一种高效抗敏止痒的桃胶多糖及其发酵提取方法和应用与流程

本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种高效抗敏止痒的桃胶多糖及其发酵提取方法和应用。

背景技术：

桃胶具有多种药用价值，在医药和美容方面的主要作用是降血脂、降血糖、皮肤保湿等功效。桃胶的分子量大、结构高度交联，溶解困难。可溶性桃胶多糖的制备通常可以用水浸胀水解提取法，以及改进的醇提、高压等几种方法，尽管改善了桃胶多糖的溶解性，分子量大大降低，但是产物的均一性较差、产物分子量分布较宽，皮肤屏障或肠道粘膜系统对桃胶多糖吸收有一定的阻碍和屏障作用，生物利用率较低。因此，有必要研究一种更有利于桃胶多糖被生物体有效利用的方法，以促进桃胶在医药或美容护肤方面的应用。鉴于生物体内多糖多是糖单元的聚合物而成，将多糖通过特定方法裂解为寡糖，可有效降低产物的分子量，便于生物体的吸收，也有望提升产物的生物活性。近年来，微生物产酶裂解桃胶多糖的研究有所发展，国外的研究从以溶解的桃胶多糖为碳源的黄曲霉培养物中分别分离出了黄曲霉胞内和胞外分泌的可以水解桃胶多糖的粗酶，国内有研究从卡拉胶裂解的菌株中筛选高表达半乳聚糖酶的菌株用于桃胶裂解和多糖的提取。

然而，高活性、高稳定性的半乳聚糖酶菌株的筛选和保存是一项具有挑战性的工作。天然菌株的表达量随着繁殖代数的增加会引起活性和稳定性下降。天然菌株需要特定的培养基条件，因此在发酵过程中引入的成分和产生的代谢产物不可避免引入新的杂质，增加后期多糖纯化的难度，以及对产品的使用带来不可控的风险。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明利用酵母工程菌，通过dna重组技术引入半乳聚糖酶基因序列，以粗提取的桃胶多糖作为营养培养液，以糖类成分作为碳源，微量植物蛋白作为氮源，维持酵母菌生长，让酵母菌产生半乳聚糖酶，形成分泌在细胞壁外侧的胞外蛋白，但不释放进入到培养液中。从而定向酶解交联的桃胶多糖，释放分子量更小的多糖单体，从而提高多糖的生物利用率。因此，本发明的第一个目的是提供一种高效抗敏止痒的桃胶多糖的发酵提取方法，以解决现有的桃胶多糖的提取方法均一性差、产物分子量分布较宽的问题。本发明的第二个目的是提供一种采用上述的发酵提取方法获得的高效抗敏止痒的桃胶多糖。本发明的第三个目的是提供一种所述的高效抗敏止痒的桃胶多糖的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

作为本发明的第一个方面，一种高效抗敏止痒的桃胶多糖的发酵提取方法，包括如下步骤：

步骤一、将浸泡后的桃胶、超纯水和可表达半乳聚糖酶的酵母菌干粉按1:5～100:0.01～0.1的比例混合，然后倒入发酵罐中恒温、恒速搅拌发酵；

步骤二、当发酵液的粘稠度降低到200～1000mpa.s时，停止搅拌，倒出发酵液，加入无水乙醇至乙醇的质量分数为60％～90％，静置，去上清；

步骤三、采用乙醇洗涤下层沉淀，减压抽滤后冷冻干燥，获得桃胶多糖。

根据本发明，步骤一的桃胶、超纯水和表达半乳聚糖酶的酵母菌干粉的比例为1:10:0.01。

较佳的，步骤二加入无水乙醇至乙醇的质量分数为70％时，静置。

根据本发明，步骤一的可表达半乳聚糖酶的酵母菌干粉的制备方法包括如下步骤：

a、酵母菌克隆的制备：提取表达载体半乳聚糖酶的基因组dna，并线性化，然电转化转入感受态毕赤酵母中；通过md平板培养，获得可表达半乳聚糖酶的酵母菌株；

b：将步骤a的可表达半乳聚糖酶的酵母菌进行纯化，然后制备成酵母菌干粉。

根据本发明，所述步骤一的发酵温度为30℃，转速50～500rpm，发酵时间为5-20h。

作为本发明的第二个方面，一种高效抗敏止痒的桃胶多糖，其采用上述所述的桃胶多糖的发酵提取方法提取获得。

作为本发明的第三个方面，一种如上述所述的桃胶多糖在制备治疗抗敏止痒的药物中的应用。

作为本发明的第四个方面，一种如上述所述的桃胶多糖在制备抗敏止痒的护肤品中的应用。

作为本发明的第五个方面，一种药物组合物，包括如上述所述的高效抗敏止痒的桃胶多糖。

作为本发明的第六个方面，一种美容组合物，包括如上述所述的高效抗敏止痒的桃胶多糖。

本发明的高效抗敏止痒的桃胶多糖的发酵提取方法，有益效果：

1、本发明利用酵母工程菌，通过dna重组技术引入1,3-半乳聚糖酶基因序列，让酵母菌表达半乳聚糖酶，形成分泌在细胞壁外侧的胞外蛋白，但不进入到培养液中，可以避免引入新的杂质，便于后续工序中的桃胶多糖的提纯；同时，本发明利用酵母工程菌的菌株保存和配方操作简单，菌株稳定，可提前制备好酵母菌干粉长期保存；

