一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法

本发明属于检测分析技术领域，尤其涉及一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法。

背景技术：

亚精胺是一类带3个氨基的低分子量脂肪族化合物，是广泛分布于所有生物体中的天然多胺之一。亚精胺广泛分布于动物机体大脑、小脑、心脏、肾脏、肺脏以及肠道等多种组织和器官中，其对于细胞增殖、分化、衰老和死亡过程具有重要调控作用。研究表明，亚精胺可减少炎症细胞浸润、抑制炎症因子表达、并可诱导自噬的功能。此外，亚精胺还具有抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤以及缓解脑损伤等重要功能。因此，探寻一种快速、高效的亚精胺提取方法对于阐明天然亚精胺调控动物生长发育、预防和治疗癌症的生物学功能及其作用机理具有重要的理论意义和现实意义。

亚精胺广泛分布于动物、植物、细菌和真菌等生物体内，对维持内环境稳态具有重要的调控作用。其中，动物肌肉和内脏组织、大豆和发酵豆制品以及某些蘑菇亚精胺含量较高。生物体内的亚精胺大部分从食物中摄取，少部分通过肠道菌群合成与自身生物合成。有研究表明，动物和人类体内多胺含量随着年龄的增长而下降，然而长寿老人体内多胺含量与青壮年人体内多胺含量相接近。增加多胺摄入可提升机体内的内源性多胺含量，并可通过诱导自噬缓解由衰老引发的心血管等疾病，进而发挥抗衰老和延长寿命的功效。可见，在日常饮食中补充亚精胺可预防疾病、延长寿命。另有研究表明，口服亚精胺可降低化学诱导的小鼠肝细胞癌和肝纤维化的发生率，并可使寿命延长25％。研究已经证明，给小鼠和老年人适量补充富含亚精胺的提取物是安全的，且具有良好的耐受性。因此，利用天然亚精胺提取物在预防疾病和延缓衰老领域具有广阔的应用前景。探寻一种快速、高效的亚精胺提取方法具有重要的理论意义和现实意义。但目前，有关在动物组织中提取亚精胺的方法匮乏。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法。

本发明采用的技术方案如下：

一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，包括以下步骤：

s1.将动物肌肉组织与水混合，在-4℃匀浆1-2h，再加入氯化钠混合均匀，然后在40-70℃超声提取10-30min，再置于-4℃放置10-20min；然后在40-70℃超声提取10-30min，再置于-4℃放置10-20min；然后在40-70℃超声提取10-30min，得到混合物；

s2.将s1所得混合物离心分离，得到沉淀和上清液；

s3.将s2所得上清液加入60％乙醇中，搅拌10-15min，过滤，得到第一滤液；

s4.向s2所得沉淀中加入60％乙醇，然后在40-70℃超声提取30-60min，重复超声提取过程2-3次，过滤，得到第二滤液；

s5.将s3所得第一滤液和s4所得第二滤液合并，然后对该合并后滤液进行60％乙醇回流提取2-3次，然后减压浓缩，所得浓缩液纯化后冷冻干燥，即可。

本发明充分研磨粉碎动物肌肉组织，置于盐溶液中，然后通过间隔低温静置和超声波提取技术，一方面利用盐溶液以有助于亚精胺的提取，一方面低温能够一定程度上维持肌肉组织中活性成分的活性，避免活性成分失活或变质与亚精胺发生结合或反应造成得率降低，同时超声提取又进一步增强了提取效果，肌肉组织中能够释放更多的亚精胺。离心分离后分别去除沉淀和上清液中的盐，并进一步提取亚精胺，然后回流浓缩干燥，即得高纯度的亚精胺。

