能够进行外显子跳读的反义核酸的制作方法

1.本发明涉及能够同时跳读靶基因的多个外显子的反义低聚物及包含该低聚物的医药组合物。


背景技术：

2.近年来，通过跳读具有引起疾病的突变的基因的外显子而产生部分具有功能的蛋白质并由此治疗疾病的外显子跳读疗法备受关注。作为能够通过这样的外显子跳读疗法治疗的疾病的例子，可以举出杜兴氏肌营养不良症(dmd)。
3.杜兴氏肌营养不良症(dmd)是约每3,500个新生男孩中就有1人发病的频率最高的高遗传性进行性肌肉疾病。虽然dmd患者在婴幼儿期显示出与健全人基本上没有差别的运动能力，但从4～5岁时起可观察到肌力降低。然后dmd患者的肌力降低会随年龄而发展，至12岁时变得无法行走，在20多岁时因心力衰竭或呼吸衰竭而死亡。因此，迫切需要开发有效的治疗药。
4.已知dmd的原因是抗肌萎缩蛋白基因的突变。抗肌萎缩蛋白基因存在于x染色体，是由220万碱基的dna形成的巨大基因。由dna转录为pre-mrna，再通过剪接去除内含子，79个外显子接合而成的mrna为13,993个碱基。由该mrna翻译成3,685个氨基酸，生成抗肌萎缩蛋白。抗肌萎缩蛋白与肌细胞的膜稳定性的保持有关，对于使肌细胞不容易被破坏而言是必需的。dmd患者的抗肌萎缩蛋白基因存在变异，因此在患者的肌细胞中基本上不表达具有功能的抗肌萎缩蛋白。因此，在dmd患者体内，在肌肉收缩时无法保持肌细胞的结构，大量的钙离子流入肌细胞内。其结果是发生肌细胞坏死和纤维化，从而使肌细胞变得难以再生。
5.贝克(becker)型肌营养不良症(bmd)的原因也是抗肌萎缩蛋白基因的突变，其症状虽然呈现出肌力降低，但通常比dmd轻，肌力降低的发展慢，在多数情况下在成年期发病。可以认为dmd与bmd的临床症状的不同在于，由于突变，在抗肌萎缩蛋白的mrna翻译为抗肌萎缩蛋白时，氨基酸可读框被破坏或保持(非专利文献1)。即，对于dmd而言，由于存在氨基酸可读框错位的突变，因此基本上不表达保持功能的抗肌萎缩蛋白，但对于bmd而言，由于突变而使外显子的一部分缺失，但保持了氨基酸可读框，因此可以产生虽然不完全但能够发挥功能的抗肌萎缩蛋白。
6.作为dmd的治疗方法，外显子跳读法正在受到期待。该方法是通过改变剪接而修复抗肌萎缩蛋白的mrna的氨基酸可读框，从而诱导表达部分恢复了功能的抗肌萎缩蛋白的方法(非专利文献2)。由成为外显子跳读的对象的外显子所翻译成的氨基酸序列部分缺失。因此，在该治疗中表达的抗肌萎缩蛋白比正常的抗肌萎缩蛋白短，但由于可保持氨基酸可读框，因此可部分保持使肌细胞稳定的功能。因此，期待通过外显子跳读能使dmd呈现与更轻症状的bmd相同的症状。外显子跳读法经过基于小鼠、犬的动物实验，正在进行对人dmd患者的临床试验。
7.可以通过以5’或3’剪接点周边的任一者或两者、或者外显子的内部为目标的反义核酸的结合来诱导外显子跳读。外显子仅在两个剪接点通过剪接体复合体进行识别的情况
下包含在mrna中。因此，通过利用反义核酸靶向剪接点周围，可以诱导外显子跳读。另外可以认为，由于外显子被剪接机构所识别，因此需要将富含丝氨酸和精氨酸的sr蛋白质结合于外显子剪接增强子(ese)，即使靶向ese也能够诱导外显子跳读。
8.抗肌萎缩蛋白基因的突变随dmd患者而不同，因此需要与基因突变的部位、种类相应的反义核酸。关于相对于抗肌萎缩蛋白基因的单一外显子以一个连续的碱基序列作为靶点来诱导外显子跳读的反义核酸，已有多个报告(专利文献1～6、以及非专利文献1及2)。另外，也报告了以抗肌萎缩蛋白基因的同一外显子作为靶点的两种反义核酸混合并使其发挥作用的情况下(双靶点化)，与单独使用各反义核酸时相比，有时跳读活性更加增强(专利文献7)。
9.另外，如上所述，不是跳读1个外显子而跳读多个外显子(外显子组)的多外显子跳读这样的方法备受关注。根据该方法，能够以抗肌萎缩蛋白基因的宽广范围的突变作为基于外显子跳读的治疗的对象。例如，在抗肌萎缩蛋白基因中，已知外显子45～55是基因突变的热点，已经报告了通过跳读这11个外显子，能够以具有缺失突变的dmd患者的约60％作为治疗对象(非专利文献3)。另外，已知如果先天缺失外显子45～55，则会患上bmd，但这些患者基本上为无症状或轻症(非专利文献4)。由此可以期待能够诱导外显子45～55跳读的药剂有望成为dmd治疗药。
10.作为诱导多外显子跳读的方法，例如报告了使用以成为外显子跳读对象的全部区域的外显子作为靶点的反义核酸的方法(非专利文献5、7、8及10)、使用以成为外显子跳读对象的区域的3’侧及5’侧这两者的不同的外显子分别作为靶点的反义核酸的方法(非专利文献6及9、以及专利文献8)。
11.但是，尚未报告以包含内含子的供体附近或受体附近的区域作为靶点的反义核酸诱导多外显子跳读。
12.现有技术文献
13.专利文献
14.专利文献1：国际公开公报第2004/048570号
15.专利文献2：国际公开公报第2009/139630号
16.专利文献3：国际公开公报第2010/048586号
17.专利文献4：美国专利公开公报第2010/0168212号
18.专利文献5：国际公开公报第2011/057350号
19.专利文献6：国际公开公报第2006/000057号
20.专利文献7：国际公开公报第2007/135105号
21.专利文献8：国际公开公报第2004/083446号
22.非专利文献
23.非专利文献1：annemieke aartsma-rus et al.,(2002)neuromuscular disorders 12:s71-s77
24.非专利文献2：wilton s.d.,e t al.,molecular therapy 2007:15:p.1288-96
25.非专利文献3：christophe beroud et al.,human mutation,28(2),2007,196-202
26.非专利文献4：yusuke echigoya et al.,molecular therapy-nucleic acids,4
(2),2015,e225
27.非专利文献5：yoshitsugu aoki et al.,pnas,109(34),2012,13763-13768
28.非专利文献6：laura van vliet et al.,bmc medical genetics,9,105,2008
29.非专利文献7：joshua lee et al.,plos one,13(5),e0197084,2018
30.非专利文献8：joshua lee et al.,methods in molecular biology,1828,141-150,2018
31.非专利文献9：annemieke aartsma-rus et al,am.j.hum.genet.74(1),83-92,2004
32.非专利文献10：yusuke echigoya et al.,molecular therapy,27(11),1-13,2019


技术实现要素：

33.发明要解决的课题
34.在上述的状况下，要求用于通过同时跳读目标pre-mrna的多个外显子(外显子组)来治疗具有各种突变的患者的医药品。
35.解决课题的方法
36.本发明人等对上述文献中记载的技术内容及抗肌萎缩蛋白基因的结构等进行了详细研究，结果发现，以人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的特定的区域作为靶点的反义核酸能够同时跳读外显子45～55中的多个外显子。本发明人等基于该见解而完成了本发明。
37.即，本发明如下所述。
38.1.39.一种反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其使人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子同时跳读，
40.上述反义低聚物包含与选自区域r1～r24中的至少1个区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列，所述区域r1～r24以下述区域rn表示：
41.由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第na位外显子的3’末端至5’末端方向上的nx碱基的碱基序列及第nb位内含子的5’末端至3’末端方向上的ny碱基的碱基序列构成的区域rn(n为1～23的奇数)、以及
42.由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第na位内含子的3’末端至5’末端方向上的nx碱基的碱基序列及第nb位外显子的5’末端至3’末端方向上的ny碱基的碱基序列构成的区域rn(n为2～24的偶数)，
43.其中，
44.n＝1时，na＝44、nb＝44、nx＝20、以及ny＝400；
45.n＝2时，na＝44、nb＝45、nx＝600、以及ny＝50；
46.n＝3时，na＝45、nb＝45、nx＝20、以及ny＝400；
47.n＝4时，na＝45、nb＝46、nx＝400、以及ny＝50；
48.n＝5时，na＝46、nb＝46、nx＝20、以及ny＝400；
49.n＝6时，na＝46、nb＝47、nx＝400、以及ny＝50；
50.n＝7时，na＝47、nb＝47、nx＝20、以及ny＝400；
51.n＝8时，na＝47、nb＝48、nx＝400、以及ny＝50；
52.n＝9时，na＝48、nb＝48、nx＝20、以及ny＝400；
53.n＝10时，na＝48、nb＝49、nx＝400、以及ny＝50；
54.n＝11时，na＝49、nb＝49、nx＝20、以及ny＝400；
55.n＝12时，na＝49、nb＝50、nx＝400、以及ny＝50；
56.n＝13时，na＝50、nb＝50、nx＝20、以及ny＝400；
57.n＝14时，na＝50、nb＝51、nx＝400、以及ny＝50；
58.n＝15时，na＝51、nb＝51、nx＝20、以及ny＝400；
59.n＝16时，na＝51、nb＝52、nx＝400、以及ny＝50；
60.n＝17时，na＝52、nb＝52、nx＝20、以及ny＝400；
61.n＝18时，na＝52、nb＝53、nx＝400、以及ny＝50；
62.n＝19时，na＝53、nb＝53、nx＝20、以及ny＝400；
63.n＝20时，na＝53、nb＝54、nx＝400、以及ny＝50；
64.n＝21时，na＝54、nb＝54、nx＝20、以及ny＝400；
65.n＝22时，na＝54、nb＝55、nx＝400、以及ny＝50；
66.n＝23时，na＝55、nb＝55、nx＝20、以及ny＝400；或者
67.n＝24时，na＝55、nb＝56、nx＝400、以及ny＝50。
68.2.69.根据[1]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0070]
区域r1为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第44位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0071]
区域r2为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位内含子的3’末端至5’末端方向上的600碱基的碱基序列及第45位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0072]
区域r3为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第45位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0073]
区域r4为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第46位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0074]
区域r5为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第46位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0075]
区域r6为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第47位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0076]
区域r7为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位外显子的3’末端至5’末端方
向上的20碱基的碱基序列及第47位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0077]
区域r8为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第48位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0078]
区域r9为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第48位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0079]
区域r10为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第49位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0080]
区域r11为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第49位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0081]
区域r12为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第50位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0082]
区域r13为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第50位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0083]
区域r14为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第51位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0084]
区域r15为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第51位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第51位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0085]
区域r16为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第51位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第52位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0086]
区域r17为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第52位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第52位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0087]
区域r18为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第52位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第53位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0088]
区域r19为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第53位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第53位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0089]
区域r20为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第53位内含子的3’末端至5’末端方
向上的400碱基的碱基序列及第54位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0090]
区域r21为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第54位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第54位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0091]
区域r22为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第54位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第55位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0092]
区域r23为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第55位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第55位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，或者
[0093]
区域r24为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第55位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第56位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域。
[0094]
[3]
[0095]
根据[1]或[2]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，上述反义低聚物包含与以下碱基序列(a)～(d)互补的碱基序列：
[0096]
(a)选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列、
[0097]
(b)与和选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列互补的碱基序列在严格条件下进行杂交的碱基序列、
[0098]
(c)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、或者
[0099]
(d)选自上述(a)、(b)及(c)中的任1个碱基序列的部分碱基序列。
[0100]
[4]
[0101]
根据[1]～[3]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0102]
上述反义低聚物为2个以上单元低聚物连接而成的反义低聚物，
[0103]
上述各单元低聚物包含与选自上述区域r1～r24中的任1个区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列、且各单元低聚物的碱基序列不是连续或相互重复的碱基序列。
[0104]
[5]
[0105]
根据[1]～[3]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0106]
上述反义低聚物为2个以上单元低聚物连接而成的反义低聚物，上述各单元低聚物包含与下述碱基序列(a)～(d)互补的碱基序列，且各单元低聚物的碱基序列不是连续或相互重复的碱基序列，
[0107]
(a)选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列、
[0108]
(b)与和选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列互补
or、-sh、-sr、-nh2、-nhr、-nr2、-n3、-cn、-f、-cl、-br及-i中的任意基团取代的核糖(上述r表示烷基或芳基，上述r’表示亚烷基)。
[0130]
[13]
[0131]
根据[10]～[12]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0132]
构成上述寡核苷酸的至少1个核苷酸的磷酸键部分为选自硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、氨基磷酸酯键、以及硼烷磷酸酯键中的任意1种。
[0133]
[14]
[0134]
根据[1]～[9]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其为吗啉代低聚物。
[0135]
[15]
[0136]
根据[14]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其为二氨基磷酸酯吗啉代低聚物。
[0137]
[16]
[0138]
根据[14]或[15]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其5’末端为选自下述化学式(1)～(3)中的任意基团。
[0139]
[化学式1]
[0140][0141]
[17]
[0142]
一种阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其抑制选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位外显子至第55位外显子中的任1个外显子单独地发生跳读，其中，
[0143]
上述阻抑基因反义低聚物包含与以下碱基序列互补的碱基序列：
[0144]
(a)选自序列号370～384的碱基序列中的任1个碱基序列、或者
[0145]
(b)与选自序列号370～384的碱基序列中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、或者
[0146]
(c)上述(a)或(b)的碱基序列的部分碱基序列。
[0147]
[18]
[0148]
根据[17]所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其由(1)选自序列号257～275中的任1个碱基序列、或(2)与选自序列号257～275中的任1个
碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列构成。
[0149]
[19]
[0150]
根据[17]或[18]所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其由选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列构成。
[0151]
[20]
[0152]
根据[17]～[19]中任一项所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其为寡核苷酸。
[0153]
[21]
[0154]
根据[20]所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0155]
构成上述寡核苷酸的至少1个核苷酸的糖部分和/或磷酸键部分经过修饰。
[0156]
[22]
[0157]
根据[20]或[21]所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0158]
构成上述寡核苷酸的至少1个核苷酸的糖部分为2’位的-oh基被选自-or、-r、-r’or、-sh、-sr、-nh2、-nhr、-nr2、-n3、-cn、-f、-cl、-br及-i中的任意基团取代的核糖(上述r表示烷基或芳基，上述r’表示亚烷基。)。
[0159]
[23]
[0160]
根据[20]～[22]中任一项所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0161]
构成上述寡核苷酸的至少1个核苷酸的磷酸键部分为选自硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、氨基磷酸酯键、以及硼烷磷酸酯键中的任意1种。
[0162]
[24]
[0163]
根据[17]～[19]中任一项所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其为吗啉代低聚物。
[0164]
[25]
[0165]
根据[24]所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其为二氨基磷酸酯吗啉代低聚物。
[0166]
[26]
[0167]
根据[24]或[25]所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其5’末端为选自下述化学式(1)～(3)中的任意基团。
[0168]
[化学式2]
[0169][0170]
[27]
[0171]
一种医药组合物，其包含[1]～[16]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0172]
[28]
[0173]
根据[27]所述的医药组合物，其进一步包含[17]～[26]中任一项所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0174]
[29]
[0175]
一种医药组合物，其包含：
[0176]
[1]～[16]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物、和
[0177]
[17]～[26]中任一项所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0178]
[30]
[0179]
根据[28]或[29]所述的医药组合物，其为：
[0180]
(1)上述反义低聚物是由序列号75构成的低聚物，上述阻抑基因反义低聚物是由序列号260构成的低聚物；
[0181]
(2)上述反义低聚物是由序列号75构成的低聚物，上述阻抑基因反义低聚物是由序列号261构成的低聚物；或者
[0182]
(3)上述反义低聚物是由序列号75构成的低聚物，上述阻抑基因反义低聚物是由序列号263构成的低聚物。
[0183]
[31]
[0184]
根据[27]～[30]中任一项所述的医药组合物，其进一步包含医药上能够允许的载体。
[0185]
[32]
[0186]
根据[27]～[31]中任一项所述的医药组合物，其用于肌营养不良症的治疗。
[0187]
[33]
[0188]
根据[27]～[32]中任一项所述的医药组合物，其用于对人类患者给药。
[0189]
[34]
[0190]
一种肌营养不良症的治疗方法，该方法包括：
[0191]
对肌营养不良症患者给药[1]～[16]中任一项所述的反义低聚物、或其医药上能
够允许的盐或其水合物、或者[27]～[33]中任一项所述的医药组合物的步骤。
[0192]
[35]
[0193]
根据[34]所述的治疗方法，其中，
[0194]
上述肌营养不良症患者是在抗肌萎缩蛋白基因具有成为外显子45～55跳读的对象的突变的患者。
[0195]
[36]
[0196]
根据[34]或[35]所述的治疗方法，其中，
[0197]
上述患者为人。
[0198]
[37]
[0199]
[1]～[16]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物、或者[27]～[33]中任一项所述的医药组合物在肌营养不良症治疗用医药品的制造中的用途。
[0200]
[38]
[0201]
[1]～[16]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物、或者[27]～[33]中任一项所述的医药组合物，其用于肌营养不良症的治疗。
[0202]
[39]
[0203]
根据[38]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物或医药组合物，其中，
[0204]
上述治疗包括进行外显子跳读，所述外显子为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子。
[0205]
[40]
[0206]
根据[38]或[39]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物或医药组合物，其中，
[0207]
在上述治疗中，肌营养不良症患者为人。
[0208]
[41]
[0209]
使上述2个以上在编号顺序上连续的外显子发生跳读的效率增加的方法，该方法包括：
[0210]
在从目标pre-mrna跳读2个以上在编号顺序上连续的外显子时，抑制上述目标pre-mrna的剪接沉默基因序列、剪接点序列或分支部位序列的步骤。
[0211]
[42]
[0212]
根据[41]所述的方法，其中，
[0213]
上述剪接沉默基因序列为核内不均一核糖核蛋白a1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein a1、hnrnpa1)的识别序列。
[0214]
[43]
[0215]
根据[41]或[42]所述的方法，其中，
[0216]
上述目标pre-mrna为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna。
[0217]
[44]
[0218]
根据[41]～[43]中任一项所述的方法，其中，
[0219]
上述2个以上在编号顺序上连续的外显子选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位
外显子至第55位外显子。
[0220]
[45]
[0221]
根据[44]所述的方法，其中，
[0222]
上述目标pre-mrna的2个以上在编号顺序上连续的外显子的跳读使用[1]～[16]中任一项所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物进行。
[0223]
[46]
[0224]
根据[44]或[45]所述的方法，其中，
[0225]
特异性地抑制上述剪接沉默基因序列、剪接点序列或分支部位序列的步骤使用[17]～[26]中任一项所述的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物进行。
[0226]
另外，本发明可包括以下方式。
[0227]
[47]
[0228]
一种反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其从目标pre-mrna中使2个以上在编号顺序上连续的外显子同时跳读，其中，
[0229]
上述反义低聚物包含与如下所述的区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列，所述区域选自：
[0230]
