一种全集成核酸即时检测装置及其应用的制作方法

1.本发明涉及属于即时检测技术领域，涉及一种全集成核酸即时检测装置及其应用，尤其涉及一种基于纸基的核酸提取、基于重组酶聚合酶扩增技术的核酸扩增和基于荧光信号的核酸即时检测装置及其应用。


背景技术：

2.现如今，核酸检测(nat)已经获得了广泛的关注。核酸检测可以为临床干预提供重要的信息，因此其在疾病诊断、食品安全、环境监测和法医鉴定方面展现了很好的潜力。特别是针对新型冠状病毒的核酸检测方法尤为重要，对控制疫情具有决定性作用。目前，通过检测新型冠状病毒的s基因、e基因和orf1ab基因来筛查新冠病毒携带者是实现新型冠状病毒检测的有效手段，适用范围最广。
3.核酸检测一般包括三个步骤——核酸提取、核酸扩增和信号读取。
4.传统意义上，核酸检测需要在中心实验室依靠基于大型仪器的技术来实现这三个步骤，例如：使用碱裂解法用于核酸提取、聚合酶链式反应(pcr)用于核酸扩增和实时荧光定量方法用于信号读取。然而，这些大型仪器价格昂贵、体积庞大、耗时，并且在资源有限的地区难以使用。因此，期望开发具有成本低、可便携、速度快和用户友好等优点的核酸即时检测技术或平台。除此之外，操作人员的专业程度以及核酸气溶胶的存在可能会对结果的准确性造成影响。因此，为了应对这些挑战，集成的核酸检测技术的发展可以避免复杂的操作并降低污染的风险。所以，亟需用于即时检测的全集成核酸检测装置。
5.一个理想的全集成核酸即时检测装置应该是成本低且方便携带的，并且能够由非专业人员在任何地方对患者样本中的特定目标物进行快速且准确的检测。
6.目前为止，已经开发了很多平台用于实现全集成的核酸检测。这些平台大致可以被分为两类——纸基微流体平台和芯片微流体平台。纸基微流体平台吸引了广泛的关注，因为纸是低成本、高度生物安全的、可折叠以及易于功能化的基底。但是，由于纸上液体流动速度不可控和易蒸发等缺陷，将纸集成在装置中仍是具有挑战的。相比之下，芯片微流体平台具有样本体积小和封闭等特点。但是其存在成本高、缺乏核心技术的规范和标准等缺陷，很难进入实际应用。
7.因此，为了克服现有核酸检测过程中存在的仪器体积大、成本高、操作复杂等问题，亟需开发一种体积小、成本低、操作简单、快速灵敏的全集成核酸即时检测装置。


技术实现要素：

8.鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种全集成核酸即时检测装置及其应用，所述核酸检测装置将核酸提取、核酸扩增和信号读取三个步骤集成在一起，操作简单、便携程度高、成本低廉，在核酸即时检测领域具有广泛的应用场景。
9.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
10.第一方面，本发明提供一种全集成核酸即时检测装置，所述全集成核酸即时检测
装置包括检测卡盒和配套元件；
11.所述检测卡盒从上到下依次包括上部夹块、中部夹块和下部夹块；
12.所述上部夹块设置用于进样的注射器弯针组件和注射器直针组件；
13.所述中部夹块设置用于核酸提取的纯化组件，所述上部夹块和中部夹块通过定位销连接；
14.所述下部夹块设置用于收集废液的离心管和用于储存冻干试剂的扩增管，所述下部夹块和中部夹块之间滑动连接；
15.所述配套元件设置于所述下部夹块的下方，包括加热组件和信号读取组件。
16.本发明提供一种全集成核酸即时检测装置，所述装置包括检测卡盒及配套元件，其中检测卡盒包括从上到下依次为上部夹块、中部夹块和下部夹块。全集成核酸即时检测装置工作时，借助分别固定有纯化组件和离心管的中部和下部夹块之间的滑动，完成对样品的纯化和核酸的洗脱；依靠加热组件与扩增管的配合，完成对目标核酸的扩增；信号的发射及读取组件，完成对目标核酸的荧光检测。
17.本发明装置将核酸提取、核酸扩增和信号读取相互集成，在一个卡盒中即可自动完成核酸提取、扩增和检测，能够显著提高核酸诊断及分析效率，且装置具有体积小、可便携、成本低、操作简单等优势。
18.作为本发明优选的技术方案，所述上部夹块包含至少3个注射器，用于储存样品、清洗液或洗脱液中的任意一种。
