免疫原性组合物或药物组合物可用作活疫苗接种或免疫疗法。活沙粒病毒颗粒的示例性剂量可以在每剂10至100个或更多个活病毒pfu范围内。在一些实施例中，沙粒病毒颗粒或三片段的沙
粒病毒颗粒的合适剂量为102、5
×
102、103、5
×
103、104、5
×
104、105、5
×
105、106、5
×
106、107、5
×
107、108、5
×
108、1
×
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
、5
×
10
11
或10
12
个pfu，可对受试者施用一次、两次、三次或根据需要的频次间隔使用更多次。在另一个实施例中，将活沙粒病毒配制成具有选自由以下各项组成的组的体积的单剂：0.2、0.5、1、2、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45和50ml。在某些实施例中，该单剂包含10
5.5-10
9.5
个感染病灶形成单位的活沙粒病毒颗粒。在另一个实施例中，配制灭活疫苗使其含有约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约15μg至约50μg或约15μg至约30μg的沙粒病毒。
[0442]
在某些实施例中，针对儿童给药，向一名儿童施用两剂本文所述的双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物，给药间隔至少一个月。在针对成人给药的具体实施例中，给出本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物的单剂量。在另一个实施例中，向一名成人施用两剂本文所述的双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物，给药间隔至少一个月。在另一个实施例中，可以向一名幼儿(6个月至9岁)首次施用两剂本文所述的双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物，给药间隔一个月。在一个特定实施例中，在其疫苗接种或免疫治疗的第一年仅接受过一剂的儿童应在下一年接受两剂。在一些实施例中，针对首次被施用本文所述的免疫原性组合物的2-8岁儿童，优选间隔4周施用两剂。在某些实施例中，针对6-35个月的儿童，半剂量(0.25ml)可能是优选的，而针对三岁以上的受试者0.5ml可能是优选的。
[0443]
在某些实施例中，组合物可以以单一剂量施用于患者，该单一剂量包含治疗有效量的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。在一些实施例中，双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒可以以单一剂量施用于患者，该单一剂量包含治疗有效量的双片段的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒，一种或多种治疗有效量的药物组合物。
[0444]
在某些实施例中，组合物以单一剂量施用于患者，然后在三至六周后施用第二种剂量。根据这些实施例，可以在第二次接种后以六至十二个月的间隔对受试者进行加强接种。在某些实施例中，加强接种可以使用不同的沙粒病毒或其组合物。在一些实施例中，如本文所述的相同的组合物的施用可以重复并间隔至少1天、2天、3天、4天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
[0445]
本文还提供了用于制备药物制剂形式的疫苗的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的方法和用途，该药物制剂包含作为活性成分的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。本技术的药物组合物以本身已知的方式制备，例如通过常规的混合和/或分散工艺。5.12组合物、给药和剂量
[0446]
本技术还涉及疫苗、免疫原性组合物(例如，疫苗配方)和药物组合物，其包含如本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。此类疫苗、免疫原性组合物和药物组合物可以根据本领域的标准程序来配制。
[0447]
相关领域的普通技术人员将容易明白，对本文描述的方法和应用的适当修改和调整可以是显而易见的并且可以在不脱离其范围或任何实施例的情况下进行。
[0448]
在另一个实施例中，本文提供了组合物，其包含本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。此类组合物可以应用在治疗和预防疾病的方法中。在一个具体实施例中，本文所述的组合物用于治疗受感染原感染或易受感染的受试者。在其他实施例中，本文所述的组合物用于治疗易患或表现出癌症或肿瘤发生特征性症状或被诊断患有癌症的受
试者。在另一个具体实施例中，本文所提供的免疫原性组合物可用于在施用该组合物的宿主中诱导免疫应答。本文所述的免疫原性组合物可用作疫苗并因此可配制成药物组合物。在一个具体实施例中，本文所述的免疫原性组合物用于预防受试者(例如，人类受试者)的感染或癌症。在其他实施例中，所述疫苗、免疫原性组合物或药物组合物适合于兽类和/或人类施用。
[0449]
在某些实施例中，本文提供了免疫原性组合物，其包含如本文所述的沙粒病毒载体。在某些实施例中，这种免疫原性组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在某些实施例中，这种免疫原性组合物还包含佐剂。与本文所述的组合物联合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同时或之后施用。在一些实施例中，术语“佐剂”是指当与本文所述的组合物联合施用或作为组合物的一部分施用时，增加、提高和/或增强对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒，以及最重要的是其载体化的基因产物的免疫应答的化合物，但当单独施用该化合物时，不会对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒和由后者所载体化的基因产物产生免疫应答。在一些实施例中，佐剂产生对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒和由后者所载体化的基因产物的免疫应答，并且不产生过敏或其他不良反应。佐剂可以通过多种机制(包括例如，淋巴细胞募集、b细胞和/或t细胞的刺激以及巨噬细胞或树突细胞的刺激)增强免疫应答。当本文所提供的疫苗或免疫原性组合物包含佐剂或与一种或多种佐剂一起施用时，可以使用的佐剂包括但不限于矿物盐佐剂或矿物盐凝胶佐剂、颗粒化佐剂、微粒化佐剂、粘膜佐剂和免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于铝盐(明矾)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3-o-脱酰单磷酰脂质a(mpl)(参见gb 2220211)、mf59(诺华公司(novartis))、as03(葛兰素史克公司(glaxosmithkline))、as04(葛兰素史克公司)、聚山梨醇酯80(tween 80；美国icl公司(icl americas,inc.))、咪唑并吡啶类化合物(参见国际申请号pct/us2007/064857，其公开为国际公开号wo2007/109812)、咪唑喹喔啉类化合物(参见国际申请号pct/us2007/064858，其公开为国际公开号wo2007/109813)和皂苷，如qs21(参见kensil等人,1995,于vaccine design:the subunit and adjuvant approach[疫苗设计：亚基和佐剂方法](powell和newman编著,普林汉诺出版社,纽约(plenum press，ny))；美国专利号5,057,540)。在一些实施例中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其他佐剂是水包油乳剂(如角鲨烯或花生油)，可选地与免疫刺激剂(如单磷酰脂质a组合(参见stoute等人,1997,n.engl.j.med.[新英格兰医学杂志]336,86-91)。
