本发明涉及乙肝病毒(hbv)的rna病毒颗粒(rna virion)抗体、使用了该抗体的hbv的rna病毒颗粒的检测方法、以及用于检测hbv的rna病毒颗粒的试剂盒。
背景技术：
：：1、全世界有约20亿人的已感染者、约3亿人的慢性感染患者的乙肝病毒(hbv)是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌，在肝癌的原因中占20-30％、每年88万人死亡的感染症(非专利文献1-5)。1970年发现了作为感染主体的丹氏粒(dane paticle，dane颗粒)，以此为契机，1972年能够利用其包膜(envelope)即hbs抗原(hepatitis b virus surface antigen，乙肝病毒表面抗原)的定性检查进行诊断，然后1979年通过hbv-dna的克隆判明了dane颗粒的主体为含dna的颗粒(完全病毒颗粒，complete virio n)或dna颗粒(dna virion)，1980年通过pcr法进行的hbv-dna检查的诊断开始广泛进行(非专利文献6)。在此之后，通过hbe抗原-抗体等各种检查法，能够更详细地掌握感染状态，为了知道有无感染，hbv-dna为监测的主流，这在至今也没有发生变化。2、对于治疗而言，具有抗病毒活性的干扰素α(ifn-α)在1990年登场，第一个核酸模拟治疗药lamivudine在1998年登场，2000年以后peg化干扰素(peg-ifn)及各种核酸模拟制剂(nuc)成为治疗的明星(非专利文献6)。由于可以抑制属于hbv标记物的乙肝病毒表面抗原(hbsag)或hbv-dna，因此hbv感染一直被认为是可控制的感染症。但是，另一方面，一直存在因来自现有检查阴性的献血供体的输血、针刺事故等而感染hbv的现象。hbv情况下的更严重的问题是无症状的感染者不知道被感染而使健康人感染，并且引起暴发。现有的检查是否充分成为新的疑问。因此，到了2010年代，为了增强检测灵敏度，开始着眼于hbsag的定量化(qhbsag)或通过下一代pcr法检测hbv-dna的方法的开发。3、在这种情况下，2012年首次明确了参与hbv感染肝细胞的受体(非专利文献7)。由于开始能够进行hbv在肝细胞中的生命周期研究，因此终于确立了试验管内的实验系统，从而一下子推进了其阐明。判明了hbv不仅转移到核内并组装到人基因中(integrated dna，整合的dna)，而且在核内形成完全封闭双链dna(convalently closed circulardeoxyribonucl eis acid，共价闭环脱氧核糖核酸，cccdna)，从而长期残留在肝脏内。该cccdna被认为是引起hbv再活化的本质。但是，通过现有的ifn以及nuc治疗无法将其完全排除(非专利文献8-11)。4、虽然也存在针对hbv的疫苗，但是至今一年仍有约3000万人新感染，450万人在继续针对慢性肝炎的治疗(非专利文献1、2)。hbv治疗的目标虽然毫无疑义是生命预后和qol的改善，但临床上的具体的治疗目标是：1)作为短期目标，是血中hbv-dna的阴性化或抑制，2)作为长期目标，是血中qhbsag的消失(非专利文献9-11)。由此，达到临床治愈的状态，患癌的风险减少。由于只要不实施侵袭性的肝活检就无法进行cc cdna的测定，因此作为实际临床并不现实，可以认为通过血中qhbsag的消失而几乎完全排除了肝脏内的cccdna。目前的新的治疗目标发生了从血中hbv-dna的阴性化或抑制向qhbsag消失(hbsag loss)的范式转变(paradigm shift)(非专利文献9-11)。5、通过近年来显著进步的nuc治疗，能够比较迅速地获得持续的病毒学反应(sustained virological resoponse，svr)的实现，进而获得血中的hbv-dna的阴性化。