(1)由上述目标pre-mrna的任意外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及相对于该外显子与3’侧相邻的内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域、或者
[0231]
(2)由上述目标pre-mrna的任意内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基或600碱基范围的碱基序列、以及相对于该内含子与3’侧相邻的外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基范围的碱基序列构成的区域。
[0232]
[48]
[0233]
根据[47]所述的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0234]
上述目标pre-mrna为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna。
[0235]
发明的效果
[0236]
根据本发明，可以提供使靶点的多个外显子同时跳读的反义低聚物。另外，根据本发明的其它方式，可以提供用于通过使目标pre-mrna的多个外显子同时跳读而治疗具有各种突变的患者的医药组合物。另外，根据本发明的其它方式，可以提供抑制目标pre-mrna的外显子单独地发生跳读的阻抑基因反义低聚物或包含该低聚物的医药组合物。另外，根据本发明的其它方式，可以以高效率同时跳读人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55。
附图说明
[0237]
图1是示出通过rt-pcr对rd细胞(人横纹肌肉瘤细胞)中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0238]
图2是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0239]
图3是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0240]
图4是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0241]
图5是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0242]
图6是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0243]
图7是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0244]
图8是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0245]
图9是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0246]
图10是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0247]
图11是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0248]
图12是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0249]
图13是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0250]
图14是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0251]
图15是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0252]
图16是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的跳读进行研究的结果的图。
[0253]
图17是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的多跳读及外显子45的单跳读进行研究的结果的图。
[0254]
图18是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～55的多跳读及外显子45的单跳读进行研究的结果的图。
[0255]
图19是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～49间的多跳读及外显子45的单跳读进行研究的结果的图。
[0256]
图20是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～49间的多跳读进行研究、并对外显子45～46、外显子45～47、外显子45～48及外显子45～49的各跳读的总量(总多跳读产物)进行计算而得到的结果的图。可以认为该各跳读均具有治疗效果。
[0257]
图21是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～52间的多跳读及外显子45的单跳读进行研究的结果的图。
[0258]
图22是示出通过rt-pcr对rd细胞中的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的外显子45～52
间的多跳读进行研究、并对外显子45～47、外显子45～48、外显子45～49、外显子45～50、外显子45～51及外显子45～52的各跳读的总量(左)、或外显子45～47、外显子45～48、外显子45～49及外显子45～51的各跳读总量(右)进行计算而得到的结果的图。可以认为外显子45～47、外显子45～48、外显子45～49及外显子45～51的各跳读均具有治疗效果。
具体实施方式
[0259]
以下，对本发明详细地进行说明。以下的实施方式是用于对本发明进行说明的示例，本发明并不仅限定于该实施方式。本发明只要不脱离其主旨，可以以各种方式实施。
[0260]
1.反义低聚物
[0261]
本发明提供一种反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其从目标pre-mrna中使2个以上在编号顺序上连续的外显子同时跳读，
[0262]
上述反义低聚物包含与如下所述区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列，所述区域选自：
[0263]
(1)由上述目标pre-mrna的任意外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及相对于该外显子与3’侧相邻的内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域、或者
[0264]
(2)由上述目标pre-mrna的任意内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基或600碱基范围的碱基序列、及相对于该内含子与3’侧相邻的外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基范围的碱基序列构成的区域。
[0265]
在本说明书中，使2个以上在编号顺序上连续的外显子“同时跳读”不仅包括将各外显子从pre-mrna去除的时机完全相同的情况，还包括在从pre-mrna至成熟mrna的期间内依次去除各外显子的情况。即，使2个以上在编号顺序上连续的外显子“同时跳读”是指，相对于pre-mrna，去除2个以上在编号顺序上连续的多个外显子。
[0266]
在本说明书中，“2个以上在编号顺序上连续的外显子”是指，在目标pre-mrna中包含的外显子当中(将全部外显子数设为texon)，外显子编号逐一增加的多个外显子。外显子编号是指，将pre-mrna的存在于最靠近5’侧的外显子确定为第1位外显子，将从5’侧至3’侧依次存在的外显子按顺序设为第2位、第3位的编号。在跳读某个基因的2个以上在编号顺序上连续的外显子的情况下，其外显子编号a1、
···
、aj可以以数列{aj}的形式表示。数列{aj}的一般项aj以下式表示。
[0267]
[数学式1]
[0268]aj
＝m+(j-1)
[0269]
式中，m为满足1≤m≤(texon-1)的任意自然数，j为满足2≤(m+j)≤texon+1的自然数。
[0270]
例如，在目标pre-mrna为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的情况下，texon为79。
[0271]
在一个方式中，j为选自1～11的任意自然数。另外，在其它方式中，j为11，j为10，j为9，j为8，j为7，j为6，j为5，j为4，j为3，j为2，j为1。
[0272]
在本说明书中，“基因”除基因组基因以外还包括cdna、pre-mrna及mrna，优选基因为pre-mrna。在本说明书中，“pre-mrna”是包含从基因组上的靶基因转录的外显子及内含子的rna分子，是mrna前体。
[0273]
在某个方式中，本发明提供使人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子同时跳读的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物(以下，将上述反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物总称为“本发明的反义低聚物”。本发明的反义低聚物有时也分别指上述反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐、或其水合物)。
[0274]
人抗肌萎缩蛋白pre-mrna是由基因组上的人抗肌萎缩蛋白基因转录的包含外显子及内含子的rna分子，是mrna前体。本领域技术人员可以通过基于人抗肌萎缩蛋白基因的基因组序列(genbank accession no.ng_012232.1)的类推而获得人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的碱基序列的信息。
[0275]
在人基因组中，人抗肌萎缩蛋白基因存在于基因座xp21.2。人抗肌萎缩蛋白基因具有约3.0mbp的大小，作为已知的人基因是最大的基因。但是，人抗肌萎缩蛋白基因的编码区域仅为约14kb，该编码区域以79个的外显子的形式分散于抗肌萎缩蛋白基因内(roberts,rg.,et al.,genomics,16:536-538(1993))。作为人抗肌萎缩蛋白基因的转录物的pre-mrna经过剪接而生成约14kb的成熟mrna。人的野生型抗肌萎缩蛋白基因成熟mrna的碱基序列是公知的(genbank accession no.nm_004006)。
[0276]
上述方式中的本发明的反义低聚物以选自区域r1～r24中的至少1个区域作为靶点。所述区域r1～r24以下述区域rn表示：
[0277]
由人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第na位外显子的3’末端至5’末端方向上的nx碱基的碱基序列及第nb位内含子的5’末端至3’末端方向上的ny碱基的碱基序列构成的区域rn(n为1～23的奇数)、以及
[0278]
由人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第na位内含子的3’末端至5’末端方向上的nx碱基的碱基序列及第nb位外显子的5’末端至3’末端方向上的ny碱基的碱基序列构成的区域rn(n为2～24的偶数)。
[0279]
以下，将区域r1～r24称为“本发明的反义低聚物的靶点区域”或可相互替换地称为“本发明的靶点区域”。
[0280]
在本说明书中，“作为靶点”是指，作为对象的碱基序列为与靶点区域的碱基序列或靶点序列的部分碱基序列互补的碱基序列。
[0281]
另外，上述方式中的本发明的反义低聚物包含与选自本发明的靶点区域r1～r24中的至少1个区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列。
[0282]
作为上述方式中的本发明的靶点区域rn的例子，可以举出以下区域。
[0283]
n＝1时，na＝44、nb＝44、nx＝20、以及ny＝400；
[0284]
n＝2时，na＝44、nb＝45、nx＝600、以及ny＝50；
[0285]
n＝3时，na＝45、nb＝45、nx＝20、以及ny＝400；
[0286]
n＝4时，na＝45、nb＝46、nx＝400、以及ny＝50；
[0287]
n＝5时，na＝46、nb＝46、nx＝20、以及ny＝400；
[0288]
n＝6时，na＝46、nb＝47、nx＝400、以及ny＝50；
[0289]
n＝7时，na＝47、nb＝47、nx＝20、以及ny＝400；
[0290]
n＝8时，na＝47、nb＝48、nx＝400、以及ny＝50；
[0291]
n＝9时，na＝48、nb＝48、nx＝20、以及ny＝400；
[0292]
n＝10时，na＝48、nb＝49、nx＝400、以及ny＝50；
[0293]
n＝11时，na＝49、nb＝49、nx＝20、以及ny＝400；
[0294]
n＝12时，na＝49、nb＝50、nx＝400、以及ny＝50；
[0295]
n＝13时，na＝50、nb＝50、nx＝20、以及ny＝400；
[0296]
n＝14时，na＝50、nb＝51、nx＝400、以及ny＝50；
[0297]
n＝15时，na＝51、nb＝51、nx＝20、以及ny＝400；
[0298]
n＝16时，na＝51、nb＝52、nx＝400、以及ny＝50；
[0299]
n＝17时，na＝52、nb＝52、nx＝20、以及ny＝400；
[0300]
n＝18时，na＝52、nb＝53、nx＝400、以及ny＝50；
[0301]
n＝19时，na＝53、nb＝53、nx＝20、以及ny＝400；
[0302]
n＝20时，na＝53、nb＝54、nx＝400、以及ny＝50；
[0303]
n＝21时，na＝54、nb＝54、nx＝20、以及ny＝400；
[0304]
n＝22时，na＝54、nb＝55、nx＝400、以及ny＝50；
[0305]
n＝23时，na＝55、nb＝55、nx＝20、以及ny＝400；或者
[0306]
n＝24时，na＝55、nb＝56、nx＝400、以及ny＝50。
[0307]
在其它方式中，作为本发明的靶点区域rn的例子，可以举出以下区域，但并不限定于此。
[0308]
n＝1时，na＝44、nb＝44、nx＝20、以及ny＝400；
[0309]
n＝2时，na＝44、nb＝45、nx＝600、以及ny＝19；
[0310]
n＝3时，na＝45、nb＝45、nx＝20、以及ny＝400；
[0311]
n＝4时，na＝45、nb＝46、nx＝400、以及ny＝50；
[0312]
n＝5时，na＝46、nb＝46、nx＝20、以及ny＝400；
[0313]
n＝6时，na＝46、nb＝47、nx＝400、以及ny＝37；
[0314]
n＝7时，na＝47、nb＝47、nx＝20、以及ny＝400；
[0315]
n＝8时，na＝47、nb＝48、nx＝400、以及ny＝19；
[0316]
n＝9时，na＝48、nb＝48、nx＝20、以及ny＝400；
[0317]
n＝10时，na＝48、nb＝49、nx＝400、以及ny＝42；
[0318]
n＝11时，na＝49、nb＝49、nx＝20、以及ny＝400；
[0319]
n＝12时，na＝49、nb＝50、nx＝400、以及ny＝44；
[0320]
n＝13时，na＝50、nb＝50、nx＝20、以及ny＝400；
[0321]
n＝14时，na＝50、nb＝51、nx＝400、以及ny＝25；
[0322]
n＝15时，na＝51、nb＝51、nx＝20、以及ny＝400；
[0323]
n＝16时，na＝51、nb＝52、nx＝400、以及ny＝24；
[0324]
n＝17时，na＝52、nb＝52、nx＝20、以及ny＝400；
[0325]
n＝18时，na＝52、nb＝53、nx＝400、以及ny＝34；
[0326]
n＝19时，na＝53、nb＝53、nx＝20、以及ny＝400；
[0327]
n＝20时，na＝53、nb＝54、nx＝400、以及ny＝43；
[0328]
n＝21时，na＝54、nb＝54、nx＝20、以及ny＝400；
[0329]
n＝22时，na＝54、nb＝55、nx＝400、以及ny＝25；
[0330]
n＝23时，na＝55、nb＝55、nx＝20、以及ny＝400；或者
[0331]
n＝24时，na＝55、nb＝56、nx＝400、以及ny＝50。
[0332]
在其它方式中，作为本发明的靶点区域rn的例子的r1～r24可以举出如下表示的区域，但并不限定于此。
[0333]
例如，在某个方式中，区域r1为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第44位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0334]
区域r2为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位内含子的3’末端至5’末端方向上的600碱基的碱基序列及第45位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0335]
区域r3为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第45位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0336]
区域r4为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第46位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0337]
区域r5为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第46位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0338]
区域r6为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第47位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0339]
区域r7为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第47位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0340]
区域r8为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第48位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0341]
区域r9为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第48位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0342]
区域r10为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第49位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0343]
区域r11为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第49位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0344]
区域r12为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第50位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列
构成的区域，
[0345]
区域r13为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第50位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0346]
区域r14为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第51位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0347]
区域r15为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第51位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第51位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0348]
区域r16为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第51位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第52位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0349]
区域r17为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第52位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第52位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0350]
区域r18为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第52位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第53位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0351]
区域r19为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第53位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第53位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0352]
区域r20为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第53位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第54位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0353]
区域r21为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第54位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第54位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0354]
区域r22为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第54位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第55位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0355]
区域r23为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第55位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第55位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，或
[0356]
区域r24为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第55位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第56位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域。
[0357]
在其它方式中，作为本发明的靶点区域rn的例子的r1～r24可以举出在上述方式中如下表示的区域，但并不限定于此。
[0358]
例如，在某个方式中，区域r1为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第44位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0359]
区域r2为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位内含子的3’末端至5’末端方向上的600碱基的碱基序列及第45位外显子的5’末端至3’末端方向上的19碱基的碱基序列构成的区域，
[0360]
区域r3为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第45位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0361]
区域r4为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第46位外显子的5’末端至3’末端方向上的50碱基的碱基序列构成的区域，
[0362]
区域r5为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第46位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0363]
区域r6为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第47位外显子的5’末端至3’末端方向上的37碱基的碱基序列构成的区域，
[0364]
区域r7为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第47位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0365]
区域r8为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第48位外显子的5’末端至3’末端方向上的19碱基的碱基序列构成的区域，
[0366]
区域r9为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第48位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0367]
区域r10为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第49位外显子的5’末端至3’末端方向上的42碱基的碱基序列构成的区域，
[0368]
区域r11为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第49位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0369]
区域r12为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列及第50位外显子的5’末端至3’末端方向上的44碱基的碱基序列构成的区域，
[0370]
区域r13为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位外显子的3’末端至5’末端方向上的20碱基的碱基序列及第50位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
1碱基的范围表示的区域属于外显子44，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子44。
[0385]
(a2)区域r2
[0386]
对于区域r2而言，在将内含子44的3’末端与外显子45的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-600碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-600碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子44，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子45。
[0387]
(a3)区域r3
[0388]
对于区域r3而言，在将外显子45的3’末端与内含子45的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子45，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子45。
[0389]
(a4)区域r4
[0390]
对于区域r4而言，在将内含子45的3’末端与外显子46的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子45，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子46。
[0391]
(a5)区域r5
[0392]
对于区域r5而言，在将外显子46的3’末端与内含子46的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子46，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子46。
[0393]
(a6)区域r6
[0394]
对于区域r6而言，在将内含子46的3’末端与外显子47的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子46，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子47。
[0395]
(a7)区域r7
[0396]
对于区域r7而言，在将外显子47的3’末端与内含子47的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子47，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子47。
[0397]
(a8)区域r8
[0398]
对于区域r8而言，在将内含子47的3’末端与外显子48的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子47，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子48。
[0399]
(a9)区域r9
[0400]
对于区域r9而言，在将外显子48的3’末端与内含子48的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子48，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子48。
[0401]
(a10)区域r10
[0402]
