1.本发明涉及微藻生物领域，特别是涉及一种小球藻的培养方法。
背景技术：
2.小球藻是单细胞植物，种类较多，多数生活在淡水中，少数生活在海洋里。按植物学分类，小球藻属于绿藻门绿藻纲绿球藻目卵囊藻科小球藻属生物，其体型小，直径一般为3～8μm，在显微镜下，需要放大400～600倍以上才能看到。小球藻所含的营养成分很高，其蛋白质含量达到50％～60％(鸡蛋的5倍)，含脂肪10％～30％，还含有多种维生素、矿物质、核酸和叶绿素。小球藻的生物活性物质糖蛋白和多糖体以及高达13％的核酸等物质，具有增强人体免疫力、抗癌、降血压、抑制血糖上升、排除体内毒素和迅速恢复机体损伤等功能，在水产渔业生产应用上也有巨大的使用价值，创造极高的经济效益。因此，小球藻的培养应用前景广阔。
3.小球藻既可以进行自养培养又可以进行异养培养。传统的培养方式多采用自养培养，小球藻的自养培养既可利用自然光照，也可以利用人工光照，培养基主要由无机化合物组成。光能自养的培养方式目前包括开放池培养和封闭式培养，前者设备简单、技术含量低、投资少，但产量低且易受自然条件的影响。自从lewin等首先发现了一些藻类能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异养生长，人们便开始对微藻异养培养产生极大兴趣，微藻异养培养能克服自养培养的缺点，可以纯种培养，条件也更容易控制，实现高密度培养，还能得到更快的生长速率和更高的产量。
4.目前一般的微藻在25℃～35℃条件下培养，其co2溶解度相差不大，当培养温度下降到5℃～15℃以后，co2在培养液中的溶解度提高了3～4倍，这为微藻的培养提供了优先条件。但是，温度降低会严重影响微藻的生长速度，甚至使大部分微藻无法生长。
5.为此，中国专利(申请号为201010220906.6)公开了一种能够在低温下培养小球藻的方法，其是通过阶梯式降温的方式，通过适宜的温度控制和合适的培养基及培养条件的协同作用使培养后的小球藻能在0
‑
15℃下正常生长。同时，中国专利(申请号为202010093875.6)公开了一种高低温连续胁迫微藻培养方法，其采用两段式培养：在预培养阶段以最适条件[25℃，100μmol/(m2·
s)]培养薇藻细胞到1.0
×
106个/l
‑
1.2
×
106个/l浓度范围，再将微藻预培养液用于连续高低温胁迫，最高温35
‑
37℃，最低温2
‑
4℃，该方法能大大缩短微藻培养周期。但温度过高容易造成部分小球藻死亡，死亡的小球藻会使水酸化，进一步加剧小球藻死亡，最后造成小球藻突然死亡的表象；同时，该方法以24小时为一个周期，每8小时就需要进行高低温调整，需要培养10
‑
14个周期，培养方式较为繁琐，且温度调整时间过于频繁，容易造成小球藻生长发育发生紊乱。
技术实现要素：
[0006]
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种小球藻的培养方法，本方法通过高低温变换培养使小球藻在低温下正常生长，且培养方式相较于现有技术更为
简单，还能降低小球藻的死亡率。
[0007]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种小球藻的培养方法，包括如下步骤：
[0008]
(1)用高温消毒法或化学药品消毒法对培养容器进行消毒，然后用水将培养容器清洗干净；
[0009]
(2)配制培养液；
[0010]
(3)接种：按藻液与培养液1∶3
‑
4的比例进行接种；
[0011]
(4)培养：
[0012]
第一阶段：光照强度为3000～4500lx，水温为25～30℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳2
‑
3毫克，培养2
‑
4天；
[0013]
第二阶段：光照强度为4000～5500lx，水温为0～5℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳4
