液滴生成方法及装置与流程

1.本发明涉及特别适于数字pcr、单细胞捕获、液滴分选以及药物传输等领域的液滴生成方法和装置。


背景技术：

2.pcr，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，pcr）是一种可在体外快速扩增特定基因或dna序列的技术。这项技术是根据生物体内dna序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对特定dna序列进行快速扩增，可在短时间内获得数百万个特异dna序列拷贝。pcr技术发展至今已经经历了3代的沿革。第一代pcr采用普通pcr仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析；第二代pcr是通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的ct值来定量起始靶基因的浓度的荧光定量pcr技术（real-time pcr，qpcr）；第三代pcr技术-数字pcr（digital pcr，dpcr，dig-pcr），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法，它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。数字pcr技术的策略可以称作“分而治之”：样品被稀释并分割至成千上万的微反应室中，这样每个反应室中只包含零或一个靶基因序列（少数反应室中含有多个）。通过计数阳性结果的反应室个数，研究者可以知道在原样品中待检靶基因分子的绝对数目。由于数字pcr在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，因此也不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于ct值的鉴定，因此数字pcr的反应受扩增效率的影响大大降低，对pcr反应抑制物的耐受能力大大提高；数字pcr实验中标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字pcr技术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变。与传统的pcr技术相比，数字pcr具有采取样品量少、节省反应试剂、可实现核酸分子绝对定量、减少同一样品中拷贝间相互干扰、更加出色的灵敏度和特异性等优点。
3.目前，市场上的数字pcr产品主要有两类：微流控芯片式数字pcr和微滴式数字pcr。微流控芯片式数字pcr技术原理是基于微流体装置可以使数字pcr能在一次pcr反应中执行高度平行分析。多层软刻蚀（multilayer soft lithography，msl）技术赋予了设计集成微流体路和控制生产微流体芯片的成本效益的能力。原则上，任何在反应管中能够进行的分子反应，都能够在微流体芯片中实现。在一个msl芯片上能够执行成千上万个独立的pcr反应，减少了试剂消耗和移液器的必要步骤，利用微流体控制阀可将单个样本分解到大量单独的微坑（microwell）中，并以自动化的方式来执行数字pcr。在微流体芯片中，一个阳性的反应至少包含一个目标分子，非常稀的样本中阳性数与目标数非常相似。在浓度较高的样本中，阳性反应含有不止一个目标分子的情况下，即使很大比例的反应是阳性，也可以通过基于泊松分布的算法计算。微滴式数字pcr技术的基本工作原理是：以某种方式产生水相微滴混合样品，并操纵其在惰性油相载体溶液中沿着微通道运动；微滴间互不干扰，每个微滴是一个独立的pcr微反应器；微滴通常在体积上远远小于微量滴定板（在第一、二代pcr技术中广泛采用，如96孔板）上的孔，甚至可以小到进行单细胞分析。其数据分析方法与芯
片式数字pcr类似。因为有许多产生和操纵微滴的技术，这给微滴式pcr技术带来了高度灵活性，研究者甚至可以为每个微滴设计个性化的实验流程。