对于区域r10而言，在将内含子48的3’末端与外显子49的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子48，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子49。
[0403]
(a11)区域r11
[0404]
对于区域r11而言，在将外显子49的3’末端与内含子49的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子49，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子49。
[0405]
(a12)区域r12
[0406]
对于区域r12而言，在将内含子49的3’末端与外显子50的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子49，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子50。
[0407]
(a13)区域r13
[0408]
对于区域r13而言，在将外显子50的3’末端与内含子50的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子50，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子50。
[0409]
(a14)区域r14
[0410]
对于区域r14而言，在将内含子50的3’末端与外显子51的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基
～-1碱基的范围表示的区域属于内含子50，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子51。
[0411]
(a15)区域r15
[0412]
对于区域r15而言，在将外显子51的3’末端与内含子51的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子51，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子51。
[0413]
(a16)区域r16
[0414]
对于区域r16而言，在将内含子51的3’末端与外显子52的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子51，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子52。
[0415]
(a17)区域r17
[0416]
对于区域r17而言，在将外显子52的3’末端与内含子52的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子52，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子52。
[0417]
(a18)区域r18
[0418]
对于区域r18而言，在将内含子52的3’末端与外显子53的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子52，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子53。
[0419]
(a19)区域r19
[0420]
对于区域r19而言，在将外显子53的3’末端与内含子53的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子53，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子53。
[0421]
(a20)区域r20
[0422]
对于区域r20而言，在将内含子53的3’末端与外显子54的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子53，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子54。
[0423]
(a21)区域r21
[0424]
对于区域r21而言，在将外显子54的3’末端与内含子54的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子54，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子54。
[0425]
(a22)区域r22
[0426]
对于区域r22而言，在将内含子54的3’末端与外显子55的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子54，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子55。
[0427]
(a23)区域r23
[0428]
对于区域r23而言，在将外显子55的3’末端与内含子55的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-20碱基～+400碱基的范围所表示的区域。此时，以-20碱基～-1碱基的范围表示的区域属于外显子55，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子55。
[0429]
(a24)区域r24
[0430]
对于区域r24而言，在将内含子55的3’末端与外显子56的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+50碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子55，以+1碱基～+50碱基的范围表示的区域属于外显子56。
[0431]
在其它方式中，作为本发明的靶点区域rn的例子的r2、r6、r8、r10、r12、r14、r16、r18、r20及r22可以举出在上述方式中如下表示的区域，但并不限定于此。
[0432]
(a2)区域r2
[0433]
对于区域r2而言，在将内含子44的3’末端与外显子45的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-600碱基～+19碱基的范围所表示的区域。此时，以-600碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子44，以+1碱基～+19碱基的范围表示的区域属于外显子45。
[0434]
(a6)区域r6
[0435]
对于区域r6而言，在将内含子46的3’末端与外显子47的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+37碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子46，以+1碱基～+37碱基的范围表示的区域属于外显子47。
[0436]
(a8)区域r8
[0437]
对于区域r8而言，在将内含子47的3’末端与外显子48的5’末端的边界设为基点0、
将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+19碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子47，以+1碱基～+19碱基的范围表示的区域属于外显子48。
[0438]
(a10)区域r10
[0439]
对于区域r10而言，在将内含子48的3’末端与外显子49的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+42碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子48，以+1碱基～+42碱基的范围表示的区域属于外显子49。
[0440]
(a12)区域r12
[0441]
对于区域r12而言，在将内含子49的3’末端与外显子50的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+44碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子49，以+1碱基～+44碱基的范围表示的区域属于外显子50。
[0442]
(a14)区域r14
[0443]
对于区域r14而言，在将内含子50的3’末端与外显子51的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+25碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子50，以+1碱基～+25碱基的范围表示的区域属于外显子51。
[0444]
(a16)区域r16
[0445]
对于区域r16而言，在将内含子51的3’末端与外显子52的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+24碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子51，以+1碱基～+24碱基的范围表示的区域属于外显子52。
[0446]
(a18)区域r18
[0447]
对于区域r18而言，在将内含子52的3’末端与外显子53的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+34碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子52，以+1碱基～+34碱基的范围表示的区域属于外显子53。
[0448]
(a20)区域r20
[0449]
对于区域r20而言，在将内含子53的3’末端与外显子54的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+43碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子53，以+1碱基～+43碱基的范围表示的区域属于外
显子54。
[0450]
(a22)区域r22
[0451]
对于区域r22而言，在将内含子54的3’末端与外显子55的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示、并将3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以-400碱基～+25碱基的范围所表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子54，以+1碱基～+25碱基的范围表示的区域属于外显子55。
[0452]
区域r1～r24的碱基序列的具体例列举如下。在本说明书中，胸腺嘧啶“t”与尿嘧啶“u”可以相互替换，是“t”或是“u”对本发明的反义低聚物的外显子跳读活性没有本质影响，因此，在本说明书中表示的碱基序列中也包括“t”为“u”的情况，以同一序列号表示。在以下的表中，即使是pre-mrna的碱基序列，有时也将“u”以表示，本领域技术人员可以适当将“t”置换为“u”来理解rna序列。
[0453]
[表1]
[0454]
[0455]
[0456]
[0457]
[0458][0459]
在其它方式中，区域r2、r6、r8、r10、r12、r14、r16、r18、r20及r22的碱基序列的具体例列举如下。
[0460]
[表2]
[0461]
[0462][0463]
此外，在其它方式中，本发明的反义低聚物以选自区域r1～r24中的至少任1个区域作为靶点，所述区域r1～r24以下述区域rn表示：
[0464]
由人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第nb位内含子的5’末端至3’末端方向上的ny碱基的碱基序列构成的区域rn(n为1～23的奇数)、以及
[0465]
由人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第na位内含子的3’末端至5’末端方向上的nx碱基的碱基序列构成的区域rn(n为2～24的偶数)。
[0466]
在上述的方式中，作为本发明的靶点区域rn的例子，可以列举如下例子，但并不限定于此。
[0467]
n＝1时，nb＝44及ny＝400；
[0468]
n＝2时，na＝44及nx＝600；
[0469]
n＝3时，nb＝45及ny＝400；
[0470]
n＝4时，na＝45及nx＝400；
[0471]
n＝5时，nb＝46及ny＝400；
[0472]
n＝6时，na＝46及nx＝400；
[0473]
n＝7时，nb＝47及ny＝400；
[0474]
n＝8时，na＝47及nx＝400；
[0475]
n＝9时，nb＝48及ny＝400；
[0476]
n＝10时，na＝48及nx＝400；
[0477]
n＝11时，nb＝49及ny＝400；
[0478]
n＝12时，na＝49及nx＝400；
[0479]
n＝13时，nb＝50及ny＝400；
[0480]
n＝14时，na＝50及nx＝400；
[0481]
n＝15时，nb＝51及ny＝400；
[0482]
n＝16时，na＝51及nx＝400；
[0483]
n＝17时，nb＝52及ny＝400；
[0484]
n＝18时，na＝52及nx＝400；
[0485]
n＝19时，nb＝53及ny＝400；
[0486]
n＝20时，na＝53及nx＝400；
[0487]
n＝21时，nb＝54及ny＝400；
[0488]
n＝22时，na＝54及nx＝400；
[0489]
n＝23时，nb＝55及ny＝400；或者
[0490]
n＝24时，na＝55及nx＝400。
[0491]
此外，在其它方式中，作为上述方式的本发明的靶点区域rn的例子的r1～r24，可以举出如下表示的区域，但并不限定于此。
[0492]
例如，在某个方式中，区域r1为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0493]
区域r2为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第44位内含子的3’末端至5’末端方向上的600碱基的碱基序列构成的区域，
[0494]
区域r3为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0495]
区域r4为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位内含子的3’末端至5’末端方
向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0496]
区域r5为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0497]
区域r6为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第46位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0498]
区域r7为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0499]
区域r8为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第47位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0500]
区域r9为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0501]
区域r10为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第48位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0502]
区域r11为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0503]
区域r12为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第49位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0504]
区域r13为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0505]
区域r14为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第50位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0506]
区域r15为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第51位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0507]
区域r16为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第51位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0508]
区域r17为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第52位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0509]
区域r18为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第52位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0510]
区域r19为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第53位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0511]
区域r20为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第53位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0512]
区域r21为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第54位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0513]
区域r22为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第54位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，
[0514]
区域r23为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第55位内含子的5’末端至3’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域，或者
[0515]
区域r24为由上述人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第55位内含子的3’末端至5’末端方向上的400碱基的碱基序列构成的区域。
[0516]
另外，在其它方式中，作为上述方式的本发明的靶点区域rn的例子的r1～r24可以举出如下表示的区域，但并不限定于此。
[0517]
(a1)区域r1
[0518]
区域r1而言，在将外显子44的3’末端与内含子44的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子44。
[0519]
(a2)区域r2
[0520]
对于区域r2而言，在将内含子44的3’末端与外显子45的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-600碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-600碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子44。
[0521]
(a3)区域r3
[0522]
对于区域r3而言，在将外显子45的3’末端与内含子45的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子45。
[0523]
(a4)区域r4
[0524]
对于区域r4而言，在将内含子45的3’末端与外显子46的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子45。
[0525]
(a5)区域r5
[0526]
对于区域r5而言，在将外显子46的3’末端与内含子46的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子46。
[0527]
(a6)区域r6
[0528]
对于区域r6而言，在将内含子46的3’末端与外显子47的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子46。
[0529]
(a7)区域r7
[0530]
对于区域r7而言，在将外显子47的3’末端与内含子47的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子47。
[0531]
(a8)区域r8
[0532]
对于区域r8而言，在将内含子47的3’末端与外显子48的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子47。
[0533]
(a9)区域r9
[0534]
对于区域r9而言，在将外显子48的3’末端与内含子48的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的
范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子48。
[0535]
(a10)区域r10
[0536]
对于区域r10而言，在将内含子48的3’末端与外显子49的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子48。
[0537]
(a11)区域r11
[0538]
对于区域r11而言，在将外显子49的3’末端与内含子49的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子49。
[0539]
(a12)区域r12
[0540]
对于区域r12而言，在将内含子49的3’末端与外显子50的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子49。
[0541]
(a13)区域r13
[0542]
对于区域r13而言，在将外显子50的3’末端与内含子50的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子50。
[0543]
(a14)区域r14
[0544]
对于区域r14而言，在将内含子50的3’末端与外显子51的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子50。
[0545]
(a15)区域r15
[0546]
对于区域r15而言，在将外显子51的3’末端与内含子51的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子51。
[0547]
(a16)区域r16
[0548]
对于区域r16而言，在将内含子51的3’末端与外显子52的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子51。
[0549]
(a17)区域r17
[0550]
对于区域r17而言，在将外显子52的3’末端与内含子52的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子52。
[0551]
(a18)区域r18
[0552]
对于区域r18而言，在将内含子52的3’末端与外显子53的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子52。
[0553]
(a19)区域r19
[0554]
对于区域r19而言，在将外显子53的3’末端与内含子53的5’末端的边界设为基点
0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子53。
[0555]
(a20)区域r20
[0556]
对于区域r20而言，在将内含子53的3’末端与外显子54的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子53。
[0557]
(a21)区域r21
[0558]
对于区域r21而言，在将外显子54的3’末端与内含子54的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子54。
[0559]
(a22)区域r22
[0560]
对于区域r22而言，在将内含子54的3’末端与外显子55的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子54。
[0561]
(a23)区域r23
[0562]
对于区域r23而言，在将外显子55的3’末端与内含子55的5’末端的边界设为基点0、并将从基点起3’侧(下游)的碱基序列区域以“+”表示的情况下，为以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域。此时，以+1碱基～+400碱基的范围表示的区域属于内含子55。
[0563]
(a24)区域r24
[0564]
对于区域r24而言，在将内含子55的3’末端与外显子56的5’末端的边界设为基点0、将从基点起5’侧(上游)的碱基序列区域以
“‑”
(minus)表示的情况下，为以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域。此时，以-400碱基～-1碱基的范围表示的区域属于内含子55。
[0565]
在上述的方式中，区域r1～r24的碱基序列的具体例可以列举如下的例子。
[0566]
[表3]
[0567]
[0568]
[0569]
[0570]
[0571][0572]
另外，在本发明的反义低聚物的靶点区域r1～r24中，关于人抗肌萎缩蛋白pre-mrna，不仅包括野生型(例如序列号233～256、341～369及385～389所示的区域)，还包括突变型。所述突变型具体具有以下的碱基序列(b0)及选自(b1)～(b16)中的任1个碱基序列。
[0573]
(b0)与和选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列互补的碱基序列在严格条件下进行杂交的碱基序列；
[0574]
(b1)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列
[0575]
(b2)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列
[0576]
(b3)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列
[0577]
(b4)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列
[0578]
(b5)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列
[0579]
(b6)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列
[0580]
(b7)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列
[0581]
(b8)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有
92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列
[0582]
(b9)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列
[0583]
(b10)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列
[0584]
(b11)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列
[0585]
(b12)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列
[0586]
(b13)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列
[0587]
(b14)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列
[0588]
(b15)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列
[0589]
(b16)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列
[0590]
在本说明书中，“在严格条件下进行杂交的碱基序列”是指，例如，以与选自序列号233～256、341～369及385～389中的任1个碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或southern杂交法等而得到的碱基序列。作为杂交的方法，例如可以利用“sambrook&russel,molecular cloning:a laboratory manual vol.3,cold spring harbor laboratory press,2001”、“ausubel,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,1987-1997”等中记载的方法。
[0591]
在本说明书中，“互补的碱基序列”并不限定于与作为对象的碱基序列形成沃森-克里克碱基配对的碱基序列，还包括形成摆动碱基对(wobble base pair)的碱基序列。这里，沃森-克里克碱基配对是指在腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶、以及鸟嘌呤-胞嘧啶之间形成氢键的碱基对，摆动碱基对是指在鸟嘌呤-尿嘧啶、次黄嘌呤核苷-尿嘧啶、次黄嘌呤核苷-腺嘌呤、以及次黄嘌呤核苷-胞嘧啶之间形成氢键的碱基对。另外，“互补的碱基序列”可以不与作为对象的碱基序列具有100％的互补性，例如，相对于作为对象的碱基序列，可以包含1个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基或5个碱基的非互补碱基，另外，相对于作为对
象的碱基序列，可以为缩短1个碱基、2个碱基、3个碱基、4个碱基或5个碱基的碱基序列。
[0592]
在本说明书中，“严格条件”可以是低严格条件、中严格条件及高严格条件中的任一种。“低严格条件”例如是5
×
ssc、5
×
邓哈特溶液(denhardt’s solution)、0.5％sds、50％甲酰胺、32℃的条件。另外，“中严格条件”例如是5