[0450]
所述组合物单独包含本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒，或连同药学上可接受的载体。可以使用所述沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的悬浮液或分散液，尤其是等渗的水性悬浮液或分散液。所述药物组合物可以经灭菌和/或可以包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，并且以本身已知的方式制备，例如通过采用传统的分散和悬浮工艺。在某些实施例中，此类分散液或悬浮液可以包含粘度调节剂。悬浮液或分散液保持在大约2℃至8℃的温度下，或者优选地为了更长时间的储存，可以先冷冻然后在使用前不久解冻，或者替代性地可以冻干储存。用于注射，疫苗或免疫原性制剂可以在水溶液、优选地生理相容的缓冲液(如汉克斯液、林格氏液或生理盐水缓冲液)中配制。溶液可以含有配方剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0451]
在某些实施例中，本文所述的组合物另外包含防腐剂，例如汞衍生物硫柳汞。在一
个具体实施例中，本文所述的药物组合物包含0.001％至0.01％的硫柳汞。在其他实施例中，本文所述的药物组合物不包含防腐剂。
[0452]
所述药物组合物包含约103至约10
11
个沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的病灶形成单位。
[0453]
在一个实施例中，所述药物组合物的给药是肠胃外给药。肠胃外给药可以是静脉内或皮下给药。因此，用于肠胃外给药的单位剂型是例如安瓿或小瓶(vials)，例如，含有约103至10
10
个病灶形成单位或105至10
15
个沙粒病毒颗粒或三区段的沙粒病毒颗粒的物理颗粒的小瓶。
[0454]
在另一个实施例中，通过(包括但不限于)口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、局部、皮下、经皮、鼻内和吸入途径和通过划痕(例如，使用分叉针刮划皮肤表层)对受试者施用本文所提供的疫苗或免疫原性组合物。具体地，可以使用皮下或静脉内途径。
[0455]
对于鼻内给药或吸入给药，借助合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)，根据本发明所使用的制剂可以方便地以气雾喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀来输送计量的量而确定。可将用于吸入器或吹入器的(例如明胶)胶囊和药筒配制成含有化合物的粉末混合物和合适的粉末基质，如乳糖或淀粉。
[0456]
活性成分的剂量取决于疫苗接种或免疫疗法的类型和受试者，以及他们的年龄、体重、个体状况、个体药代动力学数据和给药方式。在某些实施例中，采用体外试验来帮助确定最佳剂量范围。有效剂量可以从源自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推算。
[0457]
在某些实施例中，包含沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的疫苗、免疫原性组合物或药物组合物可用作活疫苗接种或免疫疗法。活沙粒病毒颗粒的示例性剂量可以在每剂10至100个或更多个活病毒pfu范围内。在一些实施例中，沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的合适剂量为102、5
×
102、103、5
×
103、104、5
×
104、105、5
×
105、106、5
×
106、107、5
×
107、108、5
×
108、1
×
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
、5
×
10
11
或10
12
个pfu，可对受试者施用一次、两次、三次或根据需要的频次间隔使用更多次。在另一个实施例中，配制活沙粒病毒使得0.2-ml单剂包含10
6.5-10
7.5
个活沙粒病毒颗粒的荧光病灶单位(fluorescent focal unit)。在另一个实施例中，配制灭活疫苗使其含有约15μg至约100μg、约15μg至约75μg、约15μg至约50μg或约15μg至约30μg的沙粒病毒。
[0458]
在某些实施例中，针对儿童给药，向一名儿童施用两剂本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物，给药间隔至少一个月。在针对成人给药的具体实施例中，给出本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物的单剂量。在另一个实施例中，向一名成人施用两剂本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物，给药间隔至少一个月。在另一个实施例中，可以向一名幼儿(6个月至9岁)首次施用两剂本文所述的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒或其组合物，给药间隔一个月。在一个特定实施例中，在其疫苗接种或免疫治疗的第一年仅接受过一剂的儿童应在下一年接受两剂。在一些实施例中，针对首次被施用本文所述的免疫原性组合物的2-8岁儿童，优选间隔4周施用两剂。在某些实施例中，针对6-35个月的儿童，半剂量(0.25ml)可能是优选的，而针对三岁以上的受试者0.5ml可能是优选的。
[0459]
在某些实施例中，组合物可以以单一剂量施用于患者，该单一剂量包含治疗有效
量的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。在一些实施例中，沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒可以以单一剂量施用于患者，该单一剂量包含治疗有效量的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒，一种或多种治疗有效量的药物组合物。
[0460]
在某些实施例中，组合物以单一剂量施用于患者，然后在三至六周后施用第二种剂量。根据这些实施例，可以在第二次接种后以六至十二个月的间隔对受试者进行加强接种。在某些实施例中，加强接种可以使用不同的沙粒病毒或其组合物。在一些实施例中，如本文所述的相同的组合物的施用可以重复并间隔至少1天、2天、3天、4天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
[0461]
本文还提供了用于制备药物制剂形式的疫苗的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的方法和用途，该药物制剂包含作为活性成分的沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。本技术的药物组合物以本身已知的方式制备，例如通过常规的混合和/或分散工艺。5.13试验方法
[0462]
在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒包含本文所提供的核苷酸序列(参见第5.4.2节)。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒经工程化使得沙粒病毒orf在两个或更多个mrna转录物上分隔开(参见第5.5节)。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒衍生自本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段(参见第5.6节)。在某些实施例中，本文所述的沙粒病毒颗粒包含本文所提供的沙粒病毒基因组或反基因组片段(参见第5.6节)。