‑
6毫克，培养5
‑
10天；
[0014]
第二阶段：光照强度为2000～4500lx，水温为5～10℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳3
‑
5毫克，培养1
‑
2天；
[0015]
(5)采收：
[0016]
当培养液中小球藻的含量≥200个/升时，可进行采收。
[0017]
进一步，所述步骤(1)中，所述高温消毒法选自煮沸消毒、烘箱干燥消毒中的一种。所述煮沸消毒为把培养容器放入锅中，加水煮沸消毒，煮沸时间为10
‑
20分钟，或将培养容器加淡水，封口，置加热炉上加热煮沸5
‑
10分钟，使整个容器内壁消毒。消毒完毕即用消毒的纸或消毒的纱布包扎瓶口。此法适合消毒小型的容器工具。所述烘箱干燥消毒为将培养容器用清水洗干净后，放入烘箱，关闭烘箱门，打开通气孔，接通电源加热，当温度上升到120℃时，关闭通气孔，停止加热；如果进行纯培养，培养容器必须灭菌，当温度上升到105℃时，关闭通气孔，继续加热至160℃，保持温度，恒温2小时及以上，然后停止加热；待温度下降到60℃以下，再打开烘箱门。有棉塞和纸包扎的培养容器，不能超过180℃，以免烘焦。
[0018]
进一步，所述步骤(1)中，所述化学药品消毒法为采用漂白粉水溶液或高锰酸钾水溶液或生石灰水溶液浸泡培养容器，进行消毒。
[0019]
可选地，所述漂白粉含有效氯25～35％，所述漂白粉水溶液的浓度为200
‑
300mg/l；所述高锰酸钾水溶液的浓度为5
‑
6％，所述生石灰水溶液的浓度为2
‑
3％。
[0020]
可选地，所述漂白粉水溶液或生石灰水溶液在培养容器中的浸泡时间不低于0.5小时，所述高锰酸钾水溶液在培养容器中的浸泡时间不低于5分钟。
[0021]
进一步，所述步骤(1)中，小规模培养时，培养容器采用桶或缸，大规模培养时，培养容器采用水泥池或透明罐体。
[0022]
进一步，所述步骤(2)中，培养液的配制方法为：
[0023]
a组分：三氯化铁45
‑
50毫克，氯化锰1.8
‑
2.0毫克，45％氧化硼200
‑
210毫克，磷酸二氢钾1
‑
1.25克，乙二胺四乙酸四钠200
‑
210毫克，碳酸钠300
‑
310毫克或edta钠100
‑
110毫克；
[0024]
b组分：氯化锌0.5
‑
0.6克，氯化钴0.5
‑
0.6克，钼酸铵0.2
‑
0.25克，硫酸铜0.5
‑
0.6克；
[0025]
将a组分和b组分放入1吨水中，充分溶解，然后加入维生素b1和b12各2.0
‑
2.5克，
搅拌均匀，配制成培养液。
[0026]
进一步，所述培养液还包括c组分：小球藻粉2
‑
5克，将a组分、b组分和c组分放入1吨水中，充分混匀，然后加入维生素b1和b12各2.0
‑
2.5克，搅拌均匀后，超声，过滤即得所述培养液。
[0027]
可选地，所述小球藻粉的制备方法为：将小球藻在50
‑
60℃温度下烘干，烘干后的小球藻含水量低于5％，然后粉碎为200
‑
300目的粉末；
[0028]
可选地，超声条件为：50
‑
60℃，6
‑
8小时。
[0029]
进一步，所述步骤(2)中，配制培养液所用的水为海水或淡水，所述海水或淡水为经沉淀、过滤后的海水或淡水。
[0030]
进一步，所述步骤(2)中，所述培养液要经过加热消毒后再使用，加热温度为85
‑
100℃，加热时间为5
‑
6分钟，或加热至沸腾即可。由于海水中的一些对藻类生长有促进作用的有机物在高温时易遭破坏，所以加温时间不宜太长。
[0031]
进一步，所述步骤(3)中，选取生活力强、生长旺盛的藻种，在天气晴朗的上午接种，优选为上午8～10时，这个时间是藻类细胞代谢最旺盛的时候。
[0032]
进一步，所述步骤(4)中，第一阶段至第二阶段，采用阶梯式降温的方式将温度从25
‑
30℃降至0
‑
5℃，降温速率为1
‑
2℃/h，以避免温度突然下降，造成小球藻部分死亡。
[0033]