×
ssc、5
×
邓哈特溶液(denhardt’s solution)、0.5％sds、50％甲酰胺、42℃或5
×
ssc、1％sds、50mm tris-hcl(ph7.5)、50％甲酰胺、42℃的条件。“高严格条件”例如是5
×
ssc、5
×
邓哈特溶液(denhardt’s solution)、0.5％sds、50％甲酰胺、50℃、或0.2
×
ssc、0.1％sds、65℃的条件。在这些条件中，温度越高，越可以期待能够高效地得到具有较高序列同一性的碱基序列。其中，作为影响杂交的严格性的因素，可以考虑温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员可以通过对这些因素进行适当选择来实现相同的严格性。
[0593]
需要说明的是，在杂交中使用市售试剂盒的情况下，可以使用例如alkphos direct labelling and detection system(ge healthcare公司)。在该情况下，可以按照试剂盒附带的实验方案，与标记了的探针进行过夜的孵育，然后在55℃的条件下用含0.1％(w/v)sds的1次清洗缓冲液对膜进行清洗后，对杂交进行检测。或者，在基于与选自序列号233～256、341～369及385～389中的任1个碱基序列互补的碱基序列的全部或一部分来制作探针时，在使用市售的试剂(例如，pcr labeling mix(roche diagnostics公司)等)对该探针标记异羟洋地黄毒苷配基(dig)的情况下，可以使用dig核酸检测试剂盒(roche diagnostics公司)对杂交进行检测。
[0594]
需要说明的是，碱基序列的同一性可以使用karlin和altschul的算法blast(basic local alignment search tool)(proc.natl.acad.sci.usa872264-2268,1990；proc natl acad sci usa 90:5873,1993)来确定。开发了基于blast的算法的被称为blastn、blastx的程序(altschul sf,et al:j mol biol 215:403,1990)。在使用blastn分析碱基序列时，参数可以设为例如得分＝100、字长＝12。在使用blast和gapped blast程序时，使用各程序的默认参数。
[0595]
本发明的反义低聚物包含与选自本发明的靶点区域r1～r24中的至少1个区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列。“其部分”是指除选自靶点区域r1～r24中的至少1个区域的全部长度以外的区域，即，是指选自靶点区域r1～r24中的至少1个区域的部分区域。部分区域的长度可以为10～60个碱基长度、10～55个碱基长度、10～50个碱基长度、10～45个碱基长度、10～40个碱基长度、10～35个碱基长度、10～30个碱基长度、10～25个碱基长度、15～60个碱基长度、15～55个碱基长度、15～50个碱基长度、15～45个碱基长度、15～40个碱基长度、15～35个碱基长度、15～30个碱基长度、15～25个碱基长度、16～60个碱基长度、16～55个碱基长度、16～50个碱基长度、16～45个碱基长度、16～40个碱基长度、16～35个碱基长度、16～30个碱基长度、16～25个碱基长度、17～60个碱基长度、17～55个碱基长度、17～50个碱基长度、17～45个碱基长度、17～40个碱基长度、17～35个碱基长度、17～30个碱基长度、17～25个碱基长度、18～60个碱基长度、18～55个碱基长度、18～50个碱基长度、18～45个碱基长度、18～40个碱基长度、18～35个碱基长度、18～30个碱基长度、18～25个碱基长度、19～60个碱基长度、19～55个碱基长度、19～50个碱基长度、19～45个碱基长度、19～40个碱基长度、19～35个碱基长度、19～30个碱基长度、19～25个碱基长度、20～60个碱基长度、20～55个碱基长度、20～50个碱基长度、20～45个碱基长度、20～40
个碱基长度、20～35个碱基长度、20～30个碱基长度、20～25个碱基长度、15～30个碱基长度、15～29个碱基长度、15～28个碱基长度、15～27个碱基长度、15～26个碱基长度、15～25个碱基长度、15～24个碱基长度、15～23个碱基长度、15～22个碱基长度、15～21个碱基长度、15～20个碱基长度、15～19个碱基长度、15～18个碱基长度、16～30个碱基长度、16～29个碱基长度、16～28个碱基长度、16～27个碱基长度、16～26个碱基长度、16～25个碱基长度、16～24个碱基长度、16～23个碱基长度、16～22个碱基长度、16～21个碱基长度、16～20个碱基长度、16～19个碱基长度、16～18个碱基长度、17～30个碱基长度、17～29个碱基长度、17～28个碱基长度、17～27个碱基长度、17～26个碱基长度、17～25个碱基长度、17～24个碱基长度、17～23个碱基长度、17～22个碱基长度、17～21个碱基长度、17～20个碱基长度、17～19个碱基长度、17～18个碱基长度、18～30个碱基长度、18～29个碱基长度、18～28个碱基长度、18～27个碱基长度、18～26个碱基长度、18～25个碱基长度、18～24个碱基长度、18～23个碱基长度、18～22个碱基长度、18～21个碱基长度、18～20个碱基长度、18～19个碱基长度、19～30个碱基长度、19～29个碱基长度、19～28个碱基长度、19～27个碱基长度、19～26个碱基长度、19～25个碱基长度、19～24个碱基长度、19～23个碱基长度、19～22个碱基长度、19～21个碱基长度、19～20个碱基长度、20～30个碱基长度、20～29个碱基长度、20～28个碱基长度、20～27个碱基长度、20～26个碱基长度、20～25个碱基长度、20～24个碱基长度、20～23个碱基长度、20～22个碱基长度、20～21个碱基长度、5～25个碱基长度、5～24个碱基长度、5～23个碱基长度、5～22个碱基长度、5～21个碱基长度、5～20个碱基长度、5～19个碱基长度、5～18个碱基长度、5～17个碱基长度、5～16个碱基长度、5～15个碱基长度、5～14个碱基长度、5～13个碱基长度、5～12个碱基长度、7～25个碱基长度、7～24个碱基长度、7～23个碱基长度、7～22个碱基长度、7～21个碱基长度、7～20个碱基长度、7～19个碱基长度、7～18个碱基长度、7～17个碱基长度、7～16个碱基长度、7～15个碱基长度、7～14个碱基长度、7～13个碱基长度、7～12个碱基长度、9～25个碱基长度、9～24个碱基长度、9～23个碱基长度、9～22个碱基长度、9～21个碱基长度、9～20个碱基长度、9～19个碱基长度、9～18个碱基长度、9～17个碱基长度、9～16个碱基长度、9～15个碱基长度、9～14个碱基长度、9～13个碱基长度、9～12个碱基长度、10～25个碱基长度、10～24个碱基长度、10～23个碱基长度、10～22个碱基长度、10～21个碱基长度、10～20个碱基长度、10～19个碱基长度、10～18个碱基长度、10～17个碱基长度、10～16个碱基长度、10～15个碱基长度、10～14个碱基长度、10～13个碱基长度、10～12个碱基长度、60个碱基长度、59个碱基长度、58个碱基长度、57个碱基长度、56个碱基长度、55个碱基长度、54个碱基长度、53个碱基长度、52个碱基长度、51个碱基长度、50个碱基长度、49个碱基长度、48个碱基长度、47个碱基长度、46个碱基长度、45个碱基长度、44个碱基长度、43个碱基长度、42个碱基长度、41个碱基长度、40个碱基长度、39个碱基长度、38个碱基长度、37个碱基长度、36个碱基长度、35个碱基长度、34个碱基长度、33个碱基长度、32个碱基长度、31个碱基长度、30个碱基长度、29个碱基长度、28个碱基长度、27个碱基长度、26个碱基长度、25个碱基长度、24个碱基长度、23个碱基长度、22个碱基长度、21个碱基长度、20个碱基长度、19个碱基长度、18个碱基长度、17个碱基长度、16个碱基长度、15个碱基长度、14个碱基长度、13个碱基长度、12个碱基长度、11个碱基长度、10个碱基长度、9个碱基长度、8个碱基长度、7个碱基长度、6个碱基长度、或5个碱基长度，但并不限定于此，上述的长度也可以增加或减少1、2或3个碱
基长度。
[0596]
本发明的反义低聚物具有使人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子同时跳读的活性。在本说明书中，将这样的目标pre-mrna中2个以上在编号顺序上连续的外显子的跳读称为“多外显子跳读”或“多跳读”，将其活性称为“多外显子跳读活性”或“多跳读活性”。
[0597]
这里，选自第45位外显子至第55位外显子中的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子是指，在pre-mrna所包含的第45位外显子至第55位外显子这11个外显子当中，外显子编号逐一增加的多个外显子。外显子编号是指，在人抗肌萎缩蛋白pre-mrna所包含的79个外显子当中，将pre-mrna的存在于最靠近5’侧的外显子确定为第1位外显子，将从5’侧至3’侧依次存在的外显子按顺序设为第2位、第3位
···
第79位的编号。需要说明的是，对于内含子，为与存在于其5’侧的外显子相同的编号。即，对于第45位内含子而言，在其5’侧存在第45位外显子，在其3’侧存在第46位外显子。另外，在本说明书中，“第n位”的外显子或内含子是指在pre-mrna中从5’末端向3’末端计数为n位的外显子或内含子。
[0598]
将选自第45位外显子至第55位外显子中的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子所包含的外显子的组合示于表4。
[0599]
[表4]
[0600]
组合包含的外显子组合包含的外显子组合145、46组合2948～50组合245～47组合3048～51组合345～48组合3148～52组合445～49组合3248～53组合545～50组合3348～54组合645～51组合3448～55组合745～52组合3549、50组合845～53组合3649～51组合945～54组合3749～52组合1045～55组合3849～53组合1146、47组合3949～54组合1246～48组合4049～55组合1346～49组合4150、51组合1446～50组合4250～52组合1546～51组合4350～53组合1646～52组合4450～54组合1746～53组合4550～55组合1846～54组合4651、52组合1946～55组合4751～53组合2047、48组合4851～54组合2147～49组合4951～55组合2247～50组合5052、53
组合2347～51组合5152～54组合2447～52组合5252～55组合2547～53组合5353、54组合2647～54组合5453～55组合2747～55组合5554、55组合2848、49
ꢀꢀ
[0601]
在表4所记载的外显子的组合中，期待对dmd发挥更高的治疗效果的跳读模式例如为组合1、2、3、4、6、8、10、18、20、21、23、25、27、28、30、32、34、36、38、40、41、43、45、46、50、52、或55。通过以这些组合进行多外显子跳读，期待对更多的dmd患者发挥治疗效果。
[0602]
另外，选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子可以包括多个连续的外显子组，没有限定，例如，可以为(例1)外显子45～46(第1外显子组)和外显子48～53(第2外显子组)，可以为(例2)外显子46～47(第1外显子组)、外显子49～50(第2外显子组)及外显子52～54(第3外显子组)。
[0603]
在本发明中，“使其进行跳读的活性”(即多跳读活性)是指，以人抗肌萎缩蛋白pre-mrna举例，使其产生人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子缺失的人抗肌萎缩蛋白mrna的活性。
[0604]
换言之，该活性是指，通过本发明的反义低聚物结合于人抗肌萎缩蛋白pre-mrna上的靶点部位，在该pre-mrna进行剪接时，缺失的外显子的相邻下游的外显子的5’末端的核苷酸连接于缺失的外显子的相邻上游的外显子的3’末端的核苷酸，形成未发生密码子移码的成熟mrna(即，未发生移码而缺失了外显子的成熟mrna)。
[0605]
本发明的反义低聚物在生理条件下显示出多跳读活性。上述“生理条件下”是指调节成与生物体内类似的ph、盐组成、温度的条件。可以举出例如为25～40℃、优选为37℃、ph5～8、优选为ph7.4、氯化钠浓度为150mm的条件。在诱导多跳读时，本发明的反义低聚物可以使用1种或多种，例如，可以组合使用2、3、4、5、6、7、8、9或10种的反义低聚物。
[0606]
是否发生多跳读可以通过以下方式确认：将本发明的反义低聚物导入抗肌萎缩蛋白表达细胞(例如，人横纹肌肉瘤细胞)，由上述抗肌萎缩蛋白表达细胞的总rna对人抗肌萎缩蛋白基因的mrna的外显子45～55的周边区域进行rt-pcr扩增，对于该pcr扩增产物进行nested pcr或序列分析。对于多跳读效率而言，从受试细胞回收人抗肌萎缩蛋白基因的mrna，在该mrna中，对于外显子45～55中的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子发生了跳读的条带的多核苷酸量“a”、外显子45～55中的任意1个外显子发生了跳读的条带的多核苷酸量“b”、以及未发生跳读的条带的多寡核苷酸量“c”进行测定，基于这些“a”、“b”及“c”的测定值按照下式进行计算。
[0607]
跳读效率(％)＝a/(a+b+c)
×
100
[0608]
例如，对于外显子45～55的多跳读效率而言，可以使用针对外显子44的正向引物和针对外显子56的反向引物对外显子45～55多跳读的条带的多核苷酸量“a”进行测定，使用针对外显子44的正向引物和针对外显子46的反向引物对外显子45单跳读的条带的多核苷酸量“b”进行测定，使用针对外显子44的正向引物和针对外显子46的反向引物对未发生跳读的条带的多核苷酸量“c”进行测定，基于这些“a”、“b”及“c”的测定值按照上述的式子进行计算。
[0609]
由于本发明的反义低聚物而在人抗肌萎缩蛋白mrna中缺失的外显子的数量为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个。将其称为缺失模式，有时在以1次跳读实验或跳读治疗而得到的结果中混合存在各种缺失模式。例如，将本发明的反义低聚物导入表达人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的细胞，对该mrna进行回收，可得到2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或11个外显子缺失的mrna混合存在的mrna。
[0610]
在某个实施方式中，“使其跳读的活性”可以以以下的(c1)～(c10)定义。
[0611]
(c1)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意2个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0612]
这里，上述2个在编号顺序上连续的外显子可以是第45位及第46位外显子、第46位及第47位外显子、第47位及第48位外显子、第48位及第49位外显子、第49位及第50位外显子、第50位及第51位外显子、第51位及第52位外显子、第52位及第53位外显子、第53位及第54位外显子、或第54位及第55位外显子。
[0613]
(c2)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意3个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0614]
这里，上述3个在编号顺序上连续的外显子可以是第45位～第47位外显子、第46位～第48位外显子、第47位～第49位外显子、第48位～第50位外显子、第49位～第51位外显子、第50位～第52位外显子、第51位～第53位外显子、第52位～第54位外显子、或第53位～第55位外显子。
[0615]
(c3)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意4个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0616]
这里，上述4个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第48位外显子、第46位～第49位外显子、第47位～第50位外显子、第48位～第51位外显子、第49位～第52位外显子、第50位～第53位外显子、第51位～第54位外显子、或第52位～第55位外显子。
[0617]
(c4)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意5个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0618]
这里，上述5个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第49位外显子、第46位～第50位外显子、第47位～第51位外显子、第48位～第52位外显子、第49位～第53位外显子、第50位～第54位外显子、或第51位～第55位外显子。
[0619]
(c5)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意6个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、
75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0620]
这里，上述6个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第50位外显子、第46位～第51位外显子、第47位～第52位外显子、第48位～第53位外显子、第49位～第54位外显子、或第50位～第55位外显子。
[0621]
(c6)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意7个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0622]
这里，上述7个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第51位外显子、第46位～第52位外显子、第47位～第53位外显子、第48位～第54位外显子、或第49位～第55位外显子。
[0623]
(c7)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意8个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0624]
这里，上述8个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第52位外显子、第46位～第53位外显子、第47位～第54位外显子、或第48位～第55位外显子。
[0625]
(c8)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意9个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0626]
这里，上述9个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第53位外显子、第46位～第54位外显子、或第47位～第55位外显子。
[0627]
(c9)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的任意10个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0628]
这里，上述10个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第54位外显子、或第46位～第55位外显子。
[0629]
(c10)选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中的第45位外显子至第55位外显子的11个在编号顺序上连续的外显子以5％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上的效率被跳读。
[0630]
这里，上述11个在编号顺序上连续的外显子可以为第45位～第55位外显子。
[0631]
本发明的反义低聚物可以为10～60个碱基长度、10～55个碱基长度、10～50个碱基长度、10～45个碱基长度、10～40个碱基长度、10～35个碱基长度、10～30个碱基长度、10～25个碱基长度、15～60个碱基长度、15～55个碱基长度、15～50个碱基长度、15～45个碱基长度、15～40个碱基长度、15～35个碱基长度、15～30个碱基长度、15～25个碱基长度、16～60个碱基长度、16～55个碱基长度、16～50个碱基长度、16～45个碱基长度、16～40个碱
基长度、16～35个碱基长度、16～30个碱基长度、16～25个碱基长度、17～60个碱基长度、17～55个碱基长度、17～50个碱基长度、17～45个碱基长度、17～40个碱基长度、17～35个碱基长度、17～30个碱基长度、17～25个碱基长度、18～60个碱基长度、18～55个碱基长度、18～50个碱基长度、18～45个碱基长度、18～40个碱基长度、18～35个碱基长度、18～30个碱基长度、18～25个碱基长度、19～60个碱基长度、19～55个碱基长度、19～50个碱基长度、19～45个碱基长度、19～40个碱基长度、19～35个碱基长度、19～30个碱基长度、19～25个碱基长度、20～60个碱基长度、20～55个碱基长度、20～50个碱基长度、20～45个碱基长度、20～40个碱基长度、20～35个碱基长度、20～30个碱基长度、20～25个碱基长度、15～30个碱基长度、15～29个碱基长度、15～28个碱基长度、15～27个碱基长度、15～26个碱基长度、15～25个碱基长度、15～24个碱基长度、15～23个碱基长度、15～22个碱基长度、15～21个碱基长度、15～20个碱基长度、15～19个碱基长度、15～18个碱基长度、16～30个碱基长度、16～29个碱基长度、16～28个碱基长度、16～27个碱基长度、16～26个碱基长度、16～25个碱基长度、16～24个碱基长度、16～23个碱基长度、16～22个碱基长度、16～21个碱基长度、16～20个碱基长度、16～19个碱基长度、16～18个碱基长度、17～30个碱基长度、17～29个碱基长度、17～28个碱基长度、17～27个碱基长度、17～26个碱基长度、17～25个碱基长度、17～24个碱基长度、17～23个碱基长度、17～22个碱基长度、17～21个碱基长度、17～20个碱基长度、17～19个碱基长度、17～18个碱基长度、18～30个碱基长度、18～29个碱基长度、18～28个碱基长度、18～27个碱基长度、18～26个碱基长度、18～25个碱基长度、18～24个碱基长度、18～23个碱基长度、18～22个碱基长度、18～21个碱基长度、18～20个碱基长度、18～19个碱基长度、19～30个碱基长度、19～29个碱基长度、19～28个碱基长度、19～27个碱基长度、19～26个碱基长度、19～25个碱基长度、19～24个碱基长度、19～23个碱基长度、19～22个碱基长度、19～21个碱基长度、19～20个碱基长度、20～30个碱基长度、20～29个碱基长度、20～28个碱基长度、20～27个碱基长度、20～26个碱基长度、20～25个碱基长度、20～24个碱基长度、20～23个碱基长度、20～22个碱基长度、20～21个碱基长度、60个碱基长度、59个碱基长度、58个碱基长度、57个碱基长度、56个碱基长度、55个碱基长度、54个碱基长度、53个碱基长度、52个碱基长度、51个碱基长度、50个碱基长度、49个碱基长度、48个碱基长度、47个碱基长度、46个碱基长度、45个碱基长度、44个碱基长度、43个碱基长度、42个碱基长度、41个碱基长度、40个碱基长度、39个碱基长度、38个碱基长度、37个碱基长度、36个碱基长度、35个碱基长度、34个碱基长度、33个碱基长度、32个碱基长度、31个碱基长度、30个碱基长度、29个碱基长度、28个碱基长度、27个碱基长度、26个碱基长度、25个碱基长度、24个碱基长度、23个碱基长度、22个碱基长度、21个碱基长度、20个碱基长度、19个碱基长度、18个碱基长度、17个碱基长度、16个碱基长度、15个碱基长度、14个碱基长度、13个碱基长度、12个碱基长度、11个碱基长度、或10个碱基长度，但并不限定于此，上述的长度也可以增加或减少1、2或3个碱基长度。
[0632]
本发明的反义低聚物的一个方式是具有多个单元低聚物相互连接而成的构成的连接型反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物(以下，称为“本发明的连接型反义低聚物”)。单元低聚物是指构成本发明的连接型反义低聚物的各低聚物。即，在本发明的连接型反义低聚物结合于人抗肌萎缩蛋白pre-mrna上的靶点碱基序列时，包含与具有连续的碱基序列的靶点碱基序列进行杂交的碱基序列的部分(单元)。
[0633]
具体而言，本发明的连接型反义低聚物是2个以上单元低聚物连接而成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，其中，
[0634]
上述各单元低聚物包含与选自上述区域r1～r24(也可以包含作为野生型的序列号233～256、341～369及385～389所示的区域及其突变型)中的任1个区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列、且各单元低聚物的碱基序列不是连续或相互重复的碱基序列。
[0635]
单元低聚物可以经由无助于杂交的接头而连接，或者可以不经由接头而直接连接。在单元低聚物彼此直接连接的情况下，位于5’末端侧的单元的3’末端和位于3’末端侧的单元的5’末端形成磷酸键或以下的任意基团。
[0636]
[化学式3]
[0637][0638]
(式中，x表示-oh、-ch2r1、-o-ch2r1、-s-ch2r1、-nr2r3、或f；
[0639]
r1表示h、烷基；
[0640]
r2及r3相同或不同，表示h、烷基、环烷基、或芳基；
[0641]
y1表示o、s、ch2、或nr1；
[0642]
y2表示o、s、或nr1；
[0643]
z表示o或s。)
[0644]
在本发明的连接型反义低聚物中，各单元低聚物可以将区域r1～r24中各区域所包含的碱基序列作为靶点，也可以将同一区域所包含的碱基序列作为靶点。另外，对于本发明的连接型反义低聚物而言，各单元低聚物的碱基序列不连续或相互重复。各单元低聚物的碱基序列不连续是指，构成本发明的连接型反义低聚物的各单元低聚物的靶点碱基序列作为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna上的碱基序列是不连续的。因此，将各单元低聚物的靶点碱基序列与人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的碱基序列进行比较时，在上述靶点碱基序列之间夹隔作为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的碱基序列的至少1个碱基。另一方面，各单元低聚物的碱基序列不相互重复是指，单元低聚物的靶点碱基序列作为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna上的碱基序列是不重复的。允许在各单元低聚物的碱基序列中偶然存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基左右的一致。
[0645]
本发明的连接型反义低聚物的上述各单元低聚物可以具有包含与下述碱基序列(d1)～(d4)互补的碱基序列，且各单元低聚物的碱基序列不是连续或相互重复的碱基序列的构成，
[0646]
(d1)选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列、
[0647]
(d2)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0648]
(d3)与和选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列互补的碱基序列在严格条件下进行杂交的碱基序列、或者
[0649]
(d4)选自上述(d1)、(d2)及(d3)中的任1个碱基序列的部分碱基序列。
[0650]
本发明的连接型反义低聚物如上所述，可以包含与选自(d1)、(d2)、(d3)及(d4)中的任1个碱基序列互补的碱基序列。(d2)的碱基序列是上述(d1)的碱基序列的突变体，作为其例子，可以列举：
[0651]
(d2-1)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0652]
(d2-2)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0653]
(d2-3)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0654]
(d2-4)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0655]
(d2-5)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0656]
(d2-6)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0657]
(d2-7)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0658]
(d2-8)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0659]
(d2-9)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0660]
(d2-10)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0661]
(d2-11)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0662]
(d2-12)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0663]
(d2-13)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0664]
(d2-14)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0665]
(d2-15)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0666]
(d2-16)与选自序列号233～256、341～369、以及385～389中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0667]
因此，构成本发明的连接型反义低聚物的上述各单元低聚物可以包含与选自上述(d1)、(d2-1)～(d2-16)、(d3)及(d4)中的任1个碱基序列互补的碱基序列。
[0668]