4.基于微流控（microfluidics）的液滴生成技术，在最近几年得到快速发展，液滴的生成是基于分散相在连续相相在微通道中交汇时的界面失稳。通过不同的微流控通道芯片设计，能够生成体积微小的液滴，并进行融合、反应和分选等操作；但是芯片上的液滴的生成需要满足特定的流速、油水界面张力、以及通道构型和通道表面修饰的条件，液滴的体积调节的范围也受到以上因素的制约。另外，液滴在通道内生成后，需要特定的步骤和装置转移到储存容器中，难以对单个液滴的条件进行定制，液滴的定位、提取和分析操作较为不方便。另外一种技术通过毛细管或微通道注射或喷射微量液体，并将液体注入微坑或点样在基片。这种技术在原理上是一种简便的液滴生成策略。然而，实际操作时，液滴在脱离毛细管时，存在液滴与管内连续液体分离的表面张力，以及液滴与管口表面的附着力，使液滴的体积定量受到影响。通常采用压电陶瓷、受热膨胀、超声等特殊的喷射或液滴激发方式增加液滴脱离出口的动能以克服表面张力的影响，通过微通道出口的特殊构型以及硅烷化或涂层处理降低液滴在管口的附着力。然而这些方式依赖于较为复杂的流体驱动装置，成本较高，对液滴体积的精确调控比较困难。此外，还可以采用将管道出口直接对准基片或微坑内点样的方法，利用液滴与基片接触的附着力和界面张力来克服液滴在管口的附着力。然而，对于成分复杂，粘度特性不一的生化样品，尚缺乏一种普遍适用的方法可以完全克服液体在微通道口附着的表面张力，避免液滴在通道口的残留及由此带来的体积误差、管口堵塞以及交叉污染。
5.综上所述，目前数字pcr产品所采用的微反应室生成技术（无论是微流控数字pcr还是微滴式数字pcr）都需要对微流或者微滴进行复杂精密的流速控制，并需要设计复杂的微流通道来实现对实验的操作。因而造成了数字pcr产品的耗材与qpcr的96孔板不兼容，价格昂贵。市场上存在需要基于更简单的微滴生成和控制技术的数字pcr产品。
6.又已知，随着对细胞生理研究的逐渐深入，科学家们开始从单细胞、单分子水平上对生命现象进行分析。对于多细胞生物来讲细胞和细胞之间是有差异的，即遗传信息的异质性。例如在肿瘤组织中，肿块中心细胞、肿块周围的细胞其基因组和转录组等遗传信息是存在差异的，这种差异在临床上可决定该肿瘤对某种疗法是否有效。目前实现单细胞测序的技术主要包括显微操作技术；激光捕获显微切割技术；激光诱导荧光检测流式细胞分选；以及微流控流式分选等，其中微流控流式分选被认为是相比较而言较为理想的单细胞分离分析手段。但是，如数字pcr液滴生成面临的问题类似，用于单细胞捕获的微流控芯片同样存在着设计、加工及操作复杂，成本高昂，且需要考虑许多因素（如特定的流速、油水界面张力以及通道构型和通道表面修饰等，生成液滴体积受各种流体力学和通道结构的影响），无法精确定量，调节的范围也受到以上因素的制约，液滴生成后尚需依赖转移装置进行进一步转移操作的步骤等不足。


技术实现要素：

7.针对数字pcr液滴生成、单细胞液滴制备等的存在的现有问题，本发明提供一种新型液滴生成方法及液滴生成装置。
8.为解决以上问题，本发明一方面，提供一种特别适用于但不限于制备数字pcr液
滴、单细胞液滴的液滴生成方法，所述液滴生成方法通过混合第一液体、与所述的第一液体不混溶的第二液体以形成液滴，其特征在于，所述的液滴生成方法包括以下步骤：向具有液滴输出口的第一腔体内输入所述的第一液体；经至少部分插入在所述的第一腔体内并具有液体进出口的第二腔体，朝向所述的液滴输出口输出所述的第二液体，其中采用所述的第一液体来驱动所述的第二液体流动；在输入所述的第一液体和输出所述的第二液体的同时，驱动所述的第一腔体、第二腔体进行振动；所述的第二液体从所述的第二腔体内流出后被所述的第一腔体内的第一液体包裹且二者共同喷射出所述的液滴输出口，获得所述的液滴，其中所述的第一液体为连续相液体，所述的第二液体为分散相液体。
9.优选地，所述的振动为往复振动，且往复振动的方向与所述的液体进出口的中心线方相垂直。
10.优选地，所述的第二腔体的液体进出口、所述的第一腔体的液滴输出口的中心线均沿竖直方向延伸，且所述的液体进出口位于所述的液滴输出口的正上方，所述的往复振动为沿着水平方向的往复振动。
