一种基于数字PCR技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用的制作方法

一种基于数字pcr技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程领域和食品检测领域，具体涉及一种基于数字pcr技术检测椰毒假单胞菌的试剂盒及其应用。


背景技术：

2.椰毒假单胞菌属于革兰氏阴性菌，兼性厌氧，易在食品表面生长，容易污染谷类发酵制品(发酵玉米面、糯玉米汤圆粉、发酵糯小米等)，薯类制品(马铃薯粉条、甘薯淀粉、山芋淀粉等)及变质银耳和木耳等。椰毒假单胞菌引起的食物中毒具有极高的致死率，对健康造成严重威胁。由该菌引发食物中毒的致死率高达 40％～100％。目前主要采用初期催吐、导泻以及后期血浆置换的方法对中毒患者进行治疗，尚无特效治疗手段或药物。椰毒假单胞菌的适宜生长温度为37℃，适宜产毒温度为26℃，其中毒事件多发在夏、秋两季，我国高发地区包括广西、云南、贵州等。2020年曾发生酸汤子中毒事件，经采玉米面样检测后发现高浓度米酵菌酸，初步定性为椰毒假单胞菌污染引起的食物中毒。
3.椰毒假单胞菌毒性作用主要由于其所产生的两种毒素：米酵菌酸和毒黄素，二者均为脂肪酸类小分子物质，研究者开发了基于液相色谱以及色谱质谱联用技术的方法对米酵菌酸和毒黄素进行检测，但这些方法需要使用较为昂贵的仪器，同时检测操作的难度较大，不利于进行快速的现场检测。针对椰毒假单胞菌的检测也被更多的关注，经典的平板培养法虽然操作简单，但耗时加长且误差范围较大。gb/t 4789.29
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2003《食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验》是椰毒假单胞菌检测的主要依据，但细菌平板培养的方法耗时较长，存在多种影响因素，不利于突发情况下的快速检测。近年来，基于pcr扩增技术的检测方法也收到了越来越多的关注，研究者通过环介导等温扩增(lamp)和荧光定量pcr 方法对椰毒假单胞菌的核酸进行检测，提高了检测的效率。然而现有核酸检测方法的定量结果均依赖于标准曲线，准确性有待提高(马晓燕,张蕴哲,王羽,刘哲, 王晓丽,张伟.环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究[j].食品工业科技,2013,34(03):321
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324；林捷,方陈玉,陆晶芳,尹丹韩,赵奇琦,王加胜.食品中椰毒假单胞菌酵米亚种实时荧光pcr检测的研究[j].食品安全质量检测学报,2020,11(11):3538
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3544)。荧光定量pcr的原理是测量pcr扩增过程中积累的荧光信号，在进行定量检测的过程中依赖于标准曲线。总体来说，现有针对椰毒假单胞菌的核酸检测方法存在明显的局限性：1.以“半定量”分析为主，无法做到不依赖于外标的“绝对定量”；2.缺乏检测过程的质量控制。这些问题都可能影响检测的准确性。为了提高针对椰毒假单胞菌检测结果的可靠性，亟需开发可进行“绝对定量”的检测方法，添加合适的阳性与阴性对照，进而形成完整的检测试剂盒，便于检测研究人员的使用。尚无基于数字pcr技术对椰毒假单胞菌进行检测的研究报道，现有方法检测的准确性有待进一步提高。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供包括阳性对照、阴性对照以及引物
探针的完整检测椰毒假单胞菌的试剂盒。
[0005]
本发明首先提供一种用于pcr检测椰毒假单胞菌的引物和探针组合，其特征在于，
[0006]
上游引物：ttgtctggcggtagaaacc
[0007]
下游引物：cgagtcaactgacccgaac
[0008]
探针：fam
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tcgatcccgtctgcctccaccaatct
‑
bhq1。
[0009]
优选地，其用于数字pcr或荧光pcr。更具体地，所述探针如下：
[0010]
fam
‑
tcgatcccgtctgcctccaccaatct
‑
bhq1。
[0011]
本发明针对椰毒假单胞菌基因组中具有高度进化保守性的16s～23s rrna序列，设计引物和探针，优化反应体系。与常见引物设计软件生成的引物和探针序列相比，我们优化设计的引物探针更适用于椰毒假单胞菌的定量检测，且同时适用于荧光定量pcr的检测体系，两种方法表现出良好的线性相关性，引物探针的优化设计扩展了该试剂盒的应用范围，方便检测者根据具体的实验条件进行应用。由此建立的基于数字pcr技术的方法，有助于提升检测的准确性，相比于现有以定性为主的检测方法，该方法的建立对于预防椰毒假单胞菌引起食物中毒的发生具有重要的意义。