另外，本发明的连接型反义低聚物如上所述，可以包含与选自(d1)、(d2)、(d3)及(d4)中的任1个碱基序列互补的碱基序列。碱基序列(d4)涉及选自上述(d1)、(d2)及(d3)中的任1个碱基序列的部分碱基序列。关于(d4)，“其部分”是指，不包括(d1)、(d2)或(d3)的全部长度的连续的部分区域。部分区域的长度为5～25个碱基长度，可以为5～24个碱基长度、5～23个碱基长度、5～22个碱基长度、5～21个碱基长度、5～20个碱基长度、5～19个碱基长度、5～18个碱基长度、5～17个碱基长度、5～16个碱基长度、5～15个碱基长度、5～14个碱基长度、5～13个碱基长度、5～12个碱基长度、7～25个碱基长度、7～24个碱基长度、7～23个碱基长度、7～22个碱基长度、7～21个碱基长度、7～20个碱基长度、7～19个碱基长度、7～18个碱基长度、7～17个碱基长度、7～16个碱基长度、7～15个碱基长度、7～14个碱基长度、7～13个碱基长度、7～12个碱基长度、9～25个碱基长度、9～24个碱基长度、9～23个碱基长度、9～22个碱基长度、9～21个碱基长度、9～20个碱基长度、9～19个碱基长度、9～18个碱基长度、9～17个碱基长度、9～16个碱基长度、9～15个碱基长度、9～14个碱基长度、9～13个碱基长度、9～12个碱基长度、10～25个碱基长度、10～24个碱基长度、10～23个碱基长度、10～22个碱基长度、10～21个碱基长度、10～20个碱基长度、10～19个碱基长度、10～18个碱基长度、10～17个碱基长度、10～16个碱基长度、10～15个碱基长度、10～14个碱基长度、10～13个碱基长度、10～12个碱基长度、25个碱基长度、24个碱基长度、23个碱基长度、22个碱基长度、21个碱基长度、20个碱基长度、19个碱基长度、18个碱基长度、17个碱基长度、16个碱基长度、15个碱基长度、14个碱基长度、13个碱基长度、12个碱基长度、11个碱基长度、10个碱基长度、9个碱基长度、8个碱基长度、7个碱基长度、6个碱基长度、5个碱基长
度，但并不限定于此、上述的长度也可以增加或减少1、2或3个碱基长度。
[0669]
各单元低聚物的大小为5～30个碱基长度，可以为5～29个碱基长度、5～28个碱基长度、5～27个碱基长度、5～26个碱基长度、5～25个碱基长度、5～24个碱基长度、5～23个碱基长度、5～22个碱基长度、5～21个碱基长度、5～20个碱基长度、5～19个碱基长度、5～18个碱基长度、5～17个碱基长度、5～16个碱基长度、5～15个碱基长度、5～14个碱基长度、5～13个碱基长度、5～12个碱基长度、7～30个碱基长度、7～29个碱基长度、7～28个碱基长度、7～27个碱基长度、7～26个碱基长度、7～25个碱基长度、7～24个碱基长度、7～23个碱基长度、7～22个碱基长度、7～21个碱基长度、7～20个碱基长度、7～19个碱基长度、7～18个碱基长度、7～17个碱基长度、7～16个碱基长度、7～15个碱基长度、7～14个碱基长度、7～13个碱基长度、7～12个碱基长度、9～30个碱基长度、9～29个碱基长度、9～28个碱基长度、9～27个碱基长度、9～26个碱基长度、9～25个碱基长度、9～24个碱基长度、9～23个碱基长度、9～22个碱基长度、9～21个碱基长度、9～20个碱基长度、9～19个碱基长度、9～18个碱基长度、9～17个碱基长度、9～16个碱基长度、9～15个碱基长度、9～14个碱基长度、9～13个碱基长度、9～12个碱基长度、10～30个碱基长度、10～29个碱基长度、10～28个碱基长度、10～27个碱基长度、10～26个碱基长度、10～25个碱基长度、10～24个碱基长度、10～23个碱基长度、10～22个碱基长度、10～21个碱基长度、10～20个碱基长度、10～19个碱基长度、10～18个碱基长度、10～17个碱基长度、10～16个碱基长度、10～15个碱基长度、10～14个碱基长度、10～13个碱基长度、10～12个碱基长度、30个碱基长度、29个碱基长度、28个碱基长度、27个碱基长度、26个碱基长度、25个碱基长度、24个碱基长度、23个碱基长度、22个碱基长度、21个碱基长度、20个碱基长度、19个碱基长度、18个碱基长度、17个碱基长度、16个碱基长度、15个碱基长度、14个碱基长度、13个碱基长度、12个碱基长度、11个碱基长度、10个碱基长度、9个碱基长度、8个碱基长度、7个碱基长度、6个碱基长度、5个碱基长度，但并不限定于此、上述的长度也可以增加或减少1、2或3个碱基长度。各单元低聚物的大小可以相同，也可以不同。
[0670]
在某个方式中，本发明的连接型反义低聚物可以是由以下碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[0671]
(e1)选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列、或者(e2)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0672]
这里，(e2)的碱基序列是(e1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0673]
(e2-1)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0674]
(e2-2)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0675]
(e2-3)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0676]
(e2-4)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0677]
(e2-5)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0678]
(e2-6)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0679]
(e2-7)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0680]
(e2-8)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0681]
(e2-9)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0682]
(e2-10)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0683]
(e2-11)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0684]
(e2-12)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0685]
(e2-13)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0686]
(e2-14)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0687]
(e2-15)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0688]
(e2-16)与选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0689]
因此，本发明的连接型反义低聚物可以由选自上述(e1)及(e2-1)～(e2-16)中的任1个碱基序列构成。
[0690]
优选本发明的连接型反义低聚物包含选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列。另外，在某个方式中，本发明的连接型反义低聚物由选自序列号18～21、80～111及225～232中的任1个碱基序列构成。
[0691]
此外，本发明的反义低聚物可以为由以下碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[0692]
(e’1)选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列、或者
[0693]
(e’2)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0694]
这里，(e’2)的碱基序列是(e’1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0695]
(e’2-1)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0696]
(e’2-2)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0697]
(e’2-3)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0698]
(e’2-4)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0699]
(e’2-5)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0700]
(e’2-6)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0701]
(e’2-7)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0702]
(e’2-8)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0703]
(e’2-9)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择
的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0704]
(e’2-10)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0705]
(e’2-11)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0706]
(e’2-12)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0707]
(e’2-13)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0708]
(e’2-14)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0709]
(e’2-15)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0710]
(e’2-16)与选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0711]
因此，本发明的反义低聚物可以由选自上述(e’1)及(e’2-1)～(e’2-16)中的任1个碱基序列构成。
[0712]
优选本发明的反义低聚物包含选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列。另外，在某个方式中，本发明的反义低聚物由选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列构成。
[0713]
在某个方式中，本发明的反义低聚物可以是由以下碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物：
[0714]
(e”1)选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列、或者
[0715]
(e”2)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232
中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0716]
这里，(e”2)的碱基序列是(e”1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0717]
(e”2-1)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0718]
(e”2-2)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0719]
(e”2-3)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0720]
(e”2-4)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0721]
(e”2-5)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0722]
(e”2-6)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0723]
(e”2-7)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0724]
(e”2-8)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0725]
(e”2-9)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0726]
(e”2-10)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0727]
(e”2-11)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0728]
(e”2-12)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0729]
(e”2-13)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、
147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0730]
(e”2-14)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0731]
(e”2-15)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0732]
(e”2-16)与选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0733]
因此，本发明的反义低聚物可以由选自上述(e”1)及(e”2-1)～(e”2-16)中的任1个碱基序列构成。
[0734]
在某个方式中，本发明的反义低聚物可以是由以下碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物：
[0735]
(e
”’
1)选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列、或者
[0736]
(e
”’
2)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0737]
这里，(e
”’
2)的碱基序列是(e
”’
1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0738]
(e
”’
2-1)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0739]
(e
”’
2-2)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、
225及228中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0740]
(e
”’
2-3)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0741]
(e
”’
2-4)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0742]
(e
”’
2-5)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0743]
(e
”’
2-6)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0744]
(e
”’
2-7)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0745]
(e
”’
2-8)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0746]
(e
”’
2-9)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0747]
(e
”’
2-10)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0748]
(e
”’
2-11)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0749]
(e
”’
2-12)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、
55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0750]
(e
”’
2-13)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0751]
(e
”’
2-14)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0752]
(e
”’
2-15)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0753]
(e
”’
2-16)与选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0754]
因此，本发明的反义低聚物可以由选自上述(e
”’
1)及(e
”’
2-1)～(e
”’
2-16)中的任1个碱基序列构成。
[0755]
优选本发明的反义低聚物为包含选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。另外，在某个方式中，本发明的反义低聚物为由选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0756]
进一步优选本发明的反义低聚物为包含选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。另外，在某个方式中，本发明的反义低聚物为由选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0757]
另外，在某个方式中，本发明的连接型反义低聚物为包含选自序列号80、82、86、92、97、98、100、102、225、228、231及232中的任1个碱基序列的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。另外，在某个方式中，本发明的连接型反义低聚物由选自序列号80、82、86、92、97、98、100、102、225、228、231及232中的任1个碱基序列构成。进一步优选本发明的连接型反义低聚物包含选自序列号102、225及228中的任1个碱基序列。另外，在某个方式中，本发明的连接型反义低聚物为由选自序列号102、225及228中的任1个碱基序列构成的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0758]
本发明的反义低聚物包含与选自区域r1～r24中的至少1个区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列。作为与区域r1～r24中包含的各区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列，可以选择选自以下组的碱基序列：由上述(e1)及(e2-1)～(e2-16)构成的组、由(e’1)及(e’2-1)～(e’2-16)构成的组、由(e”1)及(e”2-1)～(e”2-16)构成的组、或由(e
”’
1)及(e
”’
2-1)～(e
”’
2-16)构成的组。例如，作为与区域r1～r24的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列，对于区域r4～r24，可以设为与各区域的碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列，对于区域r1～r3，可以设为选自(e1)及(e2-1)～(e2-16)中的碱基序列，也可以设为r1～r3的区域中包含的碱基序列。
[0759]
本发明的反义低聚物(包含本发明的连接型反义低聚物)可以是寡核苷酸、吗啉代低聚物、或肽核酸(peptide nucleic acid：pna)低聚物(以下，分别称为“本发明的反义寡核苷酸”、“本发明的反义吗啉代低聚物”、或“本发明的反义肽核酸低聚物”)。
[0760]
本发明的反义寡核苷酸是以核苷酸作为结构单元的反义低聚物，所述核苷酸可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或修饰核苷酸中的任一种。
[0761]
修饰核苷酸是指构成核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的核酸碱基、糖部分、以及磷酸键部分的全部或一部分经过修饰的核苷酸。
[0762]
作为核酸碱基，可以列举例如：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或它们的修饰碱基。作为所述修饰碱基，可以列举例如：假尿嘧啶、3-甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶、5-烷基胞嘧啶(例如，5-甲基胞嘧啶)、5-烷基尿嘧啶(例如，5-乙基尿嘧啶)、5-卤代尿嘧啶(例如，5-溴尿嘧啶)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿嘧啶)、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、1-甲基腺嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲羰基甲基尿嘧啶、5-甲基氧基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-甲硫基-n6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸、2-硫胞嘧啶、嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、异鸟嘌呤、吲哚、咪唑、黄嘌呤等，但并不限定于此。
[0763]
作为糖部分的修饰，可以列举例如：核糖2’位的修饰及糖的其它部分的修饰。作为核糖2’位的修饰，可以列举例如：将核糖的2’位的-oh基取代为-or、-r、-r’or、-sh、-sr、-nh2、-nhr、-nr2、-n3、-cn、-f、-cl、-br、-i的修饰。这里，r表示烷基或芳基，r’表示亚烷基。
[0764]
作为糖的其它部分的修饰，可以列举例如：将核糖或脱氧核糖的4’位的o取代为s而得到的糖、将糖的2’位与4’位交联而成的糖、例如lna(锁定核酸，locked nucleic acid)或ena(2
’‑
o,4
’‑
c-亚乙基桥接的核酸，2
’‑
o,4
’‑
c-ethylene-bridged nucleic acids)等，但并不限定于此。
[0765]
作为磷酸键部分的修饰，可以列举例如：将磷酸二酯键替换为硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、膦酸烷基酯键、氨基磷酸酯键、硼烷磷酸酯键(boranophosphate bond)(enya et al:bioorganic&medicinal chemistry,2008,18,9154-9160)的修饰(例如，参考专利再公表公报第2006/129594号及第2006/038608号)。
[0766]
在本发明中，作为烷基，优选为直链状或支链状的碳原子数1～6的烷基。具体而言，可以列举例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基。该烷基可以被取代，作为所述取代基，可以列举例如：卤素、烷氧基、氰基、硝基，可以取代1～3个这些基团。
[0767]
在本说明书中，作为环烷基，优选碳原子数3～12的环烷基。具体而言，可以列举例如：环丙烷、环丁烷、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环癸基、环十二烷基。
[0768]
在本说明书中，作为卤素，可以列举：氟、氯、溴、碘。
[0769]
在本说明书中，作为烷氧基，可以列举直链状或支链状的碳原子数1～6的烷氧基，例如：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基等。特别优选为碳原子数1～3的烷氧基。
[0770]
在本说明书中，作为芳基，优选为碳原子数6～10的芳基。具体而言，可以列举例如：苯基、α-萘基、β-萘基。特别优选为苯基。该芳基可以被取代，作为所述取代基，可以列举例如：烷基、卤素、烷氧基、氰基、硝基，可以取代1～3个这些基团。
[0771]
在本说明书中，作为亚烷基，优选为直链状或支链状的碳原子数1～6的亚烷基。具体而言，可以列举例如：亚甲基、二亚甲基(ethylene)、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、2-(乙基)三亚甲基、1-(甲基)四亚甲基。
[0772]
在本说明书中，作为酰基，可以列举直链状或支链状的烷酰基或芳酰基。作为烷酰基，可以列举例如：甲酰基、乙酰基、2-甲基乙酰基、2,2-二甲基乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、2,2-二甲基丙酰基、己酰基等。作为芳酰基，可以列举例如：苯甲酰基、甲苯酰基、萘甲酰基。所述芳酰基可以在能够取代的位置发生取代，可以用烷基取代。
[0773]
本发明的反义寡核苷酸优选为以下述通式表示的基团作为结构单元的本发明的反义低聚物，其中，核糖的2’位的-oh基被甲氧基取代，磷酸键部分为硫代磷酸酯键。
[0774]
[化学式4]
[0775][0776]
(式中，base表示核酸碱基。)
[0777]
本发明的反义寡核苷酸可以用各种自动合成装置(例如，akta oligopilot plus 10/100(ge healthcare))来容易地合成，或者可以委托第三方机构(例如，promega公司或takara公司)等来制作。
[0778]
本发明的反义吗啉代低聚物为以下述通式表示的基团作为结构单元的本发明的反义低聚物。
[0779]
[化学式5]
[0780][0781]
(式中，base与上述含义相同；w表示以下任意式所示的基团。
[0782]
[化学式6]
[0783][0784]
(式中，x表示-ch2r1、-o-ch2r1、-s-ch2r1、-nr2r3或f；
[0785]
r1表示h、烷基；
[0786]
r2及r3相同或不同，表示h、烷基、环烷基或芳基；
[0787]
y1表示o、s、ch2或nr1；
[0788]
y2表示o、s或nr1；
[0789]
z表示o或s。))
[0790]
作为本发明的反义吗啉代低聚物的合成中所使用的吗啉基单体化合物的例子，可以列举表5所示的吗啉基单体化合物(a)、吗啉基单体化合物(c)、吗啉基单体化合物(t)、以及吗啉基单体化合物(g)，但并不限定于此。
[0791]
[表5]
[0792][0793]
在本发明中，吗啉代低聚物优选为以下式所示的基团作为结构单元的低聚物(二氨基磷酸酯吗啉代低聚物(以下，称为“pmo”))。
[0794]
[化学式7]
[0795][0796]
(式中，base、r2、r3与上述含义相同。)
[0797]
吗啉代低聚物例如可以按照国际公开公报第1991/009033号、或国际公开公报第2009/064471号中记载的方法来制造。特别是pmo可以按照国际公开公报第2009/064471号、或国际公开公报第2013/100190号中记载的方法来制造。
[0798]
本发明的反义肽核酸低聚物为以下述通式所示的基团作为结构单元的反义低聚物。
[0799]
[化学式8]
[0800][0801]
(式中，base与上述含义相同。)
[0802]
肽核酸低聚物例如可以按照以下文献来进行制造。
[0803]
1)p.e.nielsen,m.egholm,r.h.berg,o.buchardt，science,254,1497(1991)2)m.egholm,o.buchardt,p.e.nielsen,r.h.berg，jacs,114,1895(1992)3)k.l.dueholm,
m.egholm,c.behrens,l.christensen,h.f.hansen,t.vulpius,k.h.petersen,r.h.berg,p.e.nielsen,o.buchardt，j.org.chem.,59,5767(1994)
[0804]
4)l.christensen,r.fitzpatrick,b.gildea,k.h.petersen,h.f.hansen,t.koch,m.egholm，o.buchardt,p.e.nielsen,j.coull,r.h.berg,j.pept.sci.,1,175(1995)5)t.koch,h.f.hansen,p.andersen,t.larsen,h.g.batz,k.otteson,h.orum,j.pept.res.,49,80(1997)
[0805]
本发明的反义低聚物(包含本发明的连接型反义低聚物)可以是其医药上能够允许的盐的形态、水合物的形态、或医药上能够允许的盐的水合物的形态。
[0806]
作为本发明的组合物中包含的本发明的反义低聚物的医药上能够允许的盐的例子，可以列举：钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐；钙盐、镁盐这样的碱土金属盐；铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐；叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n
’‑
二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷基磺酸盐；苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐；乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐等。这些盐可以用公知的方法来制造。或者，本发明的反义低聚物可以为其水合物的形态。
[0807]
2.阻抑基因反义低聚物
[0808]
本发明的其它方式提供抑制外显子单一跳读(以下称为“单跳读”)的阻抑基因反义低聚物。阻抑基因反义低聚物能够通过抑制单跳读而提高反义低聚物所带来的多外显子跳读的效果。单跳读涉及不同时跳读多个外显子而仅跳读1个外显子。
[0809]