进一步地，s1中动物肌肉组织和水的质量比为1:1-2；优选为1:1。

进一步地，氯化钠在混合物中的浓度为50-70wt％；优选为60wt％。

进一步地，s2中离心分离条件为：3000-5000rpm，10-20min。

进一步地，s2中离心分离条件为：3000rpm，15min。

进一步地，s3中上清液与60％乙醇的体积比为1:3-5；优选为1:4。

进一步地，s4中沉淀与60％乙醇的质量比为1:2-3；优选为1:3。

进一步地，s5中滤液和乙醇的体积比为1:3-6；优选为1:5。

进一步地，回流提取的温度为75-85℃，每次回流提取的时间为3-4h。

进一步地，回流提取的温度为80℃，每次回流提取的时间为3h。

进一步地，s5中冷冻干燥的温度为-80℃。

进一步地，浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明利于盐溶液增强提取率，同时采用低温避免活性成分失活或变质与亚精胺发生结合或反应造成得率降低，超声提取又进一步增强了提取效果，肌肉组织中能够释放更多的亚精胺。本发明方法获得的产品，经检测产率约为95.33％，所得产率高，此外，检测杂峰少，可见亚精胺纯度高。此外，本发明方法操作简单，纯度高，重复性高，提取试剂安全、可控、成本低，提取时间短、效率高，单位时间内提取样品量多，亚精胺纯度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1制得样品的液相色谱图；

图2为工作曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本发明较佳的实施例提供一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，具体步骤如下：

s1.将动物肌肉组织与水按照质量比为1:1混合，在-4℃匀浆1h，再加入氯化钠混合均匀，使得氯化钠在混合物中的浓度为60wt％，然后在50℃超声提取15min，再置于-4℃放置15min；然后在50℃超声提取15min，再置于-4℃放置15min；然后在50℃超声提取15min，得到混合物；

s2.将s1所得混合物在3000rpm离心分离15min，得到沉淀和上清液；

s3.将s2所得上清液加入60％乙醇中，搅拌12min，过滤，得到第一滤液；其中，上清液与60％乙醇的体积比为1:4；

s4.向s2所得沉淀中加入60％乙醇，然后在60℃超声提取45min，重复超声提取过程2次，过滤，得到第二滤液；其中，沉淀与60％乙醇的质量比为1:3；

s5.将s3所得第一滤液和s4所得第二滤液合并，然后对该合并后滤液在80℃下60％乙醇回流提取3h，2次，然后减压浓缩，所得浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化后于-80℃冷冻干燥，即可；其中，滤液和乙醇的体积比为1:5。

实施例2

本发明较佳的实施例提供一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，具体步骤如下：

s1.将动物肌肉组织与水按照质量比为1:1.5混合，在-4℃匀浆2h，再加入氯化钠混合均匀，使得氯化钠在混合物中的浓度为55wt％，然后在60℃超声提取10min，再置于-4℃放置15min；然后在60℃超声提取10min，再置于-4℃放置15min；然后在60℃超声提取10min，得到混合物；

s2.将s1所得混合物在4000rpm离心分离12min，得到沉淀和上清液；

s3.将s2所得上清液加入60％乙醇中，搅拌10min，过滤，得到第一滤液；其中，上清液与60％乙醇的体积比为1:3；

s4.向s2所得沉淀中加入60％乙醇，然后在60℃超声提取35min，重复超声提取过程3次，过滤，得到第二滤液；其中，沉淀与60％乙醇的质量比为1:2；

s5.将s3所得第一滤液和s4所得第二滤液合并，然后对该合并后滤液在80℃下60％乙醇回流提取3h，3次，然后减压浓缩，所得浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化后于-80℃冷冻干燥，即可；其中，滤液和乙醇的体积比为1:4。

实施例3

本发明较佳的实施例提供一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，具体步骤如下：

s1.将动物肌肉组织与水按照质量比为1:2混合，在-4℃匀浆1h，再加入氯化钠混合均匀，使得氯化钠在混合物中的浓度为65wt％，然后在65℃超声提取20min，再置于-4℃放置15min；然后在65℃超声提取20min，再置于-4℃放置15min；然后在65℃超声提取20min，得到混合物；

s2.将s1所得混合物在5000rpm离心分离10min，得到沉淀和上清液；

s3.将s2所得上清液加入60％乙醇中，搅拌15min，过滤，得到第一滤液；其中，上清液与60％乙醇的体积比为1:3；

s4.向s2所得沉淀中加入60％乙醇，然后在65℃超声提取55min，重复超声提取过程2次，过滤，得到第二滤液；其中，沉淀与60％乙醇的质量比为1:3；

s5.将s3所得第一滤液和s4所得第二滤液合并，然后对该合并后滤液在80℃下60％乙醇回流提取3h，2次，然后减压浓缩，所得浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化后于-80℃冷冻干燥，即可；其中，滤液和乙醇的体积比为1:6。