[0012]
本发明进一步提供一种检测椰毒假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包括所述的引物和探针组合。进一步地，还包括阴性对照、阳性对照，其中阴性对照是黄曲霉菌株的基因组dna。
[0013]
为了给测量过程提供质量控制的参考，增加了来源确定的阳性对照和阴性对照的基因组参考物质，试剂盒中以提取纯化后的椰毒假单胞菌基因组作为阳性对照；在选取阴性对照的过程中，通过分析研究认为黄曲霉作为一种腐生真菌，常见于存储不当的粮食与粮食制品中，也可能对奶制品、食用油等造成污染，其代谢产物黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物。黄曲霉与椰毒假单胞菌均可污染粮食相关制品，且都具有将强的致病性，两者检测的混淆将不利于科学预防与诊断，基于此，以黄曲霉菌株的基因组作为阴性对照，不仅能为相关检测过程提供质控物，同时也帮助克服检测椰毒假单胞菌过程中黄曲霉可能造成的干扰。阳性与阴性对照具有较高的纯度，取用方便，与待测样品同时进行测量，有助于提升检测的有效性与准确性。
[0014]
目前，现有对椰毒假单胞菌的检测方法大多停留在实验室研究阶段，还未形成包含引物、探针以及阳性对照和阴性对照参考物质的完整检测试剂盒，为检测工作带来不便。数字pcr可以不依赖于标准曲线对核酸进行定量检测，保证量值溯源至自然单位，基于数字pcr技术的检测方法是后期标准物质研制的基础，有利于提高不同检测方法的可比性和一致性。而在测试剂盒中加入阳性和阴性对照的基因组参考物质，可以为检测过程提供质量控制，在实际应用过程中，能够帮助排除黄曲霉污染可能的干扰，有利于食物中毒事件的科学预防。也就是说，以椰毒假单胞菌的基因组作为阳性对照，黄曲霉的基因组作为阴性对照，有利于避免两者可能的混淆问题，为检测过程的质量控制提供了参考，有助于提升椰毒假单胞菌核酸检测的准确性，可以广泛的应用于潜在污染食物的检测。
附图说明
[0015]
图1软件生成的引物探针应用于数字pcr体系的效果图。
[0016]
图2优化后的引物探针应用于数字pcr体系的效果图。
[0017]
图3数字pcr体系退火温度优化。
[0018]
图4数字pcr反应体系中引物和探针的工作浓度优化。
[0019]
图5数字pcr方法在其测量范围内的定值结果。
[0020]
图6数字pcr方法表现出良好的线性。
[0021]
图7椰毒假单胞菌的荧光定量pcr和数字pcr检测方法的线性相关性。
[0022]
图8椰毒假单胞菌检测试剂盒组成示意图。
[0023]
图9应用该试剂盒对实际样品进行检测的结果。
具体实施方案
[0024]
下面结合具体实例，进一步阐述本发明，但不构成对本发明限制。
[0025]
实施例1引物和探针的设计
[0026]
由于在检测过程中需要基于椰毒假单胞菌的全基因组进行扩增，引物和探针的适用性非常重要。本发明针对椰毒假单胞菌基因组中进化过程高度保守的 16s～23s rrna序列(genbank基因号：ef552059)设计数字pcr体系的引物和探针。采用primer5.0软件自动设计的引物探针结果如下。其中探针5`端连接fam， 3`端连接bhq1。
[0027]
表1自动设计数字pcr检测椰毒假单胞菌的引物探针序列
[0028]
名称序列上游引物gtctttgtcattggcgatt下游引物atacaatcacaacccggat探针fam
‑
acgcccatctcaatagacgctt
‑
bhq1
[0029]
利用软件自动设计的引物探针进行扩增实验，结果如图1所示的扩增效果。其中可以观察到在反应体系中，阳性与阴性的液滴单元难以区分，影响定量检测的准确性。
[0030]
基于此，本发明人对引物和探针进行了优化。通过对gc含量、扩增产物的长度进行优化后设计引物与探针，得到如表1中所示的优化设计的引物和探针的序列信息。
[0031]
表2优化后的数字pcr检测椰毒假单胞菌的引物探针序列
[0032]
名称序列上游引物ttgtctggcggtagaaacc下游引物cgagtcaactgacccgaac探针fam
‑
tcgatcccgtctgcctccaccaatct
‑
bhq1
[0033]
以椰毒假单胞菌的基因组dna为模板，通过nanodrop测定dna的浓度，结合基因组的相对分子量计算拷贝数浓度，通过稀释，计算反应中模板dna浓度为4000copies/μl，按照下表中的组成配制数字pcr反应体系：
[0034][0035]
数字pcr反应的温度循环过程如下表中所示：
[0036][0037]
pcr扩增完成后经过读数，结果如图2所示，得到的扩增效果图，在该反应体系中，阳性与阴性的液滴单元可以较好的区分，且阳性反应信号相对集中。引物和探针的适用性，是后续继续优化数字pcr反应体系的重要基础。
[0038]
实施例2退火温度的优化
[0039]
本实施例对pcr反应的退火温度进行了优化。设置退火温度的梯度包括 54℃，56℃，58℃，60℃以及62℃。