具体而言，本发明提供抑制选自人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的第45位外显子至第55位外显子中的任1个外显子单独地发生跳读的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。以下，将上述阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物总称为“本发明的阻抑基因反义低聚物”。本发明的阻抑基因反义低聚物有时分别指上述阻抑基因反义低聚物、其医药上能够允许的盐、或者其水合物。
[0810]
本发明的阻抑基因反义低聚物通过以人抗肌萎缩蛋白pre-mrna上的剪接沉默基因序列、分支部位序列、或剪接点序列的部位作为靶点来抑制剪接，从而抑制单跳读。利用本发明的阻抑基因反义低聚物，与对照相比，作为对象的外显子的单跳读的效率降低。
[0811]
例如，抑制选自第45位外显子至第55位外显子中的任1个外显子单独进行跳读的阻抑基因反义低聚物以第44位至第56位中的任意外显子的剪接沉默基因序列、或第44位至第55位中的任意内含子的剪接沉默基因序列、分支部位序列、或剪接点序列作为靶点。
[0812]
在本说明书中，剪接沉默基因序列是具有抑制识别外显子的作用的pre-mrna上的碱基序列要素。作为剪接沉默基因序列，可以列举例如：核内不均一核糖核蛋白a1(hnrnp a1)、hnrnp a2/b1、dazap1、hnrnp i、fox-1、fox-2、hnrnp h1、hnrnp h2、hnrnp h3、hnrnp l、sam68、srp40等蛋白质或蛋白质复合体的识别序列等。
[0813]
在本说明书中，剪接点是外显子与内含子的边界。根据内含子的5’末端以gu、au等
开始、内含子的3’末端以ag、ac等结束可以推定剪接点。
[0814]
在本说明书中，分支部位是在剪接反应中攻击5’剪接点进行共价键合的内含子中的序列。分支部位序列是指包含分支部位的内含子中的碱基序列。
[0815]
作为成为本发明阻抑基因反义低聚物的靶点(以下称为“阻抑基因序列”)的剪接沉默基因序列、分支部位序列、或剪接点序列，例如，可以举出以下的碱基序列(序列号370～384及390)。另外，阻抑基因序列、分支部位序列及剪接点序列的位置可以使用spliceaid(francesco piva et al.，bioinformatics，25(9)，1211-1213，2009)、spliceaid-2(francesco piva et al.，human mutation，33(1)，81-85，2012)、spliceaid-f(matteo giulietti et al.，nucleic acids res.，41，d125-d131，2012)、attract-a(girolamo giudice et al.，database(oxford)，baw035，2016)、sroogle(schraga schwartz et al.，nucleic acids res.，37，w189-w192，2009)、reg rna(hsi-yuan huang et al.，nucleic acids res.，34，w429-w434，2006)、reg rna 2.0(tzu-hao chang et al.，bmc bioinformatics，14(suppl 2)，s4，2013)、human splicing finder(francois-olivier desmet et al.，nucleic acids res.，37，9，e67，2009)、svm-bpfinder(andre corvelo et al.，plos comput biol.，6，11，e1001016，2010)等软件进行检测。
[0816]
[表6]
[0817][0818]
y：表示a或u；n表示a、g、c、u、或t。
[0819]
这里，作为剪接沉默基因序列的具体例，可以举出序列号370～382。另外，作为序列号370～382的突变体，可以列举：
[0820]
(f1)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0821]
(f2)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0822]
(f3)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且
具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0823]
(f4)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0824]
(f5)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0825]
(f6)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0826]
(f7)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0827]
(f8)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0828]
(f9)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0829]
(f10)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0830]
(f11)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0831]
(f12)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0832]
(f13)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0833]
(f14)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0834]
(f15)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0835]
(f16)与选自序列号370～382中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0836]
本发明的在某个方式中，上述剪接沉默基因序列可以为核内不均一核糖核蛋白a1(hnrnp a1)的识别序列。将人hnrnp a1的识别序列的例子示于序列号370～379。
[0837]
另外，这里，作为剪接点序列的具体例，可以举出序列号384或390。
[0838]
另外，作为序列号384或390的突变体，可以举出：
[0839]
(g1)与序列号384或390的碱基序列具有80％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
20％以内的长度的碱基序列。
[0840]
另外，这里，作为分支部位序列的具体例，可以举出序列号383。另外，作为序列号383的突变体，可以举出：
[0841]
(h1)与序列号383的碱基序列具有80％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
20％以内的长度的碱基序列。
[0842]
另外，作为上述阻抑基因序列的突变型，以下的靶点区域也包含于本发明的阻抑基因反义低聚物的靶点碱基序列。
[0843]
(i1)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0844]
(i2)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0845]
(i3)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0846]
(i4)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0847]
(i5)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0848]
(i6)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0849]
(i7)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0850]
(i8)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0851]
(i9)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0852]
(i10)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0853]
(i11)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0854]
(i12)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0855]
(i13)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0856]
(i14)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0857]
(i15)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0858]
(i16)与选自序列号370～384及390中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0859]
作为本发明的阻抑基因反义低聚物的一个方式，可以举出包含与选自序列号370～384及390所示的碱基序列及上述(i1)～(i16)所示的突变型碱基序列中的任1个碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列的阻抑基因反义低聚物。另外，在其它方式中，可以举出本发明的阻抑基因反义低聚物由与选自序列号370～384及390所示的碱基序列中的任1个碱基序列或其部分碱基序列互补的碱基序列构成。
[0860]
这里，“其部分”与本发明的反义低聚物一项中所述的定义相同。
[0861]
作为本发明的阻抑基因反义低聚物另一个方式，可以举出由以下碱基序列构成的
阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[0862]
(j1)选自序列号257～275中的任1个碱基序列、或者
[0863]
(j2)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0864]
这里，(j2)的碱基序列是(j1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0865]
(j2-1)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0866]
(j2-2)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0867]
(j2-3)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0868]
(j2-4)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0869]
(j2-5)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0870]
(j2-6)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0871]
(j2-7)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0872]
(j2-8)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0873]
(j2-9)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0874]
(j2-10)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0875]
(j2-11)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0876]
(j2-12)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0877]
(j2-13)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0878]
(j2-14)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0879]
(j2-15)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0880]
(j2-16)与选自序列号257～275中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0881]
因此，作为本发明的阻抑基因反义低聚物的另一个方式，可以举出由选自(j1)及(j2-1)～(j2-16)中的任1个碱基序列构成的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许
的盐或其水合物。
[0882]
作为本发明的阻抑基因反义低聚物的另一个方式，可以举出由以下碱基序列构成的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[0883]
(j’1)选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列、或者
[0884]
(j’2)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0885]
这里，(j’2)的碱基序列是(j’1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0886]
(j’2-1)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0887]
(j’2-2)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0888]
(j’2-3)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0889]
(j’2-4)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0890]
(j’2-5)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[0891]
(j’2-6)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[0892]
(j’2-7)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[0893]
(j’2-8)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[0894]
(j’2-9)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[0895]
(j’2-10)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[0896]
(j’2-11)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[0897]
(j’2-12)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[0898]
(j’2-13)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[0899]
(j’2-14)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[0900]
(j’2-15)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[0901]
(j’2-16)与选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列
同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[0902]
因此，作为本发明的阻抑基因反义低聚物的另一个方式，可以举出由选自(j’1)及(j’2-1)～(j’2-16)中的任1个碱基序列构成的阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。
[0903]
本发明的阻抑基因反义低聚物在生理条件下可提高多跳读效果。上述“生理条件下”是指调节成与生物体内类似的ph、盐组成、温度的条件。可以举出例如为25～40℃、优选为37℃、ph5～8、优选为ph7.4、氯化钠浓度为150mm的条件。
[0904]
本发明的阻抑基因反义低聚物是否提高了多外显子跳读的效果可以通过以下方式确认：准备(i)仅使用了本发明的反义低聚物的多外显子跳读的实验体系、以及(ii)使用了本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的多外显子跳读的实验体系，并且具备其它的条件，观察实验体系(ii)所得到的多外显子跳读效果与实验体系(i)所得到的多外显子跳读效果的差异。
[0905]
多跳读的效果的测定如本发明的反义低聚物一项的“1.反义低聚物”中所述。
[0906]
本发明的阻抑基因反义低聚物为10～60个碱基长度，可以为10～55个碱基长度、10～50个碱基长度、10～45个碱基长度、10～40个碱基长度、10～35个碱基长度、10～30个碱基长度、10～25个碱基长度、15～60个碱基长度、15～55个碱基长度、15～50个碱基长度、15～45个碱基长度、15～40个碱基长度、15～35个碱基长度、15～30个碱基长度、15～25个碱基长度、16～60个碱基长度、16～55个碱基长度、16～50个碱基长度、16～45个碱基长度、16～40个碱基长度、16～35个碱基长度、16～30个碱基长度、16～25个碱基长度、17～60个碱基长度、17～55个碱基长度、17～50个碱基长度、17～45个碱基长度、17～40个碱基长度、17～35个碱基长度、17～30个碱基长度、17～25个碱基长度、18～60个碱基长度、18～55个碱基长度、18～50个碱基长度、18～45个碱基长度、18～40个碱基长度、18～35个碱基长度、18～30个碱基长度、18～25个碱基长度、19～60个碱基长度、19～55个碱基长度、19～50个碱基长度、19～45个碱基长度、19～40个碱基长度、19～35个碱基长度、19～30个碱基长度、19～25个碱基长度、20～60个碱基长度、20～55个碱基长度、20～50个碱基长度、20～45个碱基长度、20～40个碱基长度、20～35个碱基长度、20～30个碱基长度、20～25个碱基长度、15～30个碱基长度、15～29个碱基长度、15～28个碱基长度、15～27个碱基长度、15～26个碱基长度、15～25个碱基长度、15～24个碱基长度、15～23个碱基长度、15～22个碱基长度、15～21个碱基长度、15～20个碱基长度、15～19个碱基长度、15～18个碱基长度、16～30个碱基长度、16～29个碱基长度、16～28个碱基长度、16～27个碱基长度、16～26个碱基长度、16～25个碱基长度、16～24个碱基长度、16～23个碱基长度、16～22个碱基长度、16～21个碱基长度、16～20个碱基长度、16～19个碱基长度、16～18个碱基长度、17～30个碱基长度、17～29个碱基长度、17～28个碱基长度、17～27个碱基长度、17～26个碱基长度、17～25个碱基长度、17～24个碱基长度、17～23个碱基长度、17～22个碱基长度、17～21个碱基长度、17～20个碱基长度、17～19个碱基长度、17～18个碱基长度、18～30个碱基长度、18～29个碱基长度、18～28个碱基长度、18～27个碱基长度、18～26个碱基长度、18～25个碱基长度、18～24个碱基长度、18～23个碱基长度、18～22个碱基长度、18～21个碱基长度、18～20个碱基长度、18～19个碱基长度、19～30个碱基长度、19～29个碱基长度、19～28个碱基长度、
oligopilot plus 10/100(ge healthcare))来容易地合成，或者可以委托第三方机构(例如，promega公司或takara公司)等来制作。
[0916]
在本发明的阻抑基因反义低聚物为吗啉代低聚物的情况(以下，称为“本发明的阻抑基因反义吗啉代低聚物”)下，本发明的阻抑基因反义吗啉代低聚物为以下述通式所示的基团作为结构单元的阻抑基因反义低聚物。
[0917]
[化学式10]
[0918][0919]
(式中，base、w与上述含义相同。)
[0920]
作为用于合成本发明的阻抑基因反义吗啉代低聚物的吗啉基单体化合物的例子，可以举出表7所示的吗啉基单体化合物(a)、吗啉基单体化合物(c)、吗啉基单体化合物(t)、以及吗啉基单体化合物(g)，但并不限定于此。
[0921]
[表7]
[0922][0923]
在本发明的阻抑基因反义吗啉代低聚物中，吗啉代低聚物优选为pmo。
[0924]
吗啉代低聚物例如可以按照国际公开公报第1991/009033号、或国际公开公报第2009/064471号中记载的方法来制造。特别是pmo可以按照国际公开公报第2009/064471号、或国际公开公报第2013/100190号中记载的方法来制造。
[0925]
在本发明的阻抑基因反义低聚物为肽核酸低聚物的情况(以下，称为“本发明的阻抑基因反义肽核酸低聚物”)下，本发明的阻抑基因反义肽核酸低聚物为以下述通式所示的基团作为结构单元的阻抑基因反义低聚物。
[0926]
[化学式11]
[0927][0928]
(式中，base与上述含义相同。)
[0929]
肽核酸可以如上所述地进行制造。
[0930]
本发明的阻抑基因反义低聚物可以是其医药上能够允许的盐的形态、水合物的形态、或医药上能够允许的盐的水合物的形态。
[0931]
作为本发明的阻抑基因反义低聚物的医药上能够允许的盐的例子，可以列举：钠盐、钾盐、锂盐这样的碱金属盐；钙盐、镁盐这样的碱土金属盐；铝盐、铁盐、锌盐、铜盐、镍盐、钴盐等金属盐；铵盐；叔辛胺盐、二苄胺盐、吗啉盐、葡糖胺盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、n-甲基葡糖胺盐、胍盐、二乙胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、n,n
’‑
二苄基乙二胺盐、氯普鲁卡因盐、普鲁卡因盐、二乙醇胺盐、n-苄基-苯乙胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐、三(羟甲基)氨基甲烷盐这样的有机胺盐；氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐这样的氢卤酸盐；硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐、磷酸盐等无机酸盐；甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、乙磺酸盐这样的低级烷基磺酸盐；苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐这样的芳基磺酸盐；乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐、马来酸盐等有机酸盐；甘氨酸盐、赖氨酸盐、精氨酸盐、鸟氨酸盐、谷氨酸盐、天冬氨酸盐这样的氨基酸盐等。这些盐可以用公知的方法来制造。或者，本发明的阻抑基因反义低聚物可以为其水合物的形态。
[0932]
[pmo的制造方法]
[0933]
本发明的反义低聚物及本发明的阻抑基因反义低聚物可以为pmo。作为pmo的1个方式，可以举出例如以下述通式(i)表示的化合物(以下称为pmo(i))。
[0934]
[化学式12]
[0935][0936]
(式中，各base、r2、r3与上述含义相同；
[0937]
n为1～99的范围内的任意整数，优选为18～28的范围内的任意整数。)
[0938]
pmo(i)可以按照公知的方法(例如参照国际公开公报第2009/064471号或国际公开公报第2013/100190号)进行制造。
[0939]
另外，本发明的反义低聚物或本发明的阻抑基因反义低聚物的5’末端可以是选自
下述化学式(1)～(3)中的任意基团。优选为(3)-oh。
[0940]
[化学式13]
[0941][0942]
以下，将上述(1)、(2)及(3)所示的基团分别称为“基团(1)”、“基团(2)”及“基团(3)”。
[0943]
3.医药用途
[0944]
本发明提供包含本发明的反义低聚物(也包含其医药上能够允许的盐或其水合物)的医药组合物(以下称为“本发明的医药组合物”)。本发明的医药组合物可以进一步包含本发明的阻抑基因反义低聚物(也包含其医药上能够允许的盐或其水合物)和/或医药上能够允许的载体。
[0945]
另外，本发明提供包含本发明的反义低聚物(也包含其医药上能够允许的盐或其水合物)和本发明的阻抑基因反义低聚物(也包含其医药上能够允许的盐或其水合物)的医药组合物(以下称为“本发明的组合医药”)。
[0946]
在本发明的医药组合物包含本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的情况下，也包含这些低聚物的任意组合。另外，在本发明的组合医药中，也包含本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的任意组合。本发明的医药组合物或本发明的组合医药所包含的反义低聚物只要是本发明的反义低聚物即可，可以是任意反义低聚物，没有特别限定，优选为由选自序列号1～111、113～177、179、180、182、183、185～193、195～198、200～223及225～232中的任1个碱基序列构成的反义低聚物，更优选为由选自序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27、28、29、35、38、39、40、41、43、45、46、47、50、51、52、53、54、55、58、59、63、64、65、66、67、68、74、75、76、77、78、80、82、86、92、97、98、100、102、113、119、121、122、124、125、126、128、130、131、132、139、142、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、225、228、231及232中的任1个碱基序列构成的反义低聚物，进一步优选为由选自序列号1、5、11、27、28、35、40、41、43、45、46、47、50、51、52、54、55、59、63、64、65、66、68、74、75、76、77、78、102、113、119、128、131、132、139、142、161、162、163、225及228中的任1个碱基序列构成的反义低聚物。
[0947]
另外，本发明的医药组合物或本发明的组合医药所包含的阻抑基因反义低聚物只要是本发明的阻抑基因反义低聚物即可，可以是任意反义低聚物，没有特别限定，优选为由选自序列号257～275中的任1个碱基序列构成的阻抑基因反义低聚物，更优选为序列号1、5、6、7、8、10、11、14、26、27，更优选为由选自序列号260、261及263中的任1个碱基序列构成的阻抑基因反义低聚物。
[0948]
在本发明的医药组合物包含本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚
物的情况下，优选包含上述的本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合。另外，本发明的组合医药优选包含上述的本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合。
[0949]
在本发明的组合医药中，作为本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合的例子，可以列举以下的组合。
[0950]
(k1)反义低聚物为由序列号75构成的低聚物、阻抑基因反义低聚物为由序列号260构成的低聚物的组合、
[0951]
(k2)反义低聚物为由序列号75构成的低聚物、阻抑基因反义低聚物为由序列号261构成的低聚物的组合、
[0952]
(k3)反义低聚物为由序列号75构成的低聚物、阻抑基因反义低聚物为由序列号263构成的低聚物的组合、
[0953]
(k4)反义低聚物为由序列号65构成的低聚物、阻抑基因反义低聚物为由序列号260构成的低聚物的组合、
[0954]
(k5)反义低聚物为由序列号65构成的低聚物、阻抑基因反义低聚物为由序列号261构成的低聚物的组合、
[0955]
(k6)反义低聚物为由序列号65构成的低聚物、阻抑基因反义低聚物为由序列号263构成的低聚物的组合、
[0956]
(k7)反义低聚物为由序列号55和59构成的低聚物的组合、阻抑基因反义低聚物为由序列号260构成的低聚物的组合、
[0957]
(k8)反义低聚物为由序列号55和59构成的低聚物的组合、阻抑基因反义低聚物为由序列号261构成的低聚物的组合、
[0958]
(k9)反义低聚物为由序列号55和59构成的低聚物的组合、阻抑基因反义低聚物为由序列号263构成的低聚物的组合。
[0959]
本发明的医药组合物可以包含上述组合的本发明的反义低聚物及本发明的阻抑基因反义低聚物。
[0960]
本发明的医药组合物及本发明的组合医药可以分别用于例如杜兴氏肌营养不良症、贝克(becker)肌营养不良症、肢带型肌营养不良症(lgmd)、先天性肌营养不良症、埃默里-德赖弗斯(emery-dreifuss)型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症、眼咽型肌营养不良症、伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(cadasil)、alport综合征等的治疗。另外，本发明的组合医药及本发明的医药组合物可以分别对人类患者、特别是肌营养不良症的人类患者给药。作为本发明的组合医药或本发明的医药组合物的给药对象的患者可以是在抗肌萎缩蛋白基因中具有成为选自外显子45～55中的2个以上外显子的跳读对象的突变的人类患者。
[0961]
在本发明的一个方式中提供一种肌营养不良症的治疗方法，该方法包括：对肌营养不良症患者给药本发明的反义低聚物、或本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合的步骤。
[0962]
在本发明的其它方式中提供一种肌营养不良症的治疗方法，该方法包括：对肌营养不良症患者给药本发明的医药组合物或本发明的组合医药的步骤。
[0963]
上述治疗方法可以伴随进行人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第