2、采用发酵法，其发酵和纯化工艺简单，发酵过程低能耗、低排放，更加环保；

3、发酵过程中，酵母菌以桃胶内的糖类物质作为碳源，以桃胶内蛋白质成分为氮源，无需引入其它培养基成分。降解了无用的蛋白质成分，便于后期桃胶多糖的纯化；

4、采用该方法提取的桃胶多糖水解程度更高，粘度低，分子量范围更窄；可以提高桃胶多糖的抗敏止痒效果；

5、步骤一的酵母菌干粉加入发酵罐后，进行搅拌，该搅拌可以快速酶解桃胶，提取桃胶内多糖。

本发明的发酵法提取的桃胶多糖，其有益效果是：对皮肤起到快速的抗敏止痒，消炎止痛的功效。因此在医药和美容领域具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为实施例1的水提法获得的桃胶多糖的色谱图。

图2为实施例2的发酵法获得的桃胶多糖的色谱图。

图3为实施例4的桃胶多糖促巨噬细胞增殖的结果图。

图4为实施例10的桃胶多糖人体皮肤止痒测试的结构图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例1工程酵母菌干粉的制备

1)酵母菌克隆的制备，根据1,3-半乳聚糖酶的氨基酸序列(序列来自ncbi：genbank:kaa8623185.1)合成出dna序列，用核酸酶切和连接，获得去信号肽的线性化的dna，dna合成与载体构建购自上海纽普生物，将线性化的dna溶于5-10μlte。取80μl商业化的感受态毕赤酵母gs115(购买自天根生物)与10μg线性化dna混合，转入预冷的0.2cm电转杯中。在冰上放置5min。设定机器参数，立即加入1ml预冷的1m山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中分成200μl等份，涂于md平板(基础葡萄糖培养基)上，在30℃孵育平板至克隆产生。

2)半乳聚糖酶的表达纯化。挑取单克隆，接种至25mlbmgy培养基(bufferedglycerol-complexmedium)中，250ml摇瓶，30℃，250rpm发酵5小时，至菌的密度值od600＝4，室温3000g离心5min，收集细胞，去除上清，用bmmy培养基重悬细胞至od600＝1.0，进行诱导表达。在1l摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入摇床继续生长。每24小时，加甲醇至终浓度为0.5％以继续诱导。连续培养3天后，sds-page电泳法检测半乳聚糖酶的表达情况。用4000rpm的离心速度收集菌体。使用pbs将菌体洗涤表面的培养基成分。最后使用冷冻干燥机将菌体干燥成菌粉。经检测，每克干菌粉中1,3-半乳聚糖酶含量为0.2克。冷藏保存备用。

实施例2高压水提法提取桃胶多糖

桃胶拣去杂物后，取约100g桃胶加适量水浸泡过夜，按料液比1:20加入超纯水，80℃热水搅拌提取，提取时间4h，次数2次。由于溶液黏度较大，先用2层纱布过滤后，滤液再8000r/min离心15min后倒出上清液，减压旋转蒸发至约为原体积的1/3，倒出，加入无水乙醇至乙醇质量分数为90％，静置过夜后倒去上层清液。下层沉淀用无水乙醇洗涤减压抽滤后冷冻干燥，得桃胶多糖。使用苯酚硫酸法测定桃胶多糖的总糖含量，使用葡萄糖测定标准曲线。

经苯酚硫酸法测定，多糖回收率为98％，考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量为0.12％，经hplc-elsd色谱分析，该多糖由半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖组成，其摩尔比为18.12：13.64：54.37：2.58：10.75。加水稀释成50mg/ml，测定溶液粘度为4000mpa.s。

hplc-sec色谱分析结果如图1所示。

图1结果显示，水提法提取多糖，其保留时间为7.3分钟。

实施例3发酵法桃胶多糖的提取

桃胶拣去杂物后，取约100g桃胶加适量水浸泡过夜，按桃胶、超纯水和表达半乳聚糖酶的酵母菌干粉的料液比1：10：0.01加入超纯水和酵母菌干粉(已表达半乳聚糖酶)，再倒入到5l的发酵罐中，添加0.5％甲醇，调节温度为30℃，转速250rpm，搅拌发酵时间10h。测定料液粘稠度，当粘稠度降低到500mpa.s以下后停止发酵。倒出料液，用高速离心机6000rpm离心10分钟。弃除底部菌体沉淀，使用卷式滤膜(孔径0.22微米)进行微滤，除去残留菌体和颗粒状成分，不会造成细菌污染。加入无水乙醇至乙醇质量分数为70％，静置过夜后倒去上层清液。下层沉淀用75％乙醇洗涤减压抽滤后冷冻干燥，得桃胶多糖。使用苯酚硫酸法测定桃胶多糖的总糖含量，使用葡萄糖测定标准曲线。使用考马斯亮蓝g250法测定蛋白含量。