[0463]
在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒是遗传上稳定的，即不具有在宿主中恢复到类似野生型(更具毒性)的复制行为(遗传稳定性)(参见第5.13节)。在某些实施例中，遗传稳定性可使用本节和第6节所述的试验方法证明。
[0464]
在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒显示高水平的转基因表达以引发针对所需靶抗原的强免疫应答(转基因表达水平)。在某些实施例中，高水平转基因表达可使用本节和第6节所述的试验方法证明。
[0465]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒表达异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述异源非沙粒病毒多肽受沙粒病毒3'utr的控制。在某些实施例中，与在相应的沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，与在相应的沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平高约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，与在相应的沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的异源非沙粒病毒多肽的表达水平相比，所述异源非沙粒病毒多肽的表达水平高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、
15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达所述异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒被引入(或感染)细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后表达所述异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒被引入(或感染)类似的细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)相比，在本公开的沙粒病毒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多出至少约或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述细胞是源自受试者的生物样本。在某些实施例中，所述生物样本源自器官(例如，脾脏)。在某些实施例中，所述生物样本是血液样本。
[0466]
在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒3'utr的控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的第二异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒被引入(或感染)细胞群后，表达异源非沙粒病毒多肽或表达第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例相比，在本公开的沙粒病毒(例如，在沙粒病毒3'utr控制下表达异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒3'utr控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的第二异源非沙粒病毒多肽的沙粒病毒被引入(或感染)类似的细胞群后表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)相比，在本公开的沙粒病毒(例如，在沙粒病毒3'utr的控制下表达异源非沙粒病毒多肽和/或在沙粒病毒3'utr的控制下表达第二异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约、或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达异源非沙粒病毒多肽和/或表达第二异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述细胞是源自受试者的生物样本。在某些实施例中，所述生物样本源自器官(例如，脾脏)。在某些实施例中，所述生物样本是血液样本。
[0467]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒表达两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒3'utr控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受沙粒病毒5'utr控制。在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒3'utr的控制，并且两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒5'utr的控制。在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受另一
个s片段中沙粒病毒5'utr的控制。在某些实施例中，所述两个异源非沙粒病毒多肽中第一个的表达受第一s片段中沙粒病毒5'utr的控制，并且两个异源非沙粒病毒多肽中第二个的表达受第二s片段中沙粒病毒3'utr的控制。在某些实施例中，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受另一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制。在某些实施例中，用本公开的沙粒病毒颗粒感染的细胞(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)表达(共表达)两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，一个异源非沙粒病毒多肽的表达受一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制，并且另一个异源非沙粒病毒多肽的表达受另一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制)相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，细胞表达两个异源非沙粒病毒多肽)高至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，一个异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达)相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，细胞表达两个异源非沙粒病毒多肽)高约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达的相同的两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，一个异源非沙粒病毒多肽在一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达，并且另一个异源非沙粒病毒多肽在另一个s片段中的沙粒病毒5'utr的控制下表达)相比，所述两个异源非沙粒病毒多