多环酰胺作为治疗癌症的UBE2K调节剂的制作方法

多环酰胺作为治疗癌症的ube2k调节剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年1月3日提交的美国临时申请no.62/956,802的优先权权益，其全部内容在此通过引入并入本文。


背景技术：

3.癌症进展是全球关注的问题，其晚期转移是全世界第二大死亡原因。泛素-蛋白酶体系统(ups)由于其在细胞增殖和存活中的作用，近来已被作为癌症治疗的重要靶标而受到关注。泛素(ub)是小的、高度保守的调节蛋白，其作为蛋白酶体降解的信号共价结合至蛋白质。泛素化是将ub转移至特定靶蛋白的多步骤过程。ub缀合通过涉及ub-活化(e1)、ub-缀合(e2)和ub-连接(e3)酶的酶级联反应发生。参见例如cancer biol ther.2010年10月15日；10(8):737
–
747。由于ub的添加和去除是所有真核细胞中的基本过程，因此ub代谢酶在多种癌症和与癌症相关的许多信号传导/调节途径中作为致癌基因或肿瘤抑制剂具有显著特征并不足为奇。参见cell cycle 2017；16(7):634
–
648。
4.虽然在该领域已经取得了进展(例如，如在fda批准的蛋白酶体抑制剂硼替佐米中)，但是仍然需要改进的ups小分子调节剂。


技术实现要素：

5.本文提供了具有式i的化合物：
[0006][0007]
及其药学上可接受的盐和组合物，其中r1、r2、p、z1、z2、x、环a和p如本文所述。所公开的化合物和组合物调节(例如抑制)ube2k和ube2k的修饰形式，即但不限于单泛素化ube2k、二泛素化ube2k、三泛素化ube2k和四泛素化ube2k，并且可用于治疗各种癌症。
附图说明
[0008]
图1说明某些本发明化合物的ube2k多泛素化活性。
[0009]
图2说明某些本发明化合物对单泛素化ube2k的选择性稳定化。
[0010]
图3说明某些本发明化合物的ube2k-ub释放活性。
[0011]
图4说明化合物131在裸鼠中的mv.4.11细胞(b粒单核细胞白血病)系衍生的异种移植模型中的抗肿瘤功效。
具体实施方式
[0012]
1.化合物的一般描述
[0013]
本文提供了式i的化合物：
或-ocf3。
[0033]“氧代”是指二价官能团＝o，即通过双键与另一个原子(通常为碳或硫)连接的氧原子。
[0034]
术语“杂芳基”是指含有1至4个独立地选自n、o和s的杂原子的特定大小的芳族环(例如，5、6、7、8或9元环)。杂芳基可以是单环或双环的。单环杂芳基包括例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基等。双环杂芳基包括其中单环杂芳基环与一个或多个芳基或杂芳基环稠合的基团。非限制性实例包括吲哚基、咪唑并吡啶基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、吡唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吲嗪基等。当指定时，杂芳基上的任选取代基可存在于任何可取代的位置上。
[0035]
术语“杂环基”是指含有1至4个独立地选自n、o和s的杂原子的特定大小的饱和或部分不饱和单环(例如，3、4、5、6或7元环)。杂环基环可连接至在任何杂原子或碳原子处的侧基，从而形成稳定的结构。此类饱和或部分不饱和杂环基的实例包括但不限于氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丙基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡咯烷基、吡啶酮基、吡咯烷酮基、哌啶基、噁唑烷基、哌嗪基、二噁烷基、二氧戊环基、吗啉基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、二氢嘧啶基、氧杂环丁烷基、氮杂环丁烷基和四氢嘧啶基。当指定时，杂环基上的任选取代基可存在于任何可取代的位置上，并且包括例如杂环基连接的位置。
[0036]
术语“环烷基”是指特定大小的单环烃(例如3、4、5、6或7元环)。环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基和环辛基。当指定时，环烷基上的任选取代基可存在于任何可取代的位置上，并且包括例如环烷基连接的位置。
[0037]
所公开的化合物以各种互变异构形式存在并且是本公开的一部分。术语“互变异构体”或“互变异构的”是指由氢原子的至少一次形式迁移和至少一次化合价变化产生的两种或更多种可互相转化的化合物/取代基。示例性互变异构包括例如以下：
[0038][0039]
这些化合物的所有这些异构形式均明确包括在内。因此，当本文的化合物由结构式表示或由本文的化学名称表示时，所述化合物可存在的所有其它互变异构形式均涵盖在结构式中。这包括其中x为n或c的式i化合物。
[0040]
本文所述的化合物可以药学上可接受的盐的形式存在。就医药用途而言，本文所述的化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。药学上可接受的盐形式包括药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。本文所述化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐包括例如无机酸(例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸和硫酸)和有机酸(例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸)的盐。具有羧酸等酸性基团的本发明的化合物可以与药学上可接受的碱(一种或多种)形成药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的碱性盐包括例如铵盐、碱金属盐(如钠盐和钾盐)和碱土金属盐(如镁盐和钙盐)。具有季铵基团的化合物还含有抗衡阴离子，例如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、高氯酸根等。这类盐的其它实例包括盐酸
盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、苯甲酸盐和具有谷氨酸等氨基酸的盐。
[0041]
术语“受试者”和“患者”可以互换使用，并且是指需要治疗的哺乳动物，例如伴侣动物(例如狗、猫等)，农场动物(例如牛、猪、马、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。通常，受试者是需要治疗的人。
[0042]
如本文所用，术语“治疗(treatment、treat、treating)”是指逆转、减轻、延迟疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制其进展，如本文所述。在一些方面，治疗可以在一种或多种症状已经发展后进行，即治疗性治疗。在其它方面，治疗可以在没有症状的情况下进行。例如，治疗可在症状发作之前(例如，根据症状史和/或根据暴露于特定生物体或其它易感性因素)施用于易感受试者，即预防性治疗。也可以在症状已经消退后继续治疗，例如延迟其复发。
[0043]
术语“药学上可接受的w”是指不破坏与其一起配制的化合物的药理学活性的无毒载体、佐剂或媒介物。可用于本文所述的组合物中的药学上可接受的载体、佐剂或媒介物包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
[0044]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指将引起受试者的生物学或医学响应的本文所述的化合物的量，例如0.01-100mg/kg体重/天之间的剂量。
[0045]
3.化合物
[0046]
在第一实施方案中，本文提供了式i的化合物：
[0047][0048]
或其药学上可接受的盐，其中所述变量如上所述。
[0049]
在第二实施方案中，式i的化合物具有式ii或iii：
[0050][0051]
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文对式i所述。
[0052]
在第三实施方案中，式i的化合物具有式iv：
[0053][0054]
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文对式i所述。
[0055]
在第四实施方案中，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的r3为氢，
其中其余变量如式i或第二实施方案所述。
[0056]
在第五实施方案中，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的y为ch2、so2或环丙基，其中其余变量如式i或第四实施方案所述。或者，作为第五实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的y为ch2，其中其余变量如式i或第四实施方案所述。
[0057]
在第六实施方案中，z1为n且z2为ch；z1为ch且z2为n；或z1和z2在式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中各自为ch，其中其余变量如式i或第四或第五实施方案所述。或者，作为第六实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的z1和z2各自为ch，其中其余变量如式i或第四或第五实施方案所述。
[0058]
在第七实施方案中，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的环a为苯基或5至6元杂芳基，其各自任选地被1至3个选自r5的基团取代，其中其余变量如式i或第四、第五或第六实施方案所述。或者，作为第七实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的环a为苯基、吡啶基、呋喃基或吡唑基，其各自任选被1至3个选自r5的基团取代，其中其余变量如式i或第四、第五或第六实施方案中所述。在另一个替代方案中，作为第七实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的环a是苯基或呋喃基，其各自任选地被1至3个选自r5的基团取代，其中其余变量如式i或第四、第五或第六实施方案所述。在另一个替代方案中，作为第七实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的环a是任选地被1至3个选自r5的基团取代的苯基，其中其余变量如式i或第四、第五或第六实施方案所述。
[0059]
在第八实施方案中，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的r1和r2在相邻碳原子上并且与它们所连接的碳原子一起形成5元含氧杂环基，其任选地被1或2个卤素取代，其中其余变量如式i或第四、第五、第六或第七实施方案所述。或者，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的r1和r2在相邻碳原子上并且与它们所连接的碳原子一起形成二氧戊环基，其任选被1或2个卤素取代，其中其余变量如式i或第四、第五、第六或第七实施方案所述。
[0060]
在第九实施方案中，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的r1为卤代(c
1-c4)烷基、卤代(c
1-c4)烷氧基或-nrcrd；并且rc为氢且rd为卤代(c
1-c4)烷基；或rc和rd一起形成4至7元杂环基，其任选被1至3个选自卤素、(c
1-c4)烷基和氧代的基团取代，其中其余变量如式i或第四、第五、第六或第七实施方案所述。或者，作为第九实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的r1为-ocf3、-ochf2、-och2cf3、-cf3、-ch2cf3、-chf2、哌啶基、吡咯烷基、氮杂环庚烷基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基或氮杂环丁烷基，并且其中所述杂环中的每一个任选地被1至3个选自卤素、(c
1-c4)烷基和氧代的基团取代，其中其余变量如式i或第四、第五、第六或第七实施方案所述。
[0061]
在第十实施方案中，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的r2为cn、卤素、(c
1-c4)烷基、卤代(c
1-c4)烷基、或(c
1-c4)烷氧基，其中其余变量如式i或第四、第五、第六、第七或第九实施方案所述。或者，作为第十实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的r2为cn或卤素，其中其余变量如式i或第四、第五、第六、第七或第九实施方案所述。在另一个替代方案中，作为第十实施方案的一部分，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的r2为氟，其中其余变量如式i或第四、第五、第六、第
七或第九实施方案所述。
[0062]
在第十一实施方案中，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的p为0，其中其余变量如式i或第四、第五、第六、第七、第九或第十实施方案所述。
[0063]
在第十二实施方案中，式i、ii、iii或iv的化合物或其药学上可接受的盐中的r5为卤素、(c
1-c4)烷基、卤代(c
1-c4)烷基、(c
1-c4)烷氧基、-n[(c
1-c4)烷基]2、或6元杂环基，其中其余变量如式i或第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案所述。或者，式i、ii、iii或iv化合物或其药学上可接受的盐中的r5为f、br、cl、-och3、-och2ch3、oh、-o(ch2)2ch3、-nme2、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-och(ch3)2、吗啉基、-ch3或-cf3，其中其余变量如式i或第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案所述。
[0064]
化合物的具体实例在实施例部分中提供并且作为本文第十三实施方案的一部分包括在内。还包括这些化合物的药学上可接受的盐以及中性形式。
[0065]
本文还提供了包含本文所述的化合物的药物组合物；和药学上可接受的载体。
[0066]
4.用途、制剂和给药
[0067]
本文所述的化合物和组合物通常可用于调节ube2k的活性。在一些方面，本文所述的化合物和组合物抑制ube2k的活性。
[0068]
在一些方面，本文所述的化合物和组合物可用于治疗癌症。因此，本文提供了治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、或包含所公开的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。还提供了本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、或包含所公开的化合物或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。还提供了用于治疗癌症的本文所述的化合物或其药学上可接受的盐、或包含所公开的化合物或其药学上可接受的盐的组合物。
[0069]
可通过本发明方法治疗的癌症包括但不限于液体癌，例如急性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病；或实体瘤，例如胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌和胃肠癌。
[0070]
在某些方面，本文所述的组合物被配制用于向需要此类组合物的受试者施用。本文所述的组合物可经口、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮存器施用。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。在一些实施方案中，所述组合物经口、腹膜内或静脉内施用。本文所述的组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。
