耐热β-半乳糖苷酶的制备的制作方法

buffer，dntps mixture，引物各0.2μmol/l，模板dna 200ng，taq dna聚合酶2.5u，5mmol/l mn
2+
，0.5u/μl的taq dna聚合酶2.5μl，7mmol/l的mg
2+
,pcr反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl cloning enhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pet20b(+)质粒用ecorⅰ、xhoⅰ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in
‑
fusion酶，50℃反应15min，转化e.coli bl21；
12.4.突变文库的高通量筛选
13.将步骤3得到的转化e.coli bl21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/ml)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/ml氨苄青霉素的100ml lb培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经xbaⅰ酶切后电击转化毕赤酵母gs115，涂布md平板，待md平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有x
‑
gal的mm培养基上，使x
‑
gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入ypd培养基500μl、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μl bmmy培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；
14.5.酶蛋白纯化
15.配制akta使用的缓冲液，其中a液：20mmol/l磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲液(ph7.5)，b液：1mol/l氯化钠溶液(20mmol/l磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲液，ph7.5)，以5倍柱床体积的a液平衡柱子后，粗酶液经a液流入captorq(1ml)阴离子柱中，通过b液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的b液洗脱杂蛋白，再以5％b液洗脱目的蛋白；
16.6.粗酶液中蛋白含量的测定
17.标准曲线绘制：以牛血清蛋白(bsa)为标准品，配置10mg/ml bsa母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/ml、8.0mg/ml、6.0mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml，取不同浓度bsa溶液或超纯水40μl，加入5倍稀释后的bio
‑
rad考马斯亮蓝蛋白染液260μl，震荡混匀后室温静置15min，取200μl加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线，取粗酶液或纯化后的酶液40μl，加入稀释后染液260μl，混匀后室温静置15min，取200μl加入酶标板中于595nm下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度；
18.7.酶活及比活力测定
19.配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/l、0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.04mmol/l、0.05mmol/l、0.06mmol/l、0.07mmol/l、0.08mmol/l、0.09mmol/l和0.1mmol/l)，定容至10ml，各取2ml，加入2ml 1mol/l na2co3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚
‑
光密度标准曲线；
20.将200μl稀释的酶液加入到800μl2.5g/l经预热的onpg(ph6.5，1mm磷酸钾缓冲液)溶液中，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反应10min，加入1ml 10％na2co3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液，假设标准曲线为y＝ax+b；
[0021][0022]
e:酶活，单位u/ml
[0023]
t:反应时间
[0024]
n:酶液稀释倍数
[0025]
v2：反应终体积
[0026]
v1：酶液添加量
[0027]
8.将比活最高的突变子，送生物公司测序。
[0028]
本发明的有益效果是：
[0029]
获得的突变β
‑
半乳糖苷酶最适反应温度大大提高
附图说明
[0030]
图1易错pcr电泳图