19.本发明中，所述上部夹块可包含多个注射器，但是至少包含三个注射器，分别用于储存样品、储存清洗液以及储存洗脱液，以完成样品的进样、样品的清洗以及洗脱。
20.作为本发明优选的技术方案，所述纯化组件包括内部设置有核酸提取层的纯化柱，用于提取和纯化核酸。
21.优选地，所述纯化组件上方设置硅胶塞，用于密封及固定所述注射器弯针组件。
22.优选地，所述核酸提取层包括fta elute卡。
23.本发明中，所述fta elute卡是一种特殊的纤维素纸，表面含有特殊的变性剂及螯合剂。当样本滴加后，fta elute卡可以使样本中的细胞或病毒裂解，并与蛋白质结合且使其变性，通过洗脱液可以将其上的核酸分子洗脱下来。本发明采用fta elute卡作为核酸提取层，实现核酸的自动化提取。
24.优选地，所述fta elute卡的上下方设置有圆环，用于固定fta elute卡。
25.本发明中，所述fta elute卡采用打孔制造成适当的尺寸。
26.优选地，所述fta elute卡是直径为4.5mm的圆形。
27.本发明中，通过依次推动装有清洗试剂和洗脱试剂的注射器柱塞以及移动固定有离心管和扩增管的下部滑块，将清洗试剂和洗脱试剂流过纯化柱中的fta elute卡到达离心管和扩增管，实现核酸的自动化提取和扩增，推动和移动的动作由机械完成。
28.作为本发明优选的技术方案，所述加热组件包括加热棒。
29.优选地，所述加热棒由传热铝块包裹，用于传递热量至所述扩增管。
30.优选地，所述加热棒的棒芯为氧化酶棒，外壳为不锈钢材料。
31.优选地，所述加热棒提供的温度范围为37～42℃，例如可以是37℃、38℃、39℃、40℃、41℃或42℃等。
32.作为本发明优选的技术方案，所述信号读取组件包括激发光光源和光源采集元件。
33.优选地，所述下部夹块的下方还设置六角螺柱，用于支撑整个检测模组并与荧光设备连接。
34.优选地，所述检测卡盒的尺寸不超过70mm
×
32mm
×
230mm。
35.本发明中所述检测卡盒的尺寸较小，方便携带，适用于多种环境下的核酸检测。
36.第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的全集成核酸即时检测装置的使用方法，所述使用方法包括如下步骤：
37.(1)将样品、清洗液和洗脱液分别置于上部夹块的注射器直针组件中，通过注射器弯针组件将样品转移至中部夹块的纯化组件中；
38.(2)所述纯化组件提取得到样品中的核酸，废液转至下部夹块的离心管中，所得核酸转入储存冻干试剂的扩增管中；
39.(3)使用加热组件对所述扩增管进行加热，所述扩增管中的核酸发生扩增反应；
40.(4)所述扩增反应结束后，利用信号的发射及读取组件获取反应体系内的荧光信号，得到核酸检测结果。
41.本发明提供的全集成核酸即时检测装置可以检测多种样品，例如可以是血清或全血等，该检测装置利用机械自动化进行加样、推动柱塞和移动夹块等操作，实现了样本中的核酸提取、核酸扩增和信号读取。
42.第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的全集成核酸即时检测装置在核酸检测中的应用。
43.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
44.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
45.(1)本发明的核酸检测装置为便携式集成化结构，包括一次性检测卡盒及配套元件，通过设置注射器弯针组件、注射器直针组件、纯化柱、ftaelute卡、离心管、扩增管、加热棒和硅胶塞等组件，将核酸提取、核酸扩增和信号读取三个步骤集成在一起，实现了全自动化，达到了在注射器内完成加样、利用固定有ftaelute卡的纯化柱、扩增管及加热棒进行核酸提取和扩增、利用激发光/发射光窗口进行荧光信号读取的目的；
46.(2)本发明的核酸检测平台利用荧光作为读取信号，检测结果可通过小型的荧光读取仪读取，增加了核酸检测装置的便携性；