肽的组合表达水平(例如，细胞表达两个异源非沙粒病毒多肽)高1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，在本公开的沙粒病毒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞(例如，细胞群)后，至少约或约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达(共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽(例如，一个在一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达的异源非沙粒病毒多肽和另一个在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达的异源非沙粒病毒多肽)的沙粒病毒被引入(或感染)细胞群后，表达(共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)相比，在本公开的沙粒病毒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，表达(共表达)两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)更高。在某些实施例中，与在沙粒病毒5'utr的控制下表达相同的两个异源非沙粒病毒多肽(例如，
在一个s片段的沙粒病毒5'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段的沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)的沙粒病毒被引入(或感染)类似的细胞群后表达(共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽的细胞比例(或数量)相比，在本公开的沙粒病毒(例如，在一个s片段中沙粒病毒3'utr的控制下表达一个异源非沙粒病毒多肽，并且在另一个s片段中沙粒病毒5'utr的控制下表达另一个异源非沙粒病毒多肽)被引入(或感染)细胞群后，多至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞表达(共表达)所述两个异源非沙粒病毒多肽。在某些实施例中，所述细胞是源自受试者的生物样本。在某些实施例中，所述生物样本源自器官(例如，脾脏)。在某些实施例中，所述生物样本是血液样本。
[0468]
在某些实施例中，本文所提供的沙粒病毒颗粒可在细胞培养中显示良好的生长，使沙粒病毒颗粒能够在工业发酵过程中产生高滴度(产量)。在某些实施例中，细胞培养中的良好生长可使用本节和第6节所述的方法证明。
[0469]
在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，所述沙粒病毒颗粒的滴度在agrag小鼠持续感染过程中与相应的野生型亲本沙粒病毒颗粒的滴度相比低1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、18倍、20倍、25倍或30倍。在某些实施例中，持续感染可以是持续至少5天、10天、14天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、53天、55天、60天、65天、70天、75天、78天、80天、90天或100天的感染。在某些实施例中，持续感染可以是持续5天、10天、14天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、53天、55天、60天、65天、70天、75天、78天、80天、90天或100天的感染。5.13.1沙粒病毒检测方法
[0470]
本领域技术人员可以如本文所述使用本领域已知的技术检测沙粒病毒基因组或反基因组片段或三片段的沙粒病毒颗粒。例如，如本文第5.6节所述，rt-pcr可以与对基因工程化沙粒病毒片段特异性的引物一起使用来检测和量化沙粒病毒基因组或反基因组片段。蛋白质印迹法、elisa、放射免疫测定、免疫沉淀或免疫细胞化学结合流式细胞术可用于量化沙粒病毒基因组或反基因组片段或三片段沙粒病毒颗粒的基因产物。5.13.2测量感染性的方法
[0471]
本领域技术人员已知的任何方法都可用于测量沙粒病毒载体制剂的感染性。例如，可以通过“病灶形成单位测定”(ffu测定)进行测定病毒/载体滴度。简而言之，用不同稀释度的病毒/载体样本涂覆和接种互补细胞。为了测定复制缺陷型沙粒病毒载体滴度，使用hek293细胞的互补(例如，在糖蛋白缺陷型沙粒病毒载体的情况下，表达糖蛋白的细胞)
bhk-21。对于具有复制能力的载体，例如mc57、3t3或vero细胞是常见的细胞底物。孵育期后，为了让细胞形成单层并让病毒附着在细胞上，该单层被甲基纤维素覆盖。当板进一步孵育时，原始感染细胞释放病毒子代。由于甲基纤维素覆盖，新病毒的传播仅限于邻近细胞。因此，每个感染性颗粒都会产生一个圆形的感染细胞区域，称为病灶。使用针对相应沙粒病毒的np或由沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒表达的另一蛋白的抗体和基于hrp的显色反应，可以使此类病灶可视化并以此可计数。病毒/载体的滴度可以每毫升的病灶形成单位(ffu/ml)计算。5.13.3沙粒病毒颗粒的生长
[0472]
本文所述的沙粒病毒颗粒的生长可以通过本领域已知的或本文所述的任何方法(例如，细胞培养)来评估。病毒生长可以通过将本文所述的沙粒病毒颗粒的连续稀释物接种到细胞培养物中(例如，在复制缺陷型载体的情况下，vero细胞或bhk-21细胞或其互补形式)进行。将病毒孵育特定时间后，收集含有病毒的上清液并可以使用标准方法纯化病毒粒子。5.13.4血清elisa
[0473]
可以通过抗原特异性血清elisa(酶联免疫吸附测定)来测定动物(例如，小鼠、豚鼠)疫苗接种或免疫治疗后的体液免疫应答。简而言之，板涂覆有抗原(例如，重组蛋白)，封闭以避免抗体的非特异性结合，并与血清的连续稀释液一起孵育。孵育后，可以(例如，使用(检测总igg或igg亚类的)酶偶联的抗物种(例如，小鼠、豚鼠)特异性抗体和随后的显色反应)检测结合的血清抗体。抗体滴度可以确定为例如终点几何平均滴度。5.13.5测定诱导抗体的中和活性的试验
[0474]
可以通过噬斑减少中和试验进行测定血清中的中和抗体。根据病毒靶标，使用合适的细胞(例如，源自atcc的arpe-19细胞)来测试巨细胞病毒中和抗体和作为测试物的gfp标记的病毒(例如，巨细胞病毒)。此外，可以使用补充的豚鼠血清作为外源补体的来源。该试验开始于在用于中和前一或两天在384孔板中接种6.5x103个细胞/孔(50微升/孔)。通过在没有细胞但具有滴定浓度的测试血清的96孔无菌组织培养板中在37℃下混合确定的病毒接种物1小时来进行中和。在中和孵育步骤后，将混合物添加到细胞中并再孵育4天，以便用酶标仪检测gfp。替代性地，可以如第5.13.2节所述检测病毒结构蛋白，而不是gfp或类似的报告基因。阳性的中和人血清用作每个板上的试验阳性对照，以检查所有结果的可靠性。使用4参数逻辑曲线拟合来确定滴度(ec50)。作为附加试验，用荧光显微镜检查孔。5.13.6lcmv噬斑减少中和试验
[0475]
简而言之，可以通过使用带有绿色荧光蛋白标记的具有复制能力的或复制缺陷型lcmv进行lcmv的噬斑减少(中和)试验，5％兔血清可以用作外源补体的来源，且噬斑可以通过荧光显微术计数。中和滴度可定义为与对照(免疫前)血清样本相比，导致噬斑减少50％、75％、90％或95％的最高血清稀释度。5.13.7lcmv基因组拷贝的测定
[0476]
根据制造商提供的方案，使用qiaamp病毒rna微型试剂盒(qiaamp viral rna mini kit，qiagen)分离qpcr lcmv rna基因组。lcmv rna基因组等价物通过在steponeplus实时pcr系统(应用生物系统)上使用iiione-step qrt-pcr试剂盒(英杰公司(invitrogen))以及引物和探针(fam报告基因和nfq-mgb猝灭剂)进行定量pcr检
