本发明涉及基因重组领域，尤其是涉及一种重组表达粒细胞集落刺激因子的工程菌及其应用。
背景技术：
粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，gcsf)是一种嗜中性粒细胞免疫防御相关的细胞因子。研究表明，人粒细胞集落刺激因子的重组蛋白具有免疫调节功能，可以促进单核巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α(tnfα)、白细胞介素(il)-12、il-8等细胞因子产生，从而激活免疫反应，并维持局部内环境稳定；粒细胞集落刺激因子还可以刺激粒系母细胞的增殖和分化，增强成熟粒细胞功能的作用，在抗感染免疫过程中起重要作用(panopoulosad,watowichss.granulocytecolony-stimulatingfactor:molecularmechanismsofactionduringsteadystateand‘mergency’hematopoiesis[j].cytokine,2008,42(3):277-288)。
大黄鱼是我国海水网箱养殖量最大的鱼类，年产量愈19.8万吨，年产值愈百亿元(2019年中国渔业年鉴，2019)。但随着养殖规模的发展和扩大，各种病原的入侵愈加频繁和剧烈，每年因病死亡鱼类损失数十亿元，给大黄鱼养殖带来了巨大创伤和挑战。病害造成的养殖损失成为制约大黄鱼养殖业发展的重要瓶颈。大黄鱼病原包括寄生虫、细菌及病毒等，但是迄今为止尚无有效药物对大黄鱼进行疾病防治。
由于粒细胞集落刺激因子基因保守性不高，在体内的含量极低。不同鱼类之间的相似性大约为80％，与哺乳动物相似性大约为30％～60％。鱼类属于低等的脊椎动物，其免疫细胞分化不成熟，导致其扩增难度较大，并限制了其功能及应用研究。迄今为止，尚未有关于大黄鱼粒细胞集落刺激因子基因序列及应用的报道。从大黄鱼粒细胞集落刺激因子入手，对其进行重组表达，在养殖中得以应用，有助于大黄鱼病害防治。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种重组表达粒细胞集落刺激因子的工程菌株，通过将来源于大黄鱼(larimichthyscrocea)的粒细胞集落刺激因子基因转化入大肠杆菌中，构建了高效重组表达粒细胞集落刺激因子的工程菌。
本发明的第二目的在于提供一种重组表达粒细胞集落刺激因子在制备提高抗病毒能力的饲料添加剂中的应用。
所述重组表达粒细胞集落刺激因子的工程菌株携带有能够表达粒细胞集落刺激因子的重组质粒；所述重组质粒含有大黄鱼粒细胞集落刺激因子基因。
所述大黄鱼粒细胞集落刺激因子基因的氨基酸序列如下：
所述大黄鱼粒细胞集落刺激因子基因的核苷酸序列如如下：
本发明通过将大黄鱼的粒细胞集落刺激因子基因导入大肠杆菌中，构建了重组表达该基因的大肠杆菌工程菌。经分离、纯化及免疫印迹检测，所述大肠杆菌工程菌能高效表达粒细胞集落刺激因子。采用浓度为5ng/m的粒细胞集落刺激因子刺激，均可以诱导大黄鱼肾细胞中抗病毒蛋白(myxovirusresistantprotein)表达量显著上升(p<0.05)，诱导后分别可以达到对照组的260％与257％。
通过人工注射本发明的纯化的重组粒细胞集落刺激因子，与对照组相比，大黄鱼感染假单胞菌3～7d后的存活率显著提高。说明本发明的粒细胞集落刺激因子能显著提高大黄鱼在受到病原感染后的死亡率，增加生产效益。所获得的重组粒细胞集落刺激因子能够显著提高大黄鱼抗病毒蛋白的表达水平，也可提高大黄鱼在受到假单胞菌感染后的存活数量，可广泛用于饲料添加剂领域。
具体实施方式
以下实施例将对本发明作进一步的说明，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，如j.萨姆布鲁克(sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：大黄鱼粒细胞集落刺激因子基因的克隆
1、总rna提取：用手术剪刀解剖活的大黄鱼，取少量心、脑、肝、肾、与头肾组织置于rna保护液中用于rna的提取。总rna的提取使用invitrogen(中国，上海)生物公司的trizolrna提取试剂，提取方法参照使用说明书。
2、cdna第一链合成：据上海生工生物工程技术服务有限公司cdna合成试剂盒说明书进行。
3、大黄鱼粒细胞集落刺激因子基因的cdna片段扩增
(1)根据genbank中报道的粒细胞集落刺激因子的保守序列设计两对兼并引物f1：5’ccgggyytgacyctbgac3’，r1：5’gaygkybckagrctgcg3’；f2：5’srtstgtstgagymgtatgt3’，r2：5’gcmayctgvrcctcgagt3’；采用巢式pcr方法扩增大黄鱼粒细胞集落刺激因子中间片段。第一轮pcr扩增条件为：以1μl心、脑、肝、肾、与头肾组织的等量cdna混合物为模板，引物f1(10μm)和r1(10μm)各10μl，94℃变性5min，第一轮pcr程序，94℃变性45s；48℃复性30s；72℃延伸45s；35个循环；最后72℃延伸7min。第二轮巢式pcr，以第一轮pcr产物1μl做模板，f2/r2为引物；反应条件：94℃变性5min；94℃变性45s；50℃复性30s；72℃延伸30s；35个循环；最后72℃延伸7min。琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)再根据常规的分子生物学技术，以上述步骤(1)所得为模板，以基因特异引物f3：5’ggctgctgtgagttttgtgtg3’，f4:5’ctcagagacctgctgacacac3’进行cdna3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’-race试剂盒说明书进行。
