一种通过剖宫产获卵的生育力保存方法与流程

1.本发明实施例涉及辅助生殖技术领域，特别涉及一种通过剖宫产获卵的生育力保存方法。


背景技术：

2.上世纪20年代，国际国内经典教科书均指出：女性和绝大多数卵母细胞的产生仅发生在胎儿期，出生后卵母细胞数目不再增加，只会不断减少。为此，女性生育力保存一般采用三种方式：胚胎、卵子或卵巢组织的冷冻保存。从1982年世界第一例冷冻胚胎婴儿出产到现在，胚胎的冷冻保存已经是具有规模的产业化技术，在当今生殖医学和辅助生殖技术领域已经有几百万健康婴儿由冷冻胚胎解冻后出产。然而，做为女性生育力保存技术之一的胚胎冷冻保存，需要女方结婚具有丈夫提供精子生产胚胎后进行冷冻保存。所以，这一技术可能不适合于未婚女性的生育力保存，而且胚胎的冷冻保存可能还需要经过外源性激素的促排过程来生产多个卵子然后再生产胚胎，为此可能也不适合于一些肿瘤患者在化疗和放疗之前的生育力保存。
3.卵子的冷冻保存适用于未婚的独身成年女性。无论是肿瘤患者在化疗和放疗之前，还是大龄患者在最佳年龄阶段进行生育力保存都是切实可行的办法。从1986年世界第一例慢速冷冻卵子出产和1999年玻璃化冷冻卵子婴儿出产以来，迄今为止业已证明有成千上万个健康婴儿由冷冻解冻的卵子出生。但是如上所述，自然情况下，女性一个月经周期只能生产一个成熟卵子，为此一个月经周期为了获取多个甚者十几个卵子的卵巢刺激促排方案，可能对肿瘤患者或者健康女性来说，都是个极大的挑战，因为非生理性的外源性激素的促排对卵巢的刺激，对身体内分泌以及可能导致的副作用是不可忽略的。
4.对于未成年女性来说，因为没有月经就没有成熟卵子生产，所以胚胎和卵子冷冻是不可行的。为此，对未成年的女性来说，卵巢组织冷冻保存才是唯一切实可行的生育力保存方法。虽然从2004年世界第一例由冷冻解冻的卵巢组织原位移植后出产健康婴儿以来，到目前为止估计大约有近160多例通过卵巢组织冷冻解冻后移植出产婴儿，但是对其有效性还有待于考证。另外，对于肿瘤患者来说，康复后把冷冻解冻的卵巢组织移植回去，有可能会把卵巢组织中残留的肿瘤细胞移植回去。为此，只有确保冷冻的卵巢组织没有肿瘤细胞残留的情况下才能进行卵巢组织的解冻和移植。
5.上述现有技术至少存在以下问题：对于不孕不育女性患者有生二胎的意愿时，需要再经历复杂的外源性促性腺激素促排卵和取卵手术过程，会导致不同程度的直接和间接的副作用，尤其是卵巢过度刺激综合症(ovarian hyper stimulation syndrome，ohss)是有生命危险的极度副作用。
6.因此，如何开发一种有效的生育力保存方法，避免不孕不育女性患者和健康女性将来有生二胎的意愿时，不再经历复杂的卵巢促排刺激和取卵手术过程，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

7.本发明实施例目的是提供一种通过剖宫产获卵的生育力保存方法，不仅可以避免一些列药物促排和有创手术的副作用进行女性自身生育力的保存，同时还可以储备这些冷冻保存的卵子成为将来潜在的有效卵子库。
8.为了实现上述目的，本发明实施例提供了一种通过剖宫产获卵的生育力保存方法，所述方法包括：
9.在剖宫产过程中，通过卵巢表面可见的卵泡获得卵泡液；
10.通过所述卵泡液，获得未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；
11.将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体放置于卵子体外成熟培养液中进行体外成熟培养，获得体外成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；
12.去除体外成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体周边的卵丘细胞和颗粒细胞，获得体外成熟卵母细胞；
13.将所述体外成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，获得具有发育潜能的卵子，以实现生育力保存。
14.进一步地，所述卵巢表面的卵泡的直径约为2
‑
10毫米。
15.进一步地，所述卵子体外成熟培养液为艾尔斯体外成熟培养液rc
‑
1060加入终浓度70
‑
80miu/毫升的促卵泡生长激素和终浓度70
‑
80miu/毫升促黄体生成激素混匀获得的混合液。