测，这些引物和探针对沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的一部分lcmv np编码区或另一基因组片段具有特异性。反应的温度情况可以是：在60℃下30分钟，在95℃下2分钟。然后在95℃下15秒，在56℃下30秒，进行45个循环。可以通过将样品结果与标准曲线进行比较来定量rna，该标准曲线由分光光度法定量的体外转录rna片段的10倍稀释系列制得，该rna片段对应于含有引物和探针结合位点的lcmv np编码序列的片段或沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒的另一基因组片段。5.13.8蛋白质印迹法
[0477]
在组织培养瓶或悬浮液中生长的感染细胞在感染后的特定时间点使用ripa缓冲液(赛默飞公司(thermo scientific))裂解，或直接使用而不进行细胞裂解。用还原剂和nupage lds样品缓冲液(novex，赛默飞公司，美国)将样品加热至99℃，持续10分钟，然后冷却至室温后上样到4％-12％sds凝胶上进行电泳。使用英杰公司iblot凝胶转印装置将蛋白质印迹到膜上，并通过丽春红(ponceau)染色使其可视化。最后，用针对目的蛋白的一抗和碱性磷酸酶缀合的二抗探测制备物，然后用1-step nbt/bcip溶液(英杰公司，美国)进行染色。5.13.9用于检测抗原特异性cd8+ t细胞的mhc肽多聚体染色实验
[0478]
本领域技术人员已知的任何实验方法都可用于测试抗原特异性cd8+ t细胞反应。例如，可以使用mhc肽四聚体染色实验(参见例如，altman j.d.等人,science[科学].1996；274:94-96；和murali-krishna k.等人,immunity[免疫力].1998；8:177-187)。简言之，该实验包括以下步骤，四聚体实验用于检测抗原特异性t细胞的存在。为了让t细胞检测其特异性的肽，它必须同时识别肽和mhc分子的四聚体，该mhc分子的四聚体是为限定的抗原特异性和t细胞的mhc单倍型(通常是荧光标记的)定制的。然后借助荧光标记通过流式细胞术检测四聚体。5.13.10用于检测抗原特异性t细胞的elispot实验。
[0479]
本领域技术人员已知的任何实验方法都可用于测试抗原特异性t细胞反应(cd4+和cd8+)。例如，可以使用elispot实验(参见例如，czerkinsky c.c.等人,j immunol methods.[免疫学方法杂志]1983；65:109-121；和hutchings p.r.等人,j immunol methods.[免疫学方法杂志]1989；120:1-8)。简言之，该实验包括以下步骤：免疫斑点板包被有抗细胞因子抗体。在特定刺激物(例如针对待测试的反应性的肽)存在的情况下，细胞在免疫斑点板中孵育。细胞分泌细胞因子，然后将其冲洗掉。然后用第二种生物素化的抗细胞因子抗体包被板，并用抗生物素蛋白-hrp系统将细胞因子分泌点可视化。5.13.11用于检测cd8+和cd4+ t细胞反应功能的细胞内细胞因子分析。
[0480]
本领域技术人员已知的任何实验方法都可用于检测cd8+和cd4+t细胞反应的功能。例如，可以使用流式细胞术结合细胞内细胞因子分析(参见例如，suni m.a.等人,j immunol methods.[免疫学方法杂志]1998；212:89-98；nomura l.e.等人,cytometry.[细胞计数法]2000；40:60-68；和ghanekar s.a.等人,clinical and diagnostic laboratory immunology.[临床和诊断性实验免疫学]2001；8:628-63)。简言之，该实验包括以下步骤：通过特定肽或蛋白质激活细胞，加入蛋白质转运的抑制物(例如，布雷菲德菌素a)以使细胞因子保留在细胞内。在限定的孵育期(通常为5小时)之后，进行洗涤步骤，并且可以将针对其他细胞标志物的抗体加入到细胞中。然后细胞被固定并透化。加入荧光染料偶联的抗细
胞因子抗体，然后可以通过流式细胞术分析细胞。5.13.12证实病毒载体复制缺陷性的实验
[0481]
本领域技术人员已知的任何测定感染性且具有复制能力的病毒颗粒的浓度的实验方法也可用作于测定样品中复制缺陷型病毒颗粒。例如，非互补细胞的ffu测定可用于此目的。
[0482]
此外，基于噬斑的测定是一种标准方法，用于根据病毒样本中的噬斑形成单位(pfu)确定病毒浓度。具体地，非互补宿主细胞的汇合单层以不同的稀释度感染病毒，并用半固体培养基(如琼脂)覆盖，以防止病毒感染任意扩散。当病毒成功感染并在固定的细胞单层内的细胞中自我复制并扩散到周围细胞时，病毒噬斑形成(参见例如，kaufmann,s.h.；kabelitz,d.(2002).methods in microbiology vol.32:immunology of infection[微生物学方法(第32卷)：感染免疫学].academic press[美国学术出版社].isbn 0-12-521532-0)，从而引发细胞病变或细胞裂解作用。噬斑的形成可能需要2到14天，具体取决于所分析的病毒。噬斑通常是手动计数的，并且结果与用于制备板的稀释因子相结合，用于计算每单位样品体积的噬斑形成单位数(pfu/ml)。pfu/ml结果代表样品中感染性且具有复制能力的颗粒的数量。当使用c细胞时，相同的测定可用于滴定复制缺陷型沙粒病毒颗粒或三片段的沙粒病毒颗粒。5.13.13病毒抗原(包括转基因插入的从病毒载体表达的非沙粒病毒多肽)的表达的实验
[0483]
本领域技术人员已知的任何实验方法都可用于测定病毒抗原和转基因插入的从病毒载体表达的非沙粒病毒多肽的表达。例如，可以进行ffu测定。对于检测，使用针对相应病毒抗原的单克隆或多克隆抗体制剂(转基因特异性ffu)。测定特异性抗体与由具有复制能力的或复制缺陷型病毒(病毒结构蛋白、病毒非结构蛋白和转基因插入的非沙粒病毒多肽)表达的蛋白质结合的方法包括流式细胞术、免疫细胞化学、免疫荧光法、蛋白质印迹法或斑点印迹法。荧光报告蛋白可以通过直接荧光显微术或流式细胞术进行可视化。5.13.14动物模型
[0484]
为了研究本文所述的沙粒病毒颗粒的重组和感染性，可以使用体内动物模型。在某些实施例中，可用于研究三片段的沙粒病毒颗粒的重组和感染性的动物模型包括小鼠、豚鼠、兔和猴。在一个优选的实施例中，可用于研究沙粒病毒的重组和感染性的动物模型包括小鼠。在更具体的实施例中，可用于研究沙粒病毒颗粒的重组和感染性的小鼠是i型干扰素受体、ii型干扰素受体和重组激活基因1(rag1)三重缺陷型。在某些实施例中，动物模型可用于测定沙粒病毒感染性和转基因稳定性。在一些实施例中，病毒rna可以从动物的血清中分离出来。各种技术是本领域技术人员容易知道的。病毒rna可以被逆转录，并且携带沙粒病毒orf的cdna可以用基因特异性引物进行pcr扩增。流式细胞术也可用于研究沙粒病毒感染性和转基因表达。6实例6.1split-c和split-e而不是split-a或split-f载体生长到与artlcmv相当的高滴度，揭示了sp定位对载体生长的关键作用
[0486]
分别在split-b和split-d病毒及其x和y变体的基因组排列中定位gp sp和gp1/gp2预期能够在类似于如图1f所示的针对r3lcmv的过程中实现片段间重组和恢复为野生型
样病毒。在一个s片段中gp sp末端且在另一个s片段中紧邻gp1上游具有断点(break point)的重组事件预期会产生双片段的野生型病毒。于是，split-b和split-d设计未被考虑用于实验测试和验证。
[0487]