进一步，所述步骤(4)中，在培养过程中，要对培养液进行搅拌，让藻体不断变换位置，使光照、养料和水温均衡，并注意观察藻液和污染防治。
[0034]
进一步，所述步骤(4)中，在小球藻的培养过程中，要经常观察藻液的颜色是否正常、是否有沉淀和附壁现象、液面是否有菌膜；若显微镜下检查有原生动物生活，可用1mg/l的福尔马林灭杀。
[0035]
进一步，所述步骤(5)中，采收时，将用0.3％～0.5％的明矾粉溶解在培养液里，待小球藻沉在水底后，除去上层的水，就能获得小球藻的浓缩液。
[0036]
如上所述，本发明的小球藻的培养方法，具有以下有益效果：
[0037]
本发明先将小球藻在最为适宜的生长条件下(光照强度为3000～4500lx，水温为25～30℃，二氧化碳补充量2
‑
3毫克/l)培养2
‑
4天，使小球藻大量繁殖生长，提高培养液中藻细胞的初始浓度，然后采用阶梯式降温的方式将温度从25
‑
30℃降至0
‑
5℃，让小球藻在低温下(0～5℃)培养5
‑
10天，使小球藻逐渐适应低温生长环境，并适当提高光照强度和二氧化碳补充量，避免小球藻在低温下生长和繁殖缓慢，最后将温度提升至5
‑
10℃，继续培养1
‑
2天，使小球藻继续生长，并使小球藻能直接作为冬季室外池塘(水温为6
‑
9℃)培养的藻源。同时，低温培养也能避免其他杂藻的产生。
[0038]
本发明的培养液除了使用常规的原料(a组分和b组分)外，还包括c组分，即小球藻粉，使用小球藻粉配制培养液，能使培养液更适合与小球藻的生长，提高小球藻的适应性，降低小球藻的死亡率，同时对小球藻低温正常生长也能起到促进作用。
具体实施方式
[0039]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离
本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0040]
以下实施例中，作为培养原料的小球藻，可以从活体小球藻种液或到较清洁的养鱼池塘、水库采集绿色的水，在显微镜下镜检纯度，然后再用，也可以向科研院所或研究机构购买。
[0041]
本发明中，培养容器的消毒方法有高温消毒法和化学药品消毒法。
[0042]
具体的，高温消毒法分为煮沸消毒、烘箱干燥消毒。
[0043]
煮沸消毒为把培养容器放入锅中，加水煮沸消毒，煮沸时间为10
‑
20分钟，或将培养容器加淡水，封口，置加热炉上加热煮沸5
‑
10分钟，使整个容器内壁消毒。消毒完毕即用消毒的纸或消毒的纱布包扎瓶口。此法适合消毒小型的容器工具。
[0044]
烘箱干燥消毒为将培养容器用清水洗干净后，放入烘箱，关闭烘箱门，打开通气孔，接通电源加热，当温度上升到120℃时，关闭通气孔，停止加热；如果进行纯培养，培养容器必须灭菌，当温度上升到105℃时，关闭通气孔，继续加热至160℃，保持温度，恒温2小时及以上，然后停止加热；待温度下降到60℃以下，再打开烘箱门。有棉塞和纸包扎的培养容器，不能超过180℃，以免烘焦。
[0045]
化学药品消毒法为采用漂白粉水溶液或高锰酸钾水溶液或生石灰水溶液浸泡培养容器，进行消毒。
[0046]
具体的，漂白粉含有效氯25～35％，漂白粉水溶液的浓度为200
‑
300mg/l；高锰酸钾水溶液的浓度为5
‑
6％，生石灰水溶液的浓度为2
‑
3％。
[0047]
具体的，所述漂白粉水溶液或生石灰水溶液在培养容器中的浸泡时间不低于0.5小时，所述高锰酸钾水溶液在培养容器中的浸泡时间不低于5分钟。
[0048]
小规模培养轮虫时，培养容器采用桶或缸，大规模培养轮虫时，培养容器采用水泥池或透明罐体。
[0049]
以下实施例中，采用5l的玻璃容器培养小球藻，将30％含氯量的漂白粉用水配制成200mg/l的漂白粉水溶液，将培养小球藻所用的玻璃容器和其他工具浸泡半小时，再用清水冲洗3
‑
4次。
[0050]
实施例1
[0051]
一种小球藻的培养方法，包括如下步骤：
[0052]