但是，“阴性化”准确地说是“抑制到测定检测限以下”，实际上在nuc治疗中，血中hbv-dna阴性化的患者血清具有感染能力这样的非常轰动的事实在2019年被实验性地首次证实(非专利文献12)。血中hbv-dna阴性化以后，直至血中qhbsag消失为止，通常需要极长的时间，或者是终身都几乎不消失的病例(非专利文献13)。由于没有这样的测定长期的血中hbv-dna的抑制、或在血中hbv-dna的阴性化期间感染能力是否消失的方法，因此难以判定何时可以停药nuc，患者不得不基本终身长期服用。因此，伴随长期服用的副作用、医疗经济的压迫也成为新的严重的课题而出现。尽管如此，在其长期的期间内，也必须以3个月1次左右的频度实施血中hbv-dna测定来监测再活化的征兆等。由于pcr检查价格昂贵，因此同样的医疗经济的压迫成为问题。另外，还存在在pcr设备、资源有限的多数地区、机构中，对血中hbv-dna测定本身的实现极其困难的问题。此外，无论如何使检测灵敏度提高，也基本达到极限的水平，并且由pcr错误引起的假阳性、假阴性的问题也完全没有完全消除。6、基于新型治疗的必要性，由于cccdna和hbv生命周期的阐明，以c ccdna本体或其转录活性(图1)为靶的本质性的新型治疗药的开发极其活跃(非专利文献9-11)。但是，在验证这样的新型作用药的效果方面，在到以往的以血中dna阴性化或抑制后qhbsag消失为目标为止的极长的期间，能够验证感染能力的指标在当前时间点是不足的，这也一直是大的阻碍因素。qhbsag是作为hbv感染的存在确认的广泛的指标，但其99％以上是没有感染能力的svp(subviral particle，亚病毒颗粒)，(实际上是有感染力的dna颗粒的100,000倍以上)，从中还无法高效地检测感染能力高的dna颗粒(非专利文献14)。此外，还判明了在作为svr长期病例的主体的hbe抗原阴性肝炎中，与cccdna相比，来自整合的dn a的包膜为主体(非专利文献15)。即，用于确认hbv是否存在的决定性的指标是必不可少的，但难以终身掌握感染能力，因此迫切期望其他指标。7、在血中hbv-dna阴性化或抑制以后，直至血中qhbsag消失为止的长期时间中，确立可检测出hbv感染能力的指标、尤其是不需要活检的非侵入性的血中标记物，不仅从对健康人的水平、垂直感染(传染)的防止，而且从医疗成本的观点出发也是极其紧迫的课题。在这样的背景中，作为能够反映cccdna的转录活性的指标(图1)，2018年以后，hbv-r na与hb核相关抗原(hbcrag)一起受到新的关注(非专利文献13)。hbcrag是基于检测作为cccdna转录产物的核相关抗原、即hbe抗原、p22r抗原、前基因组rna(pregenomic rna，pgrna)、hbc抗原这4种优异的理论的标记物，从与致癌相关的报告起备受关注(非专利文献16)。但是，由于必须进行使核相关抗原从包膜颗粒或免疫复合物释放这样的人工的前处置，并且测定范围窄至3-7logu/ml，因此在超过7的高值病例中需要追加稀释，或者在低于3的低值病例(相当于基本dna阴性化的病例)中无法克服无法进行反映准确的病势的监测的缺点。(非专利文献13-14)。8、2016年实验证明了hbv pgrna在血中作为被覆于包膜的病毒颗粒(virion)存在(非专利文献17)。作为反映cccdna的转录活性和存在数量的新型标志物，突然开始受到关注，成为现在非常热的新研究领域。相继有启示作为hbe抗原血清转换(seroconversion)的预测标记物、nu c中止判定标记物的可能性、进一步反映存在数量的hbe抗原阴性肝炎中的ifn的效果判定、中止判定有用的报告(非专利文献18-20)。由于通过基于肝活检的cccdna测定进行持续性病势监测在现实中是不可能的，因此作为最受期待的血中标记物而兴起。但是，虽然在研究水平上盛行，但在作为临床诊断药的实用性方面存在课题。虽然race法逐渐被替换为pcr法，但由于尚不存在具有充分共识的pcr法，因此在实验室水平上混合存在，因此今后的调整具有很大困难(非专利文献13-14)。