因此，产生了各自携带两个转基因orf的基于lcmv的split-a、split-c、split-e和split-f病毒，并且分析了它们的细胞培养生长特性。对于本实验，使用如flatz等人和kallert等人发表的基于鼠聚合酶i/聚合酶ii的沙粒病毒拯救系统(图5)(flatz l等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊]2006；103,4663-4668；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2007；8,15327)。用于细胞内聚合酶i驱动表达新设计的相应的split-a、split-e和split-f病毒的s片段(pol-i-s1、pol-i-s2，参见图6a右侧的示意图)的质粒由商业供应商基于合成的dna组装，该合成的dna连接到现有的表达盒中(flatz l等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊]2006；103,4663-4668；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2007；8,15327)。用质粒组合转染稳定表达lcmv糖蛋白的bhk-21细胞(flatz l等人,nat med[自然-医学]2010；16,339-345)，该质粒组合由以下组成：i)编码野生型lcmv l片段的基于聚合酶i的表达质粒(pol-i-l)，ii)分别编码病毒的s1和s2片段的基于聚合酶i的表达质粒(pol-i-s1、pol-i-s2)和聚合酶ii驱动的病毒反式作用因子(l和np)表达质粒(pc-l、pc-np，图5)。转染后6天，通过非互补3t3细胞上的免疫病灶形成测定法(iff)测定三片段病毒的感染滴度(battegay m等人,j virol methods[病毒学方法杂志]1991；33,191-198)。split-e病毒的滴度达到每毫升》10e6个病灶形成单位(pfu、ffu)，而split-a和split-f病毒的滴度保持在10e5个ffu/ml以下(图6a)。在独立的类似实验中，生成了并排的split-c和artlcmv病毒以分别表达一个gfp和一个番茄(tom，红色荧光蛋白)转基因(参见图6b右侧的示意图)。在质粒转染后的第6天，两种病毒达到了相似的滴度，接近10e6个ffu/ml。为了测定病毒在感染非互补bhk-21细胞(无gp转基因)后的生长情况，生成了split-c、split-a和artlcmv病毒以分别表达一个gfp orf和一个p1a癌症-睾丸自身抗原orf(参见图6c右侧的示意图)。为了与split-c和split-a病毒中的sp侧翼p1a转基因可以比较，r3lcmv中的p1a orf与上游组织纤溶酶原激活物信号序列(“sp1a”)框内表达。以感染复数(moi)为0.01感染细胞48小时后，收集上清液并测定病毒滴度。split-c病毒的滴度超过10e6个ffu/ml，与artlcmv相当或较之更高，而split-a病毒的滴度保持在10e4个ffu/ml以下。
[0488]
在附加的实验中，293f悬浮细胞用携带如图6d所示的基因组的split-c、split-e或artlcmv载体感染。收获上清液以测定随时间的变化的病毒滴度(图6d)。在感染后的初始时间点(24小时和48小时)，split-c和split-e载体的滴度显著高于artlcmv(p《0.01，通过bonferroni后续检验的单因素方差分析)。当滴度达到峰值时(感染后72小时、96小时和120小时)，三种病毒的滴度都相似(p》0.05，通过bonferroni后续检验的单因素方差分析)。已知用artlcmv载体感染的培养物不仅产生具有如图6d所示的基因组的三片段的颗粒，另外还产生过量的仅携带s
np
和l片段而不携带s
gp
片段的双片段的颗粒(kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2017；8,15327)。当在gp转基因反式互补293t细胞(293t-gp细胞，flatz l等人，nat med[自然-医学]2010；16,339-345)上进行免疫病灶形成测定时，可以观察到后一种双片段的颗粒。因此，在gp假型293t-gp细胞上评估的感染滴度与在非假分型3t3细胞上可检测到的滴度之间的比率可以作为携带artlcmv或split载体的所有三个基因组片段
的载体颗粒比例的量度。对48小时收集的样品测定了该比率(参见图6d中显示的实验)。结果发现，在载体的对数生长阶段，artlcmv的该比率显著高于split-c或split-e(图6e)。这个发现表明，与artlcmv相比，split-c和split-e载体在包装三个基因组片段方面都更有效，这可能解释了它们在细胞培养增殖的初始阶段更快速的生长和更高的滴度产量(对照图6d)。
[0489]
总之，具有split-c和split-e基因组的病毒生长至高滴度，与artlcmv相当，而split-a和split-f生长至比上述病毒低10倍以上的滴度。split-c和split-e载体设计的共同点是它们在3'utr的控制下将沙粒病毒gp sp定位，这将它们与生长不良的split-a和split-f载体设计区分开来。因此，在3'utr的控制下将分离的沙粒病毒gp sp定位使得split-c和split-e载体能够生长至与三片段的沙粒病毒载体(如artlcmv)相当的滴度，从而使split-c和split-e设计相比split-a和split-f是优选的。基于在5'utr的控制下的gp sp定位，split-b和split-d载体基因组预期均不会提供有利的生长特性。6.2从基于lcmv的split-c病毒s1片段的转基因表达水平比从artlcmv的s
gp
片段的转基因表达水平高数倍
[0490]
接下来，由携带一个gfp和一个tomato转基因的基于lcmv的split-c病毒和artlcmv病毒(split-c(tom/gfp)、artlcmv(tom/gfp)；如图7)表达的转基因的量在每个细胞水平上进行比较。以moi＝0.1感染bhk-21细胞，感染后24小时通过荧光显微术观察gfp。结果发现在split-c(tom/gfp)感染的细胞中，gfp水平明显高于在artlcmv(tom/gfp)感染的细胞中。然而，artlcmv(tom/gfp)感染细胞的gfp水平也明显高于未感染的对照细胞(图7中的“无病毒”)的背景荧光。
[0491]
为了量化这两种病毒的gfp和tom表达，8小时后(即感染后32小时)对相同细胞进行流式细胞术。当针对侧向散射(ssc，图8b)绘制gfp时，在split-c(tom/gfp)和artlcmv(tom/gfp)感染的细胞中均发现了明显分离的表达gfp的细胞群。对这些细胞设门(设门参见图8b)用于进一步分析并与未感染的对照细胞的gfp阴性细胞群(“无病毒”)进行比较。三个经设门群体中gfp水平的直方图分析证实了通过荧光显微术获得的视觉印象(图8c)。split-c(tom/gfp)感染细胞中的gfp水平比artlcmv(tom/gfp)感染细胞中的gfp水平高约7倍(图8c)，而后者也明显高于未感染的对照背景。然而重要的是，这两种病毒表达几乎相同水平的tom。鉴于这两种病毒携带相同的表达tom的s2/s
np
片段，这是意料之中的。同时，通过作为gfp测定的内部参考标准，这一发现验证了从病毒各自s1片段的gfp表达的差异水平。因此，结果发现，与artlcmv的s
np
片段相比，三片段的沙粒病毒的split-c设计使s1片段中编码的转基因表达高数倍(约7倍)，而从s2片段的转基因表达水平与artlcmv设计的s
np
片段的没有区别。6.3与在artlcmv感染的培养物相比，更高比例的细胞在split-c感染的培养物中共表达s
np
和s
gp
编码的转基因分析了split-c和基于artlcmv的载体在感染培养物的细胞中共表达它们各自的两个转基因的能力。简言之，bhk-21细胞被split-c(tom/gfp)或artlcmv(tom/gfp)感染，两者都从s1/s
gp
片段表达gfp且从s2/s
np
片段表达tom。用于进一步比较，还包括了从s2/s
np
片段表达gfp和从s1/s
gp
片段表达tom的artlcmv(gfp/tom)载体(图8d)。较早的报道(kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2017；8,15327)表明，在artlcmv载体感染的培养物中，只
有少数细胞同时表达s
np