16.进一步地，将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体放置于卵子体外成熟培养液中进行体外成熟培养，获得体外成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体，具体包括：
17.将所述卵子体外成熟培养液分别加入双孔培养皿的内圈和外圈内，于温度为37℃三气培养箱内平衡≥30分钟，获得内圈培养液和外圈培养液；
18.将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体置于所述外圈培养液内清洗，后置于所述内圈培养液中进行体外成熟培养，获得体外成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体。
19.进一步地，每个所述双孔培养皿的内圈至多放入10个未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体。
20.进一步地，所述体外成熟培养的时间24
‑
48小时。
21.进一步地，所述去除体外成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体周边的卵丘细胞和颗粒细胞，获得体外成熟卵母细胞，具体包括：
22.将所述培养后的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体转移到透明质酸酶溶液中放置1分钟后，用艾尔斯剥卵管d
‑
190吹打去所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体外围的颗粒细胞，再用艾尔斯d
‑
160和d
‑
130吹打去除卵子周边的卵丘细胞，获得成熟卵母细胞。
23.进一步地，所述将所述成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻保存，获得具有发育潜能卵子，具体包括：
24.将玻璃化冷冻液分别制成玻璃化冷冻v1小滴液和v2小滴液在室温条件下平衡至少30分钟；
25.将所述成熟卵母细胞置于所述玻璃化冷冻v1小滴液中平衡5
‑
8分钟后转移到所述玻璃化冷冻v2小滴液中1分钟，然后把卵子转移置于艾尔斯封闭式载杆前段小槽内，盖好封闭式保护套，轻轻放入液氮中进行玻璃化冷冻。冷冻结束后，置于保存液氮罐中进行保存。
26.进一步地，所述艾尔斯封闭式载杆前段小槽内放入的所述成熟卵母细胞≤2个。
27.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
28.本发明实施例提供的一种有效的卵源进行女性自身生育力保存方法，在剖宫产过程中从卵巢表面可见卵泡获取未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体置于卵子体外成熟培养液中进行体外成熟培养，获得成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；去除所述成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体周边的颗粒细胞和卵丘细胞，获得成熟卵母细胞；将所述成熟卵母细胞进行玻璃化冷冻，在液氮中保存具有发育潜能的卵子；该方法采用剖宫产的同时取卵，取出的未成熟卵进行体外成熟培养，然后成熟的卵子进行玻璃化冷冻保存，适当时卵子解冻和体外受精生产胚胎进行移植，不仅可以避免一些列药物促排和有创手术的副作用进行女性自身生育力的保存，同时还可以储备这些冷冻保存的卵子成为将来潜在的有效卵子库。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
30.图1为本发明实施例提供的一种通过剖宫产获卵的生育力保存方法的流程图；
31.图2为通过卵巢表面可见的卵泡直接抽取卵泡液的模式图。
具体实施方式
32.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
33.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为根据本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