另外，在确立了pcr法之后，也与hbv-dna同样地，可以容易地预测到会产生成本、资源限制的问题，甚至由于血清的保存条件比dna严格，因此还预测到在这点上也会增加困难。9、现有技术文献10、专利文献11、wo2019/235584：一种有效的肝炎病毒的抗体诱导法、抗体和检测系统12、非专利文献13、1)who.guidelines for the prevention,care and treatment of persons with chronic hepatitis b infection.march 2015.14、2)who.guidelines on hepatitis b and c testing.february 2017.15、3)terrault na,loch asf,mcmahon bj et al.update on prevention,diagnosis,and treatment of chronic hepatitis b：aasld 2018hepatitis bguidance.hepatol 67：1560,2018.16、4)european association foe the study of the liver.easl 2017clinicalpra ctice guideline on the management of hepatitis b virus infection.jhepatol 67：370,2017.17、5)日本肝臓学会肝炎診療ガイドライン作成委員会。b型肝炎治療ガイドライン(第3.1版)。2019年3月。18、6)marzio dh,hann h.then and now：the progress in hepatitis b 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glycan isomer，乙肝表面抗原聚糖异构体：hbsaggi”)，实施了试管内的hbv病毒的感染抑制实验，结果判明了具有中和活性(专利文献1)。7、本发明是基于发现了hbsaggi特异性地识别rna颗粒的发明。过去完全无法预测使用hbsaggi，在实际的生物体的血液样品中与rna颗粒结合的可能性。这是因为，尤其是在人血液中也包含饮食来源的糖链而存在极庞大、丰富多彩的糖链，因此通常即使使用针对糖蛋白的抗体，也不容易从血液样品中检测出目标糖蛋白。8、发明者们使用实际的慢性乙肝病患者血清，使用hbsaggi实施免疫沉降试验，并深入研究了在与hbsaggi结合的级分中什么被识别了，结果令人惊讶的是，弄清楚了其识别血中的hbv-rna(图2)。该发现意味着其与含有rna的病毒颗粒的包膜结合，判明了其确实具有捕获rna颗粒这样的完全预料不到的作用。而且，不仅在nuc治疗前的hbv-dn a高值的状态下，在通过nuc治疗血中hbv-dna阴性化的患者中，也检测出了血中rna颗粒。9、此外还可知，通过进一步测定免疫沉降前的hbv-rna值、未与hbs aggi结合的级分中的hbv-rna值，还能够识别rna颗粒和游离rna(free rna)(图2)。10、在通过nuc治疗血中hbv-dna阴性化或svr化的患者中，在以h bsag消失为目标继续治疗的长期的时间中，作为能够掌握感染能力、成为药剂的中止/再次开始的标准的标记物，在血中hbv-rna受到重视的同时，并没有克服尚未确立基于pcr的诊断方法，及可测定的区域、机构受限的课题。11、本技术提供一种使用hbsaggi、能够通过免疫学方法简便地检测出并测定rna颗粒的分子，还能够通过床边检测(point-of-care)进行床边水平的测定的方法。12、迄今为止，关于病毒dna、rna的量的测定，通过pcr扩增拷贝并进行测定的方法为主流，但本发明是一下改变了这样的现状的划时代性的技术。