11.优选地，所述的振动的振幅为5~500微米，和/或，所述的振动的频率为10hz-10khz。
12.优选地，分别采用泵来驱动所述的第一液体、第二液体流动，其中输入所述的第一液体的速度为1000ml/h~10000ml/h，输出所述的第二液体的速度为1ml/h~100ml/h。
13.优选地，生成液滴过程中，使所述的第一腔体、第二腔体同步振动，用于驱动所述的第一液体、第二液体的泵独立地且可选择的与所述第一腔体、第二腔体保持同步振动或者不进行振动。
14.优选地，所述的第一液体为油相，所述的第二液体为包含了待检测生物或化学物质的水相。
15.优选地，所述的第二腔体为单腔体或多腔体，所述的多腔体为2个、3个、4个或更多个腔体，多个腔体之间同心设置或并排设置或部分同心部分并排地设置。
16.进一步优选地，所述的第二腔体为单腔体，先在所述的第二腔体中填充所述的第一液体，然后经所述的液体进出口将所述的第二液体吸取到已经存有所述的第一液体的第二腔体中，最后驱动所述的第一液体进而驱动所述的第二液体再从所述第二腔体输出。
17.进一步优选地，所述的第二腔体为单腔体，通过驱动多股液体使其在进入所述的第二腔体前进行混合后或者在所述的第二腔体内进行混合形成所述的第二液体，所述的多股液体中的每一股分别通过所述的第一液体来驱动。
18.进一步优选地，所述的第二腔体为多腔体，包括外腔体和位于所述的外腔体内并与其同心设置的内腔体，所述的第二液体包括第一组份和第二组份，分别经所述的外腔体和内腔体的液体进出口输出所述的第一组份和第二组份，输出所述的第一组份、第二组份二者被所述的第一腔体内的第一液体包裹且共同喷射出所述的液滴输出口，获得所述的液滴。
19.进一步优选地，所述的第二腔体为多腔体，包括并排设置的多个分腔体，所述的第二液体相应包括多个分组份，分别经多个所述的分腔体一一输出多个所述的分组份，输出
的多个所述的分组份被所述的第一腔体内的第一液体包裹且共同喷射出所述的液滴输出口，获得所述的液滴。
20.本发明另一方面提供一种液滴生成装置，包括用于输出振动的振动装置、用于液滴生成的第一室，以及第二室，所述的第一室包括第一腔体、与所述的第一腔体相连通的第一液体进口和液滴输出口，所述的第二室包括第二腔体、与所述的第二腔体相连通用于所述的第二液体的进出的液体进出口，所述的振动装置与所述的第一室相连接用于驱动所述的第一室整体进行振动。
21.优选地，所述的振动装置用于驱动所述的第一室在水平方向上进行往复振动。
22.优选地，所述的第二室的下部插入在所述的第一腔体内且下部形成有所述的液体进出口，所述的第二室的液体进出口位于所述的第一室的液滴输出口的正上方。
23.进一步优选地，所述的第一室的液滴输出口、第二室一端的液体进出口之间具有0.1~5mm间隙。
24.优选地，所述的液滴生成装置还包括振动传动罩，所述的振动装置与所述的振动传动罩相连接，所述的振动传动罩套设在所述的第一室的外部。
25.优选地，所述的液滴生成装置还包括用于提供各液体流动所需驱动力的泵。
26.进一步优选地，所述的泵可与所述的第一室、第二室之间通过柔性连接件连接。
27.优选地，所述的第一室与所述的第二室可拆卸的连接，所述的第一室包括与所述的第一腔体相连接的接口，所述的第二室可穿过所述的接口设置。进一步优选地，所述的接口处设置有密封结构。
28.优选地，所述的第二室包括两端开口的管体，两端所述的开口分别形成所述的液体进出口，所述的管体的下部靠近开口处收窄，形成与所述的管体其他部位相比相对更窄的液体进出口。
29.进一步优选地，所述的第二室还包括设置在所述的管体上的一个、二个或更多个用于连接其他管道的连接部，所述的液滴生成装置还可选择地包括通过所述的连接部与所述的管体接通的一个或多个进液管道，所述的第二室以及一个或多个所述的进液管道用于分别通入所述的第二液体的不同组成部分。
30.进一步优选地，所述的管体包括外管体、位于所述的外管体内并与其同心设置的内管体，所述的内管体下端的液体进出口位于所述的外管体下端的液体进出口的上方，所述的外管体、内管体用于分别通入所述的第二液体的不同组成部分。