34.除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
35.本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路根据下：
36.根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种通过剖宫产获卵的生育力保存方法，如图1所示，所述方法包括：
37.s1、在剖宫产过程中，通过卵巢表面可见卵泡获得卵泡液；
38.其中，所述可见卵泡的直径为2
‑
10毫米；在剖宫产时从卵巢表面直接抽吸所有的卵泡液；
39.s2、通过所述卵泡液，获得未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；
40.具体地：在实验室把试管内的卵泡液倒入到直径60毫米的培养皿中寻找未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体(cumulus
‑
oocyte complexes，cocs)；
41.s3、将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体置于卵子体外成熟培养液中进行体外
成熟培养，获得体外成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；
42.其中，所述卵子体外成熟培养液为艾尔斯体外成熟培养液rc
‑
1060加入终浓度70
‑
80miu/毫升促卵泡生长激素(fsh)和终浓度70
‑
80miu/毫升促黄体生成激素(lh)混匀获得的混合液；加入终浓度70
‑
80miu/毫升fsh和终浓度70
‑
80miu/毫升lh的原因：有助于未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体的成熟，fsh和lh最终浓度过高于70
‑
80iu/毫升对未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体有不利影响，过低70
‑
80miu/毫升将不会起到有效作用；所述卵子体外成熟培养液的体积为1毫升。优选为1毫升，该体积范围内有利于10个未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；
43.具体地，将所述混合液分别加入双孔培养皿的内圈(1毫升)和外圈(2毫升)内，于温度为37℃三气培养箱内平衡至少30分钟；
44.将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体置于所述外圈培养液内清洗，然后转移到所述内圈培养液中进行体外成熟培养24
‑
48小时，以便获得成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体。
45.其中，将未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体置于所述外圈培养液内清洗，后置于所述内圈培养液中进行体外成熟培养的原因在于：外圈培养液可以清洗未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体周边的不利于成熟的因子，使内圈的成熟培养液内的有效成份保持我们期望的浓度，比如说促卵泡生成激素和促黄体生成素的终浓度为70
‑
80miu/毫升等；
46.所述于培养环境温度为37℃三气培养箱内平衡至少30分钟的原因为：艾尔斯卵子体外成熟培养液rc
‑
1060需要至少平衡30分钟才能使培养液的酸碱度(ph值)达到培养要求(ph7.0
‑
7.4)；
47.每个所述双孔培养皿的内圈至多放入10个未成熟的所述卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体。这是因为我们以前的研究结果证明，超过10个以上的cocs会造成操作上的困难，比如说所有cocs会附着在一起；
48.所述体外成熟培养的时间24
‑
48小时。在体外培养24小时后，去除卵子周边的颗粒细胞和卵丘细胞有助于判别卵子是否成熟，成熟的卵子(m
‑
ii)将进行玻璃化冷冻保存。在去除颗粒细胞和卵丘细胞过程中，一旦发现卵子尚未成熟，那么就要停止颗粒细胞和卵丘细胞的吹打去除，放回卵子体外成熟培养液中继续培养24小时，然后再观察这些卵子是否成熟。如果这些卵子在体外培养48小时后成熟，在这一时间节点，对这些体外成熟卵再进行玻璃化冷冻保存。