[0040]
以椰毒假单胞菌的基因组dna为模板，通过nanodrop测定dna的浓度，结合基因组的相对分子量计算拷贝数浓度，通过稀释，计算反应中模板dna浓度为4000copies/μl，按照下表中的组成配制数字pcr反应体系：
[0041][0042]
数字pcr反应的温度循环过程如下表中所示：
[0043][0044]
pcr扩增完成后经过读数，如图3中所示，以阳性与阴性信号差距最显著为判定标准，最终确定反应体系的退火温度为56℃。
[0045]
实施例3引物与探针工作浓度的优化
[0046]
本实施例为了确定最佳的引物和探针工作浓度。分别设置了引物浓度梯度 (200nm、400nm、600nm、800nm)和探针的浓度梯度(200nm、300nm、 400nm)进行正交试验。
[0047]
以椰毒假单胞菌的基因组dna为模板，通过nanodrop测定dna的浓度，结合基因组的相对分子量计算拷贝数浓度，通过稀释，计算反应中模板dna浓度为4000copies/μl，按照下表中的组成配制数字pcr反应体系：
[0048][0049][0050]
数字pcr反应的温度循环过程如下表中所示：
[0051][0052]
pcr扩增完成后经过读数，如图4中所示，以阳性与阴性信号差距最显著为判定标准，最终选定引物和探针的工作浓度分别为600nm和400nm。
[0053]
实施例4数字pcr反应测量范围确定
[0054]
数字pcr的测量范围为1～105copies/μl，以椰毒假单胞菌的基因组dna为模板，通过nanodrop测定dna的浓度，结合基因组的相对分子量计算拷贝数浓度，对dna模板进行梯度稀释后进行数字pcr定量分析。按照下表中的组成配制数字 pcr反应体系：
[0055][0056]
数字pcr反应的温度循环过程如下表中所示：
[0057][0058][0059]
pcr扩增完成后经过读数，在梯度稀释过程中通过重量称量的方法计算稀释倍数，下表中统计了dna浓度计算的到的拷贝数浓度与数字pcr定量检测结果，其中数字pcr的定量结果为三次重复实验的平均值。图5中为测量范围内数字 pcr的定值结果，ntc表示无模板的空白对照。
[0060][0061]
接下来进行线性回归分析，如图6中所示，在其测量范围内，数字pcr方法表现出良好的线性(r2＝0.998)
[0062]
实施例5数字pcr反应与荧光定量pcr的比较
[0063]
值得注意的是，通过设计优化的引物探针，同样适用于荧光定量pcr体系，利用上述梯度稀释的dna模板，进行荧光定量pcr的测量，下表中统计了荧光定量pcr与数字pcr定量检测结果，表中的定量结果为三次重复实验的平均值(参照实施例4中的反应体系和反应程序)
[0064][0065][0066]
在10copies/μl浓度以下，荧光定量pcr无有效的读数，说明数字pcr检测方法具有更高的灵敏性，更适用于微量样品的检测，在两种方法共同的测量范围内，进行了线性相关性分析。如图7中所示，荧光定量pcr与数字pcr两种方法表现出良好的线性相关性(r2＝0.999)。
[0067]
考虑到数字pcr反应使用的仪器比较昂贵、操作较为复杂，而荧光定量pcr 的应用范围更大，本发明的实验结果证明该试剂盒同时适用于数字pcr和荧光定量pcr检测方法，为使用提供了较大的便利。
[0068]
实施例6测量过程中的质量控制
[0069]
为了给测量过程提供质量控制的参考，增加了来源确定的阳性对照和阴性对照的基因组参考物质，试剂盒中以提取纯化后的椰毒假单胞菌基因组作为阳性对照；在选取阴性对照的过程中，通过分析研究，认为黄曲霉作为一种腐生真菌，常见于存储不当的粮食与粮食制品中，也可能对奶制品、食用油等造成污染，其代谢产物黄曲霉毒素被世界卫生组织划定为1类致癌物。黄曲霉与椰毒假单胞菌均可污染粮食相关制品，且都具有将强的致病性，两者检测的混淆将不利于科学预防与诊断，基于此本发明以黄曲霉菌株的基因组作为阴性对照，不仅能为相关检测过程提供质控物，同时也帮助克服检测椰毒假单胞菌过程中黄曲霉可能造成的干扰。阳性与阴性对照具有较高的纯度，取用方便，与待测样品同时进行测量，有助于提升检测的有效性与准确性，图8是检测试剂盒组成示意图。
[0070]
采用液体培养基培养不同时长的椰毒假单胞菌菌液作为检测样品，利用本发明的检测试剂盒进行数字pcr检测，按下述方法(参照实施例4中的反应体系和反应程序)
[0071]
实验结果如图9和下表中所示，其中样品1为过夜培养、明显浑浊的椰毒假单胞菌菌液，样品2为培养6小时未见明显浑浊的椰毒假单胞菌菌液，表中的定量结果为三次重复实验的平均值。
[0072] 数字pcr定值(copies/μl)阳性对照4220样品1168样品227.67阴性对照0
[0073]
实验结果表明，利用本发明的该试剂盒，可以对浓度较低的试剂样品(未见明显浑浊的菌液)进行检测，不依赖标准曲线提供准确的拷贝数浓度，同时证明试剂盒中阳性对照与阴性对照均可以发挥质量控制的作用。该试剂盒适用于椰毒假单胞菌的定量检测，对于预防食物中毒事件的发生具有重要的意义。