[0031]
图2蛋白标准曲线
[0032]
图3对硝基苯酚
‑
光密度标准曲线
具体实施方式
[0033]
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
[0034]
实施例1
[0035]
本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；
[0036]
表1实验材料和试剂
[0037]
e.coli t
‑
a克隆载体pet20b(+)上海联迈生物工程有限公司质粒小提试剂盒天根生化科技有限公司氨苄青霉素上海通蔚生物有限公司考马斯亮蓝r
‑
250北京索莱宝科技有限公司琼脂糖凝胶dna回收试剂盒大连宝生物工程有限公司限制性内切酶大连宝生物工程有限公司taq酶大连宝生物工程有限公司in
‑
fusion cloning试剂盒大连宝生生物工程有限公司酵母粉dxoid ltd.england胰蛋白胨dxoid ltd.england酵母氮源neb巴斯德毕赤酵母gs115invitrogen公司邻硝基苯酚
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷applichem公司
[0038]
表2实验仪器设备
[0039]
[0040][0041]
lb培养基配方:胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，ph7.0；
[0042]
固体lb培养基：每100ml液体lb培养基加2g琼脂粉，高压灭菌；
[0043]
ypd培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，ph6.0；
[0044]
md固体培养基：0.00004％biotin，1.34％ynb，2％葡萄糖，1.5％琼脂糖；
[0045]
mm固体培养基：0.00004％biotin，1.34％ynb，0.5％甲醇，1.5％琼脂糖；
[0046]
bmmy培养基：2％蛋白胨，1％酵母提取物，0.3％k2hpo4,1.18％kh2po4，1.34％ynb，0.5％甲醇(v/v)，0.00004％biotin；
[0047]
ptm微量盐：0.6％cuso4，0.008％nai2，0.3％mnso4，0.02％na2moo4，0.002％h3bo3，0.05％cocl2，2％zncl2，6.5％feso4，0.5％硫酸(v/v)；
[0048]
酵母发酵基础盐培养基：0.5％kh2po4，5％nh4h2po4，1.485％mgso4，1.82％k2so4，0.093％caso4，0.15％koh，0.00011％biotin，0.44％ptm微量盐，2％葡萄糖；
[0049]
酵母发酵基础盐诱导培养基：0.5％kh2po4，5％nh4h2po4，1.485％mgso4，1.82％k2so4，0.093％caso4，0.15％koh，0.00011％biotin，0.44％ptm微量盐，0.5％甲醇；
[0050]
iptg储存液(200mg/ml):用去离子水配制成200mg/ml异丙基硫代
‑
β
‑
d
‑
半乳糖苷，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成每管1ml，贮存于
‑
20℃；
[0051]
氨苄青霉素储存液(200mg/ml)：用去离子水配制成200mg/ml的氨苄青霉素(amp)贮存液，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装成每管1ml，贮存于
‑
20℃；
[0052]
50
×
tae电泳缓冲液：tris 242g，冰乙酸57.1ml，0.5mol/l edta(ph8.0)100ml，用蒸馏水定容至1l；
[0053]
琼脂糖溶液(1.2％)：称取0.60g琼脂糖，溶解于50ml巴比妥钠
‑
hcl缓冲液中；
[0054]
1.从ncbi上获得β
‑
半乳糖苷酶序列(β
‑
galactosidase，genbank:nt_166518.1)，交生物公司合成，设计pcr引物f:5'
‑
aattaattcggatccgaattcctgaactctcgcggaatttga
‑
3'，5'
‑
gtggtggtggtggtgctcgagtttcatgtagcatctcaatatgattaact
‑
3'，pcr反应结束后，加20μl cloning enhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，采用ecorⅰ、xhoⅰ酶切pet20b(+)质粒，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in
‑
fusion酶，50℃反应15min，转化e.coli jm109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主e.coli bl21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；
[0055]
2.质粒dna的提取
[0056]
将携带有质粒pet20b(+)/β
‑
galactosidase的e.coli bl21基因工程菌接种于lb/amp(amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；