(3)再根据常规分子生物学技术，提取心、脑、肝、肾、与头肾组织的总rna，以基因特异引物r3:5’caagcctgcgcatccaaaag3’对它反转录合成cdna第一链，以该cdna为模板，以引物r4：5’aggccaggttcggactatg’与r5:5’agccacctccttcatcttgtt3’进行cdna5’端快速扩增，操作步骤按宝生物5’-race试剂盒说明书进行。利用race获得3’与5’序列，拼接为cdna全长序列。
实施例2：重组表达载体的构建
本发明采用pet32a(+)原核表达载体，以高保真taq酶进行pcr，使用基因特异引物f6：5’cgcggatccgctcccatcagc3’(下划线表示ncoi的酶切位点)，下游引物r6：5’ccgctcgagacggggcctttg3’(下划线斜体表示xhoi的酶切位点)，pcr所用taq酶为高保真taq酶(宝生物，大连)，退火温度为63.8℃，扩增粒细胞集落刺激因子基因的成熟肽片段。琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并割胶纯化产物，与pet32a(+)载体连接。转化大肠杆菌top10后，挑取单克隆利用上述f6，r6引物进行菌落pcr筛选并测序，验证测序，与序列表中seqidno：3中成熟肽相同，将测序正确的阳性菌株进行保种，完成载体的构建。
实施例3：大肠杆菌工程菌的构建
以大肠杆菌bl21(de3)为重组表达菌株，将验证正确的阳性重组载体与空载体转化到表达菌株，挑取单克隆，提取质粒，测序验证序列正确。挑取含有重组质粒的单克隆，37℃震荡培养过夜。吸取1ml菌液于lb液体培养基，37℃条件下250r/min振荡培养至对数生长期。加入异丙基-β-d-硫代半苷(iptg)进行诱导，16℃,140rpm，振荡培养20h，离心15min分别收集上清液及菌体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜进行免疫印迹，并以his标签抗体(ah367,碧云天)作为抗体检测后，表明重组的粒细胞集落刺激因子在上清及菌体中均有表达，将工程菌种命名为(lc-r-gcsf-pet32a-bl21)。
实施例4：粒细胞集落刺激因子重组蛋白的纯化及去热源
(1)按1︰10(w/v)比例，将菌体加入ph7.4的pbs缓冲液(50mmpbs，ph7.4，0.5mnacl，含1％tritonx-100，0.5mmedta)。在冰浴中采用超声波破碎菌体(50w，破碎4s，间歇4s)直至肉眼观测液体清澈透明后，12500g低温离心15min分离上清和沉淀，收集上清与deae-sepharose离子交换介质孵育12h，收集上清。
(2)上清液上profinityimac(bio-rad)亲和柱(层析介质处理方法参照说明书)。采用pbs缓冲液洗脱，继续用含25,50,100,200,300,400mm的咪唑的pbs缓冲液分段洗脱，流速：0.5mlmin-1，收集洗脱液。洗脱液置于含8m尿素的pbs中透析24h除去咪唑，再逐渐降低尿素浓度，换液透析，最后在50mmpbs、100mmnacl在4℃透析直至完全除去咪唑，再采用toxinerasertm内毒素去除试剂盒(金斯瑞)去除内毒素(参照说明书)。再用聚丙酰胺凝胶电泳检测蛋白质的纯度，结果表明，纯化后获得单一条带的重组粒细胞集落刺激因子。
实施例5：重组的粒细胞集落刺激因子的生物功能
将10ng纯化的重组粒细胞集落刺激因子加入2mldme/f-12培养基(hyclone)(以10ng的表达载体空质粒的表达产物为对照)，培养大黄鱼肾细胞系24h，采用实时定量pcr检测大黄鱼抗病毒蛋白的表达量。结果表明：经重组粒细胞集落刺激因子刺激后，与对照组相比，抗病毒蛋白的表达量显著上升，可以达到对照组的260％。
实施例6：重组的粒细胞集落刺激因子在大黄鱼养殖中的应用
养殖大黄鱼幼鱼50±12.3g，水温20±2℃，盐度28.0‰，置于1吨养殖桶，充分曝气，密度50尾/吨。每日投喂市售健马牌大黄鱼配合饲料，暂养7天。设置实验组与对照组，每组3个重复。实验组每尾鱼腹腔注射纯化的重组粒细胞集落刺激因子1μg/100g(溶于0.9％的nacl)，注射相同体积生理盐水为对照。24h后腹腔注射假单胞菌(5×105cfu/尾)，记录注射细菌后7d内的死亡率。实验结果以大黄鱼存活数目表示，如表1所示：
表1
试验结果显示，在注射病原4d后，大黄鱼死亡率大幅增加，但是通过腹腔注射纯化的粒细胞集落刺激因子的实验组大黄鱼在人工感染假单胞菌后3～7日内的存活数量均高于对照组，其中第3/5/6天达到显著差异(*代表p<0.05差异显著)，说明本发明的粒细胞集落刺激因子能显著提高大黄鱼的抗病力，增加生产效益。
本发明通过将大黄鱼的粒细胞集落刺激因子基因导入大肠杆菌中，构建了重组表达该基因的大肠杆菌工程菌。所述大肠杆菌工程菌能高效表达粒细胞集落刺激因子，所获得的重组粒细胞集落刺激因子能够显著提高大黄鱼抗病毒蛋白的表达水平，也可提高大黄鱼在受到假单胞菌感染后的存活数量，可广泛用于饲料添加剂领域。
序列表
<110>集美大学
<120>一种重组表达粒细胞集落刺激因子的工程菌株及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
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<213>大黄鱼(pseudosciaenacrocea)
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