对比例1

一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，具体步骤如下：

将动物肌肉组织与水按照质量比为1:1混合，在-4℃匀浆1h，再加入氯化钠混合均匀，使得氯化钠在混合物中的浓度为60wt％，然后在50℃超声提取15min，再置于-4℃放置15min；然后在50℃超声提取15min，再置于-4℃放置15min；然后在50℃超声提取15min，得到混合物；将混合物加入60％乙醇中，搅拌15min，过滤，得到滤液；对滤液在80℃下60％乙醇回流提取3h，2次，然后减压浓缩，所得浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化后于-80℃冷冻干燥，即可；其中，滤液和乙醇的体积比为1:5。

对比例2

一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，具体步骤如下：

s1.将动物肌肉组织与水按照质量比为1:1混合，在-4℃匀浆1h，再加入氯化钠混合均匀，使得氯化钠在混合物中的浓度为60wt％，在50℃超声提取15min，得到混合物；

s2.将s1所得混合物在3000rpm离心分离15min，得到沉淀和上清液；

s3.将s2所得上清液加入60％乙醇中，搅拌12min，过滤，得到第一滤液；其中，上清液与60％乙醇的体积比为1:4；

s4.向s2所得沉淀中加入60％乙醇，然后在60℃超声提取45min，重复超声提取过程2次，过滤，得到第二滤液；其中，沉淀与60％乙醇的质量比为1:3；

s5.将s3所得第一滤液和s4所得第二滤液合并，然后对该合并后滤液在80℃下60％乙醇回流提取3h，2次，然后减压浓缩，所得浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化后于-80℃冷冻干燥，即可；其中，滤液和乙醇的体积比为1:5。

对比例3

一种从动物肌肉组织中提取亚精胺的方法，具体步骤如下：

将动物肌肉组织与水按照质量比为1:1混合，在-4℃匀浆1h，再加入氯化钠混合均匀，使得氯化钠在混合物中的浓度为60wt％，在50℃超声提取15min，得到混合物；将混合物加入60％乙醇中，搅拌15min，过滤，得到滤液；对滤液在80℃下60％乙醇回流提取3h，2次，然后减压浓缩，所得浓缩液经c18中压制备柱进行中压快速纯化后于-80℃冷冻干燥，即可；其中，滤液和乙醇的体积比为1:5。

实验例

亚精胺标准贮备液准确称取亚精胺标准品0.0158g，用水溶解，分别定容至10ml容量瓶，该贮备溶液含亚精胺为1mmol/ml.准确移取上述两溶液1ml于2个10ml容量瓶中，用水定容至刻度，作为标准使用液。

取亚精胺标准使用液40ul置于10ml带盖塑料离心管中，加入7ul苯甲酰氯，再加入1ml2mol/lnaoh，涡漩20s后在37℃水浴反应20min.加入2ml饱和naci溶液，混匀后用2ml乙醚萃取，于离心机上(1500/min)离心5min后，取1ml醚相于1ml离心管中，在37℃水浴下干燥。用100ul甲醇涡旋溶解，取滤液配制成亚精胺浓度皆为0.020，0.010，0.007，0.005，0.004nmo/ul的混合溶液标准系列.取10μl试样，用液相色谱分析测定，以峰面积对浓度绘制工作曲线。

经检测通过实施例1的方法在1.0g猪肌肉组织中可提取获得0.2207mg亚精胺，而相同的猪肌肉组织样品中高效液相色谱法检测的亚精胺实际含量为0.2315mg，本发明可提取出猪肌肉组织中95.33％的亚精胺，而在一般提取亚精胺的产率约为85％，采用相同方法测得对比例1的产率为90.25％，对比例2的产率为88.65％，对比例3的产率为86.04％，可见本发明方法获得的产率高，此外，检测杂峰少，纯度高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。