49.s4、去除所述体外培养的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体周边的颗粒细胞和卵丘细胞，获得成熟卵母细胞；
50.具体地，将所述体外培养24小时后的卵丘细胞
‑
卵子复合体转移到透明质酸酶溶液中(37℃)放置1分钟后，用艾尔斯剥卵管d
‑
190吹打去除所述成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体外围的颗粒细胞，再用艾尔斯d
‑
160和d
‑
130轻轻吹打去除卵子周边的卵丘细胞，获得成熟的卵母细胞。
51.s5、将所述成熟的卵母细胞进行玻璃化冷冻，然后放入液氮罐中，使女性自身获得具有发育潜能卵母细胞的保存；
52.具体包括：将玻璃化冷冻液分别制成玻璃化冷冻v1小滴液和v2小滴液；具体地，将玻璃化冷冻液(艾尔斯玻璃化冷冻液)从2
‑
4℃冰箱中取出分别制成玻璃化冷冻t1和t2小滴(最小100微升/滴)在室温下至少平衡30分钟后使用；
53.将所述成熟卵母细胞置于所述玻璃化冷冻v1小滴液中平衡后转移置于所述玻璃化冷冻v2小滴液中平衡，然后把卵子转移置于艾尔斯封闭式载杆前段小槽内，盖好封闭式保护套，轻轻放入液氮中进行玻璃化冷冻；把冷冻载杆转移至液氮罐中进行保存；具体地，用艾尔斯剥卵管d
‑
160把成熟卵从卵子体外成熟培养液中转移到所述玻璃化冷冻v1小滴液中平衡5
‑
8分钟(室温)，然后转移到所述玻璃化冷冻v2小滴液液中放置1分钟(室温)；用艾尔斯d
‑
160剥卵管把收缩的卵子(最多2个卵子)放到艾尔斯封闭式载杆(rc
‑
straw)前段小槽内，在这一阶段前段小槽内卵子和所述玻璃化冷冻v2小滴液的液体量不得太少(适量为0.2
‑
0.3微升)，然后盖好外边封闭式保护套，轻轻放入液氮中进行玻璃化冷冻。
54.本发明实施例提供的一种有效卵源生育力保存方法，采用在剖宫产的同时从卵巢表面可见的卵泡中取卵，取出的未成熟卵进行体外成熟培养，然后成熟的卵子进行玻璃化冷冻保存，适当时卵子解冻和体外受精生产胚胎进行移植，从而实现女性自身的生育力保存。
55.需要体外受精时，将卵子进行解冻即可，具体地，把艾尔斯解冻液rc
‑
t从2
‑
4℃冰箱中取出分别制成解冻t1、t2、t3和t4小滴(最小200微升/滴)在室温下至少平衡30分钟。把冷冻保存的载杆在液氮中拔出保护套，然后立刻从液氮表面把载有卵子的小槽部分浸入艾尔斯解冻液t1液中使卵子脱落于t1液中。在t1液中平衡3分钟后，用艾尔斯剥卵管d
‑
160把卵子转移到t2液中平衡3分钟，然后再转移到t3液中平衡3分钟。最后把卵子转移到t4液中平衡3分钟，再转移到艾尔斯受精培养液(rc
‑
1030)中进行体外受精的前培养。
56.下面将结合实施例、对比实验数据对本申请的一种有效卵源的生育力保存方法进行详细说明。
57.实施例1
58.本实施例提供一种有效卵源的生育力保存方法，具体为人类，具体操作如下：
59.(1)剖宫产取卵：
60.准备2
‑
3个5
‑
10毫升注射器连接18
‑
22g注射针头，注射器内吸入2
‑
3毫升37℃卵子体外成熟培养液(艾尔斯卵子体外成熟培养液rc
‑
1060)。
61.在剖宫产过程中，从卵巢表面可见的卵泡用注射器吸取卵泡液，获得未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体；用艾尔斯捡卵管(rc
‑
tp)把未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体转移到卵子体外成熟液中进行体外成熟培养。
62.(2)未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体的体外成熟培养：
63.准备10毫升卵子体外成熟培养液(艾尔斯体外成熟培养液rc
‑
1060)并加入最终浓度为75miu/毫升促卵泡生长激素和终浓度70
‑
80miu/毫升促黄体生成激素，然后用一个60毫米双孔培养皿制成内圈放入1毫升和外圈放入2毫升的卵子体外成熟培养皿，放入37℃三气培养箱内至少平衡30分钟后才可以使用。
64.用艾尔斯捡卵管rc
‑