31.进一步优选地，所述的管体包括多个至少部分并排设置的分管体，多个所述的分管体用于分别通入所述的第二液体的不同组成部分。
32.优选地，振动装置可以采用本领域常规的各种高频振动发生器，例如可以是高频机械振动发生器（压电陶瓷装置、音圈电机、mems等）。
33.由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明通过第一腔体、第二腔体和孔结构可实现稳定的两种互不相溶液体的共流喷射，同时通过对第一腔体、第二腔体进行往复振动调制使得内层液体喷射可以稳定的破裂为均匀的微滴，整个生成过程无需微米量级的微流道结构，通量高。
34.本发明的装置结构简单，零部件少，产业上易于制造；本发明的方法对于生化样品而言，也可以稳定获得均一大小的液滴，液滴体积和生成速率可自由调节，并且不容易受到
外力干扰的影响，产业上容易实施。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
36.附图1为实施例一中微滴生成装置的分解示意图；附图2为实施例一中微滴生成装置的使用状态示意图；附图3为实施例二中第二室的结构示意图；附图4为实施例三中第二室的结构示意图；附图5为实施例四中第二室的结构示意图。
37.以上附图中：1、第一室；10、第一腔体；10a、第一液体进口；10b、液滴输出口；10c、阀；10d、接口；2、第二室；20、第二腔体；20a、20b、液体进出口；20c、连接部；210、外管体；211、内管体；22、分管体；3、振动装置；30、振动传动罩；4a、4b、泵；5、收集器；6、进液管道。
具体实施方式
38.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
40.在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
41.实施例一：如图1、2所示的一种液滴生成装置，其包括第一室1、第二室2、振动装置3、泵4a、4b、收集器5等。
42.第一室1包括第一腔体10、与第一腔体10连通的第一液体进口10a和液滴输出口10b，第一液体进口10a用于与泵4a连接，液滴输出口10b处设置阀10c，其内径通常可以为0.1~5mm。此外，第一室1还包括接口10d，用于连接第二室2，该接口10d处优选设置弹性密封
圈或其他密封结构。在本实施例中：接口10d、液滴输出口10b分别位于第一室1的上下两侧。
43.第二室2包括第二腔体20、与第二腔体20相连通用于第二液体的进出的液体进出口20a、20b。在本实施例中：第二室2为两端开口的管体，两端开口分别形成液体进出口20a、20b，管体一端的液体进出口20a用于与泵4b连接，管体另一端靠近开口处收窄，形成与管体其他部位相比相对更窄的液体进出口20b，该液体进出口20b的内径通常可以为0.1~5mm。
44.振动装置3与第一室1相连接，振动装置可以采用本领域常规的各种高频振动发生器，例如可以是高频机械振动发生器（压电陶瓷装置、mems等）。在本实施例中：装置还包括振动传动罩30，振动装置3与振动传动罩30相连接，振动传动罩30套设在第一室1的外部，振动装置3通过振动传动罩30向第一室1施加往复振动，进而带动插入在第一室1内的第二室2一同进行往复振动。
45.此外，泵4a、4b可采用柱塞泵等。
46.第一室1、第二室3、振动装置3、泵4a、4b均可以是独立的部件，在使用时进行连接。
47.使用时：第二室2通过接口10d竖直插入第一腔体10，接口10d处的弹性密封圈可以使二者连接处保持密封和稳定，第二室2下端的液体进出口20b位于第一室1的液滴输出口10b的正上方，且第一室1的液滴输出口10b、第二室2一端的液体进出口20b之间具有0.1~5mm间隙。