55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子的跳读。在上述治疗方法中，上述肌营养不良症患者可以是在抗肌萎缩蛋白基因具有成为外显子45～55跳读的对象的突变的患者。上述患者可以是人，可以是在抗肌萎缩蛋白基因具有成为外显子45～55跳读的对象的突变的人类患者。
[0964]
本发明还提供本发明的反义低聚物、或者本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合、或本发明的医药组合物、或者本发明的组合医药在肌营养不良症治疗用医药品的制造中的用途。
[0965]
此外，本发明提供用于肌营养不良症治疗的本发明的反义低聚物、或者本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合、或本发明的医药组合物、或者本发明的组合医药。上述治疗可以伴随进行人抗肌萎缩蛋白pre-mrna中选自第45位外显子至第55位外显子的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子的跳读。在上述治疗中，上述肌营养不良症患者可以是在抗肌萎缩蛋白基因具有成为外显子45～55跳读对象的突变的患者。上述患者可以为人，可以为抗肌萎缩蛋白基因中具有成为外显子45～55跳读对象的突变的人类患者。
[0966]
本发明的反义低聚物、或者本发明的反义低聚物和本发明的阻抑基因反义低聚物的组合、或本发明的医药组合物、或者本发明的组合医药的给药方式只要是医药上能够允许的给药方式即可，没有特别限制，可以根据治疗方法来选择，从传递至肌组织的容易性的观点考虑，优选静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、口服给药、间质给药(interstitial administration)、经皮给药等。另外，作为本发明的组合物可采用的剂型，没有特别限制，可以列举例如：各种注射剂、口服剂、输液剂、吸入剂、软膏剂、洗剂等。
[0967]
在对肌营养不良症患者给药本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物的情况下，本发明的组合物优选包含促进该低聚物传递至肌组织的载体。这样的载体只要在医药上能够允许即可，没有特别限制，作为其例子，可以列举：阳离子性脂质体、阳离子性聚合物等阳离子性载体、或者利用了病毒包膜的载体。作为阳离子性脂质体，可以列举例如：以2-o-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1,3-o-二油酸甘油酯和磷脂作为必需结构成分而形成的脂质体(以下称为“脂质体a”)、oligofectamine(注册商标)(invitrogen公司制造)、lipofectin(注册商标)(invitrogen公司制造)、lipofectamine(注册商标)(invitrogen公司制造)、lipofectamine 2000(注册商标)(invitrogen公司制造)、dmrie-c(注册商标)(invitrogen公司制造)、genesilencer(注册商标)(gene therapy systems公司制造)、transmessenger(注册商标)(qiagen公司制造)、transit tko(注册商标)(mirus公司制造)、nucleofector ii(lonza)。其中，优选脂质体a。作为阳离子性聚合物，可以列举例如：jetsi(注册商标)(qbiogene公司制造)、jet-pei(注册商标)(聚乙烯亚胺、qbiogene公司制造)。作为利用了病毒包膜的载体，可以列举例如：genomeone(注册商标)(hvj-e脂质体、石原产业株式会社制造)。或者可以使用日本专利2924179号中记载的医药器件、专利再公表公报第2006/129594号(jp wo2006/129594)及专利再公表公报第2008/096690号(jp wo2008/096690)中记载的阳离子性载体。
[0968]
本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药所包含的本发明的反义低聚物的浓度根据载体的种类等而不同，在0.1nm～100μm的范围内是适当的，优选为1nm～10μm的范围内，更优选为10nm～1μm的范围内。另外，本发明的组合物中包含的本发明的反义低聚物与
载体的重量比(载体/本发明的反义低聚物)根据该低聚物的性质及该载体的种类等而不同，在0.1～100的范围内是适当的，优选为1～50的范围内，更优选为10～20的范围内。
[0969]
本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药中包含的本发明的阻抑基因反义低聚物的浓度根据载体的种类等而不同，在0.1nm～100μm的范围内是适当的，优选为1nm～10μm的范围内，更优选为10nm～1μm的范围内。另外，本发明的组合物中包含的本发明的阻抑基因反义低聚物与载体的重量比(载体/本发明的阻抑基因反义低聚物)根据该低聚物的性质及该载体的种类等而不同，在0.1～100的范围内是适当的，优选为1～50的范围内，更优选为10～20的范围内。
[0970]
本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药可以为水溶液的形态。在该情况下，本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药可以以2.5～500mg/ml、5～450mg/ml、10～400mg/ml、15～350mg/ml、20～300mg/ml、20～250mg/ml、20～200mg/ml、20～150mg/ml、20～100mg/ml、20～50mg/ml、20～40mg/ml、20～30mg/ml、23～27mg/ml、24～26mg/ml、或25mg/ml的浓度包含本发明的反义低聚物。或者，本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药可以以10～100mg/ml、15～95mg/ml、20～80mg/ml、25～75mg/ml、30～70mg/ml、35～65mg/ml、40～60mg/ml、45～55mg/ml、47～53mg/ml、48～52mg/ml、49～51mg/ml、或50mg/ml的浓度包含本发明的反义低聚物。
[0971]
另外，在本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药为水溶液的形态的情况下，可以以2.5～500mg/ml、5～450mg/ml、10～400mg/ml、15～350mg/ml、20～300mg/ml、20～250mg/ml、20～200mg/ml、20～150mg/ml、20～100mg/ml、20～50mg/ml、20～40mg/ml、20～30mg/ml、23～27mg/ml、24～26mg/ml、或25mg/ml的浓度包含本发明的阻抑基因低聚物。或者，本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药可以以10～100mg/ml、15～95mg/ml、20～80mg/ml、25～75mg/ml、30～70mg/ml、35～65mg/ml、40～60mg/ml、45～55mg/ml、47～53mg/ml、48～52mg/ml、49～51mg/ml、或50mg/ml的浓度包含本发明的阻抑基因低聚物。
[0972]
本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药可以为干燥形态。在该情况下，为了制备水溶液形态的本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药，例如，可以将125mg或250mg的干燥形态的本发明的反义低聚物与0.5ml～100ml的水混合(相当于1.25mg/ml～250mg/ml或2.5mg/ml～500mg/ml的本发明的反义低聚物浓度)、优选与1ml～50ml的水混合(相当于2.5mg/ml～125mg/ml或5mg/ml～250mg/ml的本发明的反义低聚物浓度)、更优选与5ml～10ml的水混合(相当于12.5mg/ml～25mg/ml或25mg/ml～50mg/ml的本发明的反义低聚物浓度)而使用。
[0973]
另外，在本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药为干燥形态的情况下，为了制备水溶液形态的本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药，例如，可以将125mg或250mg的干燥形态的本发明的阻抑基因低聚物与0.5ml～100ml的水混合(相当于1.25mg/ml～250mg/ml或2.5mg/ml～500mg/ml的本发明的阻抑基因低聚物浓度)、优选与1ml～50ml的水混合(相当于2.5mg/ml～125mg/ml或5mg/ml～250mg/ml的本发明的阻抑基因低聚物浓度)、更优选与5ml～10ml的水混合(相当于12.5mg/ml～25mg/ml或25mg/ml～50mg/ml的本发明的阻抑基因低聚物浓度)而使用。
[0974]
本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药所包含的本发明的反义低聚物及本发明的阻抑基因低聚物的上述浓度可以是本发明的反义低聚物及本发明的阻抑基因低聚
物各自的浓度，也可以是将本发明的反义低聚物及本发明的阻抑基因低聚物合计的浓度。
[0975]
在本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药中，除本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物和上述的载体以外，还可以任意配合医药上能够允许的添加剂。作为所述添加剂，可以列举例如：乳化助剂(例如，碳原子数6～22的脂肪酸、其在医药上能够允许的盐、白蛋白、右旋糖酐)、稳定剂(例如，胆固醇、磷脂酸、甘露醇、山梨糖醇)、等渗剂(例如，氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、ph调节剂(例如，盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺)。这些添加剂可以使用一种或两种以上。本发明的组合物中该添加剂的含量为90重量％以下是适当的，优选为70重量％以下，更优选为50重量％以下。
[0976]
本发明的组合物和/或本发明的组合医药可以通过在载体的分散液中加入本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物并适当搅拌来制备。另外，添加剂可以在本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物添加前的适当的工序中添加，也可以在添加后的适当的工序中添加。作为添加本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物时可以使用的水性溶剂，只要是医药上能够允许的溶剂即可，没有特别限制，可以列举例如：注射用水、注射用蒸馏水、生理盐水等电解质液、葡萄糖液、麦芽糖液等糖液。另外，对于上述情况下的ph及温度等条件而言，本领域技术人员可以适当选择。
[0977]
本发明的组合物和/或本发明的组合医药可以制成例如液体制剂、其冷冻干燥制剂。该冷冻干燥制剂可以按照通常方法对具有液体制剂形态的本发明的组合物进行冷冻干燥处理来制备。例如，可以在对具有液体制剂形态的本发明的组合物进行适当灭菌之后，将给定量分配于管型瓶中，在约-40～-20℃范围内的条件下进行2小时左右的预冷冻，在约0～10℃范围内、减压下进行一次干燥，接着在约15～25℃范围内、减压下进行二次干燥，进行冷冻干燥。然后，通常将管型瓶内部置换为氮气并压盖，可以得到本发明的组合物的冷冻干燥制剂。
[0978]
本发明的组合物和/或本发明的组合医药的冷冻干燥制剂通常可以通过添加任意适当的溶液(再溶解液)而再溶解来使用。作为这样的再溶解液，可以列举：注射用水、生理盐水、其它普通输液。该再溶解液的液量根据用途等而不同，没有特别限制，为冷冻干燥前的液量的0.5～2倍量或500ml以下是适当的。
[0979]
作为给药本发明的医药组合物和/或本发明的组合医药时的用量，优选在考虑了所含有的本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物的种类、剂型、年龄、体重等患者的状态、给药途径、疾病性质与程度的基础上进行调节，作为对于成人的本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物的量，可以在1次给药中以平均每1kg体重0.1mg～1g、优选以平均每1kg体重1mg～100mg、进一步优选以平均每1kg体重1mg～90mg、更优选以平均每1kg体重1mg～80mg进行给药。给药频率可以在1～3天1次、1周1次、或2～3周1次。该数值有时根据作为靶点的疾病种类、给药方式、靶分子而有所不同。因此，根据情况，有时在此以下的用量或给药频率就足够了，反之，有时需要设为在此以上的用量或给药频率。
[0980]
作为本发明的组合物和/或本发明的组合医药的其它方式，可以列举：包含能够表达本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物的载体和上述载体的医药组合物。所述表达载体可以是能够表达多个本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义
低聚物的载体。可以与含有本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物的本发明的组合物同样地在该组合物中添加医药上能够允许的添加剂。该组合物中含有的表达载体的浓度根据载体的种类等而不同，在0.1nm～100μm的范围内是适当的，优选为1nm～10μm的范围内，更优选为10nm～1μm的范围内。该组合物中含有的表达载体与载体的重量比(载体/表达载体)根据表达载体的性质、载体的种类等而不同，在0.1～100的范围内是适当的，优选为1～50的范围内，更优选为10～20的范围内。另外，该组合物中含有的载体的含量与含有本发明的反义低聚物和/或本发明的阻抑基因反义低聚物的本发明的组合物的情况相同，关于其制备方法等也与本发明的组合物的情况相同。
[0981]
4.人抗肌萎缩蛋白以外的目标pre-mrna
[0982]
本说明书对于目标pre-mrna为人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的情况进行了具体说明，但并不限定于此，在人抗肌萎缩蛋白以外的目标pre-mrna的情况下，对于反义低聚物及阻抑基因反义低聚物的设计、制造、使用方法，也可以按照本说明书的公开或本领域的公知的技术及方法来实施。本领域技术人员基于本说明书的公开或本领域的公知的技术及方法，也可以相对于人抗肌萎缩蛋白以外的目标pre-mrna设计、制造及使用其反义低聚物或阻抑基因反义低聚物。同样地，本领域技术人员基于本说明书的公开或本领域的公知的技术及方法，也可以使用反义低聚物进行目标pre-mrna的多外显子跳读，并且使用阻抑基因反义低聚物提高多外显子跳读的效率。
[0983]
在本说明书中，作为目标pre-mrna的例子，可以举出人γ-肌聚糖(sgcg)、人notch3、以及人抗肌萎缩蛋白的pre-mrna。在本发明的某个方式中，目标pre-mrna可以是人抗肌萎缩蛋白pre-mrna。另外，在本发明的其它方式中，目标pre-mrna可以是sgcg或人notch3。
[0984]
人sgcg及人notch3的目标pre-mrna的多外显子跳读所使用的反义低聚物的靶点区域的碱基序列如下所述。
[0985]
将本发明中的人sgcg的pre-mrna的靶点区域以序列号283及284示于以下。
[0986]
[表8]
[0987][0988]
将本发明的人notch3的pre-mrna的靶点区域示于以下。
[0989]
[表9]
[0990][0991]
作为对人sgcg的pre-mrna诱导多外显子跳读的人sgcg用反义低聚物，例如可以举出将以内含子3的3’末端作为基点的-400～+50碱基范围作为靶点的反义低聚物，作为具体例，可以举出由如下碱基序列构成的人sgcg用反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[0992]
(l1)选自序列号287～308中的任1个碱基序列、或者
[0993]
(l2)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[0994]
这里，(l2)的碱基序列是(l1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[0995]
(l2-1)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[0996]
(l2-2)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[0997]
(l2-3)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[0998]
(l2-4)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[0999]
(l2-5)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[1000]
(l2-6)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[1001]
(l2-7)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[1002]
(l2-8)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[1003]
(l2-9)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[1004]
(l2-10)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[1005]
(l2-11)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[1006]
(l2-12)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[1007]
(l2-13)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[1008]
(l2-14)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[1009]
(l2-15)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[1010]
(l2-16)与选自序列号287～308中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[1011]
因此，作为人sgcg用反义低聚物的另一个方式，可以举出由选自(l1)及(l2-1)～(l2-16)中的任1个碱基序列构成的人sgcg用反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。人sgcg用反义低聚物包含于本发明。
[1012]
作为人sgcg的pre-mrna的单跳读的阻抑基因反义低聚物(人sgcg用阻抑基因反义低聚物)，可以举出例如以内含子4的剪接沉默基因序列或单跳读的剪接点作为靶点的反义低聚物，作为具体例，可以举出由如下碱基序列构成的人sgcg用阻抑基因反义低聚物、或者
其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[1013]
(m1)选自序列号331～335中的任1个碱基序列、或者
[1014]
(m2)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[1015]
这里，(m2)的碱基序列是(m1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[1016]
(m2-1)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[1017]
(m2-2)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[1018]
(m2-3)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[1019]
(m2-4)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[1020]
(m2-5)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[1021]
(m2-6)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[1022]
(m2-7)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[1023]
(m2-8)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[1024]
(m2-9)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[1025]
(m2-10)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[1026]
(m2-11)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[1027]
(m2-12)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[1028]
(m2-13)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[1029]
(m2-14)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[1030]
(m2-15)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[1031]
(m2-16)与选自序列号331～335中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[1032]
因此，作为人sgcg用阻抑基因反义低聚物的另一个方式，可以举出由选自(m1)及(m2-1)～(m2-16)中的任1个碱基序列构成的人sgcg用阻抑基因反义低聚物、或者其医药上
能够允许的盐或其水合物。人sgcg用阻抑基因反义低聚物包含于本发明。人sgcg用阻抑基因反义低聚物包含于本发明。人sgcg用阻抑基因反义低聚物可以使sgcg的pre-mrna的多跳读效率增加。
[1033]
作为对于人notch3的pre-mrna诱导多外显子跳读的人notch3用反义低聚物，例如可以举出将以内含子3的受体附近的区域、即内含子3的3’末端为基点的-400～+50碱基范围作为靶点的反义低聚物，例如，可以举出由如下碱基序列构成的人notch3用反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[1034]
(n1)选自序列号309～330中的任1个碱基序列、或者
[1035]
(n2)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[1036]
这里，(n2)的碱基序列是(n1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[1037]
(n2-1)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[1038]
(n2-2)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[1039]
(n2-3)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[1040]
(n2-4)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[1041]
(n2-5)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[1042]
(n2-6)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[1043]
(n2-7)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[1044]
(n2-8)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[1045]
(n2-9)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[1046]
(n2-10)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[1047]
(n2-11)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[1048]
(n2-12)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[1049]
(n2-13)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[1050]
(n2-14)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[1051]
(n2-15)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[1052]
(n2-16)与选自序列号309～330中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[1053]
因此，作为人notch3用反义低聚物的另一个方式，可以举出由选自(n1)及(n2-1)～(n2-16)中的任1个碱基序列构成的人notch3用反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。人notch3用反义低聚物包含于本发明。
[1054]
作为人notch3的pre-mrna的单跳读的阻抑基因反义低聚物(人notch3用阻抑基因反义低聚物)，例如，可以举出以内含子4的剪接沉默基因序列或单跳读的剪接点作为靶点的反义低聚物，作为具体例，可以举出由如下碱基序列构成的人notch3用阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物，所述碱基序列为：
[1055]
(o1)选自序列号336～340中的任1个碱基序列、或者
[1056]
(o2)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列。
[1057]
这里，(o2)的碱基序列是(o1)的碱基序列的突变型，作为突变型，可以列举：
[1058]
(o2-1)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有85％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
15％以内的长度的碱基序列、
[1059]
(o2-2)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有86％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
14％以内的长度的碱基序列、
[1060]
(o2-3)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有87％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
13％以内的长度的碱基序列、
[1061]
(o2-4)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有88％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
12％以内的长度的碱基序列、
[1062]
(o2-5)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有89％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
11％以内的长度的碱基序列、
[1063]
(o2-6)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有90％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
10％以内的长度的碱基序列、
[1064]
(o2-7)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有91％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
9％以内的长度的碱基序列、
[1065]
(o2-8)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有92％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
8％以内的长度的碱基序列、
[1066]
(o2-9)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有93％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
7％以内的长度的碱基序列、
[1067]
(o2-10)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有94％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
6％以内的长度的碱基序列、
[1068]
(o2-11)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有95％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
5％以内的长度的碱基序列、
[1069]
(o2-12)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有96％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
4％以内的长度的碱基序列、
[1070]
(o2-13)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有97％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
3％以内的长度的碱基序列、
[1071]
(o2-14)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有98％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
2％以内的长度的碱基序列、
[1072]