[0071]
任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄率(rate of excretion)、药物组合和治疗医师的判断以及所治疗的具体疾病的严重程度。本文所述的化合物在组合物中的量还将取决于组合物中的具体化合物。
[0072]
实施方式
[0073]
公开的化合物的代表性实例在以下非限制性方法、方案和实例中说明。
[0074]
一般合成路线
[0075]
方案1：
[0076][0077]
式i化合物可根据上文一般方案1制备，其中，例如使适当的氰基起始材料与硫化铵(例如[nh4]2s)任选地在碱存在下且在高温下反应以形成相应硫化胺。参见步骤1。然后在步骤2中用适当的被保护的胺环化成相应的杂芳基，其中pg是胺保护基，如酸不稳定的保护基。然后将胺暴露(例如用酸)，并且接着使用例如基于二酰亚胺的试剂或类似物与适当的酸偶联(参见步骤3)，以形成式i化合物。变量具有与本文所述相同的含义。
[0078]
方案2：
[0079][0080]
式i的化合物还可以根据上述一般方案2制备，其中例如使适当的氨基和羧酸起始材料反应(例如在碱和任选的添加剂的存在下)以在步骤1中形成氰基产物。接着所述氰基可以例如在高温下和任选地在无机碱的存在下环化，以在步骤2中形成式1的化合物。变量具有与本文所述相同的含义。
[0081]
示例性合成
[0082]
n-((5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺(化合物2)的合成：
[0083][0084]
向冷却至0℃的2-(三氟甲基)苯甲酸(500mg，2.626mmol)于dmf(2ml)中的溶液中添加(5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲胺(662mg，2.629mmol，1eq)、hatu(380mg，5.258mmol)和dipea(129mg，8.097mmol)。将所述溶液在室温下搅拌16小时。反应完成后，蒸馏出溶剂，然后添加水(10ml)，并用etoac萃取(50ml
×
2次)，并用na2so4干燥。然后减压浓缩得到粗产物。然后通过快速柱色谱(洗脱液：20％etoac/正己烷)纯化所述粗产物，得到标题化合物(650mg，70％)产物，为n-((5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.77(s,1h),8.94(s,1h),7.77(d,j＝
8.0hz,1h),7.40-7.70(m,2h),7.40(m,2h),7.32(s,1h),7.05(m,1h),6.40-6.48(m,1h),4.40(s,2h).lcms:m/z352.1[m+h]
+
[0085]
使用与上述化合物1类似的方法，使用适当的起始材料制备表1中的下列化合物。
[0086]
表1
[0087]
[0088]
[0089]
[0090][0091]
5-氟-2-(哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物80)的合成：
[0092][0093]
步骤1：5-氟-2-(哌啶-1-基)苯甲酸甲酯
[0094][0095]
向2,5-二氟苯甲酸甲酯(500mg，2.906mmol)于dmf(10ml)中的经搅拌的溶液中添加哌啶(0.37ml，3.488mmol)，随后添加k2co3(1g，7.267mmol)，并将反应混合物在80℃下搅拌12小时。反应完成后，减压浓缩溶剂，用水(10ml)稀释并用etoac(2
×
15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，减压浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱(洗脱液：40％etoac于己烷中)纯化粗化合物，得到5-氟-2-(哌啶-1-基)苯甲酸甲酯，为棕色固体(350mg，50.87％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ7.33-7.36(m,1h),7.26-7.31(m,1h),7.10-7.13(m,1h),3.79(s,3h),2.82-2.87(m,4h),1.58(s,4h),1.48(s,2h).lc-ms m/z(m-h):238.0
[0096]
步骤2：5-氟-2-(哌啶-1-基)苯甲酸
[0097][0098]
向5-氟-2-(哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(250mg，1.054mmol)于thf：h2o(10ml+5ml)中的经搅拌的溶液中添加lioh(200mg，4.219mmol)。然后将反应物在室温下搅拌12小时。反应完成后，蒸馏出溶剂，用etoac(10ml)稀释，分离有机层，并用1n hcl溶液(5ml)酸化水层，用etoac(2
×
10ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，在旋转蒸发仪上浓缩，得到5-氟-2-(哌啶-1-基)苯甲酸(200mg，75.47％)，为棕色固体。
[0099]1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ18.55(s,1h),11.97(s,1h),7.82-7.85(m,1h),7.69-7.72(m,1h),7.51-7.56(m,1h),3.07(t,j＝5.2hz,4h),1.89(bs,2h),1.73(bs,4h),1.60(d,j＝4.8hz,2h),lc-ms m/z(m-h):238.0
[0100]
步骤3：5-氟-2-(哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)苯甲酰胺
[0101][0102]
在0℃下向5-氟-2-(哌啶-1-基)苯甲酸(300mg，1.345mmol)于dcm(20ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(385mg，2.015mmol)和hobt(308mg，2.281mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15min并向其中添加(5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲胺(310mg，1.614mmol)，并将反应在室温下搅拌12h。反应完成后，减压浓缩溶剂，用水(10ml)稀释并用etoac(2
×
15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，减压浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱(洗脱液：40％etoac于己烷中)纯化粗化合物，得到5-氟-2-(哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(11mg，21.31％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ12.84(s,1h),10.53(s,1h),7.54-7.64(m,1h),7.32-7.40(m,4h),7.04-7.11(m,1h),6.54(s,1h),4.47-4.56(m,2h),2.78(s,4h),1.47(s,4h),1.39(s,2h).lc-ms m/z(m-h):385.0。
[0103]
使用与上述化合物80类似的方法，使用适当的起始材料制备表2中的下列化合物。
[0104]
表2
[0105][0106]
n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(哌啶-1-基)苯甲酰胺(化合物102)的合成：
[0107][0108]
步骤1：5-硝基-1h-吡唑-3-甲酸乙酯的合成
[0109][0110]
在0℃下向5-硝基-1h-吡唑-3-甲酸(5g，31.84mmol)于乙醇(50ml)中的经搅拌的溶液中添加socl2(8ml)。将反应混合物在80℃下搅拌12小时。反应完成后，蒸馏出溶剂，用etoac(50ml)稀释，并用饱和nahco3溶液(50ml)、然后用水(50ml)洗涤一次，分离有机层，用na2so4干燥，在旋转蒸发仪上浓缩，得到粗化合物。将粗化合物用乙醚(25ml)研磨，得到5-硝基-1h-吡唑-3-甲酸乙酯，为灰白色固体(4.5g，77.58％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ15.19(s,1h),7.48(s,1h),4.32-4.37(m,2h),1.31(t,j＝7.2hz,3h).lc-ms m/z(m-h):186.1
[0111]
步骤2：5-氨基-1h-吡唑-3-甲酸乙酯的合成
[0112][0113]
向5-硝基-1h-吡唑-3-甲酸乙酯(10g，54.05mmol)于acoh:thf(1:1)中的经搅拌的溶液中添加pd/c(wt/wt，100mg)，并使反应混合物在50psi下氢化12小时。反应完成后，将混合物通过硅藻土床过滤，用甲醇(2x50m)洗涤，经无水na2so4干燥，在旋转蒸发仪上浓缩，得到5-氨基-1h-吡唑-3-甲酸乙酯，为灰白色固体(8g，95.57％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ12.09(s,1h),5.63(s,1h),5.15(s,1h),4.16(s,2h),1.23(s,3h),lc-ms m/z(m-h):156.1
[0114]
步骤3：5-碘-1h-吡唑-3-甲酸乙酯的合成
[0115]
[0116]
在0℃下向5-氨基-1h-吡唑-3-甲酸乙酯(1.2g，7.74mmol)于hcl(12ml)中的经搅拌的溶液中添加nano2(658mg，9.67mmol)/h2o(6ml)。将得到的混合物在0℃下搅拌30min，并在相同温度向其中缓慢添加ki(1.6g，9.63mmol)/h2o(6ml)，将混合物温热至室温并搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用冷水(20ml)稀释并用etoac(2x25ml)萃取。将合并的有机层用饱和硫代硫酸钠溶液(20ml)洗涤一次，然后用h2o(20ml)洗涤。有机层经na2so4干燥，在旋转蒸发仪上浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱(洗脱液：10％etoac于己烷中)纯化粗化合物，得到5-碘-1h-吡唑-3-甲酸乙酯，为灰白色固体(320mg，16％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ14.23(s,1h),6.88(s,1h),4.27-4.32(m,2h),1.28(t,j＝7.2hz,3h),lc-ms m/z(m-h):266.92
[0117]
步骤4：5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酸乙酯的合成
[0118][0119]
向5-碘-1h-吡唑-3-甲酸乙酯(100mg，0.273mmol)在1,4-二噁烷-h2o(8ml+2ml)中的经搅拌的溶液中添加(2-甲氧基苯基)硼酸(45mg，0.296mmol)和na2co3(72mg，0.679mmol)。将反应混合物用氩气脱气10min并向混合物中添加四(三苯基膦)钯(31mg，0.026mmol)并将反应在100℃下加热12h。反应完成后，减压浓缩溶剂，用水(10ml)稀释并用etoac(2
×
15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，减压浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱(洗脱液：60％etoac于己烷中)纯化粗化合物，得到5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酸乙酯，为灰白色固体(47mg，70.14％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ13.56(s,1h),7.72(d,j＝7.6hz,1h),7.30-7.39(m,1h),7.11-7.20(m,3h),7.01-7.05(m,1h),4.25-4.33(m,2h),3.89(s,3h),1.29(d,j＝7.2hz,3h),lc-ms m/z(m-h):247
[0120]
步骤5：5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酸的合成
[0121][0122]
在0℃下向5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酸乙酯(400mg，1.62mmol)于thf:h2o(20ml+10ml)中的经搅拌的溶液中添加lioh.h2o(260mg，6.504mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，蒸馏出溶剂，用etoac(10ml)稀释，分离有机层，并用1n hcl溶液(5ml)酸化水层，用etoac(2
×
25ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，在旋转蒸发仪上浓缩，得到5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酸，为棕色固体(250mg，70.62％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ13.21(s,1h),7.77(d,j＝6.8hz,1h),7.34(t,j＝8.0hz,1h),7.11-7.14(m,2h),7.01(t,j＝7.2hz,1h),3.88(s,3h).lc-ms m/z(m-h):219
[0123]
步骤6：5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酰胺的合成
[0124][0125]
在室温下向5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酸(250mg，1.146mmol)于dmf(6ml)中的经搅拌的溶液中添加hatu(650mg，1.720mmol)、dipea(740mg，3.440mmol)和nh4hco3(360mg，4.587mmol)并搅拌12h。反应完成后，将混合物用水和乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥并减压浓缩。通过grace柱色谱纯化粗化合物，用80％etoac/石油醚洗脱，得到5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酰胺(80mg，产率：32.25％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ13.24(s,1h),7.88-7.94(m,1h),7.68(d,j＝7.6hz,1h),7.45(s,1h),7.27-7.38(m,1h),6.96-7.19(m,4h),3.89(s,3h).lc-ms m/z(m-h):218
[0126]
步骤7：(5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲胺的合成
[0127][0128]
在0℃下向5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-甲酰胺(80mg，0.368mmol)于thf(10ml)中的经搅拌的溶液中添加氢化铝锂(54mg，1.474mmol)并将反应混合物在80℃下搅拌12h。反应完成后，用na2so4浆液终止反应，然后添加etoac(20ml)，通过硅藻土垫过滤。减压浓缩所得滤液，得到(5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲胺(45mg，60％)，为灰白色固体，其不经进一步纯化即用于下一步骤。lc-ms m/z(m-h):204
[0129]
步骤8：n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(哌啶-1-基)苯甲酰胺