tp把获得的未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体转移到培养皿外圈培养中清洗一下，然后再把未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体转移到内圈中进行体外成熟培养。内圈培养皿内可以最多放入10个未成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体进行体外成熟培养。培养24小时后，把扩张成熟的卵丘细胞
‑
卵子
‑
复合体用艾尔斯捡卵管rc
‑
tp转移到透明质酸酶溶液(艾尔斯颗粒细胞去除液rc
‑
1110)中放置1分钟后，用艾尔斯剥卵管d
‑
190反复吹打去除外围的颗粒细胞，然后分别再用艾尔斯d
‑
160和d
‑
130吹打去除卵子周边的卵丘细
胞。
65.在这一阶段判别培养的卵子是否成熟，成熟的卵子(m
‑
ii)将进行玻璃化冷冻保存。在机械地吹打去除颗粒细胞和卵丘细胞过程中，一旦发现卵子尚未成熟，那么就要停止颗粒细胞和卵丘细胞的吹打去除，放回卵子体外成熟培养液中继续培养24小时，然后再观察这些卵子是否成熟。在体外培养48小时后，如有卵子成熟，在这一时间节点，对这些体外成熟卵再进行玻璃化冷冻保存。
66.(3)卵子的玻璃化冷冻和保存：
67.把玻璃化冷冻液(艾尔斯玻璃化冷冻液rc
‑
v)从2
‑
4℃冰箱中取出分别制成玻璃化冷冻v1和v2小滴(最小100微升/滴)在室温下至少平衡30分钟。用艾尔斯剥卵管d
‑
160把成熟卵从卵子体外成熟培养液中转移到v1液里平衡5
‑
8分钟(室温)，然后转移到v2液中放置1分钟(室温)。
68.用艾尔斯d
‑
160剥卵管把收缩的卵子(最多2个卵子)放到艾尔斯封闭式载杆(rc
‑
straw)前段小槽内，在这一阶段前段小槽内卵子和v2液体量不得太少(适量为0.2
‑
0.3微升)，然后盖好外边封闭式保护套，轻轻放入液氮中进行玻璃化冷冻。冷冻结束后，把载杆放入液氮罐中进行保存。
69.(4)卵子的解冻和体外受精：
70.把艾尔斯解冻液rc
‑
t从2
‑
4℃冰箱中取出分别制成解冻t1、t2、t3和t4小滴(最小200微升/滴)在室温下至少平衡30分钟。把冷冻保存的载杆在液氮中拔出保护套，然后立刻从液氮表面把载有卵子的小槽部分浸入艾尔斯解冻液t1液中使卵子脱落于t1液中。在t1液中平衡3分钟后，用艾尔斯剥卵管d
‑
160把卵子转移到t2液中平衡3分钟，然后再转移到t3液中平衡3分钟。最后把卵子转移到t4液中平衡3分钟，再转移到艾尔斯受精培养液(rc
‑
1030)中进行体外受精的前培养。
71.(5)体外受精生产胚胎后进行移植出产婴儿。
72.实验例1
73.本发明实施例1中的未成熟卵体外成熟和体外受精出产的婴儿在出生体重和出产缺陷上进行统计，如表1所示。
74.表1
‑
1187例妊娠中1421例体外成熟卵出产婴儿的测量结果
[0075][0076]
由表1可知，本发明实施例1中的未成熟卵体外成熟和体外受精出产的婴儿在出生体重和出产缺陷上没有显著地增加。
[0077]
实验例2
[0078]
体内成熟卵子冷冻解冻后的复苏率与体外成熟卵冷冻解冻后的复苏率进行比较，统计如表2所示。
[0079]
表2
[0080]
组别体内成熟卵子冷冻解冻后的复苏率体外成熟卵冷冻保存后的复苏率复苏率％90％以上80％以上
[0081]
由表2的数据可知：
[0082]
与体内成熟卵子冷冻解冻后的复苏率90％相比，体外成熟卵的解冻复苏率在80％左右。本发明实施例在进行人卵巢组织冷冻保存的同时，也可以通过卵巢组织获取一些未成熟卵进行体外成熟后进行玻璃化冷冻保存，这样可以进一步提高生育力保存效率。并且证明卵子应该在体外成熟以后再进行冷冻保存，而不是进行未成熟卵的冷冻保存。实例已证明，未成熟卵在体外成熟后可以进行玻璃化冷冻保存，在解冻后进行体外受精生产胚胎后移植出产了健康的婴儿。
[0083]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0084]
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为
包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
[0085]
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。