47.(3)本发明的核酸检测平台利用机械自动化进行加样、推动柱塞和移动夹块等操作，实现了样本中的核酸提取、核酸扩增和信号读取，检测过程中无需离心机、电泳仪、热循环仪等大型仪器，降低了成本，也无需由专业人员在中心实验室、医院等特定环境中完成操作；
48.(4)本发明的核酸检测平台采用纸、注射器和离心管等作为基础耗材，将核酸提取、核酸扩增和信号读取集成在一起，具有成本低、易生产、易便携等特点，更加适用于核酸的即时检测场景。
附图说明
49.图1为全集成核酸即时检测装置的正视图。
50.图2为全集成核酸即时检测装置的立体图。
51.其中，1
‑
下部夹块，2
‑
上部夹块，3
‑
注射器弯针组件，4
‑
注射器直针组件，5
‑
中部夹块，6
‑
纯化柱，7
‑
fta elute卡，8
‑
离心管，9
‑
扩增管，10
‑
定位销，11
‑
传热铝块，12
‑
加热棒，13
‑
六角螺柱，14
‑
硅胶塞，15
‑
注射器组件固定螺丝。
52.图3为实施例2中检测hpv dna后得到的实时荧光定量曲线图。
53.图4为实施例2中检测hpv dna后得到的电泳图；其中泳道m表示蛋白marker，泳道1表示对照组1，泳道2表示对照组2，泳道3表示实验组1，泳道4表示实验组2。
54.图5为实施例2中检测meca
‑
mrsadna后得到的实时荧光定量曲线图。
55.图6为实施例2中检测meca
‑
mrsadna后得到的电泳图；其中泳道m表示蛋白marker，泳道1表示对照组1，泳道2表示对照组2，泳道3表示实验组1，泳道4表示实验组2。
具体实施方式
56.下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
57.以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
58.需要理解的是，在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
59.需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
60.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
61.以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
62.实施例1
63.本实施例提供一种全集成核酸即时检测装置，其包括检测卡盒、配套的加热组件和小型荧光读取仪。其中，所述检测卡盒的结构参见图1和图2。
64.本实施例中提供的检测卡盒为一次性检测卡盒，从上到下依次为上部夹块2、中部夹块5和下部夹块1。
65.(1)上部夹块2设置有5ml注射器弯针组件3和5ml注射器直针组件4；
66.(2)中部夹块5设置有纯化柱6，纯化柱6内部固定有fta elute卡7，所述中部夹块5的上方固定有硅胶塞14；
67.所述fta elute卡7的直径为4.5mm；
68.(3)下部夹块1设置有2ml的离心管8和0.2ml的扩增管9。
69.其中，上部夹块2和中部夹块5通过定位销10连接，中部夹块5和下部夹块1滑动连接；
70.(4)配套元件包括加热棒12和包裹加热棒12的传热铝块11；所述加热棒12的棒芯为氧化酶棒、外壳为不锈钢材料，用于为扩增管9传递热量；
71.下部夹块1的下方还设置了六角螺柱13，用于与小型荧光读取仪连接。
72.其工作原理如下：
73.(1)检测卡盒工作时，借助固定有纯化柱6的中部夹块5和固定有离心管8的下部夹块1的滑动，完成对样品的纯化和核酸的洗脱；
74.(2)依靠加热棒12和传热铝块11与扩增管9的配合，完成对目标核酸的扩增；
75.(3)依靠小型荧光读取仪，完成对目标核酸的荧光检测。
76.本发明提供的核酸检测装置是通过推动装有样本、清洗试剂和洗脱试剂的5ml注射器直针组件4以及移动固定有2ml离心管8和0.2ml扩增管9的下部夹块1，清洗试剂和洗脱试剂依次流过纯化柱6中的fta elute卡7到达2ml离心管8和0.2ml扩增管9，实现核酸的自动化提取和扩增，其中，推动和移动的动作均由机械完成。
77.实施例2