和s
gp
编码的转基因。与该较早的报道一致，本实验表明，以moi＝0.1感染后24小时，在artlcmv(tom/gfp)和artlcmv(gfp/tom)感染的[00492]培养物中分别仅有13％和19％的细胞表现出可检测水平的两个载体转基因(图8e)。在artlcmv(tom/gfp)感染的培养物中，仅表达s
np
编码的tom的细胞(22％)比共表达gfp/tom的细胞(13％)丰度更高(图8e)。类似地，artlcmv(gfp/tom)感染的培养物中s
np
编码的gfp单阳性细胞(44％)比gfp/tom共表达细胞(19％)频率更高(图8e)。与此形成鲜明对比的是，split-c(tom/gfp)感染的培养物中约一半的细胞表达了可检测水平的tom和gfp，因此超过了仅表达gfp(39％)或tom(4％)的细胞亚群)(图8e)。6.4即使在高度免疫缺陷型小鼠中长时间复制后，split-c病毒也能稳定减毒
[0493]
为了测试split-c设计是否允许稳定减毒，在高度免疫缺陷型agrag小鼠中进行了感染实验，这些agrag小鼠不仅由于rag1缺陷而缺乏t细胞和b细胞，而且对于缺损的i型干扰素受体和ii型干扰素受体基因也是纯合的。第二组agrag小鼠用表达gfp的r3lcmv感染，已知其由于能够进行片段间重组而在遗传上不稳定(图1f；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2017；8,15327)。第三组小鼠用毒性双片段的lcmv对照病毒(lcmvwt)感染。通过测定血液中表达np的ffu随时间检测病毒血症，反映总lcmv感染性并因此反映三种病毒的复制能力和毒力(图9a)。在感染后第14天，split-c和r3lcmv感染的小鼠都表现出比感染毒性双片段的lcmvwt的动物低得多的病毒载量。然而，在感染后第35天左右，在r3lcmv感染小鼠中的病毒血症持续增加，至第53天达到与lcmvwt感染的动物相当的水平。r3lcmv感染的小鼠的病毒载量的这种持续增加先前已证明是由于片段间重组和恢复为双片段的病毒基因组所致(对照图1f；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2017；8,15327)。与此形成鲜明对比的是，在78天的观察期内，split-c感染的小鼠的病毒血症始终低于lcmvwt，这表示载体的稳定减毒表型。测定表达gfp的ffu作为表达转基因病毒的量度(图9b)。然后计算总病毒感染性(由np ffu确定)与表达gfp的感染性(图9c)的比率。对于r3lcmv感染的小鼠，该比率随时间显著增加，这表明至第78天，感染性颗粒的总数超过转基因表达颗粒的70倍以上。相比之下，该比率在split-c感染的小鼠中始终很低。
[0494]
在agrag小鼠中进行了第二次独立感染实验，以进一步测试和比较遗传稳定性。除了包括在如图9a-9c所示的实验中的三个实验组之外，第四组小鼠用表达gfp的artlcmv感染，已知artlcmv在遗传上是稳定的(图1g；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2017；8,15327)。通过测定血液中表达np的ffu随时间检测病毒血症，反映总lcmv感染性并因此反映四种病毒的复制能力和毒力(图9d)。在感染后的第7天和第21天，split-c、artlcmv和r3lcmv感染的小鼠表现出比感染毒性双片段的lcmvwt的动物低得多的病毒载量。然而，在感染后的第21天和第42天之间，在r3lcmv感染的小鼠中的病毒血症大大增加，并且从第42天起，与lcmvwt感染的动物相比，病毒血症保持在一个稳定水平。r3lcmv感染的小鼠的病毒载量的这种增加先前已证明是由于片段间重组和恢复为双片段的病毒基因组所致(对照图1f；(kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2017；8,15327)。与此形成鲜明对比的是，在136天的观察期内，split-c和artlcmv感染的小鼠的病毒血症始终低于lcmvwt，这表示split-c载体的稳定减毒表型。测定表达gfp的ffu作为表达转基因病毒的量度(图9e)，并计算总病毒感染性(由np ffu确定)与表达gfp的感染性的比率(图9f)。对于r3lcmv感染的小鼠，该比率随时间显著增加，这表明至第136天，感染性颗粒的总数平均超过转基因表达颗
粒的600倍以上。相比之下，split-c和artlcmv感染的小鼠的相应平均比率保持在小于10。
[0495]
这些数据表明，在三片段的沙粒病毒基因组设计中，gp sp与gp1/gp2的分离(如此处以split-c设计为例)使得即使在高度免疫缺陷型小鼠中长时间复制后也能稳定减毒。6.5基于lcmv的split-c载体的s1片段上的转基因递送比其从artlcmv载体的s
gp
片段的表达具有更高的免疫原性
[0496]
鉴于从基于lcmv的split-c病毒的s1片段的转基因表达水平比从artlcmv的相应s
gp
片段的转基因表达水平高约7倍(图7和图8a-8e)，然后评估免疫原性水平以了解是否存在转基因表达水平与免疫原性之间的相关性。首先，评估了cd8+ t细胞对从基于lcmv的split-c病毒(split-c(p1a/gfp))的s1片段表达的p1a转基因的反应，并与在其s
gp
片段中递送p1a orf的artlcmv载体的免疫原性比较，该p1a orf与上游组织纤溶酶原激活物信号序列(“sp1a”，artlcmv(gfp/sp1a))融合。因此，两种p1a翻译产物都插入了er，这可以增强免疫原性(malin as等人,microbes infect[微生物和感染]2000；2,1677-1685)。两种载体的基因组都分别在其相同的s2和s
np
片段上携带gfp转基因(图10a)。在免疫后第9天，借助mhc i类四聚体通过流式细胞术测定血液中p1a表位特异性cd8+ t细胞的频率。split-c(p1a/gfp)免疫小鼠中的平均p1a特异性cd8+ t细胞频率比用artlcmv(gfp/sp1a)免疫的对照高约2.8倍，并且这种差异具有统计学意义(图10b，通过未配对的双尾学生t检验，p《0.01)。相比之下，cd8+ t细胞对两种载体的共同骨架表位np118的反应在两组动物之间没有显著差异(p》0.05，图10c)。p1a表位特异性和载体骨架特异性cd8+ t细胞应答之间的比率(p1a:np118比率，图10d)在两种载体之间同样有显著差异(p《0.01)。使用表达p1a的载体的这些结果表明，与由artlcmv的s
gp
片段中编码的转基因所引发的反应相比，lcmv载体的split-c设计引发了在其s1片段中编码的转基因的更高免疫原性。因此，split-c设计将免疫显性转换成转基因特异性反应并远离载体骨架表位。
[0497]
为了证实和扩展这些观察结果，研究了c57bl/6小鼠对包含hpv16 e7和e6蛋白的非致癌融合抗原(e7e6)的cd8+ t细胞反应(cassetti等人,vaccine[疫苗]2004；3-4,520-527)。从其各自的s1/s
gp
片段表达e7e6的split-c和基于artlcmv的载体与gfp转基因在其相同的s2/s
np
片段上结合，将split-c和基于artlcmv的载体进行了工程化(图11a)。在免疫后第8天评估来自血液的急性效应反应时，split-c载体诱导的e7特异性cd8+ t细胞的频率显著高于artlcmv载体(图11b)。相比之下，在artlcmv免疫的小鼠中，cd8+ t细胞对免疫显性lcmv核蛋白骨架衍生的表位np396的反应的频率更高(图11c)。与artlcmv免疫小鼠相比，这些差异转化为split-c中更高的e7转基因：np396骨架反应比率且因此更有利的免疫显性(图11d)。在免疫后第22天从相同动物的脾脏评估cd8+ t细胞记忆。与急性效应反应相似，split-c免疫小鼠表现出比artlcmv免疫小鼠更高频率的e7特异性cd8+ t细胞(图11e)但较低频率的np396特异性cd8+ t细胞(图11f)。这些差异同样转化为split-c接种动物中的更高的e7：np396表位显性比率(图11g)。同样就绝对细胞计数而言，split-c免疫小鼠的e7特异性cd8+ t细胞超过了artlcmv免疫动物(图11h)，而np396特异性cd8+ t细胞在artlcmv接种组中更高(图11i)。当研究载体诱导的cd8+ t细胞反应的亚群分布时，注意到与artlcmv免疫小鼠相比，split-c免疫小鼠具有显著更高数量的e7特异性cd62l