(1)对培养容器进行消毒，然后用水将培养容器清洗干净。
[0053]
(2)配制培养液，培养液的配制方法为：
[0054]
a组分：三氯化铁50毫克，氯化锰2.0毫克，45％氧化硼200毫克，磷酸二氢钾1克，乙二胺四乙酸四钠200毫克，碳酸钠毫克或edta钠100毫克。
[0055]
b组分：氯化锌0.5克，氯化钴0.5克，钼酸铵0.2克，硫酸铜0.5克。
[0056]
将a组分和b组分放入1吨淡水中，充分溶解，然后加入维生素b1和b12各2.0克，搅拌均匀，配制成培养液。培养液经90℃加热5分钟，再使用。
[0057]
(3)接种：
[0058]
选取生活力强、生长旺盛的藻种，在天气晴朗的上午接种，具体为上午8时。按藻液与培养液1∶3的比例进行接种。
[0059]
(4)培养：
[0060]
第一阶段：光照强度为4000lx，水温为28
‑
30℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧
化碳，每升培养液补充二氧化碳2毫克，培养3天；
[0061]
第二阶段：光照强度为5000lx，水温为0～2℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳5毫克，培养8天；
[0062]
第二阶段：光照强度为4500lx，水温为6
‑
8℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳4毫克，培养1天。
[0063]
其中，第一阶段至第二阶段，采用阶梯式降温的方式将温度从28
‑
30℃降至0
‑
2℃，降温速率为1
‑
2℃/h，以避免温度突然下降，造成小球藻部分死亡。
[0064]
培养过程中，要对培养液进行搅拌，每天搅拌2
‑
3次，让藻体不断变换位置，使光照、养料和水温均衡；要注意观察藻液和污染防治，经常观察藻液的颜色是否正常、是否有沉淀和附壁现象、液面是否有菌膜；若显微镜下检查有原生动物生活，可用1mg/l的福尔马林灭杀。
[0065]
(5)采收：
[0066]
当培养液中小球藻的含量≥200个/升时，可进行采收。
[0067]
采收时，将用0.3％的明矾粉溶解在培养液里，待小球藻沉在水底后，除去上层的水，就能获得小球藻的浓缩液。
[0068]
经检测，所得小球藻的浓缩液中的藻细胞浓度为0.7588
×
108个/毫升。实施例2
[0069]
一种小球藻的培养方法，包括如下步骤：
[0070]
(1)对培养容器进行消毒，然后用水将培养容器清洗干净。
[0071]
(2)配制培养液，培养液的配制方法为：
[0072]
a组分：三氯化铁45毫克，氯化锰1.8毫克，45％氧化硼200
‑
210毫克，磷酸二氢钾1.25克，乙二胺四乙酸四钠210毫克，碳酸钠310毫克或edta钠110毫克。
[0073]
b组分：氯化锌0.6克，氯化钴0.6克，钼酸铵0.25克，硫酸铜0.6克。
[0074]
c组分：小球藻粉2克。小球藻粉的制备方法为：将小球藻在60℃温度下烘干，烘干后的小球藻含水量低于5％，然后粉碎为200目的粉末。将a组分、b组分和c组分放入1吨淡水中，充分溶解，然后加入维生素b1和b12各2.2克，搅拌均匀，在60℃超声6小时，过滤后制成培养液。培养液加热至沸腾后再使用。
[0075]
(3)接种：
[0076]
选取生活力强、生长旺盛的藻种，在天气晴朗的上午接种，具体为上午9时，这个时间是藻类细胞代谢最旺盛的时候。按藻液与培养液1∶4的比例进行接种。
[0077]
(4)培养：
[0078]
第一阶段：光照强度为3000lx，水温为25～27℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳2毫克，培养4天；
[0079]
第二阶段：光照强度为4000lx，水温为3～5℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳4毫克，培养10天；