[0130][0131]
在0℃下向2-(哌啶-1-基)苯甲酸(45mg，0.22mmol)于二氯甲烷中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(63mg，0.33mmol)和hobt(50mg，0.32mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15min并向所得混合物中添加(5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲胺(45mg，0.26mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，减压浓缩溶剂，用水(10ml)稀释并用etoac(2
×
15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，减压浓缩，得到粗化合物。通过制备型tlc纯化粗化合物(用5％meoh/dcm洗脱)，得到5-氟-2-(哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(5.3mg，6.16％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)旋转异构体δ12.80(s,1h),10.22(s,1h),7.09(d,j＝7.6hz,1h),7.64(bs,1h),7.40-7.47(m,1h),7.27-7.29(m,2h),7.18(t,j＝7.2hz,1h),7.09(d,j＝8.0hz,1h),6.99(bs,1h),6.66(s,1h),4.51(s,2h),3.85(s,3h),2.80(s,4h),1.49(s,4h),1.38(s,2h).lc-ms m/z(m-h):391.0
[0132]
使用与上述化合物102类似的方法，使用适当的起始材料制备表3中的下列化合物。
[0133]
表3
[0134][0135][0136]
2-(4,4-二氟哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物76)的合成：
[0137][0138]
步骤1：2-溴苯甲酸甲酯的合成
[0139][0140]
在0℃下向2-溴苯甲酸(10gm，50mmol)于甲醇(80ml)中的经搅拌的溶液中添加浓硫酸(8ml，150mmol)，并将反应混合物在回流温度下搅拌16小时。反应完成后，将反应混合物减压完全浓缩。将粗产物用冷水淬灭并用乙酸乙酯(2
×
100ml)萃取。将合并的有机层用水(50ml)、饱和碳酸氢钠溶液(50ml)洗涤，并用硫酸钠干燥。浓缩有机层得到纯黄色液体产物2-溴苯甲酸甲酯(9.0gm，83％产率)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.79(dd,j＝7.4,1.9hz,1h),7.65(dt,j＝25.6,12.6hz,1h),7.42
–
7.29(m,2h),3.94(s,3h)。
[0141]
步骤2：2-(4,4-二氟哌啶-1-基)苯甲酸甲酯的合成
[0142][0143]
向2-溴苯甲酸甲酯(250mg，1.162mmol)于1,4-二噁烷(5ml)中的经搅拌的溶液中添加4,4-二氟哌啶盐酸盐(202mg，1.2818mmol)、xanthphos(335mg，0.581mmol)和cs2co3(944mg，2.905mmol)。将反应混合物用氩气脱气5次，然后添加pd2dba3(106mg，0.1166mmol)。将反应混合物在110℃下搅拌16h。反应完成后，将混合物冷却，用水淬灭并用乙酸乙酯(2
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤并用硫酸钠干燥。将干燥的有机层减压浓缩，得到粗产物，为黄色液体。使用乙酸乙酯和己烷作为洗脱剂通过快速柱色谱纯化。获得2-(4,4-二氟哌啶-1-基)苯甲酸甲酯纯物质(40mg，16％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.85
–
7.73(m,1h),7.42(dd,j＝11.1,4.4hz,1h),7.10
–
6.98(m,2h),3.89(s,3h),3.22
–
3.07(m,4h),2.16(ddd,j＝19.3,13.8,5.6hz,4h)。
[0144]
步骤3：2-(4,4-二氟哌啶-1-基)苯甲酸的合成
[0145][0146]
向2-(4,4-二氟哌啶-1-基)苯甲酸甲酯(770mg，3.019mmol)于乙醇(8ml)中的经搅拌的溶液中添加水(2ml)和naoh(480mg，12.078mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。反应完成后，反应混合物用水稀释，并且水层用乙酸乙酯(2
×
50ml)洗涤。含水层的产物用2n hcl酸化并用乙酸乙酯(2
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤并经硫酸钠干燥。减压浓缩有机层，得到产物2-(4,4-二氟哌啶-1-基)苯甲酸(580mg，80％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ14.99(s,1h),7.87(d,j＝7.5hz,1h),7.57(t,j＝7.5hz,1h),7.49(d,j＝8.0hz,1h),7.26(t,j＝7.3hz,1h),3.15(s,4h),2.16(t,j＝13.9hz,4h).lc-ms m/z(m+h):242.0。
[0147]
步骤4：2-(4,4-二氟哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺
[0148][0149]
向2-(4,4-二氟哌啶-1-基)苯甲酸(25mg，0.104mmol)于二氯甲烷(5ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(29mg，0.156mmol)、hobt(23mg，0.156mmol)和三乙胺(0.067ml，0.468mmol)，然后添加5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(24mg，0.114mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16h。反应完成后，将混合物用水淬灭并用二氯甲烷(2
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤并经硫酸钠干燥。减压浓缩有机层，得到粗产物，为红色液体。使用乙酸乙酯和己烷作为洗脱剂通过快速色谱纯化粗产物，得到2-(4,4-二氟哌啶-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(10mg，25％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ14.35(s,0.4h),13.97(s,0.6h),9.81(s,0.4h),9.73(s,0.6h),7.87
–
7.66(m,2h),7.53(dd,j＝11.5,4.2hz,1h),7.46(t,j＝7.7hz,1h),7.30(t,j＝7.6hz,1h),7.19(dd,j＝13.9,6.4hz,1h),7.14
–
7.07(m,1h),4.66(d,j＝5.6hz,1.2h),4.57(d,j＝5.0hz,0.8h),3.04(s,4h),2.15(s,4h).lc-ms m/z(m+h):404.1。
[0150]
使用与上述化合物76类似的方法，使用适当起始材料制备表4中的下列化合物。
[0151]
表4
[0152]
[0153]
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158][0159]
3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)吡嗪-2-甲酰胺(化合物87)的合成：
[0160][0161]
步骤1：3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)吡嗪-2-甲酸乙酯的合成
[0162][0163]
在0℃下向3-氯吡嗪-2-甲酸乙酯(300mg，1.61mmol)于dmf(10ml)中的经搅拌的溶液中添加cs2co3(1.2g，3.22mmol)和et3n(162.9mg，1.61mmol)，然后添加3,3-二氟吡咯烷.hcl(277.9mg，1.93mmol)。将反应混合物在密封管中在100℃下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用水稀释并用etoac(3
×
20ml)萃取。合并的有机层经无水na2so4干燥并真空浓缩。粗产物用正己烷研磨，并干燥所得产物，得到3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)吡嗪-2-甲酸乙酯，为黄色浆液(260mg，62％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.23(d,j＝2hz,1h),8.03(d,j＝2hz,1h),4.50(q,j＝6.4hz,2h),3.78
–
3.72(m,4h),2.51
–
2.40(m,2h),1.46(t,j＝6.8hz,3h)。
[0164]
步骤2：3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)吡嗪-2-甲酸的合成
[0165][0166]
在0℃下向3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)吡嗪-2-甲酸乙酯(250mg，0.97mmol)于thf:h2o(5ml:2ml)中的经搅拌的溶液中添加lioh(244.67mg，5.83mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，用1n hcl酸化所述反应混合物并用etoac(2
×
20ml)萃取，将有机层经mgso4干燥并真空浓缩，得到3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)吡嗪-2-甲酸，为灰白色固体。(200mg，90.17％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ13.50(s,1h),8.28(d,j＝2.4hz,1h),7.97(s,1h),3.80(t,j＝12.8hz,2h),3.62(t,j＝7.2hz,2h),2.56
–
2.49(m,2h)。
[0167]
步骤3：3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲
基)吡嗪-2-甲酰胺的合成
[0168][0169]
在0℃下向3-((3,3-二氟吡咯烷-1-基)甲基)吡嗪-2-甲酸(70mg，0.30mmol)于ch2cl2(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(87.57mg，0.45mmol)、hobt(61.8mg，0.45mmol)和et3n(92.62mg，0.91mmol)。将所得混合物搅拌10min，并且接着添加(5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺。添加hcl(72.62mg，0.33mmol)并将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用水洗涤并用ch2cl2(2
×
10ml)萃取。有机层经mgso4干燥并真空浓缩。通过制备型hplc纯化粗产物，得到3-(3,3-二氟吡咯烷-1-基)-n-((5-(噻吩-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)吡嗪-2-甲酰胺，为灰白色固体(39mg，32.63％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ13.96(brs,1h),9.26(brs,1h),8.26(s,1h),7.94(s,1h),7.59(d,j＝12hz,2h),7.14(s,1h),4.55(d,j＝5.6hz,2h),3.80(t,j＝13.2hz,2h),3.66(t,j＝11.2hz,2h),2.49
–
2.39(m,2h).lc-ms(m/z):391.10(m+h)
+
[0170]
使用与上述化合物87类似的方法，使用适当的起始材料制备表5中的下列化合物。
[0171]
表5
[0172]
[0173][0174]
n-((5-(4-甲基噻吩-3-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物16)的合成：
[0175][0176]
步骤1：n-((1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺：
[0177][0178]
在0℃下向2-(三氟甲氧基)苯甲酸(25g，0.121mmol)于dmf(250ml)中的经搅拌的溶液中添加hatu(46.1g，0.121)，随后添加(2h-吡唑-3-基)甲胺(11.7g，0.1213)和dipea(39.1g，0.303mmol)。然后将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用水(2.5l)稀释并用etoac(2x500ml)萃取。合并的有机层用h2o(250ml)、饱和nahco3溶液(250ml)、最后用盐水(250ml)洗涤一次。有机层经na2so4干燥，浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱(洗脱液：70％etoac/石油醚)纯化粗化合物，得到n-((1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(18.3g，53.0％产率)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ12.64(d,j＝47.1hz,1h),8.87(d,j＝42.1hz,1h),7.76
–
7.50(m,3h),7.49
–
7.27(m,2h),6.15(d,j＝12.1hz,1h),4.42(t,j＝11.1hz,2h).lc-ms m/z(m+h):286.1。
[0179]
步骤2：n-((1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺：
[0180][0181]
在室温下向n-((1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(18.3g，64.15mmol)于甲苯(400ml)中的经搅拌的溶液中添加3,4-二氢-2h-吡喃(5.39g，64.1mmol)。然后将反应在80℃下加热4h。反应完成后，蒸馏出溶剂甲苯，并用etoac(250ml)稀释残余物，用饱和nahco3溶液(100ml)和h2o(100ml)洗涤一次。分离有机层，经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。将由此得到的粗产物用石油醚(200ml)研磨并搅拌12h。将固体过滤并真空干燥，得到n-((1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(12.57g，51.5％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ8.87(s,1h),7.80(d,j＝2.2hz,1h),7.57(t,j＝7.0hz,2h),7.46
–
7.38(m,2h),6.20(d,j＝2.2hz,1h),5.32(d,j＝10.3hz,1h),4.38(d,j＝5.9hz,2h),3.90(d,j＝11.0hz,1h),3.67
–
3.52(m,1h),2.07(dd,j＝24.7,11.0hz,1h),1.98
–
1.80(m,2h),1.65(s,1h),1.51(d,j＝3.5hz,2h).lc-ms m/z(m+h):370.1.