78.本实施例中利用全集成核酸即时检测平台对血清或全血中的hpv dna进行电泳和荧光检测。
79.本实施例中采用重组酶聚合酶等温扩增(rpa)对目标dna进行扩增。
80.(1)试剂填充：
81.在注射器直针组件4的注射器中分别加入样品、清洗液ddh2o和洗脱液(洗脱buffer，来自杭州众测公司raa
‑
basic试剂盒)；
82.在所述扩增管9内加入冻干试剂，所述冻干试剂(来源于杭州众测公司raa
‑
basic试剂盒)，含有用于反应的酶、dntps、引物、荧光染料和保护剂，所述酶包括rpa扩增反应所需的重组酶、聚合酶和单链结合蛋白；所述荧光染料为sybr greenⅰ，其激发波长为497nm，发射波长为520nm；
83.用于扩增hpv dna的引物序列为：
84.上游引物(seq id no.1)：atgtcattatgtgctgccatatctacttca
85.下游引物(seq id no.2)：atcttctttaggtgctggaggtgtatgttt；
86.(2)核酸的提取与检测
87.通过推动装有样本、清洗试剂和洗脱试剂的5ml注射器直针组件4以及移动固定有离心管8和扩增管9的下部夹块1，清洗试剂和洗脱试剂依次流过纯化柱6中的fta elute卡7到达2ml离心管8和0.2ml扩增管9；
88.其中，洗脱次数分别设置为1次和2次，并按照上述样品检测过程检测阴性对照(control)；
89.通过上述步骤共得到2组样品的实验结果和2组阴性对照的实验结果：
90.实验组1：hpv dna标准样品，洗脱1次(standard sample
‑
1)；
91.实验组2：hpv dna标准样品，洗脱2次(standard sample
‑
2)；
92.对照组1：阴性对照样品，洗脱1次(control
‑
1)；
93.对照组2：阴性对照样品，洗脱2次(control
‑
2)。
94.通过小型荧光读取仪读取荧光信号，所得实时荧光定量曲线如图3所示，图中，阴性对照无荧光信号值，被成功扩增的产物的荧光信号值一直增强，直到到达平台期，且荧光信号值随模板浓度的增加而增加。
95.通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增反应液中是否含有目标dna，所得结果如图4所示，电泳图中，阴性对照无条带，被成功扩增的产物在250bp～300bp之间存在条带，且条带亮度随模板浓度的增加而增加。
96.同时，本实施例中还使用同样的方法对meca
‑
mrsa(耐甲氧西林金葡菌的meca基因)进行检测。
97.通过小型荧光读取仪读取荧光信号，所得实时荧光定量曲线如图5所示，洗脱1次后，阴性对照无荧光信号值，洗脱2次后，阴性对照始终保持在一个低水平处(推测导致阴性对照出现荧光的原因可能是阴性样品被污染，需要进行复检)；而样品在洗脱1次后，能够检测到荧光强度，而洗脱2次后，样品中的meca
‑
mrsa被成功扩增，所得产物的荧光信号值一直增强，直到到达平台期，且洗脱两次的效果较好，荧光信号值随模板浓度的增加而增加。
98.通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增反应液中是否含有目标dna，所得结果如图6所示，电泳图中，阴性对照无条带，对照样品中存在条带，且条带亮度随模板浓度的增加而增加。
99.综上所述，本发明的核酸检测平台通过设置有注射器弯针组件、注射器直针组件、纯化柱、fta elute卡、离心管、扩增管、加热棒和硅胶塞，将核酸提取、核酸扩增和信号读取三个步骤集成在一起，实现了全自动化在注射器直针组件和扩增管内进行核酸提取和扩增，并利用配套的信号的发射及读取组件进行荧光信号读取的目的。本发明利用机械自动化进行加样、推动柱塞和移动夹块等操作，实现了样本中的核酸提取、核酸扩增和信号读取，检测过程中无需离心机、电泳仪、热循环仪等大型仪器，降低了成本，也无需由专业人员在中心实验室、医院等特定环境中完成操作；
100.申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。