(o2-15)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有99％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
1％以内的长度的碱基序列、以及
[1073]
(o2-16)与选自序列号336～340中的任1个碱基序列具有99.5％以上的序列同一性、且具有与上述选择的任1个碱基序列的长度相比为
±
0.5％以内的长度的碱基序列。
[1074]
因此，作为人notch3用阻抑基因反义低聚物的另一个方式，可以举出由选自(o1)及(o2-1)～(o2-16)中的任1个碱基序列构成的人notch3用阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物。人notch3用阻抑基因反义低聚物包含于本发明。人notch3用阻抑基因反义低聚物可以使notch3的pre-mrna的多跳读效率增加。
[1075]
将序列号287～340的碱基序列示于以下。
[1076]
[1077][1078]
5.使多外显子跳读的效率增加的方法
[1079]
本发明提供一种使下述2个以上在编号顺序上连续的外显子发生跳读的效率增加的方法(以下称为“本发明的增大方法”)，该方法包括：在从目标pre-mrna跳读2个以上在编号顺序上连续的外显子时，抑制上述目标pre-mrna的剪接沉默基因序列、剪接点序列、或分支部位序列的步骤。
[1080]
在本发明的增大方法中，上述目标pre-mrna的2个以上在编号顺序上连续的外显子的跳读可以使用诱导多外显子跳读的反义低聚物、例如本发明的反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物来进行。
[1081]
本发明的增大方法通过抑制目标pre-mrna上的剪接沉默基因序列、剪接点序列或分支部位序列来抑制单跳读，可以使多外显子跳读的效率增加。本发明的增大方法包括抑制这些目标pre-mrna上的剪接沉默基因序列、剪接点序列或分支部位序列的功能，更具体而言，包括通过用阻抑基因反义低聚物靶向这些序列而抑制外显子的单跳读。
[1082]
另外，在本发明的增大方法中，抑制上述剪接沉默基因序列、剪接点或分支部位序列的步骤可以使用本发明的阻抑基因反义低聚物等阻抑基因反义低聚物、或者其医药上能够允许的盐或其水合物来进行。
[1083]
在本发明的增大方法中，可以在抑制剪接沉默基因序列、分支部位序列及剪接点序列的步骤中使用包含与目标pre-mrna上的剪接沉默基因序列、分支部位序列及剪接点序列互补的碱基序列的低聚物作为阻抑基因反义低聚物。
[1084]
剪接沉默基因序列、分支部位序列及剪接点序列如上所述。在本发明的增大方法的某个方式中，上述剪接沉默基因序列可以是核内不均一核糖核蛋白a1(hnrnp a1)的识别序列。将人hnrnp a1的识别序列的例子示于序列号370～379。
[1085]
在本发明的增大方法中“使用”上述反义低聚物及上述阻抑基因反义低聚物是指，使上述反义低聚物及上述阻抑基因反义低聚物进入表达目标pre-mrna的细胞，并使目标pre-mrna发生外显子跳读。作为使上述反义低聚物及上述阻抑基因反义低聚物进入上述细胞的方法，可以列举使用了阳离子性脂质体、阳离子性聚合物等阳离子性载体、或者利用了病毒包膜的载体的导入方法。作为阳离子性脂质体，可以列举例如：以2-o-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1,3-o-二油酸甘油酯和磷脂作为必需结构成分而形成的脂质体(以下称为“脂质体a”)、oligofectamine(注册商标)(invitrogen公司制造)、lipofectin(注册商标)(invitrogen公司制造)、lipofectamine(注册商标)(invitrogen公司制造)、lipofectamine 2000(注册商标)(invitrogen公司制造)、dmrie-c(注册商标)(invitrogen公司制造)、genesilencer(注册商标)(gene therapy systems公司制造)、transmessenger(注册商标)(qiagen公司制造)、transit tko(注册商标)(mirus公司制造)、nucleofector ii(lonza)。其中，优选脂质体a。作为阳离子性聚合物，可以列举例如：jetsi(注册商标)
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐11.5g。接着，加入氨基聚苯乙烯树脂：primer support 200 amino(ge healthcare japan公司制造、17-5214-97)25.0g、三乙胺8.5ml，在室温下振荡4天。在反应后，过滤取出树脂。用吡啶、甲醇、二氯甲烷依次清洗得到的树脂，进行减压干燥。向得到的树脂加入四氢呋喃(脱水)200ml、乙酸酐15ml、2,6-二甲基吡啶15ml，在室温下振荡2小时。过滤取出树脂，用吡啶、甲醇、二氯甲烷依次清洗，进行减压干燥，得到了26.7g的目标产物。
[1097]
对于该目标产物的负载量而言，通过使用公知的方法测定409nm下的uv吸光度而确定了平均每1g树脂的三苯甲基摩尔量。树脂的负载量为129.2μmol/g。
[1098]
uv测定条件
[1099]
设备：u-2910(株式会社日立制作所)
[1100]
溶剂：甲磺酸
[1101]
波长：409nm
[1102]
ε值：45000
[1103]
担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{[(2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物2)的制造
[1104]
按照与化合物1相同的方法制造了标题化合物。其中，在本工序中使用了1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-5-甲基嘧啶-2,4(1h,3h)-二酮来代替化合物1的制造工序1中使用的n-{1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺。
[1105]
对于该目标产物的负载量而言，通过使用公知的方法测定409nm下的uv吸光度而确定了平均每1g树脂的三苯甲基摩尔量。树脂的负载量为164.0μmol/g。
[1106]
担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{[(2s,6r)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物3)的制造
[1107]
按照与化合物1相同的方法制造了标题化合物。其中，在本工序中使用了n-{9-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]嘌呤-6-基}苯甲酰胺来代替化合物1的制造工序1中使用的n-{1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺。
[1108]
对于该目标产物的负载量而言，通过使用公知的方法测定409nm下的uv吸光度而确定了平均每1g树脂的三苯甲基摩尔量。树脂的负载量为185.7μmol/g。
[1109]
担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{{(2s,6r)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙酰基)氨基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基}甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物4)的制造
[1110]
按照与化合物1相同的方法制造了标题化合物。其中，在本工序中使用了n-{6-(2-氰基乙氧基)-9-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]嘌呤-2-基}-2-苯氧基乙酰胺来代替化合物1的制造工序1中使用的n-{1-[(2r,6s)-6-(羟甲基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]-2-氧代-1,2-二氢嘧啶-4-基}苯甲酰胺。
[1111]
对于该目标产物的负载量而言，通过使用公知的方法测定409nm下的uv吸光度而确定了平均每1g树脂的三苯甲基摩尔量。树脂的负载量为164.8μmol/g。
[1112]
以人抗肌萎缩蛋白基因的内含子的供体附近或受体附近的区域作为靶点的反义pmo的制造
[1113]
依据以下的记载合成了以表10所示的人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的内含子44～55的供体附近或受体附近的区域作为靶点的、具有表11的pmo no.1～232的碱基序列(序列号1～232)的pmo。pmo的5’末端为下述基团(3)。用注射用水(株式会社大塚制药工场制造)溶解合成的pmo。
[1114]
[化学式14]
[1115][1116]
需要说明的是，本发明的反义低聚物或本发明的阻抑基因反义低聚物的靶点碱基序列以“ha1_b
1-c
1”、“ha2_b
2-c2_ha3_b
3-c
3”、或“ha4_b
4-c4_ha5_b
5-c5_ha6_b
6-c
6”的方式记载。
[1117]“ha1_b
1-c
1”是本说明书中的第一方式的反义低聚物的靶点碱基序列。“ha
1”表示人抗肌萎缩蛋白基因的第a位外显子，“b
1”表示靶点碱基序列的5’末端的碱基，“c
1”表示靶点碱基序列的3’末端的碱基。“ha1_b
1-c
1”可以在其3’末端具有添加的1个碱基，这样的靶点碱基序列以“ha1_b
1-c1_n”表示(“n”表示任意的碱基)。
[1118]
在“b
1”、“c
1”为正的整数的情况下，“b
1”、“c
1”分别表示在将第a位外显子的5’末端碱基作为第1位的碱基时其为3’末端方向的第几位的碱基。另一方面，在“b
1”、“c
1”为负的整数的情况下，“b
1”、“c
1”分别表示在将第(a-1)位内含子的3’末端的碱基作为第-1位时其为5’末端方向的第几位的碱基。
[1119]
例如，“h45_(-10)-15”的情况是指，该靶点碱基序列的5’末端为第44位内含子的3’末端至5’末端方向上第10位的碱基、且该靶点碱基序列的3’末端为第45位外显子的5’末端至3’末端方向上第15位的碱基的碱基序列。
[1120]“ha2_b
2-c2_ha3_b
3-c
3”是本说明书中的第二方式的反义低聚物的靶点碱基序列。作为“ha2_b
2-c2_ha3_b
3-c
3”的第1部分的“ha2_b
2-c
2”是指构成该反义低聚物的3’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列，作为第2部分的“ha3_b
3-c
3”是指构成该反义低聚物的5’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列。“ha3_b
3-c
3”可以在其3’末端具有添加的1个碱基，这样的靶点碱基序列以“ha2_b
2-c2_ha3_b
3-c3_n”表示(“n”表示任意的碱基)。各“ha2_b
2-c
2”及“ha3_b3_-c
3”与上述“ha1_b
1-c
1”的表示方法相同。
[1121]
需要说明的是，在“ha
2”与“ha
3”相同的情况下，可以省略“_ha
3”部分。
[1122]
例如，“h45_(-5)-5_25-35”或“h45_(-5)-5_h45_25-35”的情况是指，构成反义低聚物的3’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列为“h45_(-5)-5”、且5’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列为“h45_25-35”的碱基序列。
[1123]“ha4_b
4-c4_ha5_b
5-c5_ha6_b
6-c
6”是本说明书中的第三方式的反义低聚物的靶点碱基序列。“ha4_b
4-c4_ha5_b
5-c5_ha6_b
6-c
6”的作为第1部分的“ha4_b
4-c
4”是指构成该反义低聚物的3’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列，作为第2部分“ha5_b
5-c
5”是指构成该反义低聚物的中间部单元低聚物的靶点碱基序列，作为第3部分的“ha6_b
6-c
6”是指构成该反义低聚物的5’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列。“ha6_b
6-c
6”可以在其3’末端具有添加的1个碱基，这样的靶点碱基序列以“ha4_b
4-c4_ha5_b
5-c5_ha6_b
6-c6_n”表示“(n”表示任意的碱
基)。各“ha4_b
4-c
4”、“ha5_b5_-c
5”及“ha6_b6_-c
6”与上述“ha1_b
1-c
1”的表示方法相同。
[1124]
需要说明的是，在“ha
4”与“ha
5”及“ha
6”相同的情况下，可以省略“_ha
5”及“_ha
6”部分。
[1125]
例如，在“h45_(-5)-5_25-35_60-70”或“h45_(-5)-5_h45_25-35_h45_60-70”的情况是指，构成反义低聚物的3’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列为“h45_(-5)-5”、中间部分单元低聚物的靶点碱基序列为“h45_25-35”、且5’末端侧单元低聚物的靶点碱基序列为“h45_60-70”的碱基序列。
[1126]
表10 人抗肌萎缩蛋白pre-mrna的靶点区域
[1127]
[1128][1129]
[表11]
[1130]
[1131]
[1132]
[1133]
[1134]
[1135][1136]
在表11的pmo中，
[1137]
以r2作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.22～71、91～93、98～99，在另外的其它方式中可以举出pmo no.22～59、91～93、98～99；
[1138]
以r4作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.150～163，在另外的其它方式中可以举出pmo no.150～160；
[1139]
以r6作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.171～177，在另外的其它方式中可以举出pmo no.171～176；
[1140]
以r8作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.180；r10作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.183；r12作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.186～191；
[1141]
以r16作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.197、198，在另外的其它方式中可以举出pmo no.197；
[1142]
以r18作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.201～206；
[1143]
以r22作为靶点区域，在其它方式中可以举出pmo no.217～223，在另外的其它方式中可以举出pmo no.217～222；
[1144]
以r24作为靶点，在其它方式中可以举出pmo no.128～142。
[1145]
将与5’末端碱基相对应的、担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{[(2s,6r)-6-(4-苯甲酰氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物1)、担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{[(2s,6r)-6-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物2)、担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{[(2s,6r)-6-(6-苯甲酰氨基嘌呤-9-基)-4-三苯甲基吗啉-2-基]甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物3)、或担载于氨基聚苯乙烯树脂的4-{{(2s,6r)-6-{6-(2-氰基乙氧基)-2-[(2-苯氧基乙酰基)氨基]嘌呤-9-基}-4-三苯甲基吗啉-2-基}甲氧基}-4-氧代丁酸(化合物4)0.2g填充于带有过滤器的柱中，使用核酸合成装置(akta oligopilot 10 plus)开始表12所示的合成循环。在成为表11中记载的各pmo的碱基序列的各偶联循环中添加了期望的吗啉基单体化合物(参照表12)。
[1146]
[表12]
[1147][1148]
(注)仅在3’末端乙酰化的情况下，在最终循环后再次仅实施了
[1149]
工序1、2、7、8.
[1150]
需要说明的是，作为解封闭(deblocking solution)溶液，使用了含有3％(w/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液。作为中和/清洗溶液，使用了以n，n-二异丙基乙胺为10％(v/v)、且四氢呋喃为5％(v/v)的方式用含有35％(v/v)乙腈的二氯甲烷溶液进行溶解而得到的溶液。作为偶联溶液a，使用了以吗啉基单体化合物为0.10m的方式用四氢呋喃溶解而得到的溶液。作为偶联溶液b，使用了以n，n-二异丙基乙胺为20％(v/v)、且四氢呋喃为10％(v/v)的方式用乙腈溶解而得到的溶液。作为封端溶液(capping solution)，使用了相对于乙腈溶解20％(v/v)乙酸酐和30％(v/v)2，6-二甲基吡啶而得到的溶液。
[1151]
作为吗啉基单体化合物，使用了表13中记载的吗啉基单体化合物(a)、吗啉基单体化合物(c)、吗啉基单体化合物(t)、以及吗啉基单体化合物(g)。
[1152]
[表13]
[1153][1154]
从反应容器中回收担载有上述合成的pmo的氨基聚苯乙烯树脂，在室温下减压干燥2小时以上。将干燥后的担载于氨基聚苯乙烯树脂的pmo放入反应容器，加入28％氨水-乙醇(1/4)5ml，在55℃下搅拌15小时。滤除氨基聚苯乙烯树脂，用水-乙醇(1/4)1ml清洗。将得到的滤液减压浓缩。将得到的残留物溶解于20mm的乙酸-三乙胺缓冲液(teaa缓冲液)与乙腈的混合溶剂(4/1)10ml，用膜过滤器进行过滤。利用反相hplc对得到的滤液进行纯化。将使用的条件示于表14。
[1155]
[表14]
[1156][1157]
cv：柱容积
[1158]
对各级分进行分析，回收目标产物，进行减压浓缩。向浓缩残留物加入2m磷酸水溶液0.5ml，搅拌15分钟。进一步加入2m的氢氧化钠水溶液2ml，使其为碱性，用膜过滤器(0.45μm)进行过滤。
[1159]
用阴离子交换树脂柱对含有得到的目标产物的水溶液进行纯化。将使用的条件示于表15。
[1160]
[表15]
[1161][1162]
对各级分进行分析(hplc)，以水溶液的形式得到了目标产物。向得到的水溶液中添加0.1m的磷酸缓冲液(ph6.0)进行中和。接着，按照表16所示的条件用反相hplc进行脱盐。
[1163]
[表16]
[1164][1165]
回收目标产物，进行减压浓缩。将得到的残留物溶于水中，进行冷冻干燥，以白色棉状固体的形式得到了作为目标化合物的各pmo。将esi-tof-ms的计算值、测定值示于下述表17。
[1166]
[表17]
[1167]
[1168]
[1169]
[1170]
[1171][1172]
以与人抗肌萎缩蛋白基因的内含子中的剪接沉默基因或单跳读相关的剪接点作为靶点的反义pmo的制造
[1173]
通过与以内含子的供体附近或受体附近的区域作为靶点的pmo相同的方法合成了
人抗肌萎缩蛋白基因的下述pmo：(i)具有以与内含子44的剪接沉默基因序列或单跳读的剪接点作为靶点的pmo no.233的碱基序列(序列号257)的pmo、(ii)具有以与内含子45的剪接沉默基因序列或单跳读相关的剪接点作为靶点的pmo no.234～244的碱基序列(序列号258～268)的pmo、(iii)具有以与内含子44的受体附近的区域(r2)和内含子45的剪接沉默基因序列或单跳读相关的剪接点作为靶点的pmo no.245～249的碱基序列(序列号269～273)的pmo(连接型)、以及(iv)具有以外显子45的剪接沉默基因序列作为靶点的pmo no.250～251的碱基序列(序列号274～275)的pmo。各pmo的5’末端为与以内含子的供体附近或受体附近的区域作为靶点的pmo相同的基团(3)。将各pmo示于表18，将esi-tof-ms的计算值、测定值示于表19。
[1174]
[表18]
[1175][1176]
下划线表示预想与内含子中的剪接沉默基因序列或单跳读相关的剪接点相对应的碱基序列。
[1177]
[表19]
[1178]
pmo no.靶点碱基序列计算值测定值233h45_(-93)-(-70)7938.757938.95234h45_166-1897757.677757.89235h45_178-2017848.727848.99236h45_183-2067869.717869.94237h45_188-2117886.737886.24238h45_191-2147886.737886.37239h45_197-2207887.737887.49240h46_(-35)-(-12)7955.747955.61241h46_(-22)_28061.828062.19
242h46_(-12)_127986.777986.42243h46_(-2)_227860.77860.83244h45_20236-202597842.737842.9245h45_16-30_191-2059824.399824.66246h45_16-30_197-2119833.49833.32247h45_16-33_197-2089840.399840.1248h45_16-35_183-1929908.439908.14249h45_18-35_191-2029843.419843.08250h45_31-547848.727848.99251h45_131-1547844.737844.85
[1179]
[实施例2：反义低聚物的多外显子跳读活性试验]
[1180]
《试验例1》
[1181]
人抗肌萎缩蛋白基因的多外显子跳读的体外测试(1)：多外显子跳读的诱导
[1182]
步骤
[1183]
对于3.5
×
105个rd细胞(人横纹肌肉瘤细胞株、由ccl-136、atcc购入)，将表11的反义低聚物(pmo no.55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162、及161(序列号55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162及161))分别以25～50μm的浓度以单独方式、或以2、3个的组合的方式导入。试剂使用amaxa cell line nucleofector kit l，通过nucleofector ii(lonza)进行导入。程序使用了t-030。
[1184]
在导入后，在包含10％胎牛血清(fbs)(invitrogen公司制造)的eagle’s minimal essential medium(emem)培养基(sigma公司制造、以下相同)2ml中于37℃、5％co2的条件下将细胞培养三晚。
[1185]
用pbs(nissui公司制造、以下相同)将细胞清洗1次后，将包含1％的2-巯基乙醇(nacalai tesque公司制造)的buffer rlt(qiagen公司制造)添加于350μl细胞，在室温下放置数分钟，使细胞溶解，回收于qiashredder均质机(qiagen公司制造)。以15,000rpm离心2分钟，制备了匀浆。按照rneasy mini kit(qiagen公司制造)所附带的实验方案提取总rna。提取到的总rna的浓度使用nanodrop nd-1000(lms公司制造)进行了测定。
[1186]
使用qiagen onestep rt-pcr kit(qiagen公司制造)对提取到的总rna 800ng进行one-step rt-pcr。按照试剂盒所附带的实验方案制备了反应液。热循环仪使用了takara pcr thermal cycler dice touch(takara bio公司制造)。使用的rt-pcr的程序如下所述。
[1187]
50℃、30分钟：逆转录反应
[1188]
95℃、15分钟：聚合酶活性化、逆转录酶灭活、cdna热变性
[1189]
[94℃、10秒钟：57℃、30秒钟；72℃、1分钟]
×
33循环：pcr扩增72℃、10分钟：最终延长反应
[1190]
rt-pcr中使用的正向引物和反向引物的碱基序列如下所述。
[1191]
正向引物：5
’‑
atttgacagatctgttgagaaatgg-3’(序列号276)
[1192]
反向引物1：5
’‑
ggctgttttcatccaggttgtg-3’(序列号277)
[1193]
反向引物2：5
’‑
agttgctgctcttttccaggt-3’(序列号278)
[1194]
通过正向引物和反向引物2的组合，可以检测发生了外显子45～55的多外显子跳读的转录产物。另外，通过正向引物和反向引物1的组合，可以检测未发生跳读的转录产物及发生了外显子45的单独外显子跳读的转录产物。
[1195]
使用bioanalyzer(agilent公司制造)及multina(株式会社岛津制作所制造)对上述pcr的反应产物进行了分析。
[1196]
对于跳读了外显子45～55中的任意2个以上在编号顺序上连续的外显子的条带的多寡核苷酸量“a”、跳读了外显子45～55中的任意1个外显子的条带的多核苷酸量“b”、以及未发生跳读的条带的多寡核苷酸量“c”进行测定。基于这些“a”、“b”及“c”的测定值，按照下式求出了多外显子跳读的跳读效率。
[1197]
跳读效率(％)＝a/(a+b+c)
×
100
[1198]
结果
[1199]
将结果示于图1～16。通过单独或组合导入pmo no.55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162及161(序列号55、59、78、65、75、77、102、35、52、47、50、46、43、40、139、119、142、113、51、11、45、54、41、74、66、64、63、68、76、28、27、225、228、1、5、132、131、128、163、162及161)，诱导了外显子45～55的多外显子跳读。
[1200]
由此表明，通过单独或组合使用表11中记载的本发明的反义低聚物可有效地诱导或可认为可诱导多外显子跳读。
[1201]
需要说明的是，确认了通过导入pmo no.6、7、8、10、14、26、29、38、39、53、58、67、80、82、86、92、97、98、100、121、122、124、125、126、130、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、231、232(序列号6、7、8、10、14、26、29、38、39、53、58、67、80、82、86、92、97、98、100、121、122、124、125、126、130、144、146、147、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、231、232)，可诱导外显子45～55的多外显子跳读。
[1202]
＜试验例2＞
[1203]
人抗肌萎缩蛋白基因的多外显子跳读的体外测试(2)：多外显子跳读的促进
[1204]
步骤
[1205]
对于3.5
×
105个rd细胞(人横纹肌肉瘤细胞株、由ccl-136、atcc购入)加入表11的反义低聚物(pmo no.75)25～50μm，将表18的反义低聚物(pmo no.236、237或239)25～50μm组合导入，按照与试验例1相同的步骤进行了测试。
[1206]
结果
[1207]
将结果示于图17及18。与pmo no.75(序列号75)单独的情况相比，组合导入了pmo no.236、237或239(序列号260、261或263)的情况下，外显子45～55的多外显子跳读的跳读效率增加。另一方面，外显子45的单独外显子跳读的跳读效率降低。
[1208]
由此表明，通过将表18中记载的本发明的阻抑基因反义低聚物与表11中记载的本发明的反义低聚物组合使用，可促进或可认为促进多外显子跳读。
[1209]
＜试验例3＞
[1210]
人抗肌萎缩蛋白基因的多外显子跳读的体外测试(3)：整体性多外显子跳读的促进
[1211]
步骤
[1212]
试验例3除了如下所述进行了one-step rt-pcr以外，按照与试验例2相同的步骤进行。
[1213]
使用qiagen onestep rt-pcr kit(qiagen公司制造)对提取出的总rna 800ng进行了one-step rt-pcr。按照试剂盒所附带的实验方案制备了反应液。热循环仪使用了takara pcr thermal cycler dice touch(takara bio公司制造)。使用的rt-pcr的程序如下所述。
[1214]
50℃、30分钟：逆转录反应
[1215]
95℃、15分钟：聚合酶活性化、逆转录酶灭活、cdna热变性
[1216]
[94℃、10秒钟；60℃、30秒钟；72℃、2分钟]
×
40循环：pcr扩增72℃、10分钟：最终延长反应
[1217]
用于rt-pcr的正向引物和反向引物的碱基序列如下所述。
[1218]
正向引物2：5
’‑
atttgacagatctgttgagaaatgg-3’(序列号279)
[1219]
反向引物3：5
’‑
ggctccaatagtggtcagtcc-3’(序列号280)
[1220]
正向引物3：5
’‑
cctgagaattgggaacatgc-3’(序列号281)
[1221]
反向引物4：5
’‑
cctccttccatgactcaagc-3’(序列号282)
[1222]
发生了人抗肌萎缩蛋白基因的外显子45～46、外显子45～47、外显子45～48或外显子45～49的多外显子跳读的转录产物可以通过正向引物2和反向引物3的组合进行检测。另一方面，发生了外显子45～46、外显子45～47、外显子45～48、外显子45～49、外显子45～50、外显子45～51或外显子45～52的多外显子跳读的转录产物可以通过正向引物3和反向引物4的组合进行检测。
[1223]
使用bioanalyzer(agilent公司制造)及multina(株式会社岛津制作所制造)对上述pcr的反应产物进行分析，对发生了各外显子跳读的转录产物的pcr产物量进行了定量。
[1224]
结果
[1225]
将结果示于图19～22。与pmo no.75(序列号75)单独的情况相比，组合导入了pmo no.236或239(序列号260或263)的情况下，不仅是外显子45～55的多外显子跳读的跳读(试验例2)，而且外显子45～46、外显子45～47、外显子45～48、或外显子45～49、外显子45～50、外显子45～51及外显子45～52的多外显子跳读的跳读效率也增加。
[1226]
由此表明，通过将表18中记载的本发明的阻抑基因反义低聚物与表11中记载的本发明的反义低聚物组合使用，可促进或可认为促进整体性的多外显子跳读。
[1227]
工业实用性
[1228]
根据本发明，可以提供能够进行人抗肌萎缩蛋白的多外显子跳读的反义低聚物及阻抑基因反义低聚物。通过使用本发明的反义低聚物及阻抑基因反义低聚物，可以提供新的dmd治疗药及治疗方法。