[0182]
步骤3：n-((5-碘-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺：
[0183][0184]
在-78℃下经10分钟向n-((1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(18.2g，49.30mmol)于干燥thf(200ml)中的经搅拌的溶液中添加1.6m正丁基锂/己烷(6.31g，98.61mmol)。然后将反应混合物在相同温度下搅拌1h。历时15min向所得混合物中添加碘(13.76g，54.2mmol)/干燥thf(200ml)。碘的添加完成后，将反应物缓慢升温至-20℃，并搅拌45min。反应完成后，将其用饱和nahso3溶液(200ml)小心淬灭，并用etoac(2
×
150ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱(洗脱液：20％etoac于石油醚中)纯化粗化合物，得到n-((5-碘-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(12.57g，51.5％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ8.91(t,j＝5.6hz,1h),7.63
–
7.53(m,2h),7.44(dd,j＝14.6,7.6hz,2h),6.43(s,1h),5.33(d,j＝9.8hz,1h),4.36(d,j＝5.6hz,2h),3.90(d,j＝10.9hz,1h),3.59(dd,j＝17.3,7.5hz,1h),2.27(dd,j＝22.8,9.5hz,1h),1.97(d,j＝12.3hz,1h),1.83(d,j＝12.1hz,1h),1.67(s,1h),1.50(s,2h).,lc-ms m/z(m+h):396.0。
[0185]
步骤4：n-((5-(4-甲基噻吩-3-基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺
[0186][0187]
向n-((5-碘-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(60mg，0.131mmol)和4-甲基噻吩-3-硼酸(20.66mg，0.157mmol)于1,4-二噁烷:水(5ml:1ml)中的经搅拌的溶液中添加na2co3(34.71mg，0.327mmol)。然后将反应混合物用氩气脱气10min，随后添加四(三苯基膦)钯(15.13mg，0.0130mmol)。将所得混合物在100℃下加热12h。反应完成后，将混合物用h2o(5ml)稀释并用etoac(2
×
10ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。将其通过制备型tlc进一步纯化，以得到n-((5-(4-甲基噻吩-3-基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(34mg，57.74％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ8.93(s,1h),7.57(dd,j＝15.8,5.4hz,3h),7.44(dd,j＝15.6,7.6hz,2h),7.34(s,1h),6.26(s,1h),5.02(d,j＝9.5hz,1h),4.43(s,2h),3.91(d,j＝11.1hz,1h),3.43(s,1h),2.33(d,j＝14.2hz,1h),2.09(d,j＝16.3hz,3h),1.90(s,1h),1.47(s,3h),1.22(s,2h).lc-ms m/z(m+h):466.2。
[0188]
使用与上述化合物16类似的方法，使用适当起始材料制备表6中的下列中间化合物。
[0189]
表6
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
[0196][0197]
[0198]
步骤5：n-((5-(4-甲基噻吩-3-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺：
[0199][0200]
在0℃下向n-((5-(4-甲基噻吩-3-基)-1-(四氢-2h-吡喃-2-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(34mg，0.073mmol)于二氯甲烷(3ml)中的经搅拌的溶液中添加1,4-二噁烷-hcl(4.0m，3ml)。将所得反应混合物在室温下搅拌4h。反应完成后，将混合物浓缩，进一步与二氯甲烷(2
×
10ml)共蒸馏，得到粗物质。通过添加h2o(10ml)，随后用饱和nahco3溶液碱化并用etoac(2
×
5ml)萃取来进行进一步处理。将合并的有机层用na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。然后将其通过制备型tlc纯化(洗脱液：30％etoac+己烷)，得到n-((5-(4-甲基噻吩-3-基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(19mg，68.24％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ12.77(d,j＝41.1hz,1h),8.92(d,j＝39.6hz,1h),7.66(s,1h),7.58(d,j＝7.0hz,2h),7.43(s,2h),7.24(d,j＝43.8hz,1h),6.38(d,j＝20.0hz,1h),4.55
–
4.36(m,2h),2.37(s,1h),2.30(d,j＝14.2hz,2h),1.22(s,1h).lc-ms m/z(m-h):382.1。
[0201]
使用与上述化合物16类似的方法，使用适当的起始材料制备表7中的下列化合物。
[0202]
表7
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209]
[0210]
[0211][0212]
n-((5-(2,5-二羟基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物40)的合成：
[0213][0214]
在0℃下向n-((5-(2,5-二甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(90mg，0.365mmol)于二氯甲烷(5ml)中的经搅拌的溶液中添加bbr3/二氯甲烷(1.0m，4ml)。将所得混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将其用nahco3水溶液(5ml)淬灭并用10％meoh/dcm(2x10ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。将其通过制备型tlc纯化(3％meoh于dcm中)，得到n-((5-(2,5-二羟基苯基)-1h-吡唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺，为灰白色固体(24mg，34.28％)。1h nmr(400mhz,dmso)δ12.80(d,1h),9.85(d,1h),8.93(d,2h),7.62(d,2h),7.45(s,2h),6.99(s,1h),6.71(s,1h),6.59(s,2h),4.47(d,2h)lc-ms(esi):m/z 393.9(m+h)
+
[0215]
使用与上述化合物40类似的方法，使用适当的起始材料制备表8中的下列化合物。
[0216]
表8
[0217]
[0218]
[0219]
[0220][0221]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物126)的合成：
[0222][0223]
步骤-1：2-甲氧基苯并硫代酰胺的合成
[0224][0225]
在0℃下向2-甲氧基苯甲腈(130g，977mmol)于吡啶(1200ml)中的经搅拌的溶液中添加硫化铵溶液(650ml，5vol)，随后添加三乙胺(150ml，1075mmol)。然后将反应混合物在55℃下搅拌12h。通过tlc(30％etoac/己烷)监测反应。反应完成后，用冷水(4.0l)稀释，过滤固体，减压干燥，得到2-甲氧基苯并硫代酰胺(145g，产率：89％)，为黄色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.94br(s,1h),9.30(brs,1h),7.68(d,j＝7.6hz,1h),7.36(t,j＝8.0hz,1h),7.04(d,j＝8.4hz,1h),6.94(t,j＝7.2hz,1h),3.79(s,3h)。
[0226]
步骤-2：((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯的合成
[0227]
[0228]
将2-甲氧基苯并硫代酰胺(61g，365mmol)和(2-肼基-2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(207g，1095mmol)/吡啶(300ml)中的经搅拌的溶液在120℃下加热48h。通过tlc监测反应完成后，用水(500ml)稀释并用etoac(2x600ml)萃取，分离有机层，用饱和nh4cl溶液(500ml)、盐水溶液(500ml)洗涤，用na2so4干燥，过滤并蒸发，得到粗化合物。用乙醚洗涤粗产物，得到((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(27g，产率：24％)，呈灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.45(s,1h),8.03(d,j＝7.2hz,1h),7.44(t,j＝7.6hz,1h),7.22-7.16(m,2h),7.06(t,j＝7.2hz,1h),4.18(d,j＝5.6hz,2h),3.94(s,3h),1.38(s,9h).lc-ms m/z(m+h):305.0.
[0229]
步骤-3：(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐的合成：
[0230][0231]
在0℃下经10分钟向((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(27g，89mmol)于dcm(150ml)中的经搅拌的溶液中添加4m hcl/1,4-二噁烷-hcl(54ml，2vol)。将反应物在室温下搅拌4h。tlc显示起始材料的完成和极性点的形成(5％meoh/dcm)。反应完成后，用石油醚(200ml)稀释，过滤形成游离固体，用乙醚(200ml)洗涤固体，真空干燥，得到(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(25g，产率：99％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.66(brs,3h),8.05(d,j＝8.0hz,1h),7.51-7.47(m,1h),7.22(d,j＝8.4hz,1h),7.10(t,j＝7.6hz,1h),6.01(brs,3h),4.13(d,j＝5.6hz,2h),3.95(s,3h).lc-ms m/z(m+h):205.1。
[0232]
步骤-4：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺的合成：
[0233][0234]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)苯甲酸(20g，104mmol)于dcm(500ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(30g，156mmol)、hobt(21g，156mmol)、(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(25g，104mmol)且随后添加三乙胺(44ml，312mmol)。将反应物在室温下搅拌12h。反应完成后，通过硅藻土床过滤固体，所得滤液用饱和nahco3溶液(500ml)、饱和nh4cl溶液(1lit)和盐水溶液洗涤一次。分离有机层，用na2so4干燥，减压浓缩，得到粗产物。将得到的粗产物用乙腈(500ml)研磨，搅拌1h，过滤并用乙醚(100ml)洗涤，并真空干燥，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(19g，产率：56％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ13.55(s,1h),8.76(bs,1h),8.07(d,j＝7.6hz,1h),7.61(d,j＝7.6hz,1h),7.52(t,j＝7.6hz,1h),7.45(t,j＝8.0hz,1h),7.36-6.99(m,5h),4.53(d,j＝5.6hz,2h),3.94(s,3h).lc-ms m/z(m+h):374.9。
[0235]
制备2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，化合物126的替代方案：
[0236][0237]
步骤1：n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺的合成
[0238][0239]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)苯甲酸(5g，26mmol)于dmf(20ml)中的经搅拌的溶液中添加hatu(15.1g，39.8mmol)、dipea(10.3g，79mmol)和2-氨基乙腈hcl(2.4g，26mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌16h。通过tlc证实反应完成后，将反应混合物用冰冷水(50ml)稀释并用etoac(2x50ml)萃取，分离有机层，用冰冷水(3x100ml)洗涤，然后用盐水溶液(2x100ml)洗涤，最后用na2so4干燥，减压浓缩，得到粗化合物。将得到的粗产物溶于乙醚(50ml)，然后用戊烷(2x50ml)研磨，过滤沉淀的固体，真空干燥，得到n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(3.5g，产率～58％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):8.98(t,j＝5.2hz,10.4hz,1h),7.56(t,j＝8hz,16.4hz,2h),7.33(t,j＝8hz,15.6hz,1h),7.26(d,j＝8hz,1h)6.99(d,j＝73.6hz,1h),4.29(d,j＝5.6hz,2h).lc-ms m/z(m-h):227.1
[0240]
阶段-2：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺的合成
[0241][0242]
向n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(3.5g，13.78mmol)和2-甲氧基苯甲酰肼(3.44g，20.6mmol)于n-buoh(20ml)中的经搅拌的溶液中添加碳酸钾(0.95g，6.89mmol)。将所得反应混合物在110℃下加热16h。通过tlc证实反应完成后，将反应混合物真空蒸发，并用水(50ml)稀释，接着用etoac(2
×
50ml)萃取，分离有机层，用盐水溶液(20ml)、水(50ml)洗涤，最后用na2so4干燥，浓缩，得到棕色粗化合物。将得到的粗产物用乙腈(5ml)稀释，搅拌15分钟，过滤沉淀的白色固体，用乙醚(2x20ml)洗涤，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(brg-0399)(1.9g，产率～37％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ13.5(s,1h),8.76(s,1h),8.06(d,j＝7.6hz,1h),7.60(d,j＝7.2hz,1h),7.52(t,j＝7.6hz,15.2hz,1h),7.45(t,j＝7.6hz,15.2hz,1h),7.36-6.99(m,5h),4.52(d,j＝5.2hz,2h),3.94(s,3h).lc-ms m/z(m-h):375.1。
[0243]
使用与上述化合物126类似的方法，使用适当的起始材料制备表9中的下列化合物。
[0244]
表9
[0245]
[0246]
[0247][0248]
n-((5-(3-甲氧基吡啶-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物34)的合成：
[0249][0250]
步骤1：3-甲氧基吡啶甲酸甲酯
[0251][0252]