由于是作为静默流行性病毒(silent epidemic virus)在全世界广泛存在感染者的hbv，因此仅通过昂贵且还需要装置的pcr检查，具有感染能力的患者的检测无法充分普及，感染络绎不绝。能够进行简便迅速检查的本发明还有助于向迄今为止无法检测的地域展开和预防由此导致的世界规模的无症状性感染者向健康人的感染。13、更具体而言，本发明提供以下的[1]～[5]。14、[1]一种hbv的抗rna病毒颗粒抗体，其特异性地识别乙肝病毒(hbv)的rna病毒颗粒。15、[2]根据上述[1]所述的hbv的抗rna病毒颗粒抗体，其包含：16、序列号1所示的重链的氨基酸序列中的cdr序列和序列号2所示的轻链的氨基酸序列中的cdr序列，17、序列号3所示的重链的氨基酸序列中的cdr序列和序列号4所示的轻链的氨基酸序列中的cdr序列，18、序列号5所示的重链的氨基酸序列中的cdr序列和序列号6所示的轻链的氨基酸序列中的cdr序列，19、序列号7所示的重链的氨基酸序列中的cdr序列和序列号8所示的轻链的氨基酸序列中的cdr序列，或20、分别与上述cdr序列具有70％同源性的重链cdr序列和轻链cdr序列。21、[3]根据上述[2]所述的hbv的抗rna病毒颗粒抗体，其包含：序列号1所示的重链的氨基酸序列中的cdr序列和序列号2所示的轻链的氨基酸序列中的cdr序列。22、[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的hbv的抗rna病毒颗粒抗体，其包含：23、序列号1所示的重链和序列号2所示的轻链，24、序列号3所示的重链和序列号4所示的轻链，25、序列号5所示的重链和序列号6所示的轻链，26、序列号7所示的重链和序列号8所示的轻链，或27、分别与上述链具有70％同源性的重链和轻链。28、[5]根据上述[4]所述的hbv的抗rna病毒颗粒抗体，其包含：序列号1所示的重链和序列号2所示的轻链。29、本发明进一步涉及以下内容。30、[6]一种hbv的rna病毒颗粒的检测方法，其包含使上述[1]～[5]中任一项所述的抗体与试样接触的工序。31、[7]根据上述[6]所述的检测方法，其包含用脱氧核糖核酸酶(dn ase)对试样进行处理的工序。32、[8]根据上述[6]或[7]所述的检测方法，其中，试样来自正在接受或接受过核酸模拟制剂治疗的患者。33、[9]根据上述[6]～[8]中任一项所述的hbv的rna病毒颗粒的检测方法，其中，试样来自确认到血中hbv-dna的抑制的患者。34、[10]一种用于检测hbv的rna病毒颗粒的试剂盒，其包含上述[1]～[5]中任一项所述的抗体。35、[11]一种用于计划hbv的预防或治疗的数据的提供方法，其包含使上述[1]～[5]中任一项所述的抗体与试样接触的工序。36、发明效果37、对于慢性乙肝(chb)患者而言，已到了通过nuc能够实现以往的治疗目标的主体即hbv-dna阴性化或持续抑制的时代，但另一方面，也清楚了在这样的患者血清中残留有感染力，这是仅通过以往的检查完全无法应对的状况。在这种情况下，每年仍然新增3000万人的hbv感染患者。因此，对于感染能力的掌握、治疗持续-中止的确定而言，迫切期望有新的hbv标记物，尤其是测定血中hbv-rna的重要性极高。检测hbv-rna的分子生物学方法只有race法、pcr法，并没有实用的诊断的方法，还停留在研究室水平的展开。38、首次清楚了，通过本发明的免疫学方法，即抗原-抗体反应，能够在h bv-rna中迅速简便地检测出被覆于包膜的rna颗粒，进而能够识别rn a颗粒和游离的rna(核苷rna)。39、以往，未考虑过用pcr以外的方法捕获rna颗粒，但通过本发明，能够划时代地以通用的简便的免疫法检测出rna颗粒。40、根据本发明，无论以往需要昂贵的试剂、装置，能够测定的机构、地域受限的pcr法如何，都能够廉价且在任何环境下进行hbv感染能力的判定，能够促进chb患者的qol，进而促进医疗经济效果，并且有助于静默流行性病毒的新感染者的减少。当前第1页12当前第1页12