经苯酚硫酸法测定，多糖回收率为98％。考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量为0.02％。植物蛋白含量显著降低。经hplc-elsd色谱分析，该粗多糖由半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖组成，其摩尔比为20.35：17.86：50.84：1.57：9.57。

hplc-sec色谱分析结果如图2所示。

图2结果显示，发酵法提取多糖，保留时间8.5分钟。

实施例3的发酵方法与实施例2的传统水提法的比较：

(1)两个方法获得的多糖回收率接近，但是发酵方法的蛋白含量显著降低，意味着多糖纯度更高。

(2)发酵方法中的多糖成分组成中葡萄糖和阿拉伯糖的组成降低，半乳糖和木糖含量提高。

(3)发酵法获得多糖分子出峰时间比水提法出峰时间长，说明分子量更低，并且出峰的宽度更窄，说明分子量分布更窄，分子大小更均一。

实施例4发酵法桃胶多糖的提取

桃胶拣去杂物后，取约100g桃胶加适量水浸泡过夜，按桃胶、超纯水和表达半乳聚糖酶的酵母菌干粉的料液比1：5：0.001加入超纯水和酵母菌干粉，再倒入到5l的发酵罐中，添加5％甲醇，调节温度为30℃，转速50rpm，慢速搅拌发酵时间20h。测定料液粘稠度，当粘稠度降低到1000mpa.s以下后停止发酵。倒出料液，用高速离心机6000rpm离心10分钟。弃除底部菌体沉淀，使用卷式滤膜(孔径0.22微米)进行微滤，除去残留菌体和颗粒状成分，不会造成细菌污染。加入无水乙醇至乙醇质量分数为70％，静置过夜后倒去上层清液。下层沉淀用75％乙醇洗涤减压抽滤后冷冻干燥，得桃胶多糖。

实施例5发酵法桃胶多糖的提取

桃胶拣去杂物后，取约100g桃胶加适量水浸泡过夜，按料液比1：100：0.01加入超纯水和酵母菌干粉，再倒入到5l的发酵罐中，添加5％甲醇，调节温度为30℃，转速500rpm，搅拌发酵时间5h。测定料液粘稠度，当粘稠度降低到200mpa.s以下后停止发酵。倒出料液，用高速离心机6000rpm离心10分钟。弃除底部菌体沉淀，使用卷式滤膜(孔径0.22微米)进行微滤，除去残留菌体和颗粒状成分，不会造成细菌污染。加入无水乙醇至乙醇质量分数为70％，静置过夜后倒去上层清液。下层沉淀用75％乙醇洗涤减压抽滤后冷冻干燥，得桃胶多糖。

实施例6促巨噬细胞增殖

为了体外测试发酵方法提取的多糖生物学活性，本实施例通过比较刺激巨噬细胞增殖的方法测定多糖的生物学效应。取对数生长时期的raw264.7小鼠巨噬细胞200μl接种于96孔板中，细胞浓度为10×10³个/孔，37℃co2培养箱中培养过夜，细胞贴壁后吸弃上清液，加入200μl浓度分别分10μg/ml、40μg/ml和80μg/ml的实施例2制备的多糖溶液和200μl浓度分别为10μg/ml、40μg/ml和80μg/ml的实施例3制备的多糖溶液，再继续在培养箱中培育24h。再加入20μlcck-8溶液，孵育2h后在490nm测定吸光度。阳性对照组为10μm的脂多糖。增殖率(％)＝(a/a0—1)×100。结果见图3。

结果显示：两种方法提取的桃胶多糖均能表现出促进巨噬细胞增殖的作用。其中，实施例3提取的桃胶多糖的效果显著优于实施例2提取的桃胶多糖，在40μg/ml时的作用最明显。水提法的效果与脂多糖相当。与空白组存在显著性差异。