在0℃下向3-甲氧基吡啶甲酸(1g，7.19mmol)于丙酮(10ml)中的经搅拌的溶液中添加k2co3(2.48g，17.97mmol)，然后添加甲基碘(2.23g，15.75mmol)。将混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物浓缩并用h2o(25ml)稀释并用etoac(2x15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并在旋转蒸发仪上浓缩，得到粗化合物。通过快速柱色谱纯化粗产物，得到3-甲氧基吡啶甲酸甲酯，为黄色浆液(570mg，47.50％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ8.16(dd,j＝4.5,1.1hz,1h),7.64(d,j＝8.6hz,1h),7.54(dd,j＝8.6,4.5hz,1h),3.84(s,3h),3.82(s,3h).lc-ms(esi):m/z 168.1(m+h)
+
[0253]
步骤2：3-甲氧基吡啶甲酰肼
[0254][0255]
在室温下向3-甲氧基吡啶甲酸甲酯(560mg，3.33mmol)于乙醇(10ml)中的经搅拌的溶液中添加水合肼(213mg，6.66mmol)并且在70℃下搅拌12h。反应完成后，将混合物浓缩并将由此得到的粗化合物用石油醚研磨，得到3-甲氧基吡啶甲酰肼，为棕色浆液(530mg，94.6％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ9.40(s,1h),8.10(d,j＝4.5hz,1h),7.53(d,j＝8.4hz,1h),7.43(dd,j＝8.5,4.6hz,1h),4.43(s,2h),3.79(s,3h).lc-ms(esi):m/z 168.2(m+h)
+
[0256]
步骤3：n-(氰基甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺
[0257][0258]
在0℃下向2-(三氟甲氧基)苯甲酸(2g，9.7mmol)于dmf(10ml)中的经搅拌的溶液中添加hatu(5.5g，14.56mmol)和dipea(3.76g，29.12mmol)。将所得混合物搅拌10min，然后添加2-氨基乙腈2(897mg，9.70mmol)，并在室温下搅拌12小时。反应完成后，将反应混合物用冰冷水(100ml)稀释并用etoac(2x20ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并真空浓缩。通过combi-flash柱色谱(洗脱液：40％etoac于己烷中)纯化得到的粗产物，得到n-(氰基甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺，为白色固体(1.8g，82.19％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ9.18(s,1h),7.65-7.60(m,2h),7.48(dd,j＝14,3.5hz,2h),4.30(d,j＝5.6hz 2h).lc-ms(esi):m/z 245.1(m+h)
+
[0259]
步骤4：n-((5-(3-甲氧基吡啶-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺
[0260]
[0261]
向n-(氰基甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺/正丁醇(2ml)中的经搅拌的溶液中添加3-甲氧基吡啶甲酰肼(44.34mg，0.26mmol)和k2co3(15.20mg，0.11mmol)，使其在微波下于165℃下搅拌30min。反应完成后，将反应混合物用冷水稀释，用etoac(2x10ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥，真空浓缩，得到粗化合物。通过制备型tlc纯化所述粗化合物，得到n-((5-(3-甲氧基吡啶-2-基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(30mg，34.5％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ14.01(s,1h),8.95(s,1h),8.27(s,1h),7.69
–
7.56(m,3h),7.52
–
7.39(m,3h),4.54(s,2h),3.92(s,3h).lc-ms(esi):m/z 394.1(m+h)
+
[0262]
2-(二氟甲氧基)-n-(1-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)环丙基)苯甲酰胺(化合物118)的合成：
[0263][0264]
步骤1：n-(1-氰基环丙基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺
[0265][0266]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)苯甲酸(1g，5.32mmol)和1-氨基环丙烷-1-甲腈盐酸盐(747mg，6.40mmol)于dmf(20ml)中的经搅拌的溶液中添加tea(3.0ml，21.28mmol)，edc.hcl(1.52mg，7.98mmol)和hobt(1.07mg，7.98mmol)。然后将所得反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用冰冷水稀释并用etoac萃取。将合并的有机层用冰冷水(3
×
100ml)、盐水(2
×
100ml)洗涤，并用na2so4干燥。浓缩，然后使用快速柱色谱纯化粗产物，得到n-(1-氰基环丙基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(560mg，产率：42％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso):δ9.20(s,1h),7.51-7.56(m,2h),6.94-7.34(m,3h),1.53-1.57(m,2h),1.18-1.22(m,2h).lc-ms(esi):m/z 400.1(m+h)
+
[0267]
步骤2：2-(二氟甲氧基)-n-(1-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)环丙基)苯甲酰胺
[0268][0269]
在室温下向n-(1-氰基环丙基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(200mg，0.79mmol)、2-甲氧基苯甲酰肼(200mg，1.2mmol)在n-buoh中的经搅拌的溶液中添加k2co3(100mg，0.72mmol)。将所得反应混合物在120℃下加热16h。反应完成后，将混合物真空浓缩，并用水稀释，并用etoac萃取。有机层用盐水、水洗涤，最后用na2so4干燥。在旋转蒸发仪上浓缩，然
后在快速柱色谱上纯化，得到2-(二氟甲氧基)-n-(1-(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)环丙基)苯甲酰胺(50mg，产率：16％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.37(s,1h),9.04(s,1h),7.99(d,j＝7.6hz,1h),7.58(d,j＝7.6hz,1h),7.52(t,j＝8.0hz,1h),7.44(t,j＝7.2hz,1h),6.94-7.37(m,6h),3.93(s,3h),1.41(s,2h),1.20-.132(m,4h).lc-ms(esi):m/z 400.1(m+h)
+
[0270]
2-(二氟甲氧基)-5-氟-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物138)的合成：
[0271][0272]
步骤1：2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲醛：
[0273][0274]
在-20℃下向koh(8.09g，142.8mmol)于乙腈(20ml)和水(20ml)中的经搅拌的溶液中添加4-氟-2-羟基苯甲醛(1g，7.14mmol)，随后经30min滴加(溴二氟甲基)膦酸二乙酯(3.80g，14.28mmol)。反应完成后，将混合物用etoac(20ml)稀释，分离有机层并用na2so4干燥。浓缩有机层，然后通过快速柱色谱(洗脱液：10％etoac于己烷中)纯化粗化合物，得到2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲醛，为黄色浆液(700mg，51.8％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ10.20(d,j＝2.8hz,1h),7.65(ddd,j＝9.0,8.0,3.3hz,1h),7.59(dd,j＝8.3,3.2hz,1h),7.46(dd,j＝9.0,4.2hz,1h),7.32(t,j＝73.6hz,1h)。
[0275]
步骤2：2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲酸：
[0276][0277]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲醛(500mg，2.62mmol)于thf:叔丁醇:h2o(10ml)中的经剧烈搅拌的溶液中添加磷酸二氢钠(1.02g，6.56mmol)，接着依序添加2-甲基-2-丁烯(473.4ml，2.29mmol)和naclo2。使混合物温热至室温并搅拌1h。反应完成后，用1n hcl(5ml)酸化反应混合物，并用etoac(2x25ml)萃取。将合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲酸，为白色固体(400mg，73.93％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.49(s,1h),7.61(dd,j＝8.7,3.2hz,1h),7.49(ddd,j＝8.9,8.0,3.3hz,1h),7.34(dd,j＝9.0,4.5hz,1h),7.10(t,j＝74.3hz,1h).gc-ms(esi):m/z 206(m)
+
[0278]
步骤3：2-二氟甲氧基-5-氟-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺：
[0279][0280]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲酸(100mg，0.48mmol)于二氯甲烷(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(113.02mg，0.72mmol)、hobt(98.37mg，0.72mmol)和tea(147.07mg，1.45mmol)。将所得混合物搅拌10min，然后添加(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(139.8mg，0.58mmol)。将混合物温热至室温并搅拌12h。完成后，将反应混合物依次用饱和nh4cl(20ml)、饱和nahco3溶液(20ml)和盐水(20ml)洗涤一次。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩。将通过快速柱色谱(洗脱液：40％etoac于己烷中)纯化由此得到的粗产物，得到化合物2-(二氟甲氧基)-5-氟-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(60mg，31.5％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.56(s,1h),8.89(s,1h),8.06(d,j＝7.6hz,1h),7.49
–
7.36(m,4h),7.31(t,j＝4.3hz,1h),7.19(d,j＝8.4hz,1h),7.12(t,j＝68hz,1h)7.07(t,j＝7.5hz,1h),6.94(s,2h),4.53(d,j＝5.6hz,2h),3.95(s,3h).lc-ms(esi):m/z 393.3(m+h)
+
[0281]
2-(二氟甲氧基)-5-氟-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺的合成
[0282][0283]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)-5-氟苯甲酸(100mg，0.48mmol)于二氯甲烷(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(113.02mg，0.72mmol)、hobt(98.37mg，0.72mmol)和tea(147.07mg，1.45mmol)。将所得混合物搅拌10min，然后添加(5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲氧胺盐酸盐(129.36mg，0.58mmol)。将混合物温热至室温并搅拌12h。反应完成后，将反应混合物依次用饱和nh4cl(20ml)、饱和nahco3溶液(20ml)和盐水(20ml)洗涤一次。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩。通过快速柱色谱(洗脱液：40％etoac于己烷中)纯化由此得到的粗产物，得到2-(二氟甲氧基)-5-氟-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(40mg，20.10％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.70(s,1h),8.90(s,1h),7.77(s,1h),7.46
–
7.37(m,2h),7.31(t,j＝4.4hz,2h),7.21(dd,j＝8.8,4.3hz,1h),7.13(t,j＝64hz,1h),4.53(d,j＝5.5hz,2h),3.94(s,3h).lc-ms(esi):m/z 411.1(m+h)
+
。
[0284]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)烟酰胺(化合物143)和2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)烟酰胺(化合物144)的合成
[0285]
步骤1：2-羟基烟酸甲酯：
[0286][0287]
在0℃下向2-羟基烟酸(5g，27.8mmol)于甲醇(75ml)中的经搅拌的溶液中添加亚硫酰氯(5ml)并在75℃下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物真空浓缩，得到粗产物。将混合物用饱和nahco3溶液(20ml)碱化并用10％甲醇/二氯甲烷(2
×
25ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并减压浓缩，得到2-羟基烟酸甲酯，为灰白色固体(2.3g，41.8％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ12.08(s,1h),8.04(dd,j＝7.1,2.2hz,1h),7.65(dd,j＝6.3,2.2hz,1h),6.25(t,j＝6.7hz,1h),3.71(s,3h).lc-ms(esi):m/z 154.1(m+h)
[0288]
步骤2：2-(二氟甲氧基)烟酸甲酯：
[0289][0290]
在0℃下向2-羟基烟酸甲酯(1.9g，12.4mmol)于dmf中的经搅拌的溶液中分批添加氢化钠(357mg，14.9mmol)并搅拌10min，然后添加2-氯-2,2-二氟乙酸(1.94g，14.9mmol)并
在125℃下搅拌2h。反应完成后，将混合物用冰冷水(25ml)稀释并用10％甲醇/二氯甲烷(2
×
10ml)萃取。减压浓缩合并的有机层以得到粗化合物。将其通过快速柱色谱纯化，得到2-(二氟甲氧基)烟酸甲酯，为浅棕色固体。1h nmr(400mhz,dmso):δ8.48(dd,j＝4.9,1.9hz,1h),8.33(dd,j＝7.6,1.9hz,1h),7.79(t,j＝72.2hz,2h),7.42(dd,j＝7.6,4.9hz,1h),3.87(s,3h).lc-ms(esi):m/z 154.1(m+h)
[0291]
步骤3：2-(二氟甲氧基)烟酸：
[0292][0293]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)烟酸甲酯(260mg，1.27mmol)于thf:h2o(10ml:5ml)中的经搅拌的溶液中添加lioh(122.8mg，5.1mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物浓缩，用h2o(10ml)稀释并用etoac(2
×
10ml)萃取。分离水层并用1n hcl溶液(5ml)酸化，并且接着用10％甲醇/二氯甲烷(2