[0057]
3.易错pcr扩增与突变文库的构建
[0058]
以步骤2获得的质粒为模板，用notⅰ酶切使质粒线性化，用引物序列5'
‑
aattaattcggatccgaattcctgaactctcgcggaatttga
‑
3'，5'
‑
gtggtggtggtggtgctcgagtttcatgtagcatctcaatatgattaact
‑
3'，进行易错pcr扩增基因(见图1)，易错pcr扩增体系(50μl)为10
×
takara taq buffer，dntps mixture，引物各0.2μmol/l，模板dna 200ng，taq dna聚合酶2.5u，5mmol/l mn
2+
，0.5u/μl的taq dna聚合酶2.5μl，7mmol/l的mg
2+
,pcr反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃10min，加20μl cloning enhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pet20b(+)质粒用ecorⅰ、xhoⅰ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in
‑
fusion酶，50℃反应15min，转化e.coli bl21；
[0059]
4.突变文库的高通量筛选
[0060]
将步骤3得到的转化e.coli bl21，37℃孵育1h后收集菌体涂布氨苄青霉素抗性培养基(100μg/ml)，37℃温育12h，将平板上菌落分别刮取，接种至含100μg/ml氨苄青霉素的100ml lb培养基中，37℃振荡培养14h后提取混合质粒，混合质粒经xbaⅰ酶切后电击转化毕赤酵母gs115，涂布md平板，待md平板上出现菌落后，将菌落挑至涂有x
‑
gal的mm培养基上，使x
‑
gal变蓝的菌株即为阳性突变体，挑取阳性菌株接种于48孔培养板中，每孔加入ypd培养基500μl、2％接种量，于28℃、200r/min培养48h，离心收集菌体以500μl bmmy培养基重悬菌体，28℃、200r/min培养48h，每12h补加甲醇至终浓度为0.5％，诱导结束后离心取上清即为粗酶液；
[0061]
5.酶蛋白纯化
[0062]
配制akta使用的缓冲液，其中a液：20mmol/l磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲液(ph7.5)，b液：1mol/l氯化钠溶液(20mmol/l磷酸氢二钠
‑
柠檬酸缓冲液，ph7.5)，以5倍柱床体积的a液平衡柱子后，粗酶液经a液流入captorq(1ml)阴离子柱中，通过b液进行梯度洗脱：以5倍柱床体积的11％的b液洗脱杂蛋白，再以5％b液洗脱目的蛋白；
[0063]
6.粗酶液中蛋白含量的测定
[0064]
标准曲线绘制：以牛血清蛋白(bsa)为标准品，配置10mg/ml bsa母液，稀释为以下几个梯度：10.0mg/ml、8.0mg/ml、6.0mg/ml、4.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml，取不同浓度bsa溶液或超纯水40μl，加入5倍稀释后的bio
‑
rad考马斯亮蓝蛋白染液260μl，震荡混匀后室温静置15min，取200μl加入酶标板中，于595nm下测定吸光度，记录数值，绘制标准曲线(见图2)，取粗酶液或纯化后的酶液40μl，加入稀释后染液260μl，混匀后室温静置15min，取200μl加入酶标板中于595n m下测定吸光度，记录数值，根据标准曲线计算酶液的蛋白浓度(见表3)；
[0065]
表3酶液蛋白浓度(mg/ml)
[0066][0067][0068]
7.酶活及比活力测定
[0069]
配制不同浓度对硝基苯酚溶液(浓度分别为0.01mmol/l、0.02mmol/l、0.03mmol/l、0.04mmol/l、0.05mmol/l、0.06mmol/l、0.07mmol/l、0.08mmol/l、0.09mmol/l和0.1mmol/l)，定容至10ml，各取2ml，加入2ml 1mol/l na2co3溶液显色，420nm波长下测定吸光度值，做对硝基苯酚
‑
光密度标准曲线(图3)，酶活标准曲线为y＝0.0498x
‑
0.0505r2＝0.9991；
[0070]
将200μl稀释的酶液加入到800μl2.5g/l经预热的onpg(ph6.5，1mm磷酸钾缓冲液)溶液中，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下反应10min，加入1ml 10％na2co3溶液终止反应，于420nm测定吸光值，空白以灭活的酶液代替有活性酶液；
[0071][0072]
e:酶活，单位u/ml
[0073]
t:反应时间
[0074]
n:酶液稀释倍数
[0075]
v2：反应终体积
[0076]
v1：酶液添加量
[0077]
表4乳糖酶比酶活
[0078]
[0079][0080]
8.将比酶活最高的突变子，送生物公司测序(见表5)。
[0081]
表5比酶活最高突变子序列与野生型序列对比
[0082][0083][0084]
本发明获得了突变体最适温度提高了20℃，具有更好的工业应用价值。