结论：发酵方法提取的桃胶多糖具有更好的促进巨噬细胞增殖的作用。

实施例7抗右旋糖酐致小鼠皮肤瘙痒的作用

为测定不同实施例提取的多糖效果，采用抗皮肤瘙痒方法评估生物利用度。取小鼠80只，雌雄各半，随机分成10组，按表1所列的剂量灌胃给药。连续5天，于末次给药后30min，各小鼠尾静脉注射右旋糖酐0.95mg/kg。以小鼠前爪搔头部、后爪搔躯干、嘴咬全身各部位作为瘙痒指征。为了更精确计算瘙痒程度，设计将爪子或嘴巴触碰到身体部位计1次，出现瘙痒动作但未触碰到身体部位计0.2次，记录30min内小鼠瘙痒次数及瘙痒持续时间。结果见表1。

表1桃胶多糖抗右旋糖酐致小鼠皮肤瘙痒作用(x±s)

注：与空白对照组比较，*p<0.05,**p<0.01

结果显示，水提法和发酵法提取的桃胶多糖对小鼠全身皮肤瘙痒模型均有较明显的止痒作用，即对外源性的右旋糖酐诱导释放内源性组胺动物瘙痒模型有显著的止痒作用，瘙痒持续时间更短。其中，实施例3和实施例5提取的桃胶多糖具有更显著的止痒作用，对主要的皮肤过敏症状有明显改善作用。

实施例8对组胺致小鼠毛细血管通透性增高的作用

取小鼠80只，雌雄各半，随机分成10组，按表2所列的剂量灌胃给药。连续5天，于末次给药30min后，腹部皮内注射组胺10μg/ml，形成一小皮丘，立即尾静脉注射0.5％依文思蓝0.01ml/g，30min后处死动物，用直径0.8mm的打孔器打下两片蓝染皮片，放入3ml生理盐水-丙酮(3:7)混合液中，37℃恒温水浴锅中放置24h，浸出液离心，取上清液，用分光光度计(610nm)测吸光度。结果见表2。

表2桃胶多糖抗血管通透性增高作用(x±s)

注：与空白对照组比较，*p<0.05,**p<0.01

结果显示：实施例3和实施例5提取的桃胶多糖对组胺引起的毛细血管通透性增加有明显的抑制作用，可以减轻或消除过敏症状。实施例3的抑制率更佳。

实施例9人体皮肤抗敏测试

招募6名皮肤健康的志愿者。清洁手臂皮肤，晾干。在两个手臂正面各选取4个区域(总共8个区域)，用记号笔画上轮廓，剪取3×3cm的滤纸贴在手臂上。每天测试一次。共测试50天。吸取3ml的1.5％组胺溶液，滴加在每片滤纸上。让滤纸均匀吸收溶液。让组胺溶液在手臂上静置30分钟。随后去掉滤纸，冲洗掉皮肤表面组胺溶液。选择红肿和瘙痒程度接近的七块区域。分别涂上1mg实施例2-5的桃胶多糖。两组阳性对照，分别涂上1mg的燕麦仁提取物。药物对照组使用100μl0.1％丹皮酚。空白组涂抹生理盐水。30分钟后观察皮肤瘙痒和表面红肿情况。结果如表3和表4所示。

表3人体皮肤抗敏测试

备注：每组每天测试一次，共测试50天。即每组的测试点总数均为50个。

表4人体皮肤抗敏测试

备注：缓解测试点占比＝缓解测试点数量/测试点总数。

结果显示，实施例3和实施例5提取的桃胶多糖具有显著的抗敏去红的作用，可以显著的缓解皮肤瘙痒、丘疹、发红症状。

实施例10人体皮肤止痒时间测试

招募6名皮肤健康的志愿者。清洁手臂皮肤，晾干。在两个手臂正面各选取3个区域(总共6个区域)，用记号笔画上轮廓，剪取3×3cm的滤纸贴在手臂上。吸取3ml的1.5％组胺溶液，滴加在每片滤纸上。让滤纸均匀吸收溶液。让组胺溶液在手臂上静置30分钟。随后去掉滤纸，冲洗掉皮肤表面组胺溶液。选择红肿和瘙痒程度接近的四块区域。分别涂上1mg/ml的实施例3制备的多糖和实施例2制备的多糖。阳性对照使用1mg/ml的燕麦仁提取物和0.1％丹皮酚溶液。空白组涂抹生理盐水。在不同的时间点触碰皮肤，感受皮肤瘙痒情况。结果如图所示。

图4结果显示，实施例3制备的多糖能够快速缓解皮肤瘙痒，5分钟可有显著的改善，20分钟完全抑制皮肤瘙痒。

综上所述，本发明的发酵法提取的桃胶多糖，其在发酵过程去除了植物内蛋白质成分，提高了多糖纯度，还具有显著的抗敏止痒功效，因此可以更好的应用于美容护肤和抗敏止痒药物领域。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。例如，本发明的实施例的序列，仅是用于解释说明本发明，本领域技术人员可以根据本发明的原理再设计引物和探针来用于检测其他靶基因序列。