×
15ml)萃取。将合并的有机层经na2so4干燥并真空浓缩，得到2-(二氟甲氧基)烟酸，为灰白色固体(60mg，24.7％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.44(s,1h),8.43(dd,j＝4.9,1.9hz,1h),8.30(dd,j＝7.6,1.9hz,1h),7.78(t,j＝72.4hz,1h),7.39(dd,j＝7.6,4.9hz,1h)。
[0294]
步骤4：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)烟酰胺(化合物143)：
[0295][0296]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)烟酸(70mg，0.37mmol)于ch2cl2(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(106.4mg，0.55mmol)、hobt(75.01mg，0.55mmol)和三乙胺(112mg，1.11mmol)。将所得混合物搅拌10min，并添加(5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(95.74mg，0.37mmol)，并在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物依次用饱和nh4cl(20ml)、饱和nahco3溶液(20ml)和盐水(20ml)洗涤。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。然后通过快速柱色谱(洗脱液：50％etoac于己烷中)纯化得到的粗产物，得到产物2-(二氟甲氧基)-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)烟酰胺，为灰白色固体(60mg，41.23％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.73(s,1h),8.83(s,1h),8.35(dd,j＝4.9,1.9hz,1h),8.11(dd,j＝7.5,1.8hz,1h),7.74(t,j＝72.1hz,1h),7.81(dd,j＝9.4,3.2hz,1h),7.42
–
7.29(m,2h),7.22(dd,j＝9.1,4.5hz,1h),4.56(d,j＝5.5hz,2h),3.95(s,3h).lc-ms(esi):m/z 394.2(m+h)
[0297]
步骤5：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)烟酰胺(化合物144)：
[0298][0299]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)烟酸(50mg，0.26mmol)于ch2cl2(10ml)中的经搅拌的溶液中添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(76.02mg，0.39mmol)、羟基苯并三唑(53.58mg，0.39mmol)和三乙胺(80.10mg，0.79mmol)。将所得混合物搅拌10min，然后添加(5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(63.6mg，0.26mmol)并在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用nh4cl水溶液稀释并用二氯甲烷萃取。将有机层依次用1n hcl、nh4co3水溶液和盐水洗涤。有机层经mgso4干燥，真空浓缩，并通过快速柱色谱纯化由此得到的粗化合物，得到产物，为白色固体(60mg，76％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.58(s,1h),8.82(s,1h),8.35(dd,j＝4.9,1.8hz,1h),8.09(t,j＝8.1hz,2h),7.73(t,j＝72.1hz,1h),7.46(t,j＝7.5hz,1h),7.37(dd,j＝7.5,4.9hz,1h),7.19(d,j＝8.4hz,1h),7.07(t,j＝7.5hz,1h),4.56(d,j＝5.4hz,2h),3.95(s,3h).lc-ms(esi):m/z376.1(m+h))
[0300]
使用与上述那些类似的方法，使用适当的起始材料制备表10中的下列化合物。
[0301]
表10
[0302]
[0303]
[0304][0305]
2-(二氟甲氧基)-3-氟-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物135)和2-(二氟甲氧基)-3-氟-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物136)的合成：
[0306][0307]
步骤1：2-(二氟甲氧基)-3-氟苯甲酸甲酯
[0308][0309]
向koh(6.58g，117.5mmol)于水(30ml)中的经冷搅拌的溶液中添加乙腈(30ml)且将溶液进一步冷却至-20℃。向所得混合物中添加2-氟-6-羟基苯甲酸甲酯(1g，5.87mmol)，接着滴加(溴二氟甲基)膦酸二乙酯(3.13g，11.7mmol)，并将反应混合物在-20℃下搅拌30min。反应完成后，将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机层经mgso4干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱纯化粗化合物，得到化合物2-(二氟甲氧基)-3-氟苯甲酸甲酯，为黄色浆液(520mg，40.31％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ7.69-7.64(m,2h),7.47-7.43(m,1h),7.12(t,j＝73.6hz,1h),3.98(s,3h)。
[0310]
步骤2：2-(二氟甲氧基)-3-氟苯甲酸
[0311][0312]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)-6-氟苯甲酸甲酯(500mg，2.27mmol)于thf:h2o(2:1)中的经搅拌的溶液中添加lioh(954.5mg，22.7mmol)并在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用1n hcl酸化，然后用10％甲醇/ch2cl2溶液萃取，将有机层用mgso4干燥并真空浓缩，得到2-(二氟甲氧基)-3-氟苯甲酸，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.53(s,1h),7.70
–
7.57(m,2h),7.44(dt,j＝13.2,6.6hz,1h),7.10(t,j＝73.8hz,1h)。
[0313]
步骤3：2-(二氟甲氧基)-3-氟-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物135)：
[0314][0315]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)-3-氟苯甲酸(100mg，0.48mmol)于ch2cl2(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(139.07mg，0.72mmol)、hobt(111.50mg，0.72mmol)和三乙胺(147mg，1.45mmol)。将所得混合物搅拌10min，且添加(5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(125mg，0.48mmol)，并在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用nh4cl水溶液稀释并用ch2cl2萃取。然后有机层依次用1n hcl、nh4co3水溶液和盐水洗涤。然后有机层经mgso4干燥，真空浓缩，得到粗产物。然后将其通过快速柱色谱纯化，得到产物2-(二氟甲氧基)-3-氟-n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为灰白色固体(70mg，35.17 1
h nmr(400mhz,dmso):δ13.71(s,1h),8.98(d,j＝5.2hz,1h),8.04-8.01(m,1h),7.89(dd,j＝9.2,3.2hz,1h),7.43(d,j＝8.4hz,1h),7.35-7.29(m,2h),7.23-7.20(m,1h),7.37(t,j＝73.2hz,1h),4.53(d,j＝5.2hz,2h),3.94(s,3h)
[0316]
步骤4：2-(二氟甲氧基)-6-氟-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物36)：
[0317]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)-3-氟苯甲酸(100mg，0.48mmol)于二氯甲烷(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(139.07mg，0.72mmol)、hobt(111.50mg，0.72mmol)和三乙胺(147mg，1.45mmol)。将得到的混合物搅拌10min，且添加((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(116.53mg，0.48mmol)，并在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用nh4cl水溶液稀释并用ch2cl2萃取。然后有机层依次用1n hcl、nh4co3水溶液和盐水洗涤。然后有机层经mgso4干燥并浓缩，得到粗产物。通过快速柱色谱纯化粗化合物，得到产物2-(二氟甲氧基)-6-氟-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺，为白色固体(70mg，36.75％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.55(s,1h),8.97(s,1h),8.06(d,j＝7.7hz,1h),7.56
–
7.38(m,4h),7.12(ddd,j＝67.7,53.3,45.4hz,3h),4.52(d,j＝5.6hz,2h),3.95(s,3h).lc-ms(esi):m/z 393.29(m+h)
[0318]
n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物127)的实例：
[0319][0320]
在0℃下向2-(三氟甲氧基)苯甲酸(250mg，1.21mmol)于ch2cl2(10ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(348.93mg，1.82mmol)、hobt(278.72mg，1.82mmol)、三乙胺
(367.68mg，3.63mmol)。将所得混合物搅拌10min，且添加(5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲胺盐酸盐(313.12mg，1.21mmol)，并在室温下再搅拌12小时。反应完成后，将混合物用nh4cl水溶液稀释并用ch2cl2萃取。然后有机层依次用1n hcl、nh4co3水溶液和盐水洗涤。然后将其经mgso4干燥并真空浓缩，得到粗化合物，将其通过快速柱色谱纯化，得到产物n-((5-(5-氟-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺，为灰白色固体(300mg，60％)。1h nmr(400mhz,dmso):δ13.68(s,1h),8.92(s,1h),7.79(d,j＝7.8hz,1h),7.60(dd,j＝16.6,7.6hz,2h),7.45(dd,j＝21.1,7.7hz,2h),7.32(s,1h),7.22(s,1h),4.52(d,j＝5.3hz,2h),3.94(s,3h).lc-ms(esi):m/z 411.24(m+h)
[0321]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物60)的合成：
[0322][0323]
步骤1：2-羟基苯甲酸甲酯
[0324][0325]
在0℃下向2-羟基苯甲酸(1g，6.57mmol)于甲醇中的经搅拌的溶液中添加h2so4(0.8ml)。然后将反应混合物加热至75℃并搅拌8h。反应完成后，将混合物真空浓缩，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到2-羟基苯甲酸甲酯(1.8g，产率：81％)，为无色液体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.49(s,1h),7.83(d d,j＝8.0hz,1.6hz,1h),7.54
–
7.50(m,1h),6.90-6.91(m,2h),3.88(s,3h)。
[0326]
步骤2：2-羟基苯甲酰肼
[0327][0328]
在室温下向2-羟基苯甲酸甲酯(1g，6.57mmol)于乙醇中的经搅拌的溶液中添加水合肼(1ml)。将反应混合物加热回流3h。反应完成后，将混合物真空浓缩，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到2-羟基苯甲酰肼(480mg，产率：48％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ12.50(brs,1h),10.05(brs,1h),15.60(d d,j＝8.0hz,1.2hz,1h),7.38
–
7.34(m,1h),6.89
–
8.82(m,2h),4.64(brs,2h).lc-ms(m/z):153.1(m+h)+
[0329]
步骤3：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物60)：
[0330][0331]
在室温下向n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(200mg，0.88mmol)和2-羟基苯甲酰肼(202mg，1.32mmol)于n-buoh中的经搅拌的溶液中添加k2co3(61mg，0.44mmol)。将所得反应混合物于165℃下微波辐照50min。反应完成后，将混合物真空浓缩，得到粗产物，将其通过快速柱色谱纯化，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(110mg，产率：35％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ14.18(brs,1h),11.42(brs,1h),8.85(brs,1h),7.92(brs,1h),7.64
–
7.53(m,2h),7.33
–
6.96(m,6h),4.61(d,j＝2.8hz,2h).lc-ms(m/z):361.1(m+h)+
[0332]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2,3-二羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物61)的合成：
[0333][0334]
步骤1：3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯
[0335][0336]
向2,3-二羟基苯甲酸甲酯(1g，5.95mmol)于氯仿和甲醇的混合物中的经搅拌的溶液中添加k2co3(3.3g，23.8mmol)和苄基溴(0.85ml，7.14mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌8h。反应完成后，将混合物真空浓缩，将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。将有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物，将其通过快速柱色谱纯化，得到5-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(600mg，产率：38％)，为无色液体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.09(s,1h),7.43(d,j＝7.2hz,2h),7.38(t,j＝7.2hz,2h),7.33
–
7.29(m,2h),7.24
–
7.21(m,1h),6.93(d,j＝8.8hz,1h),5.05(s,2h),3.88(s,3h).lc-ms(m/z):259.07(m+h)
+
[0337]
步骤2：3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酰肼