48.泵4a与第一室1的第一液体进口10a连接，泵4b与第二室2的液体进出口20a连接，具体的：泵4a、4b与第一液体进口10a、液体进出口20a可以采用柔性连接件连接，这样在振动装置3驱动第一室1、第二室2进行往复振动时，泵4a、4b始终保持固定。
49.采用上述微滴生成装置可以进行数字pcr液滴的制备，过程如下：通过泵4b的控制可用第二室2通过液体进出口20b先吸入连续相液体（油相）a，继续通过液体进出口20b再吸入分散相液体（水相）b，吸入的分散相液体体积不超过第二腔体20的容积，分散相液体a与液体b互不相溶。将第二室2插入第一腔体10内，直至其液体进出口20b接近液滴输出口10b。
50.然后向第一腔体11中注满连续相液体c，阀10c打开，同时推动泵5a和泵5b，使得第二腔体20中的分散相液体b和第一腔体10中的连续相液体c共流喷射出液滴输出口10b。泵5a推动速度为1~100ml/h，泵5b推动速度为1000~10000ml/h。在推动双泵的同时，振动装置4进行振幅为5~500微米、频率10hz-10khz的高频机械往复振动，带动第一腔体10、第二腔体20使第一腔体10、第二腔体20发生图示左右方向的往复振动，分散相液体b、连续相液体c的喷射流同时按照振动装置4的振动频率破裂为均匀的微滴，并一同流入收集器6。在收集器6中，连续相液体重新合成完整的油相，而分散相液体b依然保持均一的分散。
51.当分散相液体b完全流入收集器6后，整个流程结束。将第二室2从第一腔体10中拔出，更换新的第二室2后，可直接用于下一次或下一个pcr液滴的制备。
52.采取上述微滴生成方法，可以容易地控制微滴的生成位置、生成体积、生成速率以及液滴的组成。具体地，可以通过调整振动频率、振动幅度、不同液体流动的相对速率、液体的粘滞性等中的一个或多个方式来调节第二液体从液滴输出口射出所形成射流的长度和粗细，而相应在所期望的位置按照所期望的速率获得具有期望体积和期望组成的液滴。
53.实施例二：本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于第二室2的具体结构：
如图3所示：第二室2还包括设置在管体上的一个、二个或更多个用于连接其他管道的连接部20c。液滴生成装置还可选择地包括通过连接部20c与管体接通的一个或多个进液管道6，第二室2以及一个或多个进液管6道用于分别通入第二液体的不同组成部分，图示中连接部20c、进液管道6设置两组。通过驱动多股液体使其在进入第二腔体20前进行混合后或者在第二腔体20内进行混合形成第二液体，多股液体中的每一股分别通过第一液体来驱动。
54.实施例三：本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于第二室2的具体结构：如图4所示：第二室2的管体包括外管体210、位于外管体210内并与其同心设置的内管体211，外管体210内形成外腔体，内管体211内形成内腔体，内管体211下端的液体进出口20b’位于外管体210下端的液体进出口20b”的上方。本实施例中：第二液体包括第一组份和第二组份，外管体210、内管体211用于分别通入第二液体的不同组成部分，第一组份和第二组份分别经外管体210的外腔体和内管体211的内腔体的液体进出口20b’、20b”输出第一组份和第二组份，第一组份和第二组份分别通过第一液体来驱动，输出第一组份、第二组份二者被第一腔体10内的第一液体包裹且共同喷射出液滴输出口10b，获得液滴。
55.实施例四：本实施例与实施例一基本相同，不同之处在于第二室2的具体结构：如图5所示：第二室2的管体包括多个至少部分并排设置的分管体22，每个分管体22内形成分腔体，多个分管体22用于分别通入第二液体的不同组成部分。本实施例中：分管体22以两个为例，第二液体包括第一组份和第二组份，第一组份和第二组份分别经两个分腔体输出，第一组份和第二组份分别通过第一液体来驱动，输出第一组份、第二组份二者被第一腔体10内的第一液体包裹且共同喷射出液滴输出口10b，获得液滴。
56.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。