low
效应记忆cd8+ t细胞(图11j)。对于表达效应标志物cx3cr1(图11k)或klrg1(图11l)的细胞，发现了类似的差异。相比之下，e7特异性cd62l
high
中央记忆cd8+ t细胞(图11m)和表达记忆前体标志物
cd127+的亚群(图11n)在split-c和artlcmv免疫小鼠中具有相似丰度。总之，在c57bl/6小鼠中的这些发现一起证实了在p1a免疫的balb/c小鼠中的观察所得：与artlcmv载体相比，split-c载体诱导更高的对s1/s
gp
编码的转基因的cd8+ t细胞反应，其均表现在频率和绝对数量上，同时发生转基因到骨架表位显性的转移。此外，这些结果中的后者表明，split-c诱导的cd8+ t细胞反应主要在其诱导效应/效应记忆cd8+ t细胞对s
gp
编码的转基因反应的能力方面表现突出，而中央记忆反应在程度上与artlcmv诱导的相当。基于鸠宁candid#1的split-c载体的产生和细胞培养生长
[0498]
产生了基于鸠宁病毒疫苗株candid#1的split-c载体(split-c-cand)，每个载体都携带两个转基因orf，并分析了它们的细胞培养生长特性。对于本实验，使用如flatz等人和kallert等人发表的基于鼠聚合酶i/聚合酶ii的沙粒病毒拯救系统(图5)(flatz l等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊]2006；103,4663-4668；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2007；8,15327)。用于细胞内聚合酶i驱动表达新设计的各split-c-cand的s片段的质粒(pol-i-s1、pol-i-s2；用于如图12a-12b所示的s1和s2片段的细胞内表达)基于现有的表达盒组装(flatz l等人,proc natl acad sci u s a[美国国家科学院院刊]2006；103,4663-4668；kallert sm等人,nat commun[自然-通讯]2007；8,15327)。用质粒组合转染稳定表达lcmv糖蛋白的bhk-21细胞(flatz l等人,nat med[自然-医学]2010；16,339-345)，该质粒组合由以下组成：i)编码野生型candid#1l片段的基于聚合酶i的表达质粒(pol-i-l)，ii)分别编码病毒的s1和s2片段的基于聚合酶i的表达质粒(pol-i-s1、pol-i-s2)和聚合酶ii驱动的candid#1反式作用因子(l和np)表达质粒(pc-l、pc-np，图5)。转染后5天，将转染培养上清液在293t细胞(不表达转基因gp)上盲传。2、7和9天后收集来自该盲传的上清液，并借助用于检测的鸠宁病毒核蛋白特异性抗体通过免疫病灶形成测定法(iff)在非互补3t3细胞(battegay m等人,j virol methods[病毒学方法杂志]1991；33,191-198)上测定三片段的split-c-cand(tom/gfp)和split-c-cand(tom/e7e6)的感染性、复制能力滴度。第7天，split-c-cand(tom/gfp)和split-c-cand(tom/e7e6)载体均达到峰值滴度≥1'000'000ffu/ml，这证明不仅旧大陆沙粒病毒(如lcmv)，而且新大陆沙粒病毒(如鸠宁candid#1)也可以转化为基于split-c设计的具有复制能力的载体。6.7从基于cand的split-c病毒s1片段的转基因表达水平比从artcand的s
gp
片段的转基因表达水平高
[0499]
接下来，由携带一个gfp和一个tomato转基因的基于cand的split-c病毒和对比病毒artcand(split-c-cand(tom/gfp)、artcand(tom/gfp)；如图13a)表达的转基因的量在每个细胞水平上进行比较。293t细胞用上述病毒之一以moi＝0.1感染，或不被感染(“无病毒”)。72小时后通过流式细胞术对gfp以及tom表达进行量化(图13b-13d)。在split-c-cand(tom/gfp)和artcand(tom/gfp)感染的细胞培养物中观察到相当比例的gfp/tom共表达细胞群(图13b)。当针对侧向散射(ssc，图13c)绘制gfp时，在split-c-cand(tom/gfp)和artcand(tom/gfp)感染的细胞中均发现了明显分离的表达gfp的细胞群，但split-c-cand(tom/gfp)感染细胞的gfp平均荧光强度(mfi)比artcand(tom/gfp)感染细胞的高约2倍。然而重要的是，这两种病毒表达几乎相同水平的tom(图13d)。鉴于这两种病毒携带相同的表达tom的s2/s
np
片段，这是意料之中的。同时，通过作为gfp测定的内部参考标准，这一发现验
证了从病毒各自s1/s
gp
片段的gfp表达的差异水平。因此，结果发现，与artcand的s
gp
片段相比，三片段的candid#1的split-c设计使s1片段中编码的转基因表达高约2倍，而从s2片段的转基因表达水平与artcand设计的s
np
片段的没有区别。6.8基于cand的split-c载体的s1片段上的转基因递送比其从artcand载体的s
gp
片段的表达具有更高的免疫原性
[0500]
鉴于从基于cand的split-c病毒的s1片段的转基因表达水平比从artcand的相应s
gp
片段的转基因表达水平高约2倍(图13c)，然后评估免疫原性水平以了解是否存在转基因表达水平与免疫原性之间的相关性。评估了cd8+ t细胞对从基于cand的split-c病毒的s1片段(split-c-cand(tom/e7e6))表达的人工hpv16 e7e6融合抗原的反应，并与在其s
gp
片段中递送e7e6转基因的artcand(tom/e7e6)载体的免疫原性比较(图14a)。两个载体的基因组均在其相同的s2和s
np
片段上分别携带tom转基因(图14a)。在免疫后第9天，借助mhc i类四聚体通过流式细胞术测定血液中e7表位特异性cd8+ t细胞的频率。split-c-cand(tom/e7e6)免疫小鼠中的平均e7特异性cd8+ t细胞频率比用artcand(tom/e7e6)免疫的对照高约7倍，并且这种差异具有统计学意义(图14b，通过未配对的双尾学生t检验，p《0.01)。相比之下，cd8+ t细胞对两种载体的共同骨架表位np205(ytvkypnl；seq id no:47)的反应在两组动物之间没有显著差异(p》0.05，图14c)。e7表位特异性和np205载体骨架特异性cd8+ t细胞应答之间的比率(e7:np205比率，图14d)在两种载体之间也有显著差异(p《0.01)。使用表达e7e6的载体的这些结果表明，与由artcand的s
gp
片段中编码的转基因所引发的反应相比，基于candid#1的载体的split-c设计引发了在其s1片段中编码的转基因的更高免疫原性。因此，split-c设计将免疫显性转换成转基因特异性反应并远离载体骨架表位。7等同物
[0501]
本文公开的病毒、核酸、方法、宿主细胞和组合物的范围不受本文所述的具体实施例的限制。实际上，根据上述说明书和附图，除了所描述的那些修改之外，病毒、核酸、方法、宿主细胞和组合物的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
[0502]
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其公开内容通过引用以其全文并入。8序列表
表5：特定沙粒病毒的登录号
s表示基因库(genbank)登录号或s片段的序列号；l表示基因库登录号或l片段的序列号。