[0338][0339]
在室温下向5-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(600mg，2.32mmol)于乙醇中的经搅拌的溶液中添加水合肼(1ml)。然后将反应混合物回流3h。反应完成后，将混合物真空浓缩并将反应混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酰肼(430mg，产率：43％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ9.21(s,1h),7.43(d,j＝7.2hz,2h),7.37(t,j＝6.8hz,2h),7.32
–
7.30(m,2h),7.09(dd,j＝9.2hz,3.2hz,1h),7.08(d,j＝8.8hz,1h),5.07(s,2h),4.51(brs,2h),3.79(s,1h).lc-ms(m/z):273.17(m+h)
+
[0340]
步骤3：n-((5-(3-(苄氧基)-2-羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺
[0341][0342]
在室温下向n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(200mg，0.88mmol)和3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酰肼(300mg，1.16mmol)于n-buoh中的经搅拌的溶液中添加k2co3(61mg，0.44mmol)。将反应混合物于165℃下微波辐照50min。反应完成后，将混合物真空浓缩，得到粗产物。然后将其通过快速柱色谱纯化，得到n-((5-(3-(苄氧基)-2-羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(120mg，产率：29％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ14.37(s,1h),11.53(brs,1h),11.25(brs,1h),8.90(brs,1h),7.53
–
7.52(m,2h),7.47(d,j＝7.6hz,2h),7.40
–
7.30(m,5h),7.25(d,j＝7.6hz,1h),7.14(s,1h),6.83(brs,1h),5.15(s,2h),4.65(brs,2h).lc-ms(m/z):467.2(m+h)
+
[0343]
步骤4：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2,3-二羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物61)：
[0344][0345]
在室温下向n-((5-(3-(苄氧基)-2-羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(120mg，0.25mmol)于乙醇中的经搅拌的溶液中添加pd/c(100mg)。将反应混合物在室温下在50psi的氢气气氛下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土床过滤并减压浓缩以得到粗产物，将其通过制备型hplc纯化，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2,3-二羟基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(30mg，产率：18％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ11.27(brs,1h),9.20(brs,1h),9.17(s,1h),7.60(d,j＝
7.2hz,1h),7.55(t,j＝8.0hz,1h),7.37
–
7.32(m,2h),7.26(d,j＝8.4hz,1h),7.15(s,1h),6.75(t,j＝8hz,1h),4.60(brs 2h),3.15(s,1h).lc-ms(m/z):377.10(m+h)
+
[0346]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(5-羟基-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物63)的合成：
[0347][0348]
步骤1：5-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯
[0349][0350]
向2,5-二羟基苯甲酸甲酯(1g，5.95mmol)于氯仿和甲醇中的经搅拌的溶液中添加k2co3(3.3g，23.8mmol)和苄基溴(0.85ml，7.14mmol)。然后将反应混合物在60℃下搅拌8h。反应完成后，将混合物真空浓缩，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩。通过快速柱色谱纯化由此得到的粗产物，得到5-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(470mg，产率：30％)，为无色液体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.09(s,1h),7.43(d,j＝7.2hz,2h),7.38(t,j＝7.2hz,2h),7.33
–
7.29(m,2h),7.24
–
7.21(m,1h),6.93(d,j＝8.8hz,1h),5.05(s,2h),3.88(s,3h).lc-ms(m/z):259.07(m+h)
+
[0351]
步骤2：5-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯
[0352][0353]
向5-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(1.2g，4.65mmol)于dmf中的经搅拌的溶液中添加k2co3(1.29g，9.3mmol)和碘甲烷(0.44ml，6.9mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到5-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1.0g)，为无色液体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ7.42(d,j＝6.8hz,2h),7.38(t,j＝7.2hz,2h),7.32(t,j＝4.8hz,1h),7.25(d,j＝3.2hz,1h),7.15(d d,j＝8.8hz,3.2hz,1h),7.07(d,j＝8.0hz,1h),5.07(s,2h),3.76(s,3h),3.74(s,3h).lc-ms(m/z):273.10(m+h)
+
[0354]
步骤3：5-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酰肼
[0355][0356]
在室温下向5-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(1g，3.6mmol)于乙醇中的经搅拌的溶液中添加水合肼(1ml)。将所得反应混合物回流3h。反应完成后，将混合物真空浓缩，用水稀释并用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥并浓缩，得到5-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酰肼(430mg，产率：43％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ9.21(s,1h),7.43(d,j＝7.2hz,2h),7.37(t,j＝6.8hz,2h),7.32
–
7.30(m,2h),7.09(dd,j＝9.2hz,3.2hz,1h),7.08(d,j＝8.8hz,1h),5.07(s,2h),4.51(brs,2h),3.79(s,1h).lc-ms(m/z):273.17(m+h)
+
[0357]
步骤4：n-((5-(5-(苄氧基)-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺
[0358][0359]
在室温下向n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(200mg，0.88mmol)和5-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酰肼(360mg，1.32mmol)于n-buoh中的经搅拌的溶液中添加k2co3(61mg，0.44mmol)。将反应混合物于165℃下微波辐照50min。然后将所得反应混合物真空浓缩，得到粗产物(200mg)，其不经进一步纯化即用于下一步骤。
[0360]
步骤5：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(5-羟基-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物63)：
[0361][0362]
在室温下向n-((5-(5-(苄氧基)-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(200mg，0.42mmol)于乙醇中的经搅拌的溶液中添加pd/c(160mg)。将反应混合物在室温下在氢气气氛(50psi)下搅拌12h。将所得反应混合物通过硅藻土床过滤并减压浓缩以得到粗产物。将其通过制备型hplc进一步纯化，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(5-羟基-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(30mg，产率：18％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ13.45(s,1h),9.20(s,1h),8.75(brs,1h),7.60(d,j＝7.6hz,1h),7.54
–
7.50(m,2h),7.35
–
7.33(m,1h),7.24(d,j＝8.4hz,1h),7.16(s,1h),7.01
–
6.98(m,1h),6.82(d,j＝3.2hz,1h),4.52(d,j＝5.6hz,2h),3.85(s,3h).lc-ms(m/z):391.10(m+h)
+
[0363]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(3-羟基-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯
甲酰胺(化合物62)的合成：
[0364][0365]
步骤-1：3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯的合成
[0366][0367]
在0℃下向2,3-二羟基苯甲酸甲酯(1)(500mg，2.973mmol)于丙酮(10ml)中的经搅拌的溶液中添加k2co3(410mg，2.973mmol)，然后添加(溴甲基)苯(423.8mg，3.568mmol)和四丁基溴化铵(191.7mg，0.594mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。将所得反应混合物减压浓缩并将由此获得的粗产物用冷水稀释并用乙酸乙酯(2
×
20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水na2so4干燥并减压浓缩。将由此得到的粗产物通过柱色谱(使用2％etoac于正己烷中)纯化，得到白色固体3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(100mg，13％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.60(s,1h),7.45(d,j＝7.2hz,2h),7.40
–
7.29(m,4h),7.27(d,j＝8hz,1h),6.84(t,j＝8hz,1h),5.14(s,2h),3.89(s,3h).lc-ms(m/z):259.30(m+h)
+
[0368]
步骤-2：3-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯的合成
[0369][0370]
在0℃下向3-(苄氧基)-2-羟基苯甲酸甲酯(500mg，1.937mmol)于dmf(20ml)中的经搅拌的溶液中添加k2co3(410mg，2.973mmol)，然后添加碘甲烷(412.4mg，2.905mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用冰水淬灭并用乙酸乙酯(3
×
20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水na2so4干燥并减压浓缩。将得到的固体用乙醚研磨并真空干燥，得到3-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(450mg，85.3％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ17.45(d,j＝7.2hz,2h),7.39(t,j＝7.2hz,2h),7.35
–
7.31(m,2h),7.09(dd,j＝8.4hz,1.6hz,1h),7.04(t,j＝7.6hz,1h),5.14(s,2h),3.95(s,3h),3.91(s,3h)。
[0371]
步骤-3：3-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酰肼的合成
[0372][0373]
在0℃下向3-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(450mg，1.65mmol)在乙醇(20ml)中的经搅拌的溶液中添加水合肼(0.5ml)。将所得反应混合物在90℃下搅拌12h并浓缩。将获得的残余物用冰冷水稀释并用乙酸乙酯(3
×
20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水na2so4干燥并减压浓缩。将得到的固体用二乙基醚研磨并减压干燥，得到3-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酰肼(250mg，55.5％)，为灰白色固体。
[0374]1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ9.27(s,1h),7.47(d,j＝7.6hz,2h),7.40(t,j＝7.2hz,2h),7.33(t,j＝7.2hz,1h),7.21(dd,j＝8.0hz,1.6hz,1h),7.09
–
7.01(m,2h),5.15(s,2h),4.47(brs,2h),2.93(s,3h)。
[0375]
步骤-4：n-((5-(3-(苄氧基)-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺的合成
[0376][0377]
在0℃下向n-(氰基甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(250mg，1.105mmol)于n-buoh(10ml)中的经搅拌的溶液中添加k2co3(76.2mg，0.552mmol)，然后添加3-(苄氧基)-2-甲氧基苯甲酰肼(331mg，1.215mmol)。所得反应混合物于165℃下微波辐射搅拌50min。反应完成后，将混合物用水稀释并用乙酸乙酯(3
×
20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水na2so4干燥并减压浓缩。通过柱色谱(使用60％etoac于正己烷中)纯化由此得到的粗产物，得到n-((5-(3-(苄氧基)-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(170mg，32％)，为棕色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ13.63(s,1h),8.54(t,j＝5.6hz,1h),7.60(t,j＝8.4hz,2h),7.54
–
7.49(m,3h),7.42(t,j＝7.2hz,2h),7.36
–
7.30(m,2h),7.26(t,j＝8.8hz,2h),7.17(t,j＝7.6hz,2h),5.19(s,2h),4.53(d,j＝5.6hz,2h),3.84(s,3h).lc-ms(m/z):481.20(m+h)
+
[0378]
步骤-5：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(3-羟基-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物62)的合成：