[0080]
第二阶段：光照强度为2000lx，水温为5～8℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳3毫克，培养2天。
[0081]
其中，第一阶段至第二阶段，采用阶梯式降温的方式将温度从25
‑
27℃降至3
‑
5℃，降温速率为1
‑
2℃/h，以避免温度突然下降，造成小球藻部分死亡。
[0082]
培养过程中，要对培养液进行搅拌，每天搅拌2
‑
3次，让藻体不断变换位置，使光
照、养料和水温均衡；要注意观察藻液和污染防治，经常观察藻液的颜色是否正常、是否有沉淀和附壁现象、液面是否有菌膜；若显微镜下检查有原生动物生活，可用1mg/l的福尔马林灭杀。
[0083]
(5)采收：
[0084]
当培养液中小球藻的含量≥200个/升时，可进行采收。
[0085]
采收时，将用0.5％的明矾粉溶解在培养液里，待小球藻沉在水底后，除去上层的水，就能获得小球藻的浓缩液。
[0086]
经检测，所得小球藻的浓缩液中的藻细胞浓度为0.8546
×
108个/毫升。
[0087]
实施例3
[0088]
一种小球藻的培养方法，包括如下步骤：
[0089]
(1)对培养容器进行消毒，然后用水将培养容器清洗干净。
[0090]
(2)配制培养液，培养液的配制方法为：
[0091]
a组分：三氯化铁48毫克，氯化锰2.0毫克，45％氧化硼200毫克，磷酸二氢钾1克，乙二胺四乙酸四钠200毫克，碳酸钠300毫克或edta钠100毫克；
[0092]
b组分：氯化锌0.5克，氯化钴0.5克，钼酸铵0.2克，硫酸铜0.5克；
[0093]
c组分：小球藻粉5克。小球藻粉的制备方法为：将小球藻在50℃温度下烘干，烘干后的小球藻含水量低于5％，然后粉碎为300目的粉末。
[0094]
将a组分、b组分和c组分放入1吨淡水中，充分溶解，然后加入维生素b1和b12各2.5克，搅拌均匀，在50℃超声8小时，过滤后制成培养液。培养液经85℃加热5分钟，再使用。
[0095]
(3)接种：
[0096]
选取生活力强、生长旺盛的藻种，在天气晴朗的上午接种，优选为上午8～10时，这个时间是藻类细胞代谢最旺盛的时候。按藻液与培养液1∶3
‑
4的比例进行接种。
[0097]
(4)培养：
[0098]
第一阶段：光照强度为4500lx，水温为26
‑
28℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳3毫克，培养2天；
[0099]
第二阶段：光照强度为5500lx，水温为2
‑
4℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳6毫克，培养5天；
[0100]
第二阶段：光照强度为4000lx，水温为6
‑
8℃，上午9点至下午2点之间，补充二氧化碳，每升培养液补充二氧化碳5毫克，培养2天。
[0101]
其中，第一阶段至第二阶段，采用阶梯式降温的方式将温度从26
‑
28℃降至2
‑
4℃，降温速率为1
‑
2℃/h，以避免温度突然下降，造成小球藻部分死亡。
[0102]
培养过程中，要对培养液进行搅拌，每天搅拌2
‑
3次，让藻体不断变换位置，使光照、养料和水温均衡；要注意观察藻液和污染防治，经常观察藻液的颜色是否正常、是否有沉淀和附壁现象、液面是否有菌膜；若显微镜下检查有原生动物生活，可用1mg/l的福尔马林灭杀。
[0103]
(5)采收：
[0104]
当培养液中小球藻的含量≥200个/升时，可进行采收。
[0105]
采收时，将用0.5％的明矾粉溶解在培养液里，待小球藻沉在水底后，除去上层的水，就能获得小球藻的浓缩液。
[0106]
经检测，所得小球藻的浓缩液中的藻细胞浓度为0.8825
×
108个/毫升。
[0107]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。