[0379][0380]
向n-((5-(3-(苄氧基)-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)-2-(二氟甲氧基)苯甲酰胺(170mg，0.354mmol)于甲醇(20ml)中的经搅拌的溶液中添加pd/c(170mg)。
将在室温下，反应混合物在氢气球下搅拌12h。反应完成后，将混合物通过短硅藻土床过滤，用甲醇洗涤，经无水na2so4干燥并浓缩。通过柱色谱(使用50％etoac于正己烷中)纯化由此得到的粗产物，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(3-羟基-2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)甲基)苯甲酰胺(45mg，32.6％)，为棕色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ9.71(brs,1h),8.79(t,j＝5.2hz,1h),7.62(dd,j＝8.0hz,1.6hz,1h),7.55
–
7.50(m,1h),7.39
–
7.31(m,2h),7.24(d,j＝8.4hz,1h),7.17(s,1h),7.03
–
6.95(m,2h),4.54(d,j＝7.6hz,2h),3.78(s,3h).lc-ms(m/z):391.1(m+h)
+
[0381]
n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)磺酰基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物123)和2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)磺酰基)苯甲酰胺(化合物124)的合成：
[0382][0383]
步骤-1：5-(2-甲氧基苯基)-4h-1,2,4-三唑-3-硫醇：
[0384][0385]
在0℃下向2-甲氧基苯酰肼(2.5g，15.04mmol)于乙醇(25ml)中的经搅拌的溶液中添加异硫氰酸三甲基硅烷酯(1.97g，15.04mmol)且将反应物在90℃下加热4h。然后向所得反应混合物中添加4m naoh溶液(25ml)，并在90℃下再搅拌4h。然后将反应混合物浓缩，用h2o(10ml)稀释并用hcl(40ml，4m)酸化。将得到的沉淀过滤并真空干燥，得到5-(2-甲氧基苯基)-4h-1,2,4-三唑-3-硫醇(2.1g mg，67.37％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ13.61(s,1h),13.11(s,1h),7.63(d,j＝6.4hz,1h),7.49(t,j＝7.2hz,1h),7.15(d,j＝8.4hz,1h),7.04(t,j＝7.2hz,1h),3.83(s,3h).lc-ms(esi):m/z 208.1(m+h)
[0386]
步骤-2：5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-磺酰胺：
[0387]
[0388]
在0℃下向5-(2-甲氧基苯基)-4h-1,2,4-三唑-3-硫醇(500mg，15.04mmol)于二氯甲烷(10ml)中的经搅拌的溶液中滴加4m hcl(10ml)和4％naocl(10ml)，同时维持温度低于5℃，随后在相同温度下进一步搅拌15min。从所得混合物中分离有机层并向其中添加nh4oh水溶液并搅拌12h。反应完成后，收集有机层，并减压浓缩，与甲苯共蒸发除去水，得到5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-磺酰胺，为灰白色固体(2.1g，67.37％)。lc-ms(esi):m/z 255.1(m+h)
[0389]
步骤-3：n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)磺酰基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物123)：
[0390][0391]
在0℃下向5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-磺酰胺(100mg，0.393mmol)和2-(三氟甲氧基)苯甲酸(81.06mg，0.393)于二氯甲烷(20ml)中的经搅拌的溶液中添加edc.hcl(113.09mg，0.589mmol)、hobt(79.58mg，0.588mmol)、dmap(5mg)和三乙胺(98.98mg，0.98mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌12h并浓缩。将所得残余物用h2o(10ml)稀释并用10％甲醇/二氯甲烷(3
×
15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。通过制备型hplc纯化粗化合物，得到n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)磺酰基)-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺，为灰白色固体(14mg，8％)。1h nmr(400mhz,dmso)δ13.75(s,1h),8.08(d,j＝6.8hz,1h),7.33(d,j＝8.0hz,1h),7.46(t,j＝7.2hz,1h),7.40(t,j＝8.4hz,1h),7.32(t,j＝7.6hz,1h),7.20(t,j＝9.6hz,2h),7.09(t,j＝8.0hz,1h),3.95(s,3h).lc-ms(esi):m/z 443.1(m+h)
[0392]
步骤-4：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)磺酰基)苯甲酰胺(化合物124)：
[0393][0394]
在0℃下向5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-磺酰胺(261.20mg，1.065mmol)于二氯甲烷(20ml)中的经搅拌的溶液中添加吡啶(168.48mg，2.130mmol)，新制备的2-(二氟甲氧基)苯甲酰氯(220mg，1.065mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将混合物用h2o(20ml)稀释并用10％甲醇/二氯甲烷(3
×
15ml)萃取。合并的有机层经na2so4干燥并浓缩，得到粗化合物。将其通过制备型hplc纯化，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-1,2,4-三唑-3-基)磺酰基)苯甲酰胺(22mg，4.86％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ7.99(d,j＝8.0hz,1h),7.67(m,1h),7.46(t,j＝8.4hz,1h),7.35(t,j＝7.2hz,1h),6.88-7.21(m,6h),3.94(s,3h).lc-ms(esi):m/z 425.1(m+h)
[0395]
2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)磺酰基)苯甲酰胺(化合
7.37(m,3h),7.18
–
7.16(d,j＝8.4hz,1h),7.05(t,j＝7.6hz,1h),6.97(d,j＝2.0hz,1h),3.89(s,3h)。
[0403]
步骤3：2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)磺酰基)苯甲酰胺(化合物121)：
[0404][0405]
在0℃下向2-(二氟甲氧基)苯甲酸(44mg，0.2371mmol)于dmf(1ml)中的经搅拌的溶液中添加hatu(72.13mg，0.1897mmol)、5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-磺酰胺(40mg，0.1581mmol)和dipea，并将所得混合物在室温下搅拌16h。然后将其用冰冷水淬灭并用乙酸乙酯(2
×
50ml)萃取。将合并的有机层用盐水溶液(50ml)洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩，得到粗产物。通过制备型hplc进一步纯化粗产物，得到2-(二氟甲氧基)-n-((5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基)磺酰基)苯甲酰胺(28mg，41.87％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso)δ13.84(s,1h),12.61(s,1h),7.76(d,j＝7.2hz,1h),7.58(t,j＝6.8hz,1h),7.52(d,j＝7.2hz,1h),7.41(t,j＝7.2hz,1h),7.31(t,j＝6.8hz,1h),7.24
–
6.95(m,5h),3.91(s,3h).lc-ms m/z(m-h):423.39。
[0406]
n-[[5-(2-甲氧基苯基)-1h-吡唑-3-基]磺酰基]-2-(三氟甲氧基)苯甲酰胺(化合物122)：
[0407][0408]
使用针对化合物121所述的方案合成化合物122。产率：25％。lc-ms m/z(m-h):442.1。
[0409]
生物化学和细胞试验
[0410]
小分子调节剂对ube2k多泛素化活性的生物化学调节。
[0411]
在含有0.05％吐温20、4mm atp和10mm mgcl2的50mm tris ph8.0、1mm tcep缓冲液中使用3μm ube2k、300nm ube1和200μm ub进行体外多泛素化活性测定。在各种浓度的化合物下进行反应，在37℃下孵育3小时，并用非还原性样品负载染料淬灭。使用4-20％criterion
tm tgx无染色
tm
蛋白凝胶和4-20％criterion染色凝胶分析样品，并使用biorad imager对无染色和考马斯后染色进行成像。在含有3％dmso的1x pbs-p+(ge)缓冲液中进行化合物滴定。在实验前立即使用新打开的dmso制备运行缓冲液。首先将化合物储备液(于dmso中，由berg提供)稀释到不含dmso的1x pbs-p+中以匹配至3％dmso。该3％dmso匹配溶液的最终浓度通过原始储备液的浓度确定(即对于100mm dmso储备液，3％匹配储备液为3mm)。然后用含有3％dmso的1x pbs-p+(ge)缓冲液将匹配储备液稀释至100μm，并连续稀
释。
[0412]
在无染色凝胶中的多泛素化测定中观察到化合物稳定单泛素化ube2k，这导致多ub产物减少。在染色的凝胶中也观察到相反情况，其中化合物处理后的多泛素化聚合使用了较少的泛素。两种效应都是剂量依赖性的。图1显示了由5个独立实验(n＝5)进行的分析。无染色凝胶利用凝胶内(in-gel)化合物，当暴露于uv光时，其增强色氨酸氨基酸的荧光。天然泛素没有色氨酸残基，而ube2k和ube1含有色氨酸。因此，在无染色凝胶上更容易检测到单-ub ube2k带。
[0413]
ube2k选择性试验
[0414]
本发明化合物对ube2k相对于其它e2的选择性在如上所述的体外多泛素化试验中测试。选择来自e2酶家族的e2-泛素缀合酶，即ube2d4、ube2e1、ube2q2、ube2s和ube2w。观察到本发明化合物在500μm下稳定单泛素化e2和多ub产物的能力。虽然本发明的化合物稳定了单-ub ube2k并减少了多ub链，但在试验中对于e2的其它类代表没有观察到相同的结果。e2具有高度保守的活性位点，本发明化合物不影响或调节其它e2的观察结果证实了这些分子参与的变构位点。结果如图2所示。
[0415]
praja 1试验
[0416]
该试验使用ube2k硫酯连接的泛素和小分子调节剂影响泛素释放到praja1 ring结构域的能力和多泛素化praja1的能力。使用elisa形式并使用抗ub a5一级抗体(af594)与缀合至碱性磷酸酶和attophos ap荧光底物系统的二级抗体(山羊多克隆抗小鼠ap)组合，测量多泛素化的水平。使用teacan spark 10m平板读取器在435的激发波长和555的发射波长下读取荧光。
[0417]
观察到本发明化合物以浓度依赖性方式调节泛素从ube2k的释放程度和praja1 ring蛋白的多泛素化。elisa信号的减少意味着泛素产生多ub praja1 ring的释放的减少。观察到本发明化合物减少了多ub praja1。参见图3。
[0418]
细胞活力试验
[0419]
使用cell titer fluor
tm
测定(promega g6080)进行细胞活力测定。mia paca-2细胞在含有10％fbs、1％pen/strep/两性霉素b的dmem培养基中生长。对细胞进行胰蛋白酶消化并使用nexcelom细胞仪计数。在greiner黑色/透明96孔板中的每孔接种50,000个细胞/100μl。用于工作流程的细胞应在储备液瓶的10代内。将这些细胞的三个不同谱系平行培养多次传代，并将每个谱系的5个完整平板接种一次。小分子化合物作为100mm储备溶液/dmso提供。使用1:3稀释制备稀释系列平板以在半对数标度上实现7点浓度。添加化合物后，将细胞在37℃、5％co2下孵育72小时。
[0420]
对于每种测试化合物条件，使用一式三份重复。对于每种参考化合物，使用一式两份重复。在72小时孵育结束时，丢弃用过的培养基。然后，以1:2000的浓度(5μl/10ml)添加100μl在dmem(无血清和酚红)中稀释的gf-afc。将细胞与反应缓冲液在37℃下孵育1h。然后在使用390nm的激发波长和505nm的发射波长的平板读数器上读取荧光。在microsoft excel 2010上分析所有原始数据，并相对于dmso媒介物对照进行标准化。将相对结果复制到graphpad prism中用于非线性回归分析和使用log(抑制剂)vs.反应方程式测定ic50和其它剂量曲线参数(最小值、最大值、hill斜率等)。结果示于表11中。数值如下：a表示《1.0mm的ic50、b表示1mm至10mm的ic50、c表示》10mm的ic50。
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表11
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肿瘤生长抑制-鼠异种移植模型中的体内poc研究材料和方法
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细胞系和肿瘤模型：
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k-562癌细胞系源自美国典型培养物保藏中心(atcc)，usa。使细胞在提供有10％的fbs(invitrogen，cat#10438-026)和1％的青霉素链霉素(invitrogen，cat#15140-122)
的imdm培养基(sigma，cat#30-2005)中生长。为了建立异种移植物，当细胞达到约70-80％融合时，通过胰蛋白酶消化收集细胞，并将5百万个k-562细胞悬浮在200μl的无血清培养基中，并与基质胶以1:1的比率混合，然后使用与24号针连接的1ml bd注射器皮下植入到scid bg小鼠的背部右胁。
[0429]
随机化
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在细胞接种10天后，一旦变得可触知，则测量k-562肿瘤移植物。当平均肿瘤体积达到约85mm3时，将动物随机分配到不同的治疗组中给药，保持肿瘤体积和动物数量，使得每组的平均肿瘤体积在各组中保持相同。
[0431][0432]
研究设计
[0433]
化合物以0.5％cmc+0.1％吐温80配制，并以8小时间隔连续给药12天bid。肿瘤生长抑制的结果示于下表11中。
[0434]
表11
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化合物131在裸鼠中的mv.4.11细胞(b粒单核细胞白血病)系衍生的异种移植模型中的抗肿瘤功效
[0437]
在裸鼠右胁腹区域皮下植入5
×
106细胞mv.4.11细胞。在细胞植入后第12天将小鼠随机分成3组(每组8只小鼠)。媒介物对照与测试化合物的制剂一起施用，并且治疗组以75和150mg/kg的剂量口服施用化合物131，以在0.1％吐温-80+0.5％cmc(羧甲基纤维素)中
的悬浮液形式，每天两次(b.i.d)，持续24天。在研究期间每周三次记录肿瘤测量值和体重，直到研究完成(第24天)。剂量组(75mg/kg和150mg/kg)的肿瘤生长抑制分别为73.6％和86.3％。见图4。
[0438]
在本技术中引用的所有参考文献(包括论文、已公布的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的内容通过引用明确地整体并入本文。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